專利名稱：篩查16SrI組植原體的芯片及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物信息學(xué)及生物檢疫鑒定技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及篩查16SrI組植原體的芯片及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
16SrI組為翠菊黃化組(Ca. Phytoplasma asteris)，組下分為11個(gè)亞組，目前 16SrI組是含有植原體種類最多的組，含有二百余個(gè)植原體株系，主要包括翠菊黃化植原體、洋蔥黃化植原體、馬鈴薯紫頂病植原體、苜蓿矮化植原體、草莓矮化植原體、泡桐叢枝植原體等。危害癥狀主要包括葉片黃化(yellowing)或變紅(reddening of leaves)、節(jié)間縮短(shortening of internodes), (stunt) ,/JnBf (little leaves)、|^^1貞±曾1胃帛致的叢枝(excessive proliferation of shoots resulting in a witches'broom)、變?nèi)~ (phyllody, leaf-like petals and sepals)、參錄變(virescence, excess ive greening of floral tissue)、花不育(sterile flowers)，韌皮部組織壞死(necrosis)、木本植物的枯梢(diehck)以及植株的生長衰退(decline)和死亡等。與其它16SrI組植原體相比，泡桐叢枝植原體在我國發(fā)生與分布范圍相對(duì)較廣。 六十年代之后，大規(guī)模泡桐人工造林運(yùn)動(dòng)的開展和全國規(guī)模的種苗調(diào)運(yùn)，泡桐叢枝病的發(fā)生和危害逐漸加重，目前除少數(shù)泡桐生長區(qū)外，各泡桐產(chǎn)區(qū)都普遍遭受此病的危害。在重病區(qū)的河南、山東、陜西等省區(qū)，苗期發(fā)病率為1-8 %，1-3年生幼樹發(fā)病率為5 % -10 %，3-5年中幼齡樹可達(dá)30-50%，10年生樹可達(dá)100%。此病害造成直接經(jīng)濟(jì)損失包括死苗和幼樹的死亡，成年樹干型差和材積的減少。據(jù)報(bào)道，1990年對(duì)河南、山東、陜西、河北、安徽、甘肅、江蘇和山西等省的調(diào)查顯示，全國叢枝病發(fā)生面積達(dá)88萬公頃，每年造成直接經(jīng)濟(jì)損失超過一億元。目前用于16SrI組植原體的檢測方法包括普通PCR、熒光PCR、電子顯微鏡技術(shù)、熒光顯微鏡等，該類方法存在特異性不強(qiáng)、步驟繁瑣等局限性，而且對(duì)于未知的、新發(fā)的植原體無法進(jìn)行檢測與監(jiān)測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種篩查16SrI組植原體的探針。本發(fā)明提供的篩查16SrI組植原體的探針，由5條探針組成，所述5條探針的核苷酸序列依次分別為序列表中的序列1-5。上述探針中，16SrI組植原體為草莓枝狀果植原體或泡桐叢枝植原體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種篩查16SrI組植原體的基因芯片。本發(fā)明提供的篩查16SrI組植原體的基因芯片，為將上述的探針固定在片基表面得到的基因芯片。在上述基因芯片中，所述片基為醛基化玻璃片基，在本發(fā)明的實(shí)施例中采用的是博奧生物有限公司晶芯 微陣列基片，產(chǎn)品目錄號(hào)420022。
在上述基因芯片中，所述16SrI組植原體為草莓枝狀果植原體或泡桐叢枝植原體。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種篩查16SrI組植原體的試劑盒。本發(fā)明提供的試劑盒，包括上述的基因芯片。在上述試劑盒中，還包括如下引物組所述引物組由如下引物對(duì)A-引物對(duì)D的4對(duì)引物對(duì)組成；所述引物對(duì)A由引物1和引物2組成；所述引物對(duì)B由引物3和引物4組成；所述引物對(duì)C由引物5和引物6組成；所述引物對(duì)D由引物7和引物8組成；所述引物1的核苷酸序列為序列表中的序列6 ；所述引物2的核苷酸序列為序列表中的序列7 ；所述引物3的核苷酸序列為序列表中的序列8 ；所述引物4的核苷酸序列為序列表中的序列9 ；所述引物5的核苷酸序列為序列表中的序列10 ；所述引物6的核苷酸序列為序列表中的序列11 ；所述引物7的核苷酸序列為序列表中的序列12 ；所述引物8的核苷酸序列為序列表中的序列13 ；上述試劑盒由上述的基因芯片和上述引物組組成。上述試劑盒中，所述16SrI組植原體為草莓枝狀果植原體或泡桐叢枝植原體。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種用于篩查16SrI組植原體的引物組。本發(fā)明提供的引物組，由如下引物對(duì)A-引物對(duì)D的4對(duì)引物對(duì)組成；所述弓丨物對(duì)A由引物1和引物2組成；所述弓丨物對(duì)B由引物3和引物4組成；所述弓丨物對(duì)C由引物5和引物6組成；所述弓丨物對(duì)D由引物7和引物8組成；所述引物1的核苷酸序列為序列表中的序列6 ；所述引物2的核苷酸序列為序列表中的序列7 ；所述引物3的核苷酸序列為序列表中的序列8 ；所述引物4的核苷酸序列為序列表中的序列9 ；所述引物5的核苷酸序列為序列表中的序列10 ；所述引物6的核苷酸序列為序列表中的序列11 ；所述引物7的核苷酸序列為序列表中的序列12 ；所述引物8的核苷酸序列為序列表中的序列13 ；所述16SrI組植原體具體為草莓枝狀果植原體或泡桐叢枝植原體。本發(fā)明還提供一種用于篩查16SrI組植原體的PCR試劑。本發(fā)明提供的PCR試劑，由上述的引物組、dNTP、PCR緩沖液和聚合酶組成。上述PCR試劑中，上述引物組中的各條引物在所述PCR試劑中的濃度均為 0.2mmol/L。
所述16SrI組植原體具體為草莓枝狀果植原體或泡桐叢枝植原體。上述探針、上述基因芯片、上述的試劑盒、上述的引物組或上述的PCR試劑在鑒定或輔助鑒定16SrI組植原中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述探針、上述基因芯片、上述的試劑盒、上述的引物組或上述的PCR試劑在制備鑒定或輔助鑒定16SrI組植原產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述16SrI組植原體具體為草莓枝狀果植原體或泡桐叢枝植原體。本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種篩查或輔助篩查待測樣品感染16SrI組植原體的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟1)將待測樣品的基因組DNA進(jìn)行標(biāo)記，得到標(biāo)記后產(chǎn)物；2)將步驟1)得到的標(biāo)記后產(chǎn)物與上述的基因芯片進(jìn)行雜交，得到雜交后芯片；2)將步驟1)得到的雜交后芯片掃描；若所述基因芯片上至少一條所述探針的信號(hào)絕對(duì)值大于5000且信噪比大于3. 0， 則待測樣品感染或候選感染16SrI組植原體。所述至少一條所述探針為5條探針。在上述方法中，步驟1)中，所述標(biāo)記為以待測樣品的基因組DNA為模板，以上述引物組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到標(biāo)記后產(chǎn)物；在上述方法中，步驟2)中，所述雜交的溫度為42°C，所述雜交的時(shí)間為12h。在上述方法中，在所述步驟2、后和步驟幻前還包括將所述雜交后芯片進(jìn)行洗滌的步驟。在上述方法中，所述16SrI組植原體具體為草莓枝狀果植原體或泡桐叢枝植原體。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的篩查16SrI組植原體的芯片中的探針具有 16SrI組植原體組水平上的高兼容性和植原體組內(nèi)的特異性，數(shù)小時(shí)內(nèi)完成對(duì)待檢樣品中可能存在的新發(fā)植原體的篩查，所需的樣品量極少，一般僅需0. lg。另外數(shù)據(jù)的分析與計(jì)算機(jī)圖像處理軟件相結(jié)合，達(dá)到分析結(jié)果能夠直觀化、可視化。本發(fā)明采用生物信息學(xué)方法對(duì) 16SrI組植原體的16S rDNA、16S_23S rDNA spacer、imp、tuf核苷酸序列進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)了該組的兼容性探針，標(biāo)準(zhǔn)植原體樣品驗(yàn)證結(jié)果證明探針效果良好。本發(fā)明的篩查16SrI組植原體的芯片可用于16SrI組植原體的檢疫鑒定。


圖1為16SrI組植原體篩查芯片探針點(diǎn)陣示意圖(5X6)圖2為應(yīng)用草莓枝狀果植原體標(biāo)準(zhǔn)樣品驗(yàn)證16SrI組植原體篩查芯片的結(jié)果圖3為應(yīng)用泡桐叢枝植原體標(biāo)準(zhǔn)樣品驗(yàn)證16SrI組植原體篩查芯片的結(jié)果圖4為篩查芯片靈敏度檢測結(jié)果圖5為PCR靈敏度檢測結(jié)果
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、篩查16SrI組植原體的芯片的制備1、組級(jí)高兼容性寡核苷酸探針的設(shè)計(jì)1)從美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)及核糖體數(shù)據(jù)庫項(xiàng)目官方網(wǎng)站(RDP)數(shù)據(jù)庫下載16SrI組植原體全基因組及核酸序列數(shù)據(jù)用于設(shè)計(jì)探針。2)整理植原體核酸序列，去除小于200bp長度的核酸序列并分組；同一組內(nèi)所有植原體序列簡稱為組內(nèi)序列，非本組的所有植原體序列簡稱為組外序列。3)使用ClusterW聯(lián)配組內(nèi)序列，尋找序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)探針。探針設(shè)計(jì)時(shí)在序列保守區(qū)域內(nèi)以2 3個(gè)堿基作為間隔，連續(xù)提取所有19bp的核酸序列，對(duì)選取的核酸序列進(jìn)行篩選，標(biāo)準(zhǔn)為GC含量在40%及60%之間，沒有大于!3bp的連續(xù)重復(fù)堿基，以及不會(huì)形成大于:3bp的發(fā)卡結(jié)構(gòu)。4)使用自編程序?qū)⑼ㄟ^步驟幻篩選的探針序列與組外序列聯(lián)配，程序計(jì)算二級(jí)結(jié)構(gòu)的自由能、MMPD(The distance of the mismatch in the middle position)、最長相同片段等條件進(jìn)行綜合打分，棄用高于模擬雜交標(biāo)準(zhǔn)分的探針。5)使用自編程序?qū)⑼ㄟ^步驟4)篩選的探針序列與組內(nèi)序列進(jìn)行比對(duì)，程序計(jì)算打分，棄用低于模擬雜交標(biāo)準(zhǔn)分的探針。6)使用BLASTN將通過步驟5)篩選得到的探針序列與步驟2)得到的特異性數(shù)據(jù)庫進(jìn)行特異性比對(duì)，Word size設(shè)為7，篩選標(biāo)準(zhǔn)為Max Score小于15分，并且無7bp以上的相同片段7)對(duì)于剩余的每一條探針進(jìn)行排序，排序標(biāo)準(zhǔn)依次為探針對(duì)組內(nèi)序列模擬雜交總分、探針對(duì)組外序列模擬雜交總分及探針對(duì)特異性數(shù)據(jù)庫的BlastN Max Score總分，取排名前兩名的兩條探針為組特異性探針。8)如果經(jīng)過步驟7)無法達(dá)到每組至少2個(gè)探針對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)，則在步驟3)降低序列保守性標(biāo)準(zhǔn)，重新設(shè)計(jì)，依此循環(huán)直到所有16SrI組序列都有2個(gè)探針對(duì)應(yīng)。如果無法從保守區(qū)域設(shè)計(jì)探針，或16SrI組內(nèi)序列無保守區(qū)域，則使用所有16SrI組全長序列設(shè)計(jì)探針。探針設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)與步驟幻到步驟7)相同。根據(jù)上述原則設(shè)計(jì)了 16S rDNA區(qū)域的1條探針(探針1)、tuf的2條探針(探針 57和探針58)、16S-23S rDNA spacer的1條探針(探針73)、及imp基因的1條探針(探針76)，其核苷酸序列分別依次為序列表中的序列1、2、3、4、5所示?？梢匀斯ず铣缮鲜?條探針。2、芯片的制備將上述1得到的5條探針用點(diǎn)樣緩沖液(博奧生物有限公司晶芯 芯片點(diǎn)樣液，產(chǎn)品目錄號(hào)440010)溶解，濃度為50 μ Μ,每條探針橫向重復(fù)3點(diǎn)點(diǎn)在醛基化玻璃片基芯片 (博奧生物有限公司晶芯 微陣列基片，產(chǎn)品目錄號(hào)420022)上，每點(diǎn)約0. 25nL,點(diǎn)直徑約 180 μ m，點(diǎn)間距為300 μ m，點(diǎn)樣均勻度的標(biāo)準(zhǔn)方差為15%。將芯片點(diǎn)有探針的一面在65°C 水浴鍋上水合10s，芯片距水面距離為3cm，在空氣中室溫自然干燥，在進(jìn)行一次水合。將點(diǎn)有探針的一面向上，放在紫外交聯(lián)儀中250mJ交聯(lián)。將芯片放在42°C預(yù)熱，0. 5% SDS清洗lOmin。將芯片轉(zhuǎn)移到42°C預(yù)熱蒸餾水中清洗aiiin。把芯片放在50ml錐形離心管中， 2000rpm離心lmin，以去除芯片表面的液體，獲得篩查16SrI組植原體的芯片。
篩查16SrI組植原體的芯片如圖1所示，圖1中1、57、58、73、76為16SrI組植原體篩查芯片探針1、57、58、73、76(對(duì)應(yīng)序列1_5)，Hex為芯片固定陽性質(zhì)控，PC為雜交陽性質(zhì)控，NC為雜交陰性質(zhì)控。實(shí)施例2、篩查16SrI組植原體的芯片的應(yīng)用一、篩查16SrI組植原體的芯片檢測樣品1、用于檢測的樣品總DNA提取1)取感染草莓枝狀果植原體的草莓葉片(拉丁名=Strawberry Phylloid Fruit Phytoplasma, id^ci :Molecular Identification and Classification of Strawberry Phylloid Fruit Phytoplasma in Group 16SrI, New Subgroup.Plant disease,2002, 86(8) :920.，公眾可從中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院獲得。)和感染泡桐叢枝植原體的泡桐葉片(拉丁名Paulownia witches' broom phytoplasma.記載在泡桐叢枝植原體抗原膜蛋白抗血清的制備及應(yīng)用，植物病理學(xué)報(bào)，2011,41 ) :161-170.)各0. lg，取適量液氮研磨， 再加入研磨液2ml充分研磨，4°C 20000rpm離心20min，棄上清。2)加入ImlDNA提取液，40ul蛋白酶K(5mg/ml)，輕輕混勻，加入160ul 10%十二烷肌氨酸鈉，混勻，在55°C溫育1 2小時(shí)，期間不斷的顛倒混勻，4°C 6000rpm, IOmin,取上清。3)加入2/3體積異丙醇到上清液中，輕混勻，-20°C保持至少30min，4°C 12000rpm, 15分鐘，棄上清。4)加入600ul帶有RNase的水液，加入30ulSDS，12ul蛋白酶K，輕輕徹底混勻， 37°C溫育60分鐘。5)加IOOul 5M NaCl混勻，再加入84ulCTAB/NaCl溶液混勻，65°C溫育10分鐘。6)加入等體積苯酚氯仿異戊醇05 24 1)混勻，4°C 12000rpm，10分鐘，
重復(fù)直至無中間白色層。7)上層水相加入等體積氯仿異戊醇04 1)，混勻，4°C 12000rpm，10分鐘。8)上清液加入2/3體積異丙醇，混勻，_20°C保持至少30分鐘，4°C 12000rpm, 10分
鐘，棄上清液。9)加入Iml 70%乙醇12000rpm離心1分鐘。洗滌兩次。加入30ul TE混勻溶解， 分別得到草莓枝狀果植原體基因組DNA和泡桐叢枝植原體基因組DNA。2、樣品標(biāo)記與雜交標(biāo)記體系為20 μ L，即在每個(gè)0. 2mL的反應(yīng)管中加入2μ L上述1得到的基因組 DNA、上游引物0. 2 μ L (終濃度為0. 2mmol/L)、下游引物0. 2 μ L (終濃度為0. 2mmol/L，5’端 TAMARA 標(biāo)記)、dNTP Mix (10mmol/L) 1· 6 μ L、LA-Taq 酶 0· 5 μ L、10 X Buffer (Mg2+) 2 μ L 及 DEPC-H20 13.5 μ L0上下游引物由分別用于擴(kuò)增包括16S rDNA、16S-23S rDNA spacer、imp及tuf探針序列的引物對(duì)組成，上述用于擴(kuò)增16S rDNA的引物對(duì)由序列表中的序列6和序列表中的序列7組成；上述用于擴(kuò)增16S-23S rDNA spacer的引物對(duì)由序列表中的序列8和序列表中的序列9組成；上述用于擴(kuò)增imp的引物對(duì)由序列表中的序列10和序列表中的序列11組成；
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上述用于擴(kuò)增tuf的引物對(duì)由序列表中的序列12和序列表中的序列13組成。PCR 反應(yīng)程序-MV 5min ；94°C 30sec，60°C 30sec，72°C Imin 30sec, 35cycles ； 72°C IOmin。雜交雜交液包括2. 4μ L 3XSSC.0. 32 μ L 0. 2% SDS、4 μ L25% 甲酰胺、0. 32 μ L 外標(biāo)、1. 6 μ L5XDenhard，s及標(biāo)記樣品7. 36 μ L ；95°C變性3min,冰浴5min,瞬時(shí)離心；將雜交液加到由實(shí)施例1得到的16SrI組植原體篩查芯片上，蓋薄片蓋好，42°C水浴雜交過夜 (12h)。分別得到雜交后的芯片(草莓枝狀果植原體)和雜交后的芯片(泡桐叢枝植原體)。3、洗滌、掃描清洗體系及程序如下
洗液I洗液II
洗液組分(最終濃度)2xSSC, 0.2%SDS 0.2xSSC
清洗溫度42。C42 V
清洗時(shí)間4min4min先將洗液I、II放在微波爐中預(yù)熱到42V，轉(zhuǎn)移到清洗盒中。雜交結(jié)束后，將雜交后的芯片轉(zhuǎn)移到盛放洗液的清洗盒中，雜交面向上，放在水平搖床上緩慢清洗。芯片清洗后，放在50ml錐形離心管中，2000rpm離心lmin，除去芯片表面的液體，分別得到待檢測芯片(草莓枝狀果植原體)、待檢測芯片(泡桐叢枝植原體)。將上述待檢測芯片(草莓枝狀果植原體)、待檢測芯片(泡桐叢枝植原體)置于掃描儀中進(jìn)行掃描分析；PMT設(shè)為900，獲得各點(diǎn)熒光強(qiáng)度、背景強(qiáng)度等數(shù)據(jù)。使用博奧生物開發(fā)的LuxScan 3. 0從掃描的芯片中提取數(shù)據(jù)，探針的信號(hào)值為探針前景值的中位值減去背景值的中位值。信噪比為圖像對(duì)應(yīng)點(diǎn)內(nèi)所有信號(hào)值中位值與背景值中位值的比值。若至少一條所述探針的信號(hào)絕對(duì)值均大于5000且信噪比均大于3. 0，判為陽性 (為16SrI組植原體感染)；探針的信號(hào)絕對(duì)值均小于5000且信噪比均小于2. 0，判為陰性 (不為16SrI組植原體感染)；如果信號(hào)模糊且信噪比介于2. 0和3. 0之間，判為可疑，實(shí)驗(yàn)
需重復(fù)驗(yàn)證。圖2、圖3的探針排列與圖1相同，陽性探針均為1、57、58、73、76。草莓枝狀果植原體的結(jié)果如圖2所示，探針1、57、58、73、76所在位置的信號(hào)絕對(duì)值均為7000 ；且信噪比均為4，說明本發(fā)明可以檢測16SrI組植原體的草莓枝狀果植原體；泡桐叢枝植原體的結(jié)果如圖3所示，探針1、57、58、73、76所在位置的信號(hào)絕對(duì)值均為7500 ；且信噪比均為4. 5，說明本發(fā)明可以檢測16SrI組植原體的泡桐叢枝植原體；上述芯片的固定陽性質(zhì)控、雜交陽性質(zhì)控及雜交陰性質(zhì)控表現(xiàn)良好，標(biāo)準(zhǔn)樣品雜交信號(hào)強(qiáng)而無背景噪音，說明設(shè)計(jì)的探針及建立的芯片篩查程序具有良好的工作效果。二、篩查16SrI組植原體芯片與PCR檢測靈敏度比較準(zhǔn)確稱取0. Ig泡桐叢枝植原體侵染的泡桐葉片，提取基因組DNA，分別用于16SrI
組植原體篩查芯片檢測和PCR檢測，兩者所用的DNA均進(jìn)行5°、5人5_2、5_3和5_4倍梯度稀釋。芯片檢測的方法同上述的一，芯片檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，圖4的探針排列與圖1相同，其中A :5_2稀釋；B 5_3稀釋；C :5_4稀釋；可以看出，16SrI組植原體篩查芯片可檢測到待檢對(duì)象的最高稀釋倍數(shù)為54。PCR檢測的引物為上游引物5，-CCTGTTAACTGGCTTTCTCCTA-3，；下游引物5，-GGAGGTTTTTGGCATTATCG-3，。PCR檢測的結(jié)果如圖5所示，1 :5°稀釋；2斤1稀釋；3 :5_2稀釋；4 :5_3稀釋；5 5-4稀釋；M =Marker DL2000，可以看出，均得到34Ibp的產(chǎn)物(Genbank號(hào)NC 005303的第 688569-688909位核苷酸)，待檢對(duì)象的最高稀釋倍數(shù)為53。因此，16SrI組植原體篩查芯片檢測靈敏度比PCR方法高5倍。
權(quán)利要求
1.一種篩查16SrI組植原體的探針，由5條探針組成，所述5條探針的核苷酸序列依次分別為序列表中的序列1-5。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的探針，其特征在于所述16SrI組植原體為草莓枝狀果植原體或泡桐叢枝植原體。
3.—種篩查16SrI組植原體的基因芯片，為將權(quán)利要求1或2所述的探針固定在片基表面得到的基因芯片。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因芯片，其特征在于所述片基為醛基化玻璃片基；所述 16SrI組植原體為草莓枝狀果植原體或泡桐叢枝植原體。
5.一種篩查16SrI組植原體的試劑盒，包括權(quán)利要求3或4所述的基因芯片。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括如下引物組 所述引物組由如下引物對(duì)A-引物對(duì)D的4對(duì)引物對(duì)組成；所述引物對(duì)A由引物1和引物2組成；所述引物對(duì)B由引物3和引物4組成；所述引物對(duì)C由引物5和引物6組成；所述引物對(duì)D由引物7和引物8組成；所述引物1的核苷酸序列為序列表中的序列6 ；所述引物2的核苷酸序列為序列表中的序列7 ；所述引物3的核苷酸序列為序列表中的序列8 ；所述引物4的核苷酸序列為序列表中的序列9 ；所述引物5的核苷酸序列為序列表中的序列10 ；所述引物6的核苷酸序列為序列表中的序列11 ；所述引物7的核苷酸序列為序列表中的序列12 ；所述引物8的核苷酸序列為序列表中的序列13 ；所述試劑盒由權(quán)利要求3或4所述的基因芯片和所述引物組組成；所述16SrI組植原體為草莓枝狀果植原體或泡桐叢枝植原體。
7.一種用于篩查16SrI組植原體的引物組，由如下引物對(duì)A-引物對(duì)D的4對(duì)引物對(duì)組成；所述引物對(duì)A由引物1和引物2組成； 所述引物對(duì)B由引物3和引物4組成； 所述引物對(duì)C由引物5和引物6組成； 所述引物對(duì)D由引物7和引物8組成； 所述引物1的核苷酸序列為序列表中的序列6 ； 所述引物2的核苷酸序列為序列表中的序列7 ； 所述引物3的核苷酸序列為序列表中的序列8 ； 所述引物4的核苷酸序列為序列表中的序列9 ； 所述引物5的核苷酸序列為序列表中的序列10 ； 所述引物6的核苷酸序列為序列表中的序列11 ； 所述引物7的核苷酸序列為序列表中的序列12 ； 所述引物8的核苷酸序列為序列表中的序列13 ；所述16SrI組植原體具體為草莓枝狀果植原體或泡桐叢枝植原體。
8.權(quán)利要求1或2所述探針、權(quán)利要求3或4所述的基因芯片、權(quán)利要求5或6所述的試劑盒或權(quán)利要求7所述的引物組在鑒定或輔助鑒定16SrI組植原中的應(yīng)用；或權(quán)利要求1或2所述探針、權(quán)利要求3或4所述的基因芯片、權(quán)利要求5或6所述的試劑盒或權(quán)利要求7所述的引物組在制備鑒定或輔助鑒定16SrI組植原產(chǎn)品中的應(yīng)用； 所述16SrI組植原體具體為草莓枝狀果植原體或泡桐叢枝植原體。
9.一種篩查或輔助篩查待測樣品感染16SrI組植原體的方法，包括如下步驟1)將待測樣品的基因組DNA進(jìn)行標(biāo)記，得到標(biāo)記后產(chǎn)物；2)將步驟1)得到的標(biāo)記后產(chǎn)物與權(quán)利要求3或4所述的基因芯片進(jìn)行雜交，得到雜交后芯片；2)將步驟1)得到的雜交后芯片掃描，若所述基因芯片上至少一條所述探針的信號(hào)絕對(duì)值大于5000且信噪比大于3. 0，則待測樣品感染或候選感染16SrI組植原體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于步驟1)中，所述標(biāo)記為以待測樣品的基因組DNA為模板，以權(quán)利要求5或6所述的試劑盒或權(quán)利要求7所述的引物組中的引物組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到標(biāo)記后產(chǎn)物； 步驟幻中，所述雜交的溫度為42°C，所述雜交的時(shí)間為12h; 在所述步驟幻后和步驟幻前還包括將所述雜交后芯片進(jìn)行洗滌的步驟； 所述16SrI組植原體具體為草莓枝狀果植原體或泡桐叢枝植原體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種篩查16SrI組植原體的芯片及其應(yīng)用。本發(fā)明的的篩查16SrI組植原體的探針，由5條探針組成，所述5條探針的核苷酸序列依次分別為序列表中的序列1-5。還提供了篩查16SrI組植原體的基因芯片，為將上述的探針固定在芯片表面得到的基因芯片。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明采用生物信息學(xué)方法對(duì)16SrI組植原體的16S rDNA、16S-23S rDNA spacer、imp、tuf核苷酸序列進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)了該組的兼容性探針，標(biāo)準(zhǔn)植原體樣品驗(yàn)證結(jié)果證明探針效果良好。本發(fā)明的篩查16SrI組植原體的芯片可用于16SrI組植原體的檢疫鑒定。
文檔編號(hào)C40B40/06GK102492773SQ20111040276
公開日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2011年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月7日
發(fā)明者張永江, 朱水芳, 牟海清, 趙文軍 申請(qǐng)人:中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院