專利名稱：一種腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬基因工程生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體的制備及其藥學(xué)應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體(TRAIL)是腫瘤壞死因子超家族中的一個成員。與腫瘤壞死因子超家族其它成員類似，可溶性形式的腫瘤壞死因子相關(guān)配體以三聚體形式與靶細(xì)胞表面三聚體化的受體分子結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)功能。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體誘導(dǎo)凋亡的作用是通過與腫瘤細(xì)胞上的死亡受體4 (DR4)和死亡受體5(DR5)的相互作用傳遞死亡信號而實(shí)現(xiàn)的。雖然腫瘤壞死因子超家族的其它成員由于具有全身性的毒副作用而使應(yīng)用受到限制，但是腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體是一個相對安全、具有腫瘤選擇性的抗腫瘤 物質(zhì)。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體在體外能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞和癌化細(xì)胞的凋亡，并且在小鼠的移植異種腫瘤，包括結(jié)腸癌、乳腺癌、多重性骨髓瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、前列腺癌等多種模型中具有較好的抗腫瘤活性。尤其重要的是，在小鼠和非人類靈長類動物中全身給藥時，TRAIL表現(xiàn)出較小或沒有毒性?；谝陨显?，重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體已經(jīng)在進(jìn)行腫瘤治療的臨床研究。但是近來一些報(bào)道顯示除了誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡外，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體還涉及到天然免疫和獲得性免疫，和自身免疫性疾病相關(guān)。例如，近來的研究報(bào)道表明它在胸腺的發(fā)育過程中調(diào)節(jié)負(fù)向選擇或凋亡胸腺細(xì)胞，并且在誘發(fā)自體免疫性疾病如I型糖尿病中起重要作用。此外，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體的受體在整個身體廣泛性表達(dá)，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體還參與肝細(xì)胞死亡和肝炎。因此在臨床上重復(fù)、全身性使用大劑量外源性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體蛋白可能會導(dǎo)致不可預(yù)料的免疫結(jié)果。這些報(bào)道使科學(xué)家非常擔(dān)心腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體在臨床中重復(fù)和持久使用時產(chǎn)生潛在的副作用。如何在腫瘤治療時，避免腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體對其它組織的毒副作用，這是腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體(TRAIL)在潛在的臨床應(yīng)用中面臨的難題。

發(fā)明內(nèi)容
為克服野生型腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體在腫瘤治療方面所面臨的缺陷，本發(fā)明目的在于發(fā)明一種具有腫瘤組織靶向性的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體，將其靶向輸送到腫瘤組織中，以此提高腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體的療效，降低其毒副作用，從而能在治療腫瘤疾病中得到應(yīng)用。氨基酞酶N(Aminopeptidase N, APN)/0)13蛋白是一種經(jīng)研究證明只表達(dá)在腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞上的蛋白質(zhì)(Pasqualini R, Koivunen E, Kain R等，CancerRes. 2000,60 :722-727)，處于靜止?fàn)顟B(tài)的正常血管內(nèi)皮細(xì)胞很少表達(dá)⑶13，近年來發(fā)現(xiàn)氨基酞酶N/OH3也與腫瘤的轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)聯(lián)(Haraguchi N, Ishii H, Mimori K等，J Clin Invest.2010,120 :3326-3339 ；Fontijn D, DuyndamMC, van Berkel MP等，Br J Cancer. 2006,94 :1627-1636 ；Fujii H, NakajimaM, Saiki I 等，Clin ExpMetastasis. 1995,13 :337-344)。為達(dá)到實(shí)現(xiàn)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體腫瘤組織靶向輸送，提高其抗腫瘤療效、降低其毒副作用的目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種具有腫瘤組織靶向性的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體，是具有序列表中序列I氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，它是通過基因工程方法構(gòu)建由CD13的配體、連接肽、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體組成的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體融合蛋白質(zhì)，即利用常規(guī)基因工程方法通過人工合成或者克隆構(gòu)建腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體的編碼基因、可溶性地重組表達(dá)和簡便地分離純化。所述CD13的配體可以是一種含有NGR序列的多肽，優(yōu)選為一種帶有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的、含有NGR序列的多肽，例如短肽CNGRC。上述的CD13的配體和腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體所構(gòu)成的腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體之間可以添加一段具有柔性結(jié)構(gòu)的、不含支鏈氨基酸的短肽，其中，短肽為1-25個氨基酸殘基，主要由甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸等不含支鏈的氨基酸組成。
上述的⑶13的配體放置于腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體N端時，在⑶13的配體之前增加一個不含支鏈的氨基酸，主要是丙氨酸或甘氨酸，以防表達(dá)時出現(xiàn)的N端氨基酸降解，影響⑶13配體的功能。所述合成的CD13的配體和腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體所組成腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體在制備腫瘤治療藥物中具有良好的應(yīng)用。以上述腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體制備的腫瘤治療藥物與現(xiàn)有化療、放療、中藥治療、生物治療等方法在腫瘤治療中能夠得到聯(lián)合運(yùn)用。進(jìn)一步地，一種在大腸桿菌中可溶性表達(dá)和簡便分離純化大量的、高純度腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體的聚體的方法。盡管目前腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體在大腸桿菌中表達(dá)多為無生物活性的包涵體產(chǎn)物，而本發(fā)明中的腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體的分子結(jié)構(gòu)和分子量比野生型腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體更為復(fù)雜，因此在大腸桿菌中表達(dá)時，其包涵體形成將更為嚴(yán)重、純化將更為復(fù)雜。本發(fā)明采用了低溫下培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體的表達(dá)方法，使得表達(dá)產(chǎn)物有效避免了包涵體的形成；本發(fā)明同時利用了腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體具有鏊合金屬離子的生物功能，利用離子交換層析和金屬親和層析相結(jié)合使得腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體得到了有效的純化、獲得了高純度的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，而且純化產(chǎn)物具有高比例的聚體形式，因此具有非常好的生物活性。其中低溫指35°c -10°c。⑶13只表達(dá)在腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞上，處于靜止?fàn)顟B(tài)的正常血管內(nèi)皮細(xì)胞很少表達(dá)。最近的研究證實(shí)，⑶13蛋白受堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)調(diào)節(jié)，選擇性高表達(dá)于1F6惡性黑色素瘤等腫瘤細(xì)胞表面，并且與腫瘤的惡性侵潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。我們用流式細(xì)胞儀分析了 CD13在不同細(xì)胞中的表達(dá)水平，結(jié)果表明人微血管內(nèi)皮細(xì)胞高水平表達(dá)⑶13，人宮頸癌細(xì)胞Hela腫瘤細(xì)胞⑶13表達(dá)水平也較高，結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-15表達(dá)中等量的⑶13分子，結(jié)腸癌細(xì)胞C0L0-205表達(dá)極微量或不表達(dá)⑶13分子。上述由⑶13配體、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體組成的腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體可以大大提高腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體在腫瘤組織中的分布、實(shí)現(xiàn)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體在腫瘤組織中的靶向輸送、大大提高腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體的抗腫瘤效果、同時顯著降低腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體的用量。同時編碼公開腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體的cDNA，它可以通過腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體的dDNA增加編碼的⑶13配體和連接肽的DNA序列制備。上述組成的腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體的cDNA可用于基因治療。本發(fā)明的腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體可以通過采用聚乙二醇、月旨肪酸化、重組加上抗體Fe片段或白蛋白等方法修飾，從而延長腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體的半衰期，達(dá)到更好的藥代動力學(xué)效果。同已有的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體及其變體相比，本發(fā)明具有的有益效果(I)更好的腫瘤組織靶向性現(xiàn)有的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體對于腫瘤組織的相對選擇性作用主要是利用腫瘤組織表達(dá)的死亡受體4和死亡受體5來顯示實(shí)現(xiàn)的，而本 專利發(fā)明的腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體除了利用腫瘤組織表達(dá)的死亡受體4和死亡受體5之外，還利用腫瘤組織豐富表達(dá)⑶13的特點(diǎn)，從而更為有效地實(shí)現(xiàn)了腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體在腫瘤組織的靶向輸送。(2)更為高效的抗腫瘤效果由于實(shí)現(xiàn)了腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體在腫瘤組織中的靶向投遞，本專利發(fā)明的腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體無論是與相同劑量的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體相比、還是與靶向于腫瘤細(xì)胞表面的整合素ανβ3、ανβδ的TRAIL變體RGD-L-TRAIL (中國發(fā)明專利申請?zhí)?200710133862. I)相比，無論在單獨(dú)使用、還是與現(xiàn)有的化療、放療、中藥治療、生物治療等方法聯(lián)合使用時都表現(xiàn)出具有更好的抗腫瘤效果。(3)更低的使用劑量由于腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體比相同劑量的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體具有更好的抗腫瘤效果，因此在使用時，能夠在保證相同抗腫瘤療效的情況下，大大降低腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體蛋白質(zhì)的用量。腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體蛋白質(zhì)給藥劑量的降低將能夠克服腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體在腫瘤治療中潛在的副作用，同時可以降低腫瘤患者的治療費(fèi)用，達(dá)到高效、低毒副作用、低成本腫瘤治療的效果。(4)便于表達(dá)和生產(chǎn)與通過腫瘤細(xì)胞特異性抗體及其抗體片段靶向的腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白質(zhì)不同，本專利發(fā)明將腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體與CD13的短肽配體相融合，分子量增加不大，從而更有利于腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體的基因克隆、表達(dá)和生產(chǎn),產(chǎn)量更高。(5)可溶性的表達(dá)和簡易的分離純化盡管目前腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體在大腸桿菌中表達(dá)時易形成無生物活性的包涵體產(chǎn)物，而本專利發(fā)明的腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體的分子結(jié)構(gòu)和分子量比野生型腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體更為復(fù)雜，因此在大腸桿菌中表達(dá)時，其包涵體形成將更為嚴(yán)重、純化將更為復(fù)雜。本發(fā)明采用了低溫下培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體的表達(dá)方法，使得表達(dá)產(chǎn)物有效避免了包涵體的形成；本發(fā)明同時利用了腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體具有鏊合金屬離子的生物功能，將金屬親和層析和離子交換層析方法相結(jié)合使得腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體得到了有效的純化、獲得了高純度的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。本發(fā)明專利通過可溶性表達(dá)和簡易分離純化方法的優(yōu)化最終導(dǎo)致純化產(chǎn)物具有高比例的聚體形式，從而保證了獲得的產(chǎn)物具有非常好的生物活性。生產(chǎn)高比例聚體形式的腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體，這是本發(fā)明與同類研究的顯著區(qū)別。本發(fā)明提供了一種有效表達(dá)和高效獲得高的聚體含量的腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體的表達(dá)方法和純化工藝。(6)在⑶13配體的N端增加一個不含支鏈的氨基酸，有效防止了表達(dá)時出現(xiàn)的N端氨基酸出現(xiàn)降解，從而影響CD13配體功能的情況。


圖I.純化的重組人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體及變體分析1A. SDS-PAGE分析結(jié)果1、祀向于⑶13的腫瘤靶向性人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體(NGR-L-TRAIL) ;2、人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體；3、靶向于整合素αν β 3、α Vβ 5的人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體(RGD-L-TRAIL)；1Β.非還原、非變性PAGE分析結(jié)果1、靶向于⑶13的腫瘤靶向性人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體(NGR-L-TRAIL) ;2、人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體(TRAIL) ;3、靶向于整 合素α V β 3、α V β 5的人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體(RGD_L_TRAIL)。圖2.流式細(xì)胞儀分析綠色熒光素標(biāo)記的人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體(TRAIL)及其腫瘤靶向性變體(NGR-L-TRAIL)與人微血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合。NGR-L-TRAIL 及其 TRAIL、RGD-L-TRAIL、小牛血清白蛋白(BSA)對照蛋白用 FITC熒光素標(biāo)記。人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HDMVEC)用I微克的標(biāo)記蛋白標(biāo)記I小時。圖3. C0L0-205細(xì)胞表面CD13和整合素aV β 3, a V β5的表達(dá)分析。3Α :CD13的表達(dá)分析；3B :整合素α νβ 3的表達(dá)分析；3C :整合素α νβ 5的表達(dá)分析。圖4.人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體(TRAIL)及其腫瘤靶向性變體(NGR-L-TRAIL)誘導(dǎo)各種腫瘤細(xì)胞凋亡的量效關(guān)系分析。4A、Hela 細(xì)胞；4B、C0L0-205 細(xì)胞；4C、HCT-15 細(xì)胞。圖5.分光光度法檢測人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體(TRAIL)及其腫瘤靶向性變體(NGR-L-TRAIL)對 CD13 陽性 Hela 細(xì)胞 Caspase-8 和 Caspase-3 酶活的影響。5A Caspase-8 ；5B :Caspase_3。細(xì)胞分別用10 270納克/毫升濃度梯度的腫瘤靶向性變體NGR-L-TRAIL和RGD-L-TRAIL蛋白分別處理Hela細(xì)胞8小時，誘導(dǎo)后細(xì)胞冰上裂解，加入熒光底物反應(yīng)I小時，然后用酶標(biāo)儀檢測分析(激發(fā)波長400nm，發(fā)射波長505nm)。圖6.人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體(TRAIL)及其腫瘤靶向性變體(NGR-L-TRAIL)在C0L0-205腫瘤模型上單獨(dú)治療以及與CPT-Il聯(lián)合治療的抗腫瘤效果。6A :人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體(TRAIL)及其腫瘤靶向性變體(NGR-L-TRAIL)，以及rgd-l-trail單獨(dú)治療；6B :人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體及其變體與CPT-Il聯(lián)合治療。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果用平均數(shù)表示；方差為標(biāo)準(zhǔn)誤；星號*表示P < O. 05 ;兩個星號**表示P < O. 01。圖7.人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體(TRAIL)及其腫瘤靶向性變體(NGR-L-TRAIL)在HT-15結(jié)腸癌腫瘤模型上單獨(dú)治療以及與CPT-Il聯(lián)合治療的抗腫瘤效果。7A :人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體(TRAIL)及其腫瘤靶向性變體(NGR-L-TRAIL)單獨(dú)治療；
7B :人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體(TRAIL)及其腫瘤靶向性變體(NGR-L-TRAIL)與CPT-Il聯(lián)合治療。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果用平均數(shù)表示；方差為標(biāo)準(zhǔn)誤；星號*表示P
<O. 05 ;兩個星號**表示P < O. 01。圖8.人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體(TRAIL)及其腫瘤靶向性變體(NGR-L-TRAIL)在TRAIL不敏感的HT-29結(jié)腸癌腫瘤模型上單獨(dú)治療以及與CPT-Il聯(lián)合治療的抗腫瘤效
果O圖9.人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體(TRAIL)及其變體(NGR-L-TRAIL)、以及RGD-L-TRAIL在C0L0-205腫瘤動物模型中在腫瘤組織的靶向富集效果比較分析。含有C0L0-205腫瘤的裸鼠分別尾靜脈注射100微升/5微居1251-標(biāo)記的人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體及其腫瘤靶向性變體蛋白。在注射5、30、60、120和240分鐘后，分 別剝離腫瘤組織并稱重，用液閃計(jì)數(shù)儀測定腫瘤組織同位素的放射量，腫瘤組織的放射量單位為每克組織測定放射量與注射放射量的百分比ID/g)，所有結(jié)果為三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。圖10. 125I同位素標(biāo)記檢測的人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體(TRAIL)及其變體(NGR-L-TRAIL)在動物器官組織中的分布。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體的制備利用計(jì)算機(jī)輔助結(jié)構(gòu)模擬和分子設(shè)計(jì)，在SGI計(jì)算機(jī)工作站上，利用MSI公司的分子設(shè)計(jì)軟件(Insightll、Discover等模塊)，在腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，對腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體的N-末端添加CD13配體短肽，進(jìn)行分子模建和分子設(shè)計(jì)，確定連接肽的氨基酸長度。在上述分子設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，我們首先選擇了連接肽為5個甘氨酸的設(shè)計(jì)方案，因?yàn)橛?jì)算機(jī)模擬顯示此方案連接肽較短，對腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、以CD13配體與CD13的結(jié)合都可能產(chǎn)生較大的影響。其它設(shè)計(jì)方案的連接肽大多都使得CD13配體與腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體的分子表面有一段距離，因此這種干擾和影響要小很多。我們同時也嘗試表達(dá)了連接肽為丙氨酸或甘氨酸、丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-絲氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸的短肽的腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體，以及含有以上三個重復(fù)的甘氨酸-(丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-絲氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸)3的25個氨基酸殘基的腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體，都獲得了相似的結(jié)果，從而證明了計(jì)算機(jī)分子設(shè)計(jì)的正確性。相形之下，添加了五個半胱氨酸的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體表達(dá)水平最高(100mg/L)，其它變體的表達(dá)水平略低，但都在50-100mg/L左右的水平。在腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體的計(jì)算機(jī)輔助分子設(shè)計(jì)中，我們利用對腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體進(jìn)行了結(jié)構(gòu)模擬和分子設(shè)計(jì)，在腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，對腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體與CD13配體之間的連接肽氨基酸序列和長度進(jìn)行分子模建和分子設(shè)計(jì)，確定連接肽的氨基酸長度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在計(jì)算機(jī)分子設(shè)計(jì)時計(jì)算的添加1-25個氨基酸短肽長度內(nèi)，只要短肽由不含支鏈的、柔性較大的氨基酸殘基、例如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸等組成，都不會對腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生任何影響，也不會影響CD13配體的功能；而且在分子動力學(xué)所計(jì)算的不含支鏈、柔性較大的25個氨基酸短肽長度范圍內(nèi)，短肽長度越長，對腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的擾動越小；相對來說，長度過短時可能對腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的影響，也可能影響⑶13配體與⑶13的結(jié)合。野生型人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體基因由從人胎盤中獲得的信使RNA反轉(zhuǎn)錄獲得。融合有CNGRC短肽的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體基因的PCR引物的核苷酸序列為引物I :5，-GGAATTCCATATGTGCAATGGTCGTTGCGGTGGTGGTGGTGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAG-3’ ；
引物 2 :5，-ATGGATCCTTAGCCA ACTAAAAAGGCCC-3，。通過PCR反應(yīng)獲得編碼CNGRC短肽和5個甘氨酸組成的連接肽的腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體(NGR-L-TRAIL)基因。腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體(NGR-L-TRAIL)基因克隆在Novagen公司的pET_23a表達(dá)載體中。獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒在埃希氏大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)。為了獲得腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體NGR-L-TRAIL的可溶性表達(dá)，表達(dá)條件如下將過夜生長的重組表達(dá)菌100倍稀釋于LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)2. 5小時，然后再在24°C下培養(yǎng)1_2小時，在24°C下加入IPTG至O. 5mM，然后細(xì)菌在24°C下誘導(dǎo)表達(dá)過夜。細(xì)菌經(jīng)離心后，懸浮于裂解液(50mM磷酸鈉，O. 5M氯化鈉，ImM 二硫蘇糖醇，pH 7.6)中超聲波破碎。重組腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體NGR-L-TRAIL蛋白質(zhì)經(jīng)過上清通過SP-sepharose陽離子樹脂純化,收集300mM NaCl洗脫峰。洗脫蛋白經(jīng)Ni-NTA瓊脂糖凝膠介質(zhì)(Qiagen公司)親和層析進(jìn)一步純化,用250兵mM咪唑洗脫,然后用SephdexG_25脫鹽。實(shí)驗(yàn)中所有用到的水均為除去內(nèi)毒素的超純水，蛋白質(zhì)定量用南京建成生物工程研究所提供的BCA蛋白測試試劑盒測定。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體及其腫瘤靶向性變體蛋白質(zhì)的純度和分子量用SDS-PAGE電泳銀染方法檢測，分子量經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定(AppliedBiosystems 4700Proteomics Analyzer)。靶向于整合素ανβ3、α V β 5 ^ TRAIL變體RGD-L-TRAIL的構(gòu)建、表達(dá)與純化按照中國發(fā)明專利申請200710133862. I進(jìn)行。在以往的報(bào)道中，野生型腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體在大腸桿菌中表達(dá)時，常常會以無生物活性的包涵體產(chǎn)物形式存在；本專利發(fā)明的腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體增加了 4個半胱氨酸(即增加兩對二硫鍵)，該變體在大腸桿菌中表達(dá)時應(yīng)當(dāng)比野生型腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體更加容易形成無生物活性的包涵體產(chǎn)物、純化將更為困難。本發(fā)明通過優(yōu)化表達(dá)條件和分離純化過程、成功地實(shí)現(xiàn)了腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體以可溶性形式表達(dá)，而且經(jīng)過陽離子樹脂層析和鎳金屬親和層析，純化獲得了具有生物活性的、高純度的腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體蛋白質(zhì)，產(chǎn)率為100毫克/升。變性還原條件下的15%聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染分析(圖1A)和質(zhì)譜測序分析都證明表達(dá)產(chǎn)物的正確性。而且在本專利的表達(dá)條件和純化工藝下，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體及其變體具有很高的聚體比例(圖1B)，這一點(diǎn)在腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體表達(dá)和純化的同類工作中是難得一見的。腫瘤壞死因子超家族蛋白都有形成單體、二聚體和三聚體的特性，并且它們的生物學(xué)活性依賴于二聚體和三聚體形式，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體也不例外。為了檢測融合CNGRC結(jié)構(gòu)域后是否對腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體形成聚體的能力產(chǎn)生影響，非變性非還原聚丙烯酰胺凝膠電泳分析顯示重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體及其腫瘤靶向性變體蛋白具有形成聚體的能力。結(jié)果顯示腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體及其腫瘤靶向性變體蛋白、以及RGD-TRAIL都有分子量約為20，000,40, 000和60，000道爾頓左右的三個條帶，這三個分子量的條帶對應(yīng)于單體、二聚體和三聚體(圖1B)。這證明本專利表達(dá)、純化的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體及其腫瘤靶向性變體蛋白確實(shí)具有正確的空間結(jié)構(gòu)、比以往報(bào)道的大腸桿菌表達(dá)的TRAIL具有更好的生物活性。實(shí)施例2腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體及其腫瘤靶向性變體與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)
腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體及其腫瘤靶向性變體NGR-L-TRAIL、以及RGD-L-TRAIL變體分別用突光素(Sigma公司)進(jìn)行標(biāo)記,標(biāo)記好的蛋白經(jīng)過Sephadex_G25分子篩除去游離的熒光素。人包皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，用含2%的胎牛血清的冰冷磷酸緩沖液洗兩遍，然后重新懸浮，加入I微克的標(biāo)記蛋白，在4°C冰育I小時。實(shí)驗(yàn)采用熒光素標(biāo)記的小牛血清白蛋白作對照。染色好的細(xì)胞洗三遍后用流式細(xì)胞儀(BectonDickinson公司)分析結(jié)合能力。我們還進(jìn)一步評價(jià)了熒光素標(biāo)記的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體及其腫瘤靶向性變體NGR-L-TRAIL、以及靶向于整合素ανβ3、ανβ5的TRAIL變體RGD-L-TRAIL (中國發(fā)明專利號ZL200710133862. I)直接與人包皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合的能力。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體NGR-L-TRAIL與人包皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體及其靶向于ανβ3和ανβ5受體的變體RGD-L-TRAIL。這些結(jié)果表明⑶13的配體短肽顯著提高腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體與血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合的能力，該腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體NGR-L-TRAIL與血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合的能力甚至明顯高于整合素α νβ 3和a 5配體短肽所提高的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體RGD-L-TRAIL與血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合的能力(圖2)。人微血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的表達(dá)有⑶13和整合素ανβ3和α νβ 5是不同的研究者所分別發(fā)現(xiàn)的，本專利首次在同一個實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中比較了人微血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的⑶13與整合素ανβ3和ανβ 5的豐度，發(fā)現(xiàn)⑶13的表達(dá)豐度明顯高于整合素ανβ3和ανβ 5的豐度，從而發(fā)現(xiàn)⑶13是一個比整合素ανβ3和ανβ5更好的人微血管內(nèi)皮細(xì)胞的定向靶分子。整合素ανβ3和ανβ 5在國際上是最受公認(rèn)的新生血管的標(biāo)志物，含有RGD序列的配基目前已經(jīng)廣泛被用來作為診斷腫瘤前期生長和腫瘤早期轉(zhuǎn)移的探針，本發(fā)明則在國際上首次證明⑶13是一個比整合素ανβ3和ανβ5更好的腫瘤靶分子，用⑶13作為腫瘤靶向能夠產(chǎn)生比整合素ανβ3和ανβ 5好得多的效果，這是出乎同行科學(xué)家意料之外的結(jié)果，也是出乎發(fā)明意料的結(jié)果，這是本發(fā)明最重要的創(chuàng)新之一。實(shí)施例3CD13和整合素ανβ3、ανβ5的表達(dá)分析細(xì)胞表面的CD13或整合素表達(dá)豐度用間接標(biāo)記法用流式細(xì)胞儀分析檢測。消化后的細(xì)胞用含2%胎牛血清的冰冷磷酸緩沖液洗兩遍，細(xì)胞重新懸浮后在冰上包被抗人CD13單克隆抗體(eBioscience公司)或抗人α V β 3整合素抗體MAB23C6 (eBioscience,公司)或抗人α V β 5整合素抗體MAB 1961 (Chemicon International公司)I小時，陰性對照采用純化的同型鼠免疫球蛋白G(eBioscience公司)。一抗包被的細(xì)胞洗兩遍后,加入綠色突光素偶聯(lián)的羊抗鼠免疫球蛋白Gl ( Y ) (Caltag Laboratories公司)二抗避光標(biāo)記30分鐘。然后洗三次，再用含4%福爾馬林的磷酸緩沖液洗固定，最后在流式細(xì)胞儀上檢測分析⑶13或整合素α V β 3、α V β 5表達(dá)的豐度，所有的染色實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。CNGRC是能夠形成兩對二硫鍵的、具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的、含有NGR序列的⑶13的配體，它具有較好的CD13的親和性和選擇性。由于本發(fā)明是針對CD13進(jìn)行設(shè)計(jì)靶向的，我們首先分析內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表面的CD13表達(dá)情況。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示人包皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)高水平的⑶13，人包皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞表面⑶13表達(dá)水平甚至高于整合素ανβ3和ανβ 5的表達(dá)水平；此外值得注意的是多種腫瘤細(xì)胞也有不同程度的⑶13的表達(dá)，其中HDMVEC和Hela具有高水平的⑶13表達(dá)、結(jié)腸癌HCT-15表達(dá)中等豐度的 CD13、結(jié)腸癌C0L0-205的CD 13表達(dá)量極微弱或不表達(dá)。腫瘤新生血管及腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)⑶13、以及整合素ανβ3、ανβ5，但是至于⑶13與整合素ανβ3、ανβ 5相比較，到底哪一個是更好的腫瘤靶向性靶點(diǎn)？從未有人對此做過詳細(xì)的研究和對比。本發(fā)明專利仔細(xì)地比較了腫瘤新生血管及腫瘤細(xì)胞表面⑶13、以及整合素α νβ 3、ανβδ的表達(dá)水平，并且在細(xì)胞和動物模型水平評價(jià)了分別靶向于CD13的TRAIL變體NGR-L-TRAIL和靶向于整合素ανβ3、ανβ 5的TRAIL變體RGD-L-TRAIL的抗腫瘤活性，獲得了令人驚訝的、與預(yù)期結(jié)果相反的結(jié)果。本發(fā)明專利比較了 C0L0-205表面的CD13和整合素ανβ3、ανβδ的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)C0L0_205表面幾乎不表達(dá)⑶13分子，但是表達(dá)低水平的整合素ανβ 3和高水平的整合素ανβ5(圖3)。與此相印證，靶向于CD13的TRAIL變體NGR-L-TRAIL誘導(dǎo)C0L0-205細(xì)胞凋亡的活性略有增加(圖5B)，而靶向于整合素ανβ3、ανβ5的TRAIL變體RGD-L-TRAIL誘導(dǎo)C0L0-205細(xì)胞凋亡的活性提高了 10倍(對于C0L0-205細(xì)胞，TRAIL的半致死劑量為3. 5納克/毫升；RGD-L-TRAIL的半致死劑量為O. 37納克/毫升)。因此無論從C0L0-205細(xì)胞表面的靶標(biāo)的表達(dá)水平、還是從NGR-L-TRAIL和RGD-L-TRAIL對于C0L0-205細(xì)胞半致死劑量的增加水平，RGD-L-TRAIL都遠(yuǎn)優(yōu)于NGR-L-TRAIL。照此推理，在C0L0-205腫瘤模型體內(nèi)，RGD-L-TRAIL的抗腫瘤效果應(yīng)該明顯好于NGR-L-TRAIL。但是在體內(nèi)C0L0-205腫瘤模型實(shí)驗(yàn)中，NGR-L-TRAIL的抗腫瘤效果明顯優(yōu)于相同劑量(100微克)的RGD-L-TRAIL，甚至于1/5劑量(20微克)的NGR-L-TRAIL的抗腫瘤效果基本等同于5倍劑量(100微克)的RGD-L-TRAIL的抗腫瘤效果。上述結(jié)果清楚地告訴我們抗腫瘤藥物的體內(nèi)抗腫瘤生物活性是無法根據(jù)其體外的實(shí)驗(yàn)活性和人們的常規(guī)邏輯和理解進(jìn)行推測和演繹的，是必須經(jīng)過踏踏實(shí)實(shí)的科學(xué)實(shí)驗(yàn)一步一步進(jìn)行驗(yàn)證，每一個層次的實(shí)驗(yàn)都缺一不可。在本專利中，體外的多個實(shí)驗(yàn)都顯示RGD-L-TRAIL的抗腫瘤活性會顯著優(yōu)于NGR-L-TRAIL，但是體內(nèi)腫瘤動物模型的抗腫瘤實(shí)驗(yàn)卻給出了截然不同的結(jié)果。實(shí)施例4膜聯(lián)蛋白(Annexin V)和碘化吡啶(PI)雙染色法檢測細(xì)胞凋亡將經(jīng)過腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體及其腫瘤靶向性變體NGR-TRAIL、以及RGD-L-TRAIL變體處理過的細(xì)胞經(jīng)過胰蛋白酶消化后，從培養(yǎng)板上吸出，用磷酸緩沖液洗兩遍，300g離心力下離心5分鐘，棄上清，然后用100微升結(jié)合緩沖液重新懸浮，加入終濃度為2微克/毫升的Annexin V-FITC (BD Pharmgen公司)室溫孵育，10分鐘后補(bǔ)充400微升的結(jié)合緩沖液，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到流式分析管內(nèi)，每管加入I微克的碘化吡啶(Sigma公司)。細(xì)胞在30分鐘內(nèi)用流式細(xì)胞儀分析。每個細(xì)胞系至少重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)。我們使用C0L0-205、HCT_15和HT-29腫瘤細(xì)胞分別評價(jià)了腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體NGR-TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的活性(圖4)。腫瘤細(xì)胞經(jīng)過一系列濃度梯度的TRAIL變體或TRAIL誘導(dǎo)處理后，用Annexin V-FITC和PI雙染色的方法、用流式細(xì)胞儀檢測分析。結(jié)果顯示不同的腫瘤細(xì)胞對TRIAL的敏感程度有差異。C0L0-205細(xì)胞最為敏感，HCT-15細(xì)胞其次，Hela細(xì)胞相對不敏感。但是在Hela腫瘤細(xì)胞中，NGR-L-TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的活性顯著提高，NGR-L-TRAIL對Hela細(xì)胞半致死劑量(EC50)約18.5納克/毫升，TRAIL對Hela細(xì)胞半致死劑量(EC50)約145納克/毫升，NGR短肽的加入使得Hela細(xì)胞對TRAIL的敏感性提高了 8倍；而對于C0L0-205和HCT-15腫瘤細(xì)胞，NGR-L-TRAIL的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的活性比TRAIL稍高一些。NGR-L-TRAIL和TRAIL對這 些腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡程度的差異與腫瘤細(xì)胞表面的CD13分子的表達(dá)及豐度是正相關(guān)的。在⑶13高表達(dá)的Hela腫瘤細(xì)胞，NGR-L-TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡活性的顯著提高源于NGR-L-TRAIL中的NGR結(jié)構(gòu)域能夠?qū)RAIL變體蛋白導(dǎo)向到靶細(xì)胞的表面、在細(xì)胞表面富集、從而增加了靶細(xì)胞表面腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體的局部濃度，使變體分子中的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體部分更加便利、頻繁和有效地接近TRAIL受體，近而增強(qiáng)了其激活細(xì)胞凋亡通路的信號，從而增強(qiáng)了 NGR-L-TRAIL的活性。并且，這種細(xì)胞凋亡活性增強(qiáng)的程度取決于腫瘤細(xì)胞表面CD13表達(dá)的豐度，豐度高的活性增強(qiáng)程度高，反之也亦然。例如，在⑶13高表達(dá)的Hela腫瘤細(xì)胞中，由于⑶13表達(dá)量高，NGR-L-TRAIL的活性提高了 8倍(圖4)。而對于CD13表達(dá)較低的C0L0-205結(jié)腸癌細(xì)胞，NGR-L-TRAIL的活性提高極少。以上結(jié)果清晰地表明腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體NGR-L-TRAIL活性的提高是由于CNGRC的靶向性而獲得的。實(shí)施例5Caspase-8 和 Caspase-3 酶活測定Caspase-8和Caspase-3酶活測定用突光檢測試劑盒測定(Oncogene公司),實(shí)驗(yàn)方法依據(jù)廠家提供的方法。熒光值由酶標(biāo)儀檢測，熒光參數(shù)為激發(fā)波長400nm，發(fā)射波長505nmo與腫瘤細(xì)胞不同，正常的人包皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞、293T腎細(xì)胞與原代的肝細(xì)胞用300納克/毫升的腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體處理24小時，也不能觀察到明顯的細(xì)胞毒性。這說明腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體能夠區(qū)分正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，但對正常細(xì)胞是相對安全。我們用熒光法檢測了腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體及其腫瘤靶向性變體處理后Hela細(xì)胞中的Caspase-8和Caspase-3的活性，與相同劑量的TRAIL相比，NGR-L-TRAIL顯示出更高的Caspase-8和Caspase-3的活性(圖5A、5B)。這說明由于NGR-L-TRAIL中的NGR結(jié)構(gòu)域能夠?qū)RAIL變體蛋白導(dǎo)向到靶細(xì)胞的表面、在細(xì)胞表面富集、從而增加了靶細(xì)胞表面腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體的局部濃度，使變體分子中的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體部分更加便利、頻繁和有效地接近TRAIL受體，近而增強(qiáng)了其激活細(xì)胞凋亡通路的信號。在FADD+和Caspase-8+突變的Jurkat細(xì)胞中，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體及其變體都不能檢測到誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這說明腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體及其變體一樣，都是通過受體-FADD-Caspase-8途徑發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用的。實(shí)施例6腫瘤動物模型的抗腫瘤療效實(shí)驗(yàn)5-6周齡的雌性裸鼠購于上海實(shí)驗(yàn)動物中心。裸鼠先尾靜脈注射100微克封閉自然殺傷性細(xì)胞的特異抗體一純化的Asialo GM-I抗體(日本W(wǎng)ako Chemicals公司)。24小時后，在裸鼠背部右上側(cè)皮下接種10萬個C0L0-205、HT-15或HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞。當(dāng)腫瘤達(dá)到70立方毫米時，隨機(jī)分組，開始治療。重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體及其腫瘤靶向性變體NGR-TRAIL、以及RGD-L-TRAIL變體蛋白經(jīng)腹腔給藥，每天一次，連續(xù)10到14天。 水溶性的喜樹堿CPT-Il (11-羥基-喜樹堿；商品名開普托；Pharmacia/Upj0hn公司產(chǎn)品)每周靜脈給藥一次，共給兩次。重組蛋白和喜樹堿均用磷酸緩沖液稀釋。腫瘤的大小用游標(biāo)卡尺進(jìn)行測量，計(jì)算公式為長乘以寬的平方除2。我們在無胸腺的裸鼠中用C0L0-205和HT-15兩種結(jié)腸癌模型來測試和比較腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體及其腫瘤靶向性變體NGR-L-TRAIL的抗腫瘤活性。因?yàn)镃0L0-205和HCT-15結(jié)腸癌都對TRAIL敏感(其中C0L0-205最為敏感)，我們在這兩個模型上評價(jià)單獨(dú)NGR-L-TRAIL對比TRAIL的治療效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4、6所示，NGR-L-TRAIL極其顯著地抑制腫瘤的生長，抑制腫瘤生長的效果明顯強(qiáng)于野生型TRAIL和RGD-L-TRAIL。在C0L0-205模型中，100微克/天劑量的NGR-L-TRAIL抑制腫瘤的生長的程度遠(yuǎn)大于100微克/天的野生型TRAIL (P <0.01) ； 100微克/天劑量的NGR-L-TRAIL抑制腫瘤生長的程度也大于100微克/天的RGD-L-TRAIL (P < O. 05);即使NGR-L-TRAIL劑量降低到野生型的1/5后(20微克/天)，抑制腫瘤生長效果優(yōu)于野生型TRAIL (100微克/天)(p
<O. 05) ；20微克/天劑量的NGR-L-TRAIL抑制腫瘤生長效果已經(jīng)將近于100微克/天劑量的RGD-L-TRAIL抑制腫瘤生長的效果(圖6)。HCT-15模型中，相同劑量處理下(400微克/天)，NGR-L-TRAIL比野生型TRAIL抑瘤效果好(P < O. 05)，也優(yōu)于 RGD-L-TRAIL (P < O. 05);當(dāng) NGR-L-TRAIL (80 微克 / 天)的給藥劑量降低到野生型TRAIL的1/5時，其抑瘤效果與野生型TRAIL(400微克/天)相當(dāng)(兩者之間沒有顯著性)(圖7)。80微克/天給藥劑量的NGR-L-TRAIL的抑瘤效果已經(jīng)接近于400微克/天的RGD-L-TRAIL的抑瘤效果。在治療過程中，NGR-L-TRAIL抑制腫瘤的生長具有劑量依賴性。以上結(jié)果表明將CNGRC肽與TRAIL融合后顯著性提高了 TRAIL的體內(nèi)抗腫瘤活性，不僅如此，NGR-L-TRAIL的抗腫瘤效果明顯強(qiáng)于RGD-L-TRAIL。本發(fā)明還探討了腫瘤靶向性TRAIL變體與化療藥物CPT-Il聯(lián)合使用的抗腫瘤效果。使用無胸腺裸鼠的C0L0-205、HCT-15和HT-29結(jié)腸癌模型來評價(jià)NGR-L-TRAIL與化療藥物CPT-Il聯(lián)合后在體內(nèi)的抗腫瘤效果。其中C0L0-205、HCT-15是TRAIL敏感型的，并且C0L0-205最為敏感，而HT-29是TRAIL不敏感型。NGR-L-TRAIL或TRAIL每天腹腔注射蛋白一次，共注射兩周，CPT-Il每兩天尾靜脈注射一次，共注射七次。在聯(lián)合給藥組中，對TRAIL敏感的C0L0-205腫瘤模型中，我們選擇一個相對低的CPT-Il劑量(6. 25毫克/每公斤/每次)聯(lián)合不同劑量的NGR-L-TRAIL (30或80微克/每天/每只)或TRAIL (270微克/每天/每只或90微克/每天/每只)；對TRAIL抵抗性的HT-29結(jié)腸癌模型中選擇相對較高劑量的CPT (25毫克/每公斤/每次)聯(lián)合NGR-L-TRAIL或TRAIL (400微克/每天
/每只)。C0L0-205模型中，30微克/天NGR-L-TRAIL聯(lián)合6. 25毫克/公斤/每次CPT-11組抑制腫瘤生長的程度遠(yuǎn)大于單獨(dú)的6. 25毫克/公斤/每次CPT-Il組(P < O. 01)，大于單獨(dú)的30微克/天NGR-L-TRAIL組(P < O. 05)，與270微克/天TRAIL聯(lián)合6. 25毫克/公斤/每次CPT-II組效果相當(dāng)，優(yōu)于90微克/天TRAIL聯(lián)合6. 25毫克/公斤/每次CPT-II組(P < O. 05)(圖 6)。HCT-15腫瘤模型中，80微克/天NGR-L-TRAIL聯(lián)合6. 25毫克/公斤/每次 CPT-Il組抑制腫瘤生長的程度大于單獨(dú)的6. 25毫克/公斤/每次CPT-Il或80微克/天NGR-L-TRAIL,并且好于400微克/天TRAIL組和400微克/天TRAIL聯(lián)合6. 25毫克/公斤/每次CPT-Il組(圖7)。值得一提的是，在400微克/每天/每只劑量NGR-L-TRAIL+CPT-11聯(lián)合治療組中，第28天后10只給藥小鼠中，有8只小鼠腫瘤消失；400微克/每天/每只TRAIL+CPT-11聯(lián)合治療組中10只動物中，有7只小鼠腫瘤消失(圖7B)。在TRAIL耐受的HT-29結(jié)腸癌模型中，單獨(dú)使用NGR-L-TRAIL時，即使在每天腹腔注射高達(dá)400微克/每只裸鼠的劑量下僅觀察到較弱的抗腫瘤效果。但是當(dāng)NGR-TRAIL+CPT-11聯(lián)合治療時，能夠顯著抑制腫瘤生長，并且比TRAIL+CPT-11聯(lián)合治療效果更好。400微克/天NGR-L-TRAIL聯(lián)合25毫克/公斤/天CPT-II組抑制腫瘤生長的程度最好，極優(yōu)于400微克/天NGR-L-TRAIL組(P < O. 01)，大于25毫克/公斤/天CPT-11 (p
<O. 05)組，同時也強(qiáng)于400微克/天TRAIL聯(lián)合25毫克/公斤/天CPT-II組(p < O. 05)。總之，在以上三種腫瘤模型中，聯(lián)合化療藥物CPT-Il后，NGR-L-TRAIL的抗腫瘤活性都比單獨(dú)使用NGR-L-TRAIL或CPT-Il治療效果強(qiáng)；并且NGR-L-TRAIL與CPT-Il的聯(lián)合使用效果比TRAIL與CPT-Il聯(lián)用的效果好。對TRAIL敏感的C0L0-205和HCT-15腫瘤，達(dá)到TRAIL相當(dāng)?shù)囊种颇[瘤效果，NGR-L-TRAIL的使用劑量分別只需要TRAIL的1/9 1/3和1/5 ;對TRIAL不敏感的HT-29腫瘤，相同劑量的NGR-L-TRAIL聯(lián)合CPT-Il組抗腫瘤效果優(yōu)于TRAIL與CPT-Il的聯(lián)合組。結(jié)果表明腫瘤靶向性變體蛋白NGR-L-TRAIL在與化療藥物CPT-Il聯(lián)用下，抗腫瘤活性比單獨(dú)使用顯著增強(qiáng)，并且抑制腫瘤的效果優(yōu)于野生型的TRIAL與化療藥物的聯(lián)用。不僅如此，聯(lián)合使用還擴(kuò)大了 TRAIL的應(yīng)用范圍，腫瘤靶向性變體蛋白可以更有效地抑制對于TRAIL不敏感的腫瘤(例如HT-29結(jié)腸癌)。體內(nèi)的動物模型進(jìn)一步證明了腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體NGR-L-TRAIL比野生型腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體、以及靶向于整合素α νβ 3、α νβ 5的TRAIL變體RGD-L-TRAIL具有更好的療效。這說明將腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體與靶向于CD13的腫瘤靶向肽融合后，確實(shí)能夠在動物腫瘤模型體內(nèi)水平提高其抗腫瘤生物活性。同樣，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體不僅在單獨(dú)使用時的藥效提高，在與化療藥物CPT-Il聯(lián)合使用時，其也具有明顯的協(xié)同效應(yīng)，療效更加顯著。將腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體與CPT-Il聯(lián)用治療，不僅可以降低各自的使用劑量，將潛在的全身性毒性最小化，而且可以擴(kuò)大應(yīng)用到原來對腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體不敏感的腫瘤治療(圖8)。體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)充分證明腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體的治療效果比腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體、甚至于整合素ανβ3、ανβ 5靶向的TRAIL變體RGD-L-TRAIL更為優(yōu)越。實(shí)施例7重組蛋白質(zhì)在腫瘤組織的藥物分布測試重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體及腫瘤靶向性變體NGR-TRAIL、以及RGD-L-TRAIL變體分別用放射性同位素125碘標(biāo)記試劑盒(Pierce公司)進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記結(jié)果=125I-腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體比活為7. 86 μ Ci/ μ g蛋白，125I-腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體比活為7. 49 μ Ci/μ g蛋白。裸鼠接種C0L0-205結(jié)腸癌后，當(dāng)腫瘤大小達(dá)到400至500立方毫米后隨機(jī)分組，分為野生型組和二種變體組，每組設(shè)五個時間點(diǎn)，分別為
5、30、60、120、240分鐘，每個時間點(diǎn)三只動物。每只荷瘤裸鼠注射100微升含有5微居的標(biāo)記蛋白質(zhì)。在各時間點(diǎn)，手術(shù)剝離小鼠腫瘤并稱重，在液閃記數(shù)儀上測定放射劑量。標(biāo)記蛋白質(zhì)在腫瘤組織的分布量為每克組織測定放射量與注射放射量的百分比ID/g)表 示。為了進(jìn)一步證實(shí)腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體在動物模型上抗腫瘤活性的增強(qiáng)是由于其能夠靶向富集到腫瘤組織，而且也為了進(jìn)一步比較NGR-L-TRAIL與RGD-L-TRAIL在體內(nèi)腫瘤動物模型上的靶向能力，我們檢測了用碘125同位素標(biāo)記的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體NGR-L-TRAIL和RGD-TRAIL、以及野生型TRAIL在腫瘤組織的分布。相同放射劑量的碘125標(biāo)記的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體及其變體分別注射到C0L0-205荷瘤裸鼠中，注射5、30、60、120和240分鐘后，手術(shù)剝離小鼠腫瘤組織并稱重，分別在液閃計(jì)數(shù)儀上測定同位素的劑量。結(jié)果顯示腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體TRAIL融合了⑶13的短肽配體CNGRC、以及α νβ 3和α Vβ 5整合素的短肽配體MDCRGDCFC肽后，明顯增強(qiáng)了 TRAIL蛋白靶向富集到C0L0-205腫瘤組織區(qū)域的能力，NGR-L-TRAIL能夠存在和特異性地富集在腫瘤組織中。注射初期，125I-RGd-L-TRAIL在腫瘤組織的分布約是125I-TRAIL的2倍、125I-NGR-L-TRAiL在腫瘤組織的分布約是125I-TRAIL的2. 5倍，NGR-L-TRAIL在C0L0-205腫瘤組織中的富集程度明顯比RGD-L-TRAIL高(圖9)。由于NGR-L-TRAIL和rgd-l-trail對腫瘤組織的親和力增強(qiáng)、在腫瘤組織中分布增加，大大減弱了其在循環(huán)血液中的清除速度，因此延長了其在腫瘤組織中的分布。注射240分鐘后，TRAIL在腫瘤組織中的分布基本已經(jīng)難以檢測到，但是仍然有相當(dāng)多的RGD-L-TRAIL持續(xù)分布在腫瘤區(qū)域(圖9)、而且此時腫瘤組織中NGR-L-TRAIL的含量為RGD-L-TRAIL的2倍。以上結(jié)果說明CNGRC肽與TRAIL融合后保持了 CNGRC肽跟血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合并抑制其增殖和誘導(dǎo)凋亡的生物學(xué)功能。因此，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體在動物體內(nèi)腫瘤組織區(qū)域分布的增多和在動物模型上觀察到其抗腫瘤活性的增強(qiáng)這兩個事實(shí)都充分證明了本專利發(fā)明的腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體NGR-L-TRAIL能夠賦予腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體非常好的、強(qiáng)于變體RGD-L-TRAIL的腫瘤靶向性，并且能夠降低用藥劑量，最終提高抗腫瘤效果。本發(fā)明首次證明CD13的配體是一個比目前在腫瘤早期診斷中廣泛應(yīng)用的整合素Integrin的RGD配體祀向性更好的腫瘤探針。實(shí)施例8重組蛋白質(zhì)在體內(nèi)與腫瘤組織的結(jié)合腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體及其腫瘤靶向性變體NGR-L-TRAIL、RGD-L-TRAIL變體、小牛血清白蛋白用綠色熒光素進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記的蛋白用凝膠分子篩S印hadex-G25除去游離的熒光素。腫瘤長至400至500立方毫米大小的荷瘤鼠經(jīng)尾靜脈注射500微克熒光素標(biāo)記的蛋白，注射30分鐘后、手術(shù)剝離小鼠腫瘤，制備腫瘤細(xì)胞單細(xì)胞懸浮液，生理鹽水洗數(shù)次，取6萬個進(jìn)行細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測，分析重組蛋白質(zhì)在腫瘤細(xì)胞表面的結(jié)合情況。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用社會科學(xué)數(shù)據(jù)包軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有的實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次，細(xì)胞凋亡和黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均標(biāo)準(zhǔn)差表示，腫瘤大小用標(biāo)準(zhǔn)誤表示。P值小于O. 05視為顯著性差異，小于O. 01視為極其顯著差異，分別用一個和兩個星號標(biāo)記。NGR-L-TRAIL在其它器官組織中的分布與TRAIL類似，并沒有在其它臟器中特異性聚集(圖10A、10B)。NGR-L-TRAIL在體內(nèi)的代謝主要通過腎臟排除體外(圖10B)。因此動物體內(nèi)腫瘤組織區(qū)域分布的增多和動物模型上觀察到抗腫瘤活性的增強(qiáng) 充分表明了我們設(shè)計(jì)分子中的NGR-L-TRAIL比RGD-TRAIL更優(yōu)越，能夠賦予TRAIL蛋白更好的靶向性，最終提高抗腫瘤效果。
權(quán)利要求
1.一種腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體，其特征是由CD13的配體肽段、連接肽、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體構(gòu)建而成的腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體融合蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體，其中所述連接肽為1-25個氨基酸殘基。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體，其特征是由一種帶有環(huán)狀結(jié)構(gòu)并含有NGR序列的短肽、連接肽、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體而組成的腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體融合蛋白質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體，其中所述連接肽為1-25個氨基酸殘基。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體，其中所述的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體是用聚乙二醇、脂肪酸化、重組加上抗體Fe片段或白蛋白等方法修飾的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體。
6.根據(jù)權(quán)利要求I或3所述的腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體的制備方法，其特征是通過人工合成或者基因克隆構(gòu)建腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體的編碼基因，利用常規(guī)基因工程方法實(shí)現(xiàn)該編碼基因的基因工程表達(dá)和分離純化。
7.根據(jù)權(quán)利要求I或3所述的腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體在大腸桿菌中可溶性表達(dá)的方法，其特征是權(quán)利要求I或3所述的腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體的大腸桿菌重組表達(dá)菌株在低溫下進(jìn)行培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)，其中低溫是指350C -10O。
8.一種腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體的分離純化方法，其特征是權(quán)利要求I或3所述的腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體通過離子交換層析和金屬親和層析獲得純化。
9.一種編碼選自腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體的cDNA，該cDNA帶有編碼⑶13配體和連接肽的連續(xù)序列。
10.一種包含權(quán)利要求6的cDNA的基因治療載體。
11.根據(jù)權(quán)利要求I或3或5所述的一種腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體在制備腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。
12.根據(jù)權(quán)利要求I或3或5所述的一種腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體在制備腫瘤治療藥物中與現(xiàn)有的腫瘤治療藥物和技術(shù)在腫瘤治療中的聯(lián)合應(yīng)用。
13.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的一種腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體cDNA及其基因治療載體在制備腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。
14.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的一種腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體cDNA及其基因治療載體在制備腫瘤治療藥物中與現(xiàn)有的腫瘤治療藥物和技術(shù)在腫瘤治療中的聯(lián)合應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬基因工程生物技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了一種腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體的設(shè)計(jì)、制備方法及其藥學(xué)應(yīng)用。該腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體是由CD13的配體、連接肽、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體組成融合蛋白質(zhì)，通過基因工程方法通過克隆構(gòu)建該變體的編碼基因、可溶性地重組表達(dá)和簡便地分離純化而生產(chǎn)。通過該腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體制備方法生產(chǎn)的變體具有很好的腫瘤組織靶向性，并且顯著增強(qiáng)的抗腫瘤效果，能夠降低獲得治療效果所需要的蛋白質(zhì)給藥劑量，提高其生物利用度，降低治療成本和克服腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體潛在的毒副作用。同時本發(fā)明中腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體的生產(chǎn)方法提供一種生產(chǎn)可溶性、高聚體形式含量的表達(dá)方法和簡便的分離純化工藝。
文檔編號C07K19/00GK102863537SQ201110187700
公開日2013年1月9日 申請日期2011年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月6日
發(fā)明者華子春, 曹林, 唐波 申請人:江蘇靶標(biāo)生物醫(yī)藥研究所有限公司, 常州南京大學(xué)高新技術(shù)研究院