以高的時(shí)間分辨率和單光子靈敏度記錄這些波動(dòng)。 對(duì)于體積元的每一個(gè)體，每個(gè)像素的強(qiáng)度時(shí)間追蹤的時(shí)空相關(guān)性分析（圖lc)提供了關(guān)于 熒光分子流入和流出運(yùn)動(dòng)的頻率和速度的統(tǒng)計(jì)信息（圖ld-f)。在校準(zhǔn)時(shí)，這種信息被轉(zhuǎn)變 為例如蛋白質(zhì)濃度和如在可溶性分子的情況時(shí)的擴(kuò)散系數(shù)等蛋白質(zhì)迀移率的空間解析圖。
[0052] 光墊顯微鏡1的光學(xué)性質(zhì)是這樣的：所述光墊顯微鏡1產(chǎn)生衍射極限的光墊，該光 墊沿著照明軸向的長度例如是約4μπι，提供多個(gè)接近共焦的單體積元的陣列（參見圖lb、 圖3a-3c和圖4)。所述光墊10的寬度是可通過在照明光路20中的狹縫27進(jìn)行調(diào)節(jié)的。 FCS照相機(jī)58的像素可以例如將最大可用的光墊區(qū)域3. 8x65 μ m2 (圖4a)細(xì)分為20條340 像素的線，但也可以進(jìn)行其它的細(xì)分。觀察體積總計(jì)為約〇.31fL，并對(duì)應(yīng)于幾乎各向同性的 點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)（PSF)(圖4e-h)。所述觀察體積的尺寸是由所述光片22的厚度和所述檢測物 鏡41的橫向分辨率所決定，所述光片22的厚度可以為約0. 7 μπι(沿著z軸向Ι/e2)或小 于0. 7 μm。這樣產(chǎn)生比標(biāo)準(zhǔn)的共焦顯微鏡大例如約1. 6倍的觀察體積（圖4i-l)。
[0053] 可以將所述光墊顯微鏡1構(gòu)建在垂直豎立的試驗(yàn)板7上，如圖Ia和圖2所示。這 種設(shè)備的垂直配置具有的附加的優(yōu)點(diǎn)是：垂直配置使得能夠使用常規(guī)皮氏培養(yǎng)皿82 (不需 要3D細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)悠仿袢肽z，例如瓊脂糖中），所述常規(guī)皮氏培養(yǎng)皿具有例如60_直 徑，裝滿直接浸沒2個(gè)物鏡的培養(yǎng)基（圖Slb、圖2)。垂直配置還避免了由于空氣-玻璃、玻 璃-培養(yǎng)基或培養(yǎng)基-瓊脂糖界面的折射率的變化所導(dǎo)致的光學(xué)像差，這樣的光學(xué)像差可 能會(huì)在使用具有用于照明的干燥物鏡的常規(guī)光片顯微鏡配置時(shí)遇到。為了使所述樣品8進(jìn) 行自由運(yùn)動(dòng)，皮氏培養(yǎng)皿82可以被固定在三軸的機(jī)動(dòng)平臺(tái)84上（例如：步進(jìn)電機(jī)：能夠以 50nm 的精確度定位樣品 8 的 LN-Mini23manipulator block XY 和 LN-Mini Z vario，Cell Biology Trading/Luigs&Neumann)〇
[0054] 可以將光墊顯微鏡I設(shè)計(jì)成：在裝配有物鏡61的可選的常規(guī)倒置顯微鏡6 (例如 Olympus IX 70)的幫助下能夠從底部（如果使用了皮氏培養(yǎng)皿的話，例如透過皮氏培養(yǎng)皿 的玻璃底）觀察所述樣品8。例如可以使用長工作距離的干燥物鏡，例如20x/0. 4NA的透 鏡。為了應(yīng)用的需要，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇最好的透鏡。由于它的更大的視野，倒置顯 微鏡6使得能夠更容易地和更快地對(duì)光墊中生物試樣8中更大的試樣進(jìn)行定位或迅速選擇 適合FCS的培養(yǎng)細(xì)胞。在試樣定位時(shí)，為了對(duì)它們進(jìn)行觀察，可以使用透射光照明，例如使 用置于皮氏培養(yǎng)皿82之上的白光發(fā)光二級(jí)管。
[0055] 可選擇地，在所述倒置顯微鏡6上可以采集標(biāo)準(zhǔn)共焦熒光圖像、圖像堆棧和FCS數(shù) 據(jù)，例如如果使用了共焦激光掃描顯微鏡（例如裝配有HCX PlanApo CS 63x/1.2NA水浸物 鏡的Leica TCS SP5A0BS SMD FCS)。為了激發(fā)，可以使用Ar激光的488nm線或另外的激 發(fā)波長。可以使用用于成像的光電倍增管和用于成像和/或FCS的雪崩光電二極管（例如 SPCM-AQR-14，Perkin_Elmer Optoelectronics公司）檢測焚光。在這個(gè)具體實(shí)施例中，檢 測小孔的直徑可以固定在1艾里斑。樣品8中的激光功率遠(yuǎn)低于用于FCS的約200 yW且 低于在物鏡前面所測定的用于共焦激光掃描顯微鏡（CLSM)采集的500 μ W。為了采集FCS 數(shù)據(jù)，將入射光束60置于先前所采集的圖像中的所關(guān)心的位置，啟動(dòng)30-60S的激光照明和 檢測器讀出。
[0056] 圖4a顯示了在Alexa488溶解在水中的情況下，用成像照相機(jī)（ζ軸是視圖方向） 成像的和通過照明可視化的照明光片。虛線區(qū)域凸顯了光墊10,在這個(gè)具體實(shí)施例中，光 墊10被調(diào)節(jié)至3. 8x65 μ m2的區(qū)域，光片22是足夠薄的以提供足夠小的單個(gè)的觀察體積元 (圖lb)。為了表征所述光片的厚度，可以將水平鏡放置在裝滿水的皮氏培養(yǎng)皿82的中心， 并將皮氏培養(yǎng)皿82連同水平鏡一起定位在照明物鏡21和檢測物鏡41兩者的焦平面中，以 將光片22直接反射至檢測物鏡41內(nèi)，如圖4b所示。在將分色鏡44和發(fā)射濾波器47從所 述第一檢測光路40中移出之后，用成像照相機(jī)48對(duì)光片22的焦截面進(jìn)行成像。得到的圖 像如圖4c所示。用高斯函數(shù)擬合平均水平強(qiáng)度分布，產(chǎn)生了 700± IOnm的Ι/e2時(shí)的全寬 (圖 2d)。
[0057] 通過分析直徑為20nm的單個(gè)熒光微球的圖像堆棧（參見圖4e的軸定義），表征了 總的PSF。根據(jù)3D高斯函數(shù)對(duì)微球的圖像堆棧的擬合（圖2f)，可以使用370±20nm的橫 向（x-y)l/e2半徑和410±40nm的軸向（z)l/e2半徑，這意味著PSF是幾乎各向同性的，具 有0. 31fL的單個(gè)觀察體積。通過表達(dá)與GFP融合的膜蛋白Pmal的酵母細(xì)胞（圖4g-h)，對(duì) 從3D堆棧中提取的橫向和軸向強(qiáng)度分布進(jìn)行了比較，確認(rèn)了 PSF的各向同性剖面。
[0058] 圖4i_l顯示了使用裝配有I. 2NA水浸物鏡且用于共焦FCS的Leica SP5共焦顯 微鏡所表征的相同微球的直接比較。按照同樣的方案，獲得了 240±10nm的橫向Ι/e2半徑 和600±20nm的軸向（z)l/e2半徑，即PSF是明顯更加各向異性的，具有0. 19fL體積。總 的來說，光墊顯微鏡的PSF是各向同性的，并比標(biāo)準(zhǔn)的共焦顯微鏡的PSF大大約1. 6倍，因 此小到足以使得能夠進(jìn)行FCS測定。此外，與常規(guī)的光片顯微鏡相比，光墊顯微鏡1使得能 夠?qū)悠?進(jìn)行各向同性的3D成像，而不需要通過旋轉(zhuǎn)樣品或圖像反卷積而從不同的方向 對(duì)樣品進(jìn)行成像。
[0059] 圖5顯示了體外的1D/2D-FCS記錄的實(shí)例。在這個(gè)應(yīng)用例中，所述光墊顯微鏡1被 用于體外熒光樣品的FCS。對(duì)作為樣品8的具有20nm直徑的FluoSphere熒光微球的ID-FCS 數(shù)據(jù)進(jìn)行了記錄。圖5a顯示了 250個(gè)單獨(dú)的自相關(guān)性函數(shù)（ACFs)，這些函數(shù)是從沿著插 圖中所示的虛線的ID-FCS記錄中計(jì)算出的。所述熒光微球趨向于形成非均質(zhì)聚集體，這在 圖像的原始數(shù)據(jù)中是清楚可見的（圖5a中所示的插圖中的亮點(diǎn)）并造成了各ACF的明顯 振幅和衰減的非均質(zhì)性。因此，在從強(qiáng)度時(shí)間追蹤中除去對(duì)應(yīng)于聚集體的尖峰（spikes)之 后，獲得圖5a中所示的ACF。當(dāng)進(jìn)行接近表面的ID-FCS記錄時(shí)，在皮氏培養(yǎng)皿82的底部， 觀察到了熒光微球的純布朗運(yùn)動(dòng)，然而在液滴的中心，能夠觀察得到的運(yùn)動(dòng)主要是對(duì)流。濾 過聚集體的FCS數(shù)據(jù)的質(zhì)量允許我們區(qū)分兩種輸送模式:ACF (圖5b)能夠用單組分異常擴(kuò) 散模型擬合，（使用下面定義的方程（2))，分別獲得不同的異常參數(shù)I. 0和1. 85,前者表示 純擴(kuò)散，而后者是定向運(yùn)動(dòng)，這一點(diǎn)正如根據(jù)能夠在電影中看到的大聚集體的運(yùn)動(dòng)所預(yù)期 的那樣。
[0060] 為了顯示光墊顯微鏡1的性能以及驗(yàn)證所測的規(guī)格，圖5c顯示了關(guān)于Alexa488 溶液在蒸餾水中擴(kuò)散的ID-FCS記錄。60個(gè)單獨(dú)ACF顯示在圖5c中，由圖5d中所標(biāo)記的 像素范圍得到的記錄僅顯示了振幅和時(shí)間依賴性上的微小變化。用單組分自由擴(kuò)散模型擬 合ACF，之前測定的410nm的軸向焦半徑和通過互相關(guān)分析（參見下文和圖5e)獨(dú)立確定的 320 μm2s 1的擴(kuò)散系數(shù)能夠取得（retrieval)490±30nm的有效橫向焦半徑（圖5d)。為了 比較，我們計(jì)算了理論上的期望值：由于我們將3像素合并（3-pixel binning)應(yīng)用到數(shù)據(jù) 中（圖5f)，所以我們將3xl90nm長的矩形檢測剖面和如上面所測定的具有370nm的1/e2半徑的高斯函數(shù)卷積，以獲得有效檢測剖面，該有效檢測剖面能夠很好地?cái)M合于具有500nm 的Ι/e2半徑的高斯函數(shù)，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果有很好的一致性。包括合并（binning)的有效焦體積 是0.57fL。從擬合中獲得的分子數(shù)目能夠被轉(zhuǎn)化成濃度分布曲線（圖5d)，其沿著線幾乎 是保持不變的，使得能夠很好地取得所使用的熒光團(tuán)濃度。因此，Alexa488的ID-FCS以獨(dú) 立的方式，充分確認(rèn)了基于成像的PSF測定。
[0061] 除了計(jì)算的ACF外，可以將空間互相關(guān)性作為像素間距離的函數(shù)如圖5e_f所示， 并通過為0-4的像素距離的CCF全局地?cái)M合方程（2)進(jìn)行計(jì)算，我們獲得了作為獨(dú)立的擬 合參數(shù)的320± 10 μm2s 1的擴(kuò)散系數(shù)。
[0062] 圖6顯示了細(xì)胞培養(yǎng)基的折射率對(duì)聚焦所述光片22的影響。為水設(shè)計(jì)的物鏡在 具有不同于水的折射率的介質(zhì)中工作時(shí)，預(yù)期會(huì)導(dǎo)致光學(xué)像差?？紤]到能夠與所述光墊顯 微鏡1 一起使用的物鏡21和41的長工作距離，即使微小的差異也可能顯示出不能忽略的 影響。為了評(píng)估此差異對(duì)用光墊顯微鏡1從1D-/2D-FCS記錄所獲得的數(shù)據(jù)的影響，我們觀 察了，使用溶解在水中或溶解在具有不同的折射率的緩沖液中的Alexa488時(shí)，光片22的光 束束腰的位置（參見圖6a-b)。當(dāng)用足夠高的強(qiáng)度進(jìn)行照明時(shí)，由于接近照明焦點(diǎn)處的熒光 團(tuán)飽和，照明光束的束腰可能被識(shí)別成黑暗狹窄的區(qū)域。這種效應(yīng)能夠被用來精確地確定 所述光墊10的位置。當(dāng)使用磷酸鹽緩沖液（PBS)代替水時(shí)，能夠觀察到光墊10朝向照明 物鏡21的4. 5 μπι或0. 14%工作距離的位移（參見圖6b)。這個(gè)結(jié)果說明了生長介質(zhì)的折 射率已被考慮到，以及所述系統(tǒng)需要通過所述檢測物鏡的合適的再聚焦和再定位而進(jìn)行相 應(yīng)的調(diào)節(jié)。
[0063] 圖6c顯示了溶解在水、IxPBS和具有Ca2+的IxPBS中的濃度為250nM的Alexa488 的ID-FCS ACF。用單組分自由擴(kuò)散模型擬合ACF，當(dāng)與水進(jìn)行比較時(shí)，PBS和PBS/Ca2+產(chǎn)生 的振幅分別明顯降低了 48%和64%。相反，對(duì)于擴(kuò)散相關(guān)時(shí)間，當(dāng)與水進(jìn)行比較時(shí)，觀察到 PBS和PBS/Ca2+分別僅較小地相對(duì)增加了 9%和13%。擴(kuò)散相關(guān)時(shí)間的不同可能要?dú)w結(jié)于 水和PBS的不同的黏度（在25°C時(shí)分別為0. 99和0. 89mPa s) ; [12, 13]。這表明介質(zhì)的折 光率的不同對(duì)焦半徑?jīng)]有影響，并表明了降低的振幅是增加的失焦信號(hào)所致。為了說明球 面像差對(duì)振幅的影響，我們對(duì)數(shù)據(jù)擬合中獲得的濃度值，應(yīng)用了校正系數(shù)，在PBS中的活體 內(nèi)測定的校正系數(shù)為〇. 52,在PBS/Ca2+中的活體內(nèi)測定的校正系數(shù)為0. 36。
[0064] 數(shù)據(jù)處理分析
[0065] 以下提供了可以與本公開內(nèi)容一起使用的用于數(shù)據(jù)處理和數(shù)據(jù)分析的實(shí)施例。本 領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)待研究的參數(shù)，也可以使用其它的數(shù)據(jù)處理和數(shù)據(jù)分析方法。 可以在本公開內(nèi)容中使用已知的用于熒光分子（或熒光微粒）擴(kuò)散的數(shù)據(jù)處理和數(shù)據(jù)分析 方法。
[0066] 對(duì)