專利名稱:非a和非b肝炎病毒的診斷及疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種用于控制非A和非B肝炎病毒(NANBA)感染蔓延的物質(zhì)和方法、更具體地說,它涉及一些針對非A和非B(NANB)肝炎,亦即肝炎C病毒的病原體的診斷性DNA片段、診斷性蛋白、診斷性抗體、以及保護(hù)性抗原和抗體。
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非A和非B肝炎(NANBH)是一種傳染性疾病或疾病族,這類疾病被認(rèn)為是由病毒引起的,并可與其他類型的與病毒相關(guān)的肝臟疾病相區(qū)別,后者包括由已知的肝炎病毒即肝炎A病毒(HAV)、肝炎B病毒(HBV)、和δ肝炎病毒(HDV)引起的疾病,以及由巨細(xì)胞病毒(CMV)或EB病毒(EBV)引起的肝炎。NANBH首先是在輸血后的個(gè)體中發(fā)現(xiàn)的。從人傳播給黑猩猩,以及在黑猩猩中的連續(xù)傳代證明,NANBH系由可傳播的傳染性病毒所致。但是,依然未能鑒別出引起NANBH的傳染性病毒,而且亦不知道引起該疾病的病毒數(shù)。
流行病學(xué)的資料表明,可能存在三種NANBH水傳播的流行型;與血或?qū)ο嚓P(guān)的類型;以及偶爾發(fā)生(已成習(xí)慣的群居)型。但是可引起NANBH的病毒數(shù)仍不清楚。
通過排除其他病毒標(biāo)記的方法已初步完成了NANBH的臨床診斷和鑒別。用于檢測推想的NANBV抗原和抗體的方法有瓊脂-凝膠擴(kuò)散、反向免疫電泳、免疫熒光顯微鏡檢查、免疫電子顯微鏡檢查、放射免疫測定和酶聯(lián)免疫吸收試驗(yàn)。然而,這些測定方法用于NANBN的診斷均無足夠的靈敏度、特效性和重現(xiàn)性。
至此,對與NANBH病毒有關(guān)的抗原抗體系統(tǒng)的特征或特性既不清楚,又缺乏一致的看法。這至少部分是由于(1)HBVDNA結(jié)合到肝細(xì)胞的基因組中;以及(2)在個(gè)體中用NANBV先于HBV感染或兩者合發(fā)感染;和(3)與HBV有關(guān)的可溶性和顆粒性抗原的已知的復(fù)雜性。另外,既有可能NANBH被誤診,也有可能NANBH是由一種以上的傳染性病毒引起的。而且,尚不清楚在感染NANBH的病人血清中,血清測定是檢測什么。有人假設(shè),瓊脂凝膠擴(kuò)散和反向免疫電泳測定系檢測自體免疫應(yīng)答或有時(shí)在血清試樣之間發(fā)生的非特異性蛋白相互作用,這種作用并不代表特異的NANBV抗原-抗體反應(yīng)。免疫熒光法、酶聯(lián)免疫吸收試驗(yàn)和放射免疫測定似乎是檢測低水平的類風(fēng)濕因子狀物質(zhì),這種物質(zhì)通常出現(xiàn)在患有其他肝病和非肝病患者的血清中,以及在患有NANBH患者的血清中。所測得的某些反應(yīng)性可以代表抗宿主-決定的細(xì)胞質(zhì)抗原的抗體。
有一些可供選擇的NANBV[例如可參見下列作者的綜述Prince(1983),F(xiàn)einstoneandHoofnagle(1984),andOverby(1985,1986,1987),以及Iwarson(1987)的文章]。然而,尚無資料證明這些可供選擇者中的某一個(gè)代表著NANBH的病原體。
需要有靈敏和特效的方法來篩選和鑒別NANBV載體,以及被NANBV污染的血或血制品是至關(guān)重要的。輸血后的病人中約有10%發(fā)生輸血后的肝炎(PTH),而其中NANBH占高達(dá)90%的比例。這一疾病的主要問題是向慢性肝損傷的不斷發(fā)展(25-55%)。
預(yù)防NANBH通過血液和血制品,或通過接近的個(gè)體接觸進(jìn)行傳染,以及對病人的護(hù)理均需要有可靠的診斷和預(yù)測手段,來檢測與NANBV相關(guān)的核酸、抗原和抗體。此外,還需要有有效的疫苗和免疫治療的治療劑來預(yù)防和/或治療此種疾病。
本發(fā)明涉及一種新發(fā)現(xiàn)的NANBH病原體,肝炎C病毒(HCV)的分離和特性鑒別。更具體地說,本發(fā)明提供了部分HCV基因組的互補(bǔ)DNA(cDNA)復(fù)制體族。這些cDNA復(fù)制體通過某種技術(shù)進(jìn)行分離,該技術(shù)包括一個(gè)新穎的步驟,即從NANBH病人的血清所感染的組織中的顆粒體所產(chǎn)生的cDNA庫中篩選表達(dá)產(chǎn)物,以檢測從迄今為止未分離和未鑒別的病毒體的基因組和所選克隆的基因組中衍生得到的新合成的抗原,它產(chǎn)生僅與感染個(gè)體(與非感染個(gè)體相比)的血清發(fā)生免疫反應(yīng)的產(chǎn)物。
利用以HCVcDNA得到的探針,以及在HCVcDNA內(nèi)所得的順序信息對HCV基因組性質(zhì)的研究表明,HCV是黃熱病病毒或類似黃熱病的病毒。
部分從HCV中得到的cDNA順序可用作探針,以檢測試樣中病毒的存在與否,并分離該病毒天然存在的變異體。這些cDNA也使得編碼在HCV基因組中的HCV抗原的多肽順序可供利用,并可產(chǎn)生多肽,后者可用作診斷檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)或試劑,和/或作為疫苗的組分。直接抗包含在這些多肽順序中的HCV表位的多克隆和單克隆抗體也可作為治療劑而用于診斷檢驗(yàn)中,用于篩選抗病毒體,以及用于分離產(chǎn)生這些cDNA的NANBV體。此外,利用從這些cDNA中所得的探針,可以分離和定序HCV基因組的其他部分,由此產(chǎn)生可用于診斷和/或處理(包括預(yù)防和治療)NANBH的其他探針和多肽。
因此,有關(guān)于多核苷酸,本發(fā)明的某些方面是純化的HCV多核苷酸,重組HCV多核苷酸,含有從HCV基因組或從HCVcDNA衍生得到的順序的重組多核苷酸,編碼HCV表位的重組多核苷酸,含有上述任何重組多核苷酸的重組載體,以及用這些載體中任一個(gè)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的另一方面是(1)重組表達(dá)系統(tǒng),它含有從HCV基因組或HCVcDNA衍生得到的DNA的開放讀碼(ORF),其中ORF可操縱地連接到與所需宿主可相容的控制順序中;(2)用重組表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞;和(3)由轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生的多肽。
本發(fā)明的再一方面是純化HCV;從純化HCV所得的多肽制劑;純化HCV多肽;以及純化多肽,后者含有在免疫學(xué)上可看作與HCV中所含的表位相同的表位。
本發(fā)明的又一方面是重組HCV多肽;含有從HCV基因組或從HCVcDNA中衍生所得順序的重組多肽;含有HCV表位的重組多肽;以及由HCV多肽組成的融合多肽。
本發(fā)明的又一方面是一種直接抗HCV表位的單克隆抗體和直接抗HCV表位的多克隆抗體的純化制劑。
本發(fā)明的又一方面是一種對HCV感染致免疫的顆粒,后者包括一個(gè)具有氨基酸順序的非HCV多肽和一個(gè)HCV表位,當(dāng)所說的氨基酸順序在真核宿主中產(chǎn)生時(shí),則該順序能形成一種顆粒。
本發(fā)明的又一方面是一種對于HCV的多核苷酸探針。
本發(fā)明涉及藥盒(kit)的方面為分析由HCV衍化的多核苷酸的樣品,包括含有來源于HCV的8個(gè)或更多的核苷酸的多核苷酸探針,在合適的容器中對包括針對于HCV抗原的抗體的用于測試HCV抗原存在的分析樣品進(jìn)行檢測。在合適的容器,對包括含有一種存在于HCV抗原上的表位上的多肽的針對HCV抗原的抗體的存在進(jìn)行分析的分析樣品進(jìn)行檢測。
本發(fā)明的其他方面還有附著于固體底物的多肽包括一個(gè)HCV表位;及附著于固態(tài)底物的HCV表位的抗體。
本發(fā)明還包括一種產(chǎn)生含有HCV表位的多肽的方法,包括在允許該多肽表達(dá)的條件下,對用含有一個(gè)編碼包括HCV表位的多肽的順序的表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng);以及用此方法產(chǎn)生的含有HCV表位的多肽。
本發(fā)明也包括另一種方法,用以檢測樣品中的HCV核酸,包括在探針和樣品中的HCV核酸之間形成多核苷酸復(fù)合體的條件下,用HCV多核苷酸的探針對核酸進(jìn)行處理;并且檢測含有探針的多核苷酸復(fù)合體。
本發(fā)明還采用免疫測試法。涉及一種檢測HCV抗原的免疫測試法,包括在抗原-抗體復(fù)合物形成所允許的條件下,將懷疑含有HCV抗原的樣品與針對于欲檢測的HCV抗原的探針抗體一起培養(yǎng);并對含有探針抗體的抗原抗體復(fù)合物進(jìn)行檢測。一種用于檢測針對于HCV抗原的抗體的免疫測試法包括在抗體-抗原形成復(fù)合物所允許的條件下,將懷疑含有抗-HCV抗體的樣品與含有HCV表位的探針多肽一起培養(yǎng);并且對含有探針抗原的抗體-抗原復(fù)合物進(jìn)行檢測。
本發(fā)明還涉及用于治療HCV感染的疫苗,包括一個(gè)含有HCV表位的致免疫的肽,或?yàn)镠CV的滅活制劑,或HCV的減毒的制劑。
本發(fā)明另一方面還涉及一種用HCV感染的組織培養(yǎng)生長細(xì)胞。
本發(fā)明還包括一種產(chǎn)生抗體HCV的抗體的方法,包括將含有在數(shù)量上足以引起免疫響應(yīng)的分離的致免疫多肽施用于個(gè)體。
本發(fā)明另外還包括一種將衍化自未確定的感染原的基因組的cDNA分離的方法,包括(a)提供用含有被感染劑感染的組織中分離的核酸得到的cDNA基因庫的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞,隨后在cDNA編碼的多肽得以表達(dá)所允許的條件下使該宿主細(xì)胞生長;(b)將該cDNA的表達(dá)產(chǎn)物與含有被該感染劑感染的個(gè)體的驅(qū)體組成部分的抗體,在允許免疫反應(yīng)的條件上下進(jìn)行相互作用,并對相互作用而產(chǎn)生的抗體-抗原復(fù)合物進(jìn)行檢測;(c)使表達(dá)在步驟(b)中形成抗體-抗原復(fù)合物的多肽的宿主細(xì)胞在允許作為個(gè)體克隆的細(xì)胞生長的條件下生長,并分離這些克隆;(d)在允許在cDNA內(nèi)編碼的多肽表達(dá)的條件下,使得自(c)的克隆的細(xì)胞生長,隨后將表達(dá)產(chǎn)物與含有不同于步驟(a)的個(gè)體(該個(gè)體被用感染劑,或?yàn)槲唇?jīng)感染劑感染的對照個(gè)體)的驅(qū)體組成部分的抗體進(jìn)行作用,接著對作為作用結(jié)果而形成的抗體-抗原復(fù)合物進(jìn)行檢測;(e)使表位與抗體(該抗體含有被感染的,以及懷疑正被感染的個(gè)體的驅(qū)體組成部分,但不包括那些對照個(gè)體的組分)形成抗體-抗原復(fù)合物的多肽的細(xì)胞,在允許個(gè)體克隆生長的條件下,使之生長,并分離這些克隆;以及(f)從(e)的宿主克隆細(xì)胞中分離cDNA。
附圖簡要說明
圖1表示插入在克隆5-1-1中的HCVcDNA的雙鏈核苷酸順序,以及編碼在其內(nèi)的多肽的推測氨基酸順序。
圖2表示在克隆5-1-1,81,1-2和91中重疊HCVcDNA順序的同源性。
圖3表示從重疊克隆81,1-2和91中所得的HCVcDNA的復(fù)合順序,以及其內(nèi)編碼的氨基酸順序。
圖4表示插入在克隆81中的HCVcDNA的雙鏈核苷酸順序,以及編碼在其內(nèi)的多肽的推測氨基酸順序。
圖5表示在克隆36中的HCVcDNA順序,重疊克隆81的NANBVcDNA的區(qū)段,以及編碼在克隆36內(nèi)的多肽順序。
圖6表示在克隆36和81中HCVcDNA的組合ORF,以及在其內(nèi)編碼的多肽。
圖7表示在克隆32內(nèi)的HCVcDNA順序,重疊克隆81的區(qū)段;以及在其內(nèi)編碼的多肽。
圖8表示在克隆35內(nèi)的HCVcDNA順序,重疊克隆36的區(qū)段,以及在其內(nèi)編碼的多肽。
圖9表示在克隆35,36,81和32內(nèi)的HCVcDNA的組合ORF,以及在其內(nèi)編碼的多肽。
圖10表示在克隆37b中的HCVcDNA順序,重疊克隆35的區(qū)段,以及在其內(nèi)編碼的多肽。
圖11表示在克隆33b中的HCVcDNA順序,重疊克隆32的區(qū)段,以及在其內(nèi)編碼的多肽。
圖12表示在克隆40b中的HCVcDNA順序,重疊克隆37b的區(qū)段,以及在其內(nèi)編碼的多肽。
圖13表示在克隆25c中的HCVcDNA順序,重疊克33b的區(qū)段,以及在其內(nèi)編碼的多肽。
圖14表示核苷酸順序和編碼在ORF中的多肽,ORF延伸通過克隆40b,37b,35,36,81,32,33b和25c中的HCVcDNA。
圖15表示在克隆33c中的HCVcDNA順序,重疊克隆40b和33c的區(qū)段,以及在其內(nèi)編碼的氨基酸。
圖16表示在克隆8h中的HCVcDNA順序,重疊克隆33c的區(qū)段,以及在其內(nèi)編碼的氨基酸。
圖17表示在克隆7e中的HCVcDNA順序,重疊克隆8h的區(qū)段,以及在其內(nèi)編碼的氨基酸。
圖18表示在克隆14c中的HCVcDNA順序,重疊克隆25c的區(qū)段,以及在其內(nèi)編碼的氨基酸。
圖19表示在克隆8f中的HCVcDNA順序,重疊克隆14c的區(qū)段,以及在其內(nèi)編碼的氨基酸。
圖20表示在克隆33f中的HCVcDNA順序,重疊克隆8f的區(qū)段,以及在其內(nèi)編碼的氨基酸。
圖21表示在克隆33g中的HCVcDNA順序,重疊克隆33f的區(qū)段,以及在其內(nèi)編碼的氨基酸。
圖22表示在克隆7f內(nèi)的HCVcDNA順序,重疊克隆7e內(nèi)順序的區(qū)段,以及在其內(nèi)編碼的氨基酸。
圖23表示在克隆11b內(nèi)的HCVcDNA順序,重疊克隆7f內(nèi)順序的區(qū)段,以及在其內(nèi)編碼的氨基酸。
圖24表示在克隆14i內(nèi)的HCVcDNA順序,重疊克隆11b內(nèi)順序的區(qū)段,以及在其內(nèi)編碼的氨基酸。
圖25表示在克隆39c內(nèi)的HCVcDNA順序,重疊克隆33g內(nèi)順序的區(qū)段,以及在其內(nèi)編碼的氨基酸。
圖26表示在克隆7e,8h,33c,40b,37b,35,36,81,32,33b,25c,14c,8f,33f和33g中從排列的cDNA中所得的復(fù)合HCVcDNA順序,圖中也表示了編碼在所得的順序內(nèi)延伸的ORF中的多肽的氨基酸順序。
圖27表示克隆12f中的HCV互補(bǔ)DNA順序,重疊克隆14i的片段和編碼在其內(nèi)的氨基酸。
圖28表示在克隆35f中的HCVcDNA順序,重疊克39c的片段,以及編碼在其內(nèi)的氨基酸。
圖29表示在克隆19g內(nèi)的HCVcDNA順序,重疊克隆35f的片段和在其內(nèi)被編碼的氨基酸。
圖30表示克隆26g的順序,重疊克隆19g的片段,在其內(nèi)被編碼的氨基酸。
圖31表示克隆15e的順序,重疊克隆26g的片段,以及在其內(nèi)被編碼的氨基酸。
圖32表示在復(fù)式cDNA中的順序,通過使5′至3′方向的克隆12f至15e排列而衍生得到,它也可表示在連續(xù)ORF中被編碼的氨基酸。
圖33表示用BB-NANB,HAV和HBV感染的黑猩猩的血清的融合蛋白質(zhì)SOD-NANB5-1-1′的Western印跡的照片。
圖34表示用NANBV,HAV,HBV感染的人體的血清和對照人體血清的融合蛋白質(zhì)SOD-NANB5-1-1′的Western印跡的照片。
圖35是一個(gè)顯示載體pAB24主要特征的圖。
圖36表示融合多肽C100-3羧基末端的推測氨基酸順序,以及編碼它的核苷酸順序。
圖37A是用考馬斯藍(lán)著色的聚丙烯酰胺凝膠的照片,可以鑒別在酵母中表達(dá)的C100-3。
圖37b表示用NANBV感染的人體血清所進(jìn)行的C100-3的Western印跡。
圖38表示以克隆81的BB-NANBVcDNA為探針,從受BB-NANBV感染的黑猩猩的肝中分離得到的RNA的Northern印跡的放射自顯影照片。
圖39表示用RNaseA或DNaseI處理,并以克隆81的BB-NANBVcDNA為探針的NANBV核酸的自顯影照片。
圖40表示從含有抗NANB5-1-1′的感染血清中所取出的NANBV顆粒內(nèi)提取的,以來自克隆81的經(jīng)32P標(biāo)記的NANBV cDNA探查的核酸放射自顯影照片。
圖41表示含有分離得到的NANBV核酸的濾子的放射自顯影照片,以從克隆81中的NANBV cDNA所得的經(jīng)32P標(biāo)記的正鏈和負(fù)鏈DNA為探針進(jìn)行了探查。
圖42表示在HCVcDNA中被編碼的多肽和來自登革熱病毒的NS蛋白質(zhì)之間的同源性。
圖43表示由ELISA篩選所確定的,在隨機(jī)樣本中HCV感染分布的組織圖。
圖44表示在ELISA測定中使用兩種構(gòu)型的免疫球蛋白-酶接合物,在隨機(jī)樣本中HCV感染分布的組織圖。
圖45表示在一種引物混合物內(nèi)的順序,來自黃熱病病毒的NSI的一段保守順序。
圖46所示為克隆kq-1中的HCVcDNA順序、重疊圖26中的cDNA的部分以及其中編碼的氨基酸。
圖47所示為由使克隆kq-1通過15e以5′至3′方向排列得到的復(fù)合cDNA中的順序;它還表示以連續(xù)ORF中編碼的氨基酸。
實(shí)施本發(fā)明的方式Ⅰ定義“肝炎C病毒”已被該領(lǐng)域的工作人員專用于迄今為止未知的NANBH病原體。因此,本發(fā)明所用的“肝炎C病毒”(HCV)系指引起NANBH的病原體,而以前被稱作為NANBV和/或BB-NANBV。HCV、NANBV和BB-NANBV這些詞在文內(nèi)是通用的。作為該詞的引伸,由HCV引起的,以前稱為NANB肝炎(NANBH)的疾病也稱為肝炎C。NANBH和肝炎C這二個(gè)詞在文內(nèi)可以通用。
本文所用的“HCV”一詞系指能引起NANBH的病毒類和病毒菌株,或從其內(nèi)衍生得到的缺陷性干涉顆粒。如下文所示,HCV病毒組包括RNA。業(yè)已知道,含有RNA的病毒具有較高的自發(fā)突變率,亦即(據(jù)報(bào)道)每一核苷酸為10-3-10-4的量級(jí)(Fields & Knipe,1986)。因此,在下文所述的HCV物種內(nèi)有多種菌株。本文所述的組合物或方法可使各種有關(guān)的菌株進(jìn)行繁殖、鑒別、檢測和分離。而且,它們也可使對付各種菌株的診斷劑和疫苗的制備成為可能,并用于供藥理應(yīng)用的抗病毒劑(可抑制HCV的復(fù)制)的篩選方法。
盡管是從一種HCV菌株中衍生得到的(以下稱為CDC/HCVI),但本文所提供的資料足以使病毒分類學(xué)家能鑒別屬于該種類的其他菌株。如文內(nèi)所述,我們已發(fā)現(xiàn)HCV是一種黃熱疫病毒或黃熱病狀病毒。黃熱病病毒顆粒的形態(tài)學(xué)和組成是已知的,并在Brinton(1986年)中進(jìn)行了討論。通常,就形態(tài)學(xué)而論,黃熱病病毒含有一個(gè)被類脂雙層膜包圍的中心核殼體。病毒顆粒是球狀的,直徑約為40-50nm。它們核心的直徑約為25-30nm。沿著病毒顆粒被膜的外表面是長約5-10nm的突出物,并帶有直徑約為2nm的未端結(jié)。
HCV編碼一種在免疫學(xué)上可視作與HCV基因組中的表位相同的表位,而本文所述的cDNA是從該HCV基因組中衍生得到,最好該表位是在本文所述的cDNA內(nèi)被編碼。若與其他已知的黃熱病病毒相比,該表位是HCV所獨(dú)有的。表位的單一性可由其與HCV的免疫反應(yīng)性和與其他黃熱病病毒種沒有免疫反應(yīng)性來確定。確定免疫反應(yīng)性的方法在該技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)是公知的,例如放射免疫測定,Elisa測定和血液反應(yīng),文內(nèi)提供了供測定用的幾種合適技術(shù)試樣。
除如上所述外,下述參數(shù)單獨(dú)或組合在一起,可用于鑒別HCV菌株。由于HCV菌株是進(jìn)化相關(guān)的,估計(jì)基因組的在核苷酸級(jí)的全部同源性約為40%或更大,較好的是約60%或更大,更好的是約80%或更大,另外,有至少約為13個(gè)核苷酸的對應(yīng)的連接順序。在推測的HCV菌株基因組順序和CDC/CHIHCVcDNA順序之間的一致性可由該技術(shù)領(lǐng)域已知的技術(shù)確定。例如可通過推測HCV的多核苷酸的順序信息與本文所述的HCVcDNA順序的直接比較來確定。另外,也可由下述方法確定,即在同源區(qū)(例如在S消化之前所用的)之間形成穩(wěn)定復(fù)體的條件下雜交多核苷酸,然后用單鏈的指定核酸酶消化,最后測定消化后片段的大小。
由于HCV菌株的進(jìn)化關(guān)系,推測的HCV菌株可根據(jù)它們的多肽級(jí)的同源性而視為相同。通常,HCV菌株在多肽級(jí)約大于40%同源性,較好的是約大于60%的同源性,更好的是約大于80%同源性。確定氨基酸順序同源性的等級(jí)在該技術(shù)領(lǐng)域中是公知的。例如,氨基酸順序可通過測定和與本文所提供的順序相比較而確定。例如,推測HCV的基因組物質(zhì)的核苷酸順序也可被測定(一般是經(jīng)由cDNA中間體);在其內(nèi)被編碼的氨基酸順序可被確定,相應(yīng)的區(qū)被進(jìn)行比較。本文所引用的從一種指定順序,例如HCVcDNA,特別是從圖1-32中所列舉的那些,或來自HCV基因組的順序所“衍生得到的”多核苷酸,是指這樣一種多核苷酸順序,它包括一個(gè)至少約有6-8個(gè)核苷酸的順序,較好的是至少約有8個(gè)核苷酸,更好的是至少約有10-12個(gè)核苷酸,而最好是至少約有15-20個(gè)核苷酸,它相當(dāng)于,亦即與指定核苷酸順序的區(qū)域同源或互補(bǔ)。最好,衍生出多核苷酸的該區(qū)域的順序與HCV基因組獨(dú)有的順序同源或互補(bǔ)。某一順序是否是HCV基因組獨(dú)有的,可由該技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)熟練人員所知的技術(shù)確定。例如,可將該順序與數(shù)據(jù)庫(例如Genebank)中的順序進(jìn)行比較,以確定其是否存在于未感染的宿主或其他有機(jī)體中。也可將該順序與其他病毒體(包括已知能引起肝炎的病毒體,例如HAV、HBV和HDV)的已知順序,以及Flavivilidae的其他成員的順序相比較。所得順序與其他順序的對應(yīng)或非對應(yīng)性也可在合適的嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交而確定。確定核酸順序互補(bǔ)性的雜交技術(shù)在該領(lǐng)域是公知的,并將在下文進(jìn)行討論[例如也可參見Maniatisetal(1982)]。此外,由雜交形成的復(fù)合多核苷酸的失配可由已知技術(shù)確定,這包括諸如用SI之類的核酸酶消化,后者專門消化復(fù)合多核苷酸中的單鏈區(qū)??僧a(chǎn)生典型DNA順序的區(qū)域包括(但不限于)諸如非轉(zhuǎn)錄區(qū)和/或非轉(zhuǎn)澤區(qū),以及編碼特定表位的區(qū)域。
所得到的多核苷酸不一定是通過物理方法從所示的核苷酸順序獲得,也可以任何方式產(chǎn)生,包括諸如化學(xué)合成或者DNA復(fù)制,反轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄,后三種是基于產(chǎn)生多核苷酸的區(qū)域所提供的堿基順序。另外,與指定順序相應(yīng)的區(qū)域的連接可按該技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)公知的方式修飾,以使之與預(yù)定的應(yīng)用一致。
同樣,從指定的核酸順序(例如圖1-33中所示的順序或從HCV基因組)衍生得到的多肽或氨基酸順序系指多肽的氨基酸順序與編碼在該順序中的多肽的氨基酸順序或其部分順序相同,其中所述的部分至少由3-5個(gè)氨基酸組成,較佳的是至少由8-10個(gè)氨基酸組成,而理會(huì)的是至少由11-15個(gè)氨基酸組成,或者其在免疫學(xué)上可與編碼在該順序中的多肽相同。
重組或衍生所得的多肽不一定是從指定的核酸順序(例如圖1-32中的順序)或HCV基因組中轉(zhuǎn)譯而來,它可以任何方式產(chǎn)生,例如包括化學(xué)合成、重組體表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)、或從突變HCV中分離。
本文所用的“重組多核苷酸”一詞系指從基因組、cDNA、半合成或合成來源的多肽苷酸,根據(jù)其來源和處理方式,(1)它不是與全部或部分的在天然或庫中的形式上與其有關(guān)的多核苷酸相關(guān);和/或(2)它與一種多核苷酸相連,而不是在天然情況下相連的那種。
本文所用的“多核苷酸”一詞系指任何長度的核苷酸(核苷酸或脫氧核苷酸)的多聚體。該名詞僅指分子的初級(jí)結(jié)構(gòu)。由此它既包括雙鏈和單鏈的RNA,又包括雙鏈和單鏈的DNA。它也包括如用甲基化作用和/或封端修飾的多核苷酸,以及未修飾形式的多肽苷酸。
本文所用的“HCV含有與cDNA相應(yīng)的順序”的詞句系指HCV含有這樣一種多核苷酸順序,它與所指定的DNA同源或互補(bǔ),而與cDNA同源或互補(bǔ)的程度約為50%或更大,較好的是至少約為70%,而更好的是至少約90%。相應(yīng)的順序至少約為70個(gè)核苷酸長度,較為可取的是至少約為80個(gè)核苷酸長度,而更為可取的是至少約為90個(gè)核苷酸。在HCV順序的cDNA之間的對應(yīng)性可由該技術(shù)領(lǐng)域已知的技術(shù)確定,例如包括將該順序內(nèi)容與所述的cDNA進(jìn)行直接比較,或者雜交和用單鏈核酸酶消化,然后測定消化片段的大小。
“純化的病毒多核苷酸”系指HCV基因組或其片段,它基本上沒有與病毒多核苷酸天然相關(guān)的多肽,亦即它含有50%以下的所述多肽,較好的是含有30%以下的多肽,更好的是含有10%以下的多肽。從病毒顆粒中純化病毒多核苷酸的技術(shù)在該技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)是公知的,這包括諸如用促溶劑使顆粒破裂;用離子交換層析法,親合層析法和密度沉降法來分離多核苷酸和多肽。
“純化的病毒多肽”一詞系指基本上無細(xì)胞組分(病毒多肽與細(xì)胞組分是天然相關(guān)的HCV多肽或其片段,亦即它含有50%以下的細(xì)胞組分,較好的是含有30%以下的細(xì)胞組分,更好的是含有10%以下的細(xì)胞組分。純化病毒多肽的技術(shù)在該技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)是公知的,并將在下文討論。
“重組宿主細(xì)胞”,“宿主細(xì)胞”、“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”、“細(xì)胞培養(yǎng)物”,以及其他表示微生物或作為單細(xì)胞實(shí)體培養(yǎng)的多肽真核細(xì)胞系的這類術(shù)語系指可以是,或業(yè)已用作重組載體或其他轉(zhuǎn)化DNA的受體的細(xì)胞,它們包括已被轉(zhuǎn)染的原始細(xì)胞的后代。應(yīng)該明白,由于偶然或有意義的突變,單親代細(xì)胞的后代在形態(tài)學(xué)或基因組或總DNA組分上不一定與原始親代完全相同。親代細(xì)胞的后代與其親代非常相似,以致可用相關(guān)的性質(zhì)進(jìn)行定性,如存在編碼所需要的肽的核苷酸順序,這類親代細(xì)胞的后代被包括在本定義所指的后代范圍內(nèi),也即上述術(shù)語所指。
“復(fù)制子”是指任何遺傳因子,如質(zhì)粒、染色體、病毒,它相當(dāng)于細(xì)胞內(nèi)的多核苷酸復(fù)制的自主單元,即能夠在其自身控制下進(jìn)行復(fù)制。
“載體”是一種復(fù)制子,其內(nèi)連接另一個(gè)多核苷酸,可使所連接的片段復(fù)制和/或表達(dá)。
“控制順序”系指這樣一種多核苷酸順序,它們對實(shí)現(xiàn)與之相連接的編碼順序的表達(dá)是必須的。這類控制順序根據(jù)宿主生物而異,在原核生物中,這種控制順序一般包括啟動(dòng)子,核糖體結(jié)合位點(diǎn)和終止子;而在真核生物中,這種控制順序一般包括啟動(dòng)子,終止子,有時(shí)還包括強(qiáng)化子。“控制順序”一詞系指至少包括表達(dá)必需的全部組分,也可包括其他的組分,這些組分的存在是有利的,如前導(dǎo)順序。
“操縱連接”系指所述的組分處于一種并列關(guān)系,以致可使它們實(shí)施原有的功能?!安倏v連接”到編碼順序上的控制順序就是以這樣一種方式連接,從致編碼順序的表達(dá)是在與控制順序相容的條件下實(shí)現(xiàn)的。
“開放編碼”(QRF)是一段編碼多肽的多核苷酸順序,這一區(qū)域可以代表一部分密碼順序或全部密碼順序。
“密碼順序”是一種多核苷酸順序,當(dāng)置于適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)順序控制之下時(shí),它轉(zhuǎn)錄成mRNA和/或轉(zhuǎn)譯成多肽。密碼順序的邊界是由5′末端的轉(zhuǎn)譯起始密碼子和3′末端的轉(zhuǎn)譯終止密碼子所確定。密碼順序可包括(但并不限于)mRNA,cDNA和重組多核苷酸順序。
“在免疫學(xué)上可視作等同的”系指亦存在于指定的多肽(通常為HCV蛋白)中,并為其所特有的表位和多肽。免疫等同性可由抗體結(jié)合和/或在結(jié)合中的競爭所確定,這類技術(shù)對于該領(lǐng)域內(nèi)具有普通技藝的人來說是已知的,并將在下文闡述。表位的單一性也可用下述方法確定,即通過計(jì)算機(jī)對已知數(shù)據(jù)庫(例如Genebank)進(jìn)行檢索,找出編碼表位的多核苷酸順序,以及與其他已知蛋白比較氨基酸順序。
本文所用的“表位”系指多肽的抗原決定簇,一個(gè)表位可包括在表位所特有的一個(gè)空間構(gòu)型內(nèi)的三個(gè)氨基酸,通常一個(gè)表位至少由5個(gè)這樣的氨基酸組成,更為普通的是至少由8-10個(gè)這類氨基酸組成。確定氨基酸空間構(gòu)型的方法是該技術(shù)領(lǐng)域公知的,包括諸如X射線結(jié)晶學(xué)和二維核磁共振法。
當(dāng)抗體對包含在多肽內(nèi)的特定表位的識(shí)別后,與多肽結(jié)合時(shí),多肽對抗體是有“免疫學(xué)反應(yīng)性”的。免疫學(xué)反應(yīng)性可由抗體結(jié)合(更具體地說由抗體結(jié)合動(dòng)力學(xué))和/或用已知多肽作為競爭子在結(jié)合中的競爭來確定,該已知多肽含有一個(gè)直接抗抗體的表位。用于確定一種多肽是否與抗體的免疫學(xué)反應(yīng)性的技術(shù)是該技術(shù)領(lǐng)域所已知的。
本文所用的“含有HCV表位的免疫”一詞包括天然存在的HCV多肽及其片段,以及由其他方法(包括化學(xué)合成或多肽在重組有機(jī)體中的表達(dá))制備的多肽。
“多肽”一詞系指核酸分子鏈,而不是指產(chǎn)物的特定長度,因此,肽、寡肽和蛋白質(zhì)均包括在多肽的定義內(nèi)。該詞也不是指多肽表達(dá)后的修飾,例如糖基化、乙酰化和磷酸化等。
本文所用的“轉(zhuǎn)化”一詞系指一個(gè)外源多核苷酸插入宿主細(xì)胞,而與用于插入的方法,例如直接吸收、轉(zhuǎn)導(dǎo)或f-交配等無關(guān)。外源多核苷酸可以作為非整合載體,例如質(zhì)粒,也可被整合到宿主基因組中。
本文所用的“處理”系指預(yù)防和治療。
本文所用的“個(gè)體”系指脊椎動(dòng)物,特別是哺乳動(dòng)物類的成員,并包括(但不限于)家畜、運(yùn)動(dòng)娛樂用的動(dòng)物、靈長類以及人類。
本文所用的核苷酸“正鏈”包含編碼多肽的順序。而“負(fù)鏈”含有與“正鏈”互補(bǔ)的順序。
本文所用的病毒的“正鏈基因組”是指其中的基因組(無論是RNA還是DNA)是單鏈的,它編碼病毒多肽。正鏈RNA病毒的例子包括外衣病毒(Togaviridae)、冠狀病毒、(Coronaviridae)、還原病毒(Retrviridae)、微小RNA病毒(Picornaviridae)和玳瑁病毒(Caliciviridae)。以前分為外衣病毒類的黃熱病病毒也包括在內(nèi)(參見Fields&Knipe(1986)]。
本文所用的“含有抗體的驅(qū)體組成部分”系指個(gè)體驅(qū)動(dòng)體中的一個(gè)部分,它是有關(guān)抗體的來源。含有抗體的驅(qū)體組成部分在該技術(shù)領(lǐng)域中是已知的,包括(但不限于)諸如血漿,血清,脊柱液,淋巴液,及呼吸道、腸道和生殖泌尿道的表面部分,淚液、唾液、乳汁、白血球和骨髓瘤。
本文所用的“純化HCV”系指這樣一種HCV制劑,它業(yè)已從病毒通常與之相關(guān)的細(xì)胞組成物中分離出來,并與可能存在于感染組織中其他類型的病毒分離。分離病毒的技術(shù)是該技術(shù)領(lǐng)域的熟練人員所知的,包括諸如離心分離和親和色譜分離法,制備凈化HCV的方法將在下文討論。
Ⅱ.本發(fā)明的描述除非另行說明,本發(fā)明的實(shí)施將采用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)常規(guī)技術(shù),這些都在該領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。這類技術(shù)在下述列舉的文獻(xiàn)中進(jìn)行了充分描述即Maniatis,F(xiàn)itsch&Sambrook,MOLECULARCLONING;ALABORATORYMANUAL(1982);DNACLONING,VOLUMESⅠANDⅡ(D.NGlovered.1985);OLIGONUCLEOTIDESYNTHESIS(M.J.Gaited,1984);NucleicACIDHYBRIDIZATION(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984);TRANSCRIPTIONANDTRANSLATION(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984);ANIMALCELLCULTURE(R.I.Freshneyed.1986);IMMOBILIZEDCELLSANDENZYMES(IRLPress,1986);B.Perbal,APRACTICALGUIDETOMOLECULARCLONING(1984);theseries,METHODSINENZYMOLOGY(AcademicPress,Inc.);GENETRANSFERVECTORSFORMAMMALIANCELLS(J.H.MillerANDM.P.Caloseds.1987,CoidSpringHarborLaboratory),MethobsinEnzymologyVol.154andVol.155(WuandGrossman,andWu,eds.,respectively),MayerandWalker,eds.(1987),IMMUNOCHEMICALMETHODSINCELLANDMOLECULARBIOLOGY(AcademicPress,London),Scopes,(1987),PROTEINPURIFICAIONPRINCIPLESANDPRACTICE,SecondEdition(Springer-Verlag,N.Y.),andHANDBOOKOFEXPERIMENTALIMMUNOLOGY,VOLUMESⅠ-Ⅳ(D.M.WeirandC.C.Blackwelleds1986).
在上下文內(nèi)提到的所有專利、專利申請書及出版物在此處列出,以供參考。
通過供給一族接近同源的核苷酸順序,而這些核苷酸順序是從存在于受HCV感染的黑猩猩的血漿內(nèi)的核苷酸順序所衍生得到的cDNA庫內(nèi)分離出的,這樣就使本發(fā)明有效的材料和方法的實(shí)現(xiàn)成為可能。由于這族核苷酸既不能與未感染的人,亦不能與未感染的黑猩猩的基因組DNA雜交,而這族順序的核苷酸僅存在于被HCV感染的黑猩猩的肝或血漿中,僅因?yàn)樵擁樞虿⒉淮嬖谟贕enebank中,因此,上述的核苷酸順序族不是來源于人類或黑猩猩的。此外,此族順序并未顯示出與HBV基因組內(nèi)所含有的順序具有顯著的同源性。
包含在克隆5-1-1中的該族內(nèi)一個(gè)成員的順序具有一個(gè)連續(xù)的開放讀碼(ORF),后者編碼一個(gè)約有50個(gè)氨基酸的多肽。被HCV感染的人體的血清含有與該多肽相結(jié)合的抗體,而未受感染的黑猩猩的血清中不含有抗該多肽的抗體。最后,鑒于未感染的黑猩猩的血清中不含有抗該多肽的抗體,這種抗體是在急性NANBH感染后,在黑猩猩中誘發(fā)產(chǎn)生的。而且,抗這種多肽的抗體不會(huì)在受HCV和HBV感染的黑猩猩和人體中檢出。根據(jù)這些判據(jù),該順序是一種病毒的cDNA,其中所說的病毒誘發(fā)NANBH,或與NANBH相關(guān),而該DNA順序示于圖1。如下文所述,在克隆5-1-1中的cDNA順序與其他分離所得的cDNA順序的不同之處在于它含有28個(gè)額外的堿基對。
cDNA族中其他被確定的成員的復(fù)合體示于圖3,這些其他成員系用與克隆5-1-1中的一個(gè)cDNA片段相同的合成順序作為探針而分離出的。cDNA族中的一個(gè)成員系用克隆81中的cDNA衍生得到的合成順序分離的,并示于圖5,該順序與克隆81的順序的復(fù)合體示于圖6。cDNA族的其他成員,包括在克隆12f,14i,11b,7f,7e,8h,33c,40b,37b,35,36,81,32,33b,25c,14c,8f,33f,33g,39c,35f,19g,26g和15c存在的順序?qū)⒃冖?A節(jié)中描述。在這些克隆中的cDNA的復(fù)合體將在Ⅳ.A.18節(jié)中描述,見圖32。復(fù)合的cDNA表明,它含有一個(gè)連續(xù)ORF,由此編碼多聚蛋白。這一描述是與下文討論的建議相一致的,該建議意指HCV是一種黃熱病病毒,或者是類似的黃熱病病毒。
示于圖1-32的cDNA族的可獲性,便有可能組建DNA探針和多肽,這二種物質(zhì)可用于診斷因HCV感染而引起的NANBH,并檢查所需的血和血制品,以及輸血者是否受到感染。例如,從這些順序中可以合成約為8-10個(gè)或更多數(shù)目核苷酸的DNA寡聚體,后者可用作雜交探針,以檢測到諸如懷疑帶有病毒的對象的血清中是否存在病毒基因組,或用于檢查獻(xiàn)血中是否存在病毒。cDNA順序也使設(shè)計(jì)和生產(chǎn)HCV特定的多肽成為可能,后者可用作診斷劑,以診斷在NANBH期間發(fā)生的抗體存在與否??筩DNA中衍生得到的純化多肽的抗體也可用于檢測被感染的個(gè)體和血中的病毒抗原。
對這類cDNA順序的了解也使之能設(shè)計(jì)和生產(chǎn)多肽,后者可被用作抗HCV的疫苗,也可用于生產(chǎn)抗體,而所說抗體又可用于疾病的預(yù)防和/或治療被HCV感染的個(gè)體。
而且,cDNA順序族使HCV基因組的進(jìn)一步特征記述成為可能。從這些順序中衍生得到的多核苷酸探針可被用于探查cDNA庫中是否存在另外的重疊cDNA順序,后者又可被用來得到更多的重疊順序。除了該基因組被截?cái)?,而且分割的片段缺少共同的順序外,此種技術(shù)可用來獲得整個(gè)基因組的順序。然而,若基因組是截?cái)嗟模瑒t通過重復(fù)本文所述的用于分離cDNA克隆的λ-gt11血清篩選法,或者從純化HCV顆粒分離基因組,可得到基因組的其他片段。
互補(bǔ)DNA順序和由這些順序衍生得到的多肽,以及抗這些多肽的抗體也可用于分離和鑒別BB-NANBV體。例如,抗包含在多肽(該多肽系從cDNA中衍生得到)中的HCV表位的抗體可被用在基于親合色譜技術(shù)的方法中,以分離出病毒。另外,上述抗體可被用來鑒別由其他方法分離出的病毒顆粒。然后,對分離出的病毒顆粒內(nèi)的病毒抗原和基因組物質(zhì)可作進(jìn)一步定性。
從HCV基因組的進(jìn)一步定序,以及從HCV抗原的進(jìn)一步定性和基因組的定性所得到的信息可使更多的探針、多肽和抗體的設(shè)計(jì)和合成成為可能,而所述的探針、多肽和抗體可用于診斷、預(yù)防和治療由HCV引起的NANBH,以及用于篩選受到感染的血和血制品。
鑒于HCV的探針(包括抗原和抗體在內(nèi))和來自于基因組的多核苷酸(互補(bǔ)DNA族系從該基因組中衍生得到)的可以獲得,由此推動(dòng)了組織培養(yǎng)系統(tǒng)的發(fā)展,而后者在闡明HCV的生物學(xué)方面有極其重要的應(yīng)用價(jià)值。而這又導(dǎo)致基于抗病毒化合物的新處理領(lǐng)域的發(fā)展,而這種抗病毒化合物能優(yōu)先抑制HCV的復(fù)制和感染。
用于鑒別和分離NANBH的病原體的方法是新穎的,該法可用于鑒別和/或分離至今尚未進(jìn)行特征鑒定的病原體,后者含有一個(gè)基因組,并與各種疾病有關(guān),包括由病毒、類病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲。在這一方法中,cDNA庫系以存在于受感染的個(gè)體中的感染組織內(nèi)的核酸所產(chǎn)生的。所述的庫在某一載體中構(gòu)建,該庫可使在cDNA中編碼的多肽進(jìn)行表達(dá)。宿主細(xì)胞克隆含有一個(gè)表達(dá)病原體中多肽的免疫反應(yīng)片段的載體,該克隆通過用來自另一個(gè)體(事先用推測的病原體進(jìn)行感染)的含有抗體的驅(qū)體組成部分來對上述庫的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行免疫檢查而選出的。免疫探桿技術(shù)的步驟包括使含有cDNA之載體的表達(dá)產(chǎn)物與二級(jí)感染個(gè)體中驅(qū)體組成部分抗體相互作用,然后檢測表達(dá)產(chǎn)物和二級(jí)感染個(gè)體的抗體之間是否形成抗體-抗原復(fù)合體。分離出的克隆的免疫學(xué)上的進(jìn)一步篩選是通過將其表達(dá)產(chǎn)物分別與用推測的病原體感染的其他個(gè)體的含有抗體的驅(qū)體組織,以及未受推測病原體感染的對照個(gè)體的組織相互作用,并用未感染的個(gè)體的抗體檢測是否形成抗原-抗體復(fù)合體,分離出對多肽編碼的含有載體的cDNA,其中所述的多肽與受感染的個(gè)體和被懷疑是受到病原體感染的個(gè)體中的抗體發(fā)生免疫反應(yīng),但不與對照個(gè)體發(fā)生此反應(yīng)。用于組建cDNA庫的感染個(gè)體和用于免疫探查的感染個(gè)體不必是相同的物種。
由此種方法分離得到的cDNA和它們的表達(dá)產(chǎn)物,以及抗該表達(dá)產(chǎn)物的抗體可用于對病原體的特性鑒定和/或獲得病原體。正如下文更為詳細(xì)所描述的,該法已成功也用于分離從HCV基因組衍生得到的一族cDNA。
Ⅱ.A互補(bǔ)DNA順序的制備來自慢性HCV感染的,并含有高效價(jià)病毒,即至少為106黑猩猩感染劑量/毫升(CID/毫升)的黑猩猩的匯集血清被用于分離病毒顆粒,從這些顆粒中分離出的核酸用作組建病毒基因組的cDNA庫的模板。用于分離推測的HCV顆粒和在λ-gt11中組建cDNA庫的方法將在Ⅳ.A.1節(jié)中進(jìn)行討論。λ-gt11是這樣一載體,它已專門演變成將插入cDNA表達(dá)為具有β-半乳糖苷酶的融合多肽;并用由特定抗原而形成的特異性抗血清來篩選大量重組體噬菌體。為200個(gè)堿基對的cDNA的一群cDNA中產(chǎn)生的λ-gt11 cDNA庫進(jìn)行篩選以尋找編碼的表位,后者能專與先前患有NANB肝炎的患者所取出的血清結(jié)合(參見Huynh,T.V.et al.,1985)。在大約10個(gè)噬菌體中篩選,對得到的5個(gè)陽性噬菌體進(jìn)行鑒別、提純后,檢驗(yàn)其是否具有與已用HCV體感染過的各種人和黑猩猩的血清結(jié)合的專一性。其中一個(gè)噬菌體5-1-1結(jié)合了被檢驗(yàn)的8份人類血清中的5份。鑒于7名正常供血者的血清未顯示出這種結(jié)合,所以此種結(jié)合似乎對從前被NANB肝炎感染過的患者中取出的血清具有選擇性。
對重組噬菌體5-1-1中的cDNA順序進(jìn)行測定,并將該順序示于圖1。由該克隆cDNA編碼的多肽示于核苷酸順序上面,該多肽是在與融合多肽的N末端的β-半乳糖苷酶部分相同的轉(zhuǎn)譯碼內(nèi)。因此,該轉(zhuǎn)譯ORF專是編碼被NANB肝炎感染患者的血清專一性識(shí)別的表位。
在重組噬菌體5-1-1中的cDNA的可獲得性使含有病毒基因組的cDNA的另外區(qū)段和/或可替換的區(qū)段的其他克隆的分離成為可能。以上描述的λ-gt11cDNA庫用從克隆5-1-1cDNA順序所衍生得到的合成多核苷酸進(jìn)行探查。探查結(jié)果產(chǎn)生了三種其他的克隆,分別被定名為81,1-2和91,并對包含在這些克隆內(nèi)的cDNA定序(參見Ⅳ.A.3和Ⅳ.A.4節(jié))。4個(gè)獨(dú)立克隆之間的同源性示于圖2,圖中同源性用垂直線表示。在克隆5-1-1,81和91中特有的核苷酸順序由小寫字母表示。
在克隆5-1-1,81,1-2和91中重組噬菌體內(nèi)存在的克隆cDNA是高度同源的,僅在二個(gè)區(qū)域不同。首先,在克隆1-2中的67號(hào)核苷酸是胸腺嘧啶核苷,而其他三個(gè)克隆在該位置為胞嘧啶核苷。然而,這種替代并不改變所編碼的氨基酸的性質(zhì)。
這些克隆之間的第二個(gè)差異是克隆5-1-1在其5′末端含有28個(gè)堿基對,而后者并不存在其他的克隆中。這額外的順序可以是5′末端的克隆的人工產(chǎn)物,后者通常在cDNA法的產(chǎn)物中可觀察到。
從克隆81的HCVcDNA內(nèi)的5′區(qū)和3′區(qū)中衍生得到的合成順序被用于從λ-gt11NANBVcDNA庫中探查和分離cDNA,該庫覆蓋克隆81cDNA(參見Ⅳ.A.5節(jié))。所產(chǎn)生的在克隆36和克隆32內(nèi)的cDNA順序分別示于圖5和圖7。
同樣,基于克隆36的5′區(qū)的合成多核苷酸被用于從覆蓋克隆36cDNA的λ-gt11NANBVcDNA庫中探查和分離cDNA(參見Ⅳ.A.8節(jié))。含有與合成的多核苷酸探針雜交的重組噬菌體的cDNA的純化克隆被稱為克隆35,包含在該克隆中的NANBVcDNA順序示于圖8。
使用分離重疊cDNA順序的技術(shù),已得到含有另外的上游,下游HCVcDNA順序的克隆。在以下Ⅳ.A節(jié)中對其他克隆的分離作了描述。
對分離到的克隆內(nèi)編碼的HCVcDNA的核苷酸順序所進(jìn)行的分析表明,復(fù)合cDNA含有一個(gè)長而連續(xù)的ORF。圖26表示來自這些克隆的復(fù)合cDNA順序,及其編碼的推測的HCV多肽。
對于修補(bǔ)cDNA順序的方法的描述是歷來最感興趣的事。本文提供所產(chǎn)生的順序(及它們的補(bǔ)體),順序或其任何部分可用合成法或用合成法與部分順序的修補(bǔ)相結(jié)合而制備得到,其中所述的部分順序修補(bǔ)系采用本文所述的同樣方法進(jìn)行。
從HCVcDNA庫和從克隆5-1-1,81,1-2和91中復(fù)制得到的λ-gt11菌株已根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定,保藏在美國典型微生物保藏中心(AmericanTypeCultureCallection(ATCC),12301ParklawnDr.,Rockville,Maryland20852),并已獲得下列登記號(hào)λ-gt11登記號(hào)保藏日期HCVcDNAlibrary403941Dec.1987clone814038817Nov.1987clone914038917Nov.1987clone1-24039017Nov.1987clone5-1-14039118Nov.1987
一俟本申請被許可和公布為美國專利后,對于得到這些保藏物的所有限制都將最終地取消,在本專利申請未決期間,按37CFR1.14和35USC1.22條款的規(guī)定而授予權(quán)利的局長所批準(zhǔn)的人才能使用上述指明的保藏物。而且,所指明的保藏物將從保藏日期維持30年,或最后請求保藏后的5年,或者美國專利可實(shí)施的期限,總之由以上較長的一種期限而定。這些保藏物和上述提到的其他保藏物僅用于提供方便,而并不要求實(shí)施根據(jù)此處所述的本發(fā)明。在保藏物中的HCVcDNA順序在文內(nèi)一并列出,以供參改。
如上所述,對基因組進(jìn)行“搜索”(walkingofgenome),將重疊的cDNA順序自HCVλ-gt-11庫中分離出來,從而提供一種相應(yīng)于完整的HCV基因組的cDNA的方法。然而,根據(jù)本文所提供的資料,分離這些cDNA的其他方法對于該技術(shù)領(lǐng)域的熟練人員來說是顯而易見的。其中某些方法在以下Ⅳ.A節(jié)中進(jìn)行了描述。
Ⅱ.B病毒多肽和片段的制備cDNA順序(或者是用以下將討論的,在圖1-26中cDNA順序分離出的任一個(gè)),及在圖1-26中的互補(bǔ)DNA順序的可獲性使得編碼在各鏈中的多肽的抗原活性區(qū)的表達(dá)載體的組建成為可能。這些抗原活性區(qū)可以從外殼或被膜抗原,或者從核心抗原中衍生得到,包括諸如多核苷酸結(jié)合蛋白質(zhì)、多核苷酸聚合酶,以及復(fù)制和/或組裝病毒顆粒所需的其他病毒蛋白質(zhì)。編碼所需多肽的片段可用常規(guī)的限制消化或合成法從cDNA克隆中衍生得到,并被連接到載體中,后者舉例來說可含有諸如β-半乳糖苷酶或超氧化岐化酶(SOD)(最好是SOD)之類的融合順序的部分。用于產(chǎn)生含有SOD融合順序的多肽的方法和載體在歐洲專利局公布號(hào)0196056的專利文獻(xiàn)(1986年10月1日公布)中進(jìn)行了描述。對SOD和HCV多肽的融合多肽,亦即NANB5-1-1′,NANB81′和C100-3(它們在HCV cDNA的復(fù)合體中被編碼)進(jìn)行編碼的載體將分別在Ⅳ.B.1,Ⅳ.B.2和Ⅳ.B.4節(jié)中進(jìn)行描述。在各有義鏈內(nèi)含有開放讀碼的HCVcDNA的任何所需部分能以重組多肽(如成熟或融合蛋白質(zhì))的形式獲得,另外,在cDNA內(nèi)編碼的多肽可通過化學(xué)合成來提供。
對所需的多肽(無論其是融合型還是成熟型,也無論其是否含有可使之分泌的信號(hào)順序)編碼的DNA可被連接到適合任何合適宿主的表達(dá)載體中。真核體和原核體宿主體系目前被用于形成重組多肽,一些其他的常用控制體系和宿主細(xì)胞系的概況給出在下面Ⅲ.A節(jié)中。然后將多肽從破碎細(xì)胞或從培養(yǎng)基中分離出來,接著再對其提純至預(yù)定的應(yīng)用所需的程度。提純可以采用該技術(shù)領(lǐng)域已知的技術(shù)進(jìn)行,例如鹽分級(jí)分離、在離子交換樹脂上的色譜分離、親合色譜法、離心分離等。例如可參見有關(guān)酶學(xué)方法中提純蛋白質(zhì)用的各種方法。這類多肽可作診斷劑、或者導(dǎo)致中和抗體的多肽可被配制成疫苗。所產(chǎn)生的抗這些多肽的抗體也可用作診斷劑,或用于被動(dòng)免疫療法。此外,如以下Ⅱ.J節(jié)所詳述的,抗這些多肽的抗體可用于分離和鑒別HCV顆粒。
HCV抗原也可從HCV病毒粒子中分離得到。病毒粒子可在組織培養(yǎng)物內(nèi)的HCV感染細(xì)胞中或感染的宿主中生長。
Ⅱ.C抗原多肽的制備和與載體的接合多肽的抗原區(qū)一般是比較小的,典型的長度是8至10個(gè)氨基酸或更短。少至5個(gè)氨基酸的片段可以表示一個(gè)抗原區(qū)。這些區(qū)段可對應(yīng)于HCV抗原區(qū)、因此,以HCV的cDNA為基礎(chǔ),編碼HCV多肽的短片段的DNA可以重組體方式表達(dá)為融合蛋白或分離多肽。另外,短的氨基酸順序可以方便地用化學(xué)合成方法得到。若合成多肽處于正確的構(gòu)象,以提供正確的表位,但它太小,以致不具有免疫原性,則可將該多肽連接到合適的載體中。
一些獲得這類連結(jié)的技術(shù)在該技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)是已知的,這包括用N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基硫)丙酸酯(SPDP)和琥珀酰亞胺基-4-(N-順丁烯二酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(SMCC)(購自PierceCompany,Rockford,Illinois)生長二硫鍵(若多肽無硫氫基,則可通過加入半胱氨酸殘基而提供)。這些試劑在它們之間形成了一個(gè)二硫鍵,在一個(gè)蛋白質(zhì)上半胱氨酸殘基形成一個(gè)肽,以及一個(gè)通過一個(gè)賴氨酸上的ε氨基或在另一個(gè)中的其他游離氨基的酰胺鍵。二硫化物/酰胺生成劑的各種品種均是已知的(例如可參見Immun,Rev.(1982)62185)。其他的雙功能偶合劑系形成硫醚,而不是二硫鍵。這類硫醚生成劑中有許多是市場上可買到的,包括6-順丁烯二酰亞胺酸、2-溴乙酸、2-碘乙酸、4-(N-順丁烯二酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸等的活性酯。羧酸基可通過與琥珀酰亞胺或1-羥基-2-硝基-4-磺酸或其鈉鹽相結(jié)合而活化。以上列舉的并不意味是完整的,顯然也可使用上述化合物的變化形式。
可以使用任何載體,只要其本身不會(huì)誘發(fā)對宿主有害的抗體的產(chǎn)生。合適的載體一般是大型的,代謝緩慢的大分子,如蛋白質(zhì),諸如膠乳功能化瓊脂糖(latex functionalized sepharose)、瓊脂糖(agarose)、纖維素、纖維素珠之類的多糖,諸如多聚谷氨酸、多聚賴氨酸之類的多聚氨基酸,氨基酸共聚物和失活的病毒顆粒(例如可參見.D節(jié))。特別有效的蛋白質(zhì)基質(zhì)是血清白蛋白、鑰孔 血藍(lán)素、免疫球蛋白分子、甲狀腺球蛋白、卵白蛋白、破傷風(fēng)類毒素,以及該技術(shù)領(lǐng)域中熟練人員所熟知的其他蛋白質(zhì)。
Ⅱ.D含有HCV表位的雜種顆粒免疫原的制備HCV表位的致免疫性可以通過下述在哺乳動(dòng)物或酵母體系中進(jìn)行制備而增強(qiáng),其中所述的哺乳動(dòng)物或酵母體系是與形成顆粒的蛋白質(zhì)(例如與肝炎B表面抗原相關(guān)的)融合或組合其中NANBV表位直接與生成顆粒的蛋白質(zhì)編碼順序相連結(jié)的構(gòu)成物產(chǎn)生對于HCV表位致免疫的雜種。另外,所制備的全部載體包括HBV特有的表位在內(nèi),如前S肽,均有不同程度的致免疫性。從形成顆粒的蛋白質(zhì),包括HCV順序在內(nèi)所組建的顆粒對于HCV和HBV是致免疫的。
業(yè)已證明,肝炎表面抗原(HBSAg)在S.Cerevisia(Valenzuelaetal.,1982)以及(例如)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞(Valenzuela,Petal.,1984)中被形成和組合成顆粒。這類顆粒的生成已被證明能增強(qiáng)單體亞單位的致免疫性。組合物也可包括HBSAg的免疫顯性表位,后者由前表面區(qū)的55個(gè)氨基酸組成(Neurathetal.,1984)。可在酵母中表達(dá)的前S-HBSAg顆粒的組合物業(yè)已在1986年3月15日公布的歐洲專利174,444中進(jìn)行了揭示。包括對于酵母表達(dá)的不同的病毒順序的雜種,業(yè)已在1986年3月26日公布的歐洲專利175,261中進(jìn)行了揭示。以上兩篇專利申請均被轉(zhuǎn)讓給本文的受讓人,此處引用僅供參改。這類組合物也可使用SV40-二氫葉酸還原酶載體(Michelleetal.,1984),在諸如中國倉鼠卵巢細(xì)胞之類的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中被表達(dá)。
此外,形成顆粒的蛋白質(zhì)編碼順序的一部分可用編碼HCV表位的密碼子替換。在這種替換中,不需要在酵母或哺乳動(dòng)物中作為引起單體聚集而形成致免疫顆粒的媒介物的區(qū)域可被刪除,由此消除了其他的HBV抗原位點(diǎn)與HCV表位的競爭。
Ⅱ.E疫苗的制備從HCVcDNA中衍生得到的一種或一種以上的致免疫多肽,以及從圖1-32中的cDNA,或者從疫苗所對應(yīng)的HCV基因組均可制備疫苗。所觀察到的存在于HCV及黃熱病毒之間的同源性涉及可能是作為疫苗最為有效的多肽的信息,同時(shí)也提供了涉及編碼它們的基因組的區(qū)域方面的信息。關(guān)于黃熱病毒基因組的一級(jí)結(jié)構(gòu)在《Rice》(1986)等上曾作過討論。據(jù)信,黃熱病毒基因組RNA為唯一的病毒專一性mRNA種,并轉(zhuǎn)譯為三個(gè)病毒結(jié)構(gòu)蛋白,即C、M及E,同時(shí)也產(chǎn)生兩個(gè)大的非結(jié)構(gòu)蛋白,NV4及NV5,及一組復(fù)雜的較小的非結(jié)構(gòu)蛋白。已經(jīng)搞清黃熱病毒的主要中和表位存在于E(外殼)蛋白(Roehrig(1986))上。依據(jù)與黃熱病毒的同源性可以預(yù)計(jì)相應(yīng)的HCVE基因及多肽編碼區(qū)域。因而,疫苗可以包括含HCVE表位的重組體多肽。這些重組體可以在細(xì)菌、酵母、或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá),或者亦可分離自病毒制劑。人們還期望另外的結(jié)構(gòu)蛋白同樣含有可引起保護(hù)性抗-HCV抗體的表位。因此,在HCV疫苗中含有E、C及M的表位的多肽可能也被單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用。
除上述之外,還發(fā)現(xiàn)用NS1(非結(jié)構(gòu)蛋白1)進(jìn)行的免疫作用,可導(dǎo)致抗黃熱病(Schlesinger等人)(1986)。盡管該免疫作用不能產(chǎn)生中和抗體,但這一點(diǎn)是確實(shí)無疑的。由于這種蛋白看似高度密集于黃熱病毒中,看來HCVNS1也同樣具有抗HCV感染的保護(hù)作用。此外,還發(fā)現(xiàn)非結(jié)構(gòu)蛋白可能也具有抗病毒致病性的保護(hù)作用,盡管它們并不產(chǎn)生中和抗體。
鑒于上述事實(shí),抗HCV的多價(jià)疫苗可以包括一種或多種結(jié)構(gòu)蛋白,及/或一種或多種非結(jié)構(gòu)蛋白。這些疫苗可以包括,例如,重組體HCV多肽及/或自病毒粒子分離的多肽。另外,也許還可在疫苗中利用滅活的HCV;滅活過程可以利用病毒胞解物或其它的本技術(shù)所了解的方法使黃熱病毒滅活,例如,用有機(jī)溶劑或去垢劑,或福爾馬林進(jìn)行處理。此外,疫苗也可從減毒的HCV株來制備。減毒的HCV株的制備敘述在下。
已知黃熱病毒中的一些蛋白含有高度密集的區(qū)域,因而,可期望在HCV及其它黃熱病毒之間進(jìn)行免疫交叉反應(yīng)。也許在黃熱病毒及HCV之間共有的表位,可產(chǎn)生抗一種或多種由這些致病原引起的疾病的保護(hù)性抗體。由此,依據(jù)這一知識(shí)也許可以設(shè)計(jì)出多種目的的疫苗。
含有致免疫的多肽作為活性組分的疫苗的制備方法對該技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)的熟練人員是公知的。通常,是將這類疫苗制備成溶液或懸浮液狀態(tài)的可注射劑,也可將其制備成適用于在注射前溶解于或懸浮液體中的固態(tài)形式。這類制劑也可以成乳化狀,或者蛋白質(zhì)被封裹在脂質(zhì)體中。活性的致免疫組分常與藥學(xué)上可接受的,并與活性組分相容的賦形劑相混合。合適的賦形劑可列舉出水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等,或它們的組合物。此外,根據(jù)需要,疫苗中可含有少量輔助物質(zhì),如可濕劑或乳化劑,pH緩沖劑,和/或能增強(qiáng)疫苗功效的佐劑??赡苡行У淖魟├影?但不限于)氫氧化鋁、N-乙?;?胞壁?;?L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正胞壁?;?L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(CGP11637,稱作為正MDP)、H-乙?;邗;?L-丙氨?;?D-異谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕櫚酰基-sn-甘油基-3-羥基磷?;趸?-乙胺(CGP19835A,稱為MTP-PE)和RIBI,后者含有從細(xì)菌中提取的三種組分,即一磷?;惢疉、海藻糖二霉菌酸酯和細(xì)胞壁骨架(MPL′TDM′CWS),并都置于2%的角鯊烯/Tween80的乳化液中。佐劑的功效可以通過測定施用了疫苗(該疫苗也含有各種佐劑)中此種多肽后所產(chǎn)生的直接抗含有HCV抗原順序的致免疫多肽的抗體的量來確定。
疫苗通常是通過注射(例如皮下注射或肌內(nèi)注射)的方式,非腸道施用的。適合于其他施用方式的另外制劑包括栓劑,和(在某些情況下)口服制劑。對于栓劑來說,常規(guī)的粘結(jié)劑和載體可包括聚(亞烷基)二醇或三甘油醇,這類栓劑可以由活性組分的含量為0.5%-10%,最好為1%-2%的混合物制成??诜苿┌ㄟ@類通常所用的賦形劑,如藥物級(jí)的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、鈉糖精、纖維素和碳酸鎂等。這些組合物可以是溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊、持續(xù)釋放的制劑或粉劑形式,并含有10%-95%的活性組分,最好是含有25%-70%的活性組分。
蛋白質(zhì)可被配制成中性或鹽的形式的疫苗。藥學(xué)上可接受的鹽包括酸加成鹽(與肽的游離氨基所形成的),系與鹽酸或磷酸之類的無機(jī)酸,或與諸如乙酸、草酸、酒石酸和馬來酸之類的有機(jī)酸所形成的。
Ⅱ.F疫苗的劑量和施用疫苗可以按與劑量處方相符合的方式施用,其施用的量應(yīng)達(dá)到預(yù)防和/或治療的效用。根據(jù)被處理的對象,對象的免疫系統(tǒng)的能力,以及所需保護(hù)的程度,所施用的疫苗量一般是每一次劑量為5微克至250微克抗原的范圍內(nèi)。所需施用的活性組分的精確量可根據(jù)醫(yī)師的判斷而定,可以因每一對象而異。
疫苗可以按單一劑量的安排方式給予,或者最好是以多次劑量安排的方式給予。多次劑量的安排是這樣的,其中接種的主要過程可以是用1-10次的單獨(dú)劑量,然后在需要維持和/或增強(qiáng)疫苗應(yīng)答的其后的時(shí)間間隔中給于其他的劑量,例如對于第二次劑量在1-4月,根據(jù)需要,其后的劑量是在幾個(gè)月后給予。劑量制度至少部分地也將由個(gè)體的需要而決定,并取決于醫(yī)師的判斷。
此外,含有致免疫HCV抗原的疫苗可以與其他免疫調(diào)節(jié)劑,如免疫球蛋白結(jié)合施用。
Ⅱ.G抗HCV表位的抗體的制備按上述方法制備得到的致免疫多肽被用于產(chǎn)生多克隆和單克隆的抗體。若需要多克隆抗體,可將選出的哺乳動(dòng)物(例如鼠、兔子、山羊、馬等)用帶有HCV表位的致免疫多肽進(jìn)行免疫。收集免疫動(dòng)物的血清,并按已知方法處理。若含有抗HCV表位的多克隆抗體的血清中存在抗其他抗原的抗體,則可用免疫親合層析法對該多克隆抗體進(jìn)行提純。用于產(chǎn)生和處理多克隆抗血清的技術(shù)對該技術(shù)領(lǐng)域是公知的(例如可參見Mayer和Walker.1987)。
另外,多克隆抗體可從以前已被HCV感染過的哺乳動(dòng)物中分離得到。在V.E節(jié)中描述了一個(gè)提純感染個(gè)體的血清中的抗HCV表位的抗體的例子,它是基于親合層析法,并使用了SOD的融合多肽和在cDNA克隆5-1-1內(nèi)編碼的多肽。
直接抗HCV表位的單克隆抗體也可以由該技術(shù)領(lǐng)域的熟練人員方便地制備。用雜種瘤制備單克隆抗體的一般方法是熟知的。不朽的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞系可由細(xì)胞融合產(chǎn)生,也可由其他技術(shù)產(chǎn)生,如用致瘤的DNA直接轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞,或用EB病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染(例如可參見M.Schreieretal.,(1980);Hammerlingetal.,(1981);Kennettetal.,(1980);seealso,U.S.PatentNos.4,341,761;4,399,121;4,427,783;4,444,887;4,466,917;4,472,500;4,491,632and4,493,890)??蓪λa(chǎn)生的一些抗HCV表位的單克隆抗體檢查它們的各種性質(zhì),如同型、表位親和力等。
直接抗HCV表位的單克隆抗體和多克隆抗體在診斷方面特別有用,而中性抗體在被動(dòng)免疫治療方面是有用的。單克隆抗體特別可用于增高抗個(gè)體基因型的抗體。
抗個(gè)體基因型的抗體是免疫球蛋白,后者攜帶需要防護(hù)的傳染體抗原的“內(nèi)像”(例如可參見Nisonoff,A.,etal.,1981和Dreesmanetal.,1985)。
增強(qiáng)抗個(gè)體基因型抗體的技術(shù)在該技術(shù)領(lǐng)域中是已知的(例如可參見Grzych,1985,MachNamaraetal.,1984和Uytdehaagetal,1985)。這類抗個(gè)體基因型抗體也可用于治療NANBH,以及用于解釋HCV抗原的致免疫區(qū)。
Ⅱ.H.用于診斷的寡核苷酸探針和藥盒將包括圖1-32中的那部分cDNAs在內(nèi)的分離出來的HCVcDNAs的已知部分作為基礎(chǔ),通過切除或合成的手段,可以制備接近8個(gè)或更多個(gè)核苷酸的寡聚物,它們與HCV基因組雜交,可用于識(shí)別病毒試劑,鑒別病毒基因組的其他特性以及檢測在致病個(gè)體中的病毒。用于檢測HCV多核苷酸(天然的或衍生的)的探針需要一定的長度以便于能夠通過雜交而檢測特異的病毒順序。6-8個(gè)核苷酸是能工作的長度,10-12個(gè)核苷酸的順序是較佳的,而約20個(gè)核苷酸的順序則是最佳的。這些順序最好從缺少異源性的區(qū)域中衍生出來。這些探針可以采用包括寡核苷酸自動(dòng)合成方法在內(nèi)的常規(guī)方法來制備。有用的探針包括諸如克隆5-1-1和這里所揭示的其他克隆,以及下面所提出的用于探查cDNA的各種寡聚物。與HCV基因組的任何特異部分相互補(bǔ)都可以。當(dāng)用作為探針時(shí),完全互補(bǔ)是最好的,盡管隨著片段的長度增加并不必需完全互補(bǔ)。
當(dāng)將這種探針用于診斷時(shí),如果需要的話,欲分析的生物樣品,如血液或血清要進(jìn)行處理以提取包含于其中的核酸。從樣品中得到的核酸要進(jìn)行凝膠電泳或其他分離大小的技術(shù)處理;或者核酸樣品也可以進(jìn)行點(diǎn)印跡而無需分離大小。然后將探針“打上”標(biāo)記。合適的標(biāo)記和對探針進(jìn)行標(biāo)記的方法是該技術(shù)領(lǐng)域中已知的,例如,通過切口轉(zhuǎn)移或激酶摻入的放射性標(biāo)記物,生物素、熒光探針和化學(xué)發(fā)光探針。然后,在相應(yīng)的嚴(yán)密的雜交條件下,用標(biāo)記的探針處理從樣品中提取出來的核酸。
可以將探針制成與HCV基因組完全互補(bǔ)。因此,為了避免假象出現(xiàn),通常十分嚴(yán)格的條件是所需要的。但是,如果探針與缺少異源性的病毒基因組是互補(bǔ)的,則只能使用十分嚴(yán)格的條件。雜交的嚴(yán)格程度是通過雜交和洗滌過程中的許多因素,包括溫度、離子強(qiáng)度、時(shí)間長短和甲酰胺的濃度來確定的。這些因素業(yè)已概述過了,如ManiatisT.(1982)。
通常,人們估計(jì)在受感染的個(gè)體的血清中,HCV基因組順序?qū)⒁韵鄬^低的水平存在,即以約102-103順序/ml的濃度存在。在雜交分析中,該水平可能需要能使用放大技術(shù)。這種技術(shù)是該技術(shù)領(lǐng)域中已知的。例如,Enzo生物化學(xué)公司的“生物橋”(“Bio-Bridge”)系統(tǒng)使用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶給DNA探針加上未經(jīng)修飾的3′-多聚胸苷尾巴。將有多聚胸苷尾巴的探針先與靶核苷酸順序雜交,然后再與生物素修飾的多聚腺苷雜交。第84103520號(hào)PCT申請和EPA124221描述了DNA雜交分析,其中(1)將被測物與單鏈DNA探針退火,該探針與一段酶標(biāo)記寡核苷酸互補(bǔ),(2)將所得到的有尾的復(fù)合體與酶標(biāo)記的寡核苷酸雜交。EPA204510描述了DNA雜交分析,其中被測DNA與有尾的(如多聚胸苷尾巴)的探針相接觸,一條具有與探針的尾巴相雜交的順序(如多腺苷酸順序)的放大鏈,該鏈可與多個(gè)標(biāo)記的鏈結(jié)合。特別需要的技術(shù)首先包括將在血清中的靶HCV順序放大約10,000倍,即約放大到每毫升106個(gè)順序。這些可以通過Saiki等(1986)的技術(shù)來完成。然后,可采用在美國共同申請(Attorney Docket No.2300-0171,1987年10月15日提出,轉(zhuǎn)讓給這里的受讓者,由此以列入?yún)⒖嘉墨I(xiàn)中)中所描述的雜交分析來測定放大的順序。該雜交分析可檢測每毫升106水平的順序,它采用可與單鏈被測核苷酸結(jié)合,或也可與多個(gè)標(biāo)記的單鏈寡核苷酸結(jié)合的核酸聚合物。合適的溶液相夾層分析可以與標(biāo)記的多核苷酸探針一起使用,制備探針的方法已在EPO225,807(1987.6.16公開)中描述了(它已轉(zhuǎn)讓給這里的受讓者,它在這里被列為參考)。
探針可以包裝到診斷藥盒內(nèi)。診斷藥盒包括被標(biāo)記或者未被標(biāo)記的探針DNA,而標(biāo)記用的成份可能包含于藥盒中。藥盒也可包含其它適合于包裝的試劑和特定的雜交方法所需要的材料,例如對照和進(jìn)行試驗(yàn)的指導(dǎo)書。
Ⅱ.I.免疫分析和診斷藥盒能夠與含有HCV抗體的血清進(jìn)行免疫反應(yīng)的多肽,如在第Ⅳ.A.章節(jié)中描述的克隆以及它們的其它組合克隆中衍生或編碼的那些(見第Ⅳ.A.章節(jié)),及在這些多肽中抗HCV特定的表位的抗體(例如,可見第Ⅳ.E.章節(jié))在免疫分析中可用于測定生物樣品(如血液或血清)中HCV抗體的存在或病毒和/或病毒抗原的存在。免疫分析設(shè)計(jì)受大量各種因素影響,這些因素中許多是該技術(shù)領(lǐng)域中已知的。例如,免疫分析可使用一個(gè)病毒抗原,如第Ⅳ.A章節(jié)中描述的含有HCVcDNA的任何克隆中衍生出來的多肽,或從這些克隆的cDNAs中衍生的cDNAs組合物中得到的多肽,或可從產(chǎn)生這些克隆中cDNAs的HCV基因組中所得到的多肽;或者,免疫分析也可以使用從上述來源中衍生的病毒抗原的混合物。例如,它可使用一個(gè)直接抗病毒表位的單克隆抗體,直接抗一個(gè)病毒抗原的單克隆抗體的組合物,直接抗不同病毒抗原的單克隆抗體、直接抗相同病毒抗原的多克隆抗體或直接抗不同病原抗體的多克隆抗體。例如,試驗(yàn)方法基于競爭、或直接反應(yīng),或夾層型分析。而試驗(yàn)方法也可使用,如固體載體,或免疫沉淀。大多數(shù)分析都需要使用標(biāo)記的抗體和多肽;標(biāo)記可以是,例如熒光的、化學(xué)發(fā)光的、放射性的或染料分子。放大得自探針的信號(hào)的分析也是已知的;例如采用生物素和抗生物素蛋白的分析,以及酶標(biāo)和介導(dǎo)性的免疫分析,如ELISA分析。
HCV的黃病毒模型使人們可以預(yù)言病毒顆粒結(jié)構(gòu)蛋白的診斷表位。C、pre-M、M和E結(jié)構(gòu)域均可能包含可用于檢測病毒抗原,尤其是用于診斷的有意義的生物勢的表位。相似地,非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域可能含有重要的診斷表位(例如,編碼假定的聚合酶的NBS;和編碼假定的互補(bǔ)結(jié)合的抗原的NSI)。包括這些特異結(jié)構(gòu)域的表位的重組多肽或病毒多肽可能可用于在受感染的血供體和受感染的病人中檢測病毒抗體。
此外,在免疫分析中,直接抗E和/或M蛋白質(zhì)的抗體可用于檢測在帶有引起NANBH的HCV的病人體中和在受感染的血供體中的病毒抗原。更進(jìn)一步地,這些抗體對于急性期供體和病人的檢測是極有用的。
適用于免疫診斷和含有合適的標(biāo)記試劑的藥盒包括有關(guān)的材料,如置于一個(gè)合適的容器中的含有HCV表位的本發(fā)明的多肽或直接抗HCV表位的抗體,及保留的試劑和進(jìn)行分析所需的材料,以及一份實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書。
Ⅱ.J.用來自病毒基因組的cDNA衍生的探針對HCV基因組、病毒顆粒和病毒抗原的進(jìn)一步定性包括如圖1-22中所示的,在Ⅳ.A章節(jié)中描述的克隆中的HCVcDNA順序的信息可用于進(jìn)一步地了解HCV基因組的順序,及識(shí)別和分離HCV病毒的信息,以便于進(jìn)一步了解它的一些特性,包括基因組的性質(zhì)、病毒顆粒的結(jié)構(gòu)和所組成抗原的性質(zhì)。換句話說,該信息可以導(dǎo)致其它的多核苷酸探針、來自HCV基因組的多肽和直接抗HCV表位的抗體,該抗體可用于由HCV引起的NANBH的診斷和治療。
在上述的克隆中的cDNA順序的信息對于用于分離來自HCV基因組尚未確定的區(qū)域中其它c(diǎn)DNA順序的探針的設(shè)計(jì)是有用的,在Ⅳ.A.章節(jié)中描述的克隆中的cDNA是從該HCV基因組中衍生出來的。例如,在圖1,3,6,9,14和22中所顯示的從靠近HCVcDNA順序的族的5′-末端或3′末端的區(qū)衍生出來的含有約8或更多個(gè)核苷酸、較佳為20個(gè)或更多個(gè)核苷酸的標(biāo)記的探針可用于從HCVcDNAs庫中分離互相重疊的cDNA順序。該順序含有與上述克隆中的cDNA互相重疊的順序,但是也含有基因組的其它區(qū)域,上述克隆中的cDNA不是從這些區(qū)域中產(chǎn)生的,該順序可用于合成用于識(shí)別其它互相重疊片段的探針,這些片段與Ⅳ.A章節(jié)中描述的克隆不一定互相重疊。除非HCV基因組被截?cái)?,且產(chǎn)生的片段缺乏共同的順序,利用分離從病毒基因組中衍生出來的互相重疊的cDNA的技術(shù)來測定整個(gè)病毒基因組順序是可能的。但是,盡管這是不可能的,但如果基因組是缺乏共同順序的片段的基因組,則基因組的順序可以通過血清學(xué)地篩選λ-gt11HCVcDNA庫而檢測,如將Ⅳ.A章節(jié)中描述的克隆的分離和測序的技術(shù)用于分離克隆5-1-1,測分離到的cDNA順序和采用分離的cDNAs來分離互相重疊的片段。換句話說,基因片斷的特征可以是從由純化的HCV微粒分離出來的病毒基因組中得到的。用于純化HCV病毒顆粒和在純化過程中檢測它們的方法在本文的下面進(jìn)行了描述。用于從病毒顆粒中分離多核苷酸基因組的方法是現(xiàn)有技術(shù)中已知的,可以采納的一種方法顯示于實(shí)例Ⅳ.A.1中。然后,將分離的基因片段克隆和測序。因此,根據(jù)這里所提供的信息,克隆和測定HCV基因組順序而不考慮它們的性質(zhì)是可能的。
用于構(gòu)造cDNA庫的方法是現(xiàn)有技術(shù)中已知的,并在上面討論了;用λ-gt11構(gòu)造HCVcDNA庫的方法將在下面的Ⅳ.A章節(jié)中討論。但是,用核酸探針篩選時(shí)用的cDNA庫也可以用已有技術(shù)中已知的其它載體,如λ-gt10[Huynh等(1985)來構(gòu)造。通過從圖1-32的cDNAs衍生出來的探針和從這些cDNAs衍生的多核苷酸合成的探針來檢測的HCV衍生的cDNA可以通過用合適的限制酶(一個(gè)或多個(gè))消化分離的多核苷酸而從克隆中分離出來并測序。例如,可參見Ⅳ.A.3和Ⅳ.A.4兩個(gè)章節(jié),它們描述了用于分離和測定與克隆5-1-1的HCVcDNA互相重疊的HCVcDNA的順序的技術(shù),而Ⅳ.A.5-Ⅳ.A.7中則描述了與克隆81中的HCVcDNA互相重疊的HCVcDNA的分離和測序,Ⅳ.A.8和Ⅳ.A.9章節(jié)中描述了與克隆81互相重疊的另一克隆(克隆36)的分離和測序。
從這些互相重疊的HCVcDNAs中衍生的順序信息可用于測定病毒基因組中的同源性和異源性區(qū)域,它可表示出基因組中不同菌株和/或缺陷顆粒的群體的存在。它也可以用于設(shè)計(jì)雜交探針,以采用在Ⅱ.G章節(jié)中所描述的技術(shù)來測定在生物樣品中,和在HCV分離過程中(后面將討論)的HCV或HCV抗原或HCV核酸。更進(jìn)一步地,互相重疊的cDNAs可用于建立表達(dá)從HCV基因組衍生的多肽的載體,所述HCV基因組也編碼在克隆5-1-1,36,81,91,和1-2以及在Ⅳ.A章節(jié)中所描述的其它克隆中編碼的多肽。建立含有HCV表位的這些多肽的技術(shù),和直接抗HCV表位抗體的技術(shù)以及它們的使用均相似于對于從包含于前面和后面討論的克隆5-1-1,32,35,36,1-2,81,91中的NANBVcDNA順序衍生的多肽的描述。
克隆5-1-1,32,35,36,81,91,1-2和Ⅳ.A章節(jié)中所描述的其他克隆中的cDNA順序族編碼了含有對于HCV專一的表位的抗原;即,在用HAV或HBV感染的個(gè)體中,以及沒有被HCV感染的個(gè)體中不存在直接抗這些抗原的抗體(見Ⅳ.B章節(jié)中所顯示的血清數(shù)據(jù)。更進(jìn)一步地,將這些cDNAs的順序信息與HAV、HBV、HDV的順序以及基因“銀行”中的基因順序的比較指示出在這些cDNAs和這些來源的多核苷酸順序之間存在最小的同源性。因此,可直接抗在這些克隆的cDNAs中編碼的抗原的抗體可用于識(shí)別從感染的個(gè)體中分離出來的BB-NANBV顆粒。此外,它們也可用于分離NANBH病毒。
通過任何已有技術(shù)中已知的方法,例如以識(shí)別大小為依據(jù)的技術(shù)(如沉積或除去的方法),或以密度法為依據(jù)的技術(shù)(如密度梯度超離心法),或采用作用劑(如聚乙二醇)的沉淀法,或借助各種材料,如陰離子或陽離子交換材料和可借助疏水性而進(jìn)行連接的材料以及親和性的層析柱的色譜法,HCV顆粒可以從BB-NANBV感染的個(gè)體的血清中或從細(xì)胞培養(yǎng)物中分離出來。在分離過程中,HCV的存在可以通過抽提出的基因組的雜交分析而檢測。采用從上面所描述的HCVcDNAs所衍生的探針,或通過使用直接抗在圖1-32中所顯示的cDNA順序的族中所編碼的HCV抗原、或也使用直接抗在上面所描述的互相重疊的HCVcDNA順序中編碼的HCV抗原的抗體作為探針的免疫分析而測定。抗體可以是單克隆的,也可以是多克隆的,在用于免疫分析前先純化抗體可能是需要的。在Ⅳ.E章節(jié)中描述了直接抗克隆5-1-1中編碼的抗原的多克隆抗體的純化過程;對于直接抗其他HCV抗原的抗體可以采用相似的純化過程。
將直接抗在圖1-32中所顯示的cDNAs族中編碼的HCV抗原、以及在互相重疊的HCVcDNAs中編碼的抗原的抗體固定于固相載體上,則它們可用于通過免疫親和色譜法分離HCV。免疫親和色譜法的技術(shù)是已有技術(shù)中已知的,包括將抗體固定于固相載體上以使它們保留它們的免疫選擇活性的技術(shù);也可以是這些技術(shù),即將抗體吸附于載體上(例如,參考Kurstak“Enzymeimmunodiagnosis”,31-37),以及將抗體共價(jià)連接到載體上??偟恼f來,這些技術(shù)與所用的在Ⅱ.C章節(jié)中描述的抗原共價(jià)連接至固相載體上的技術(shù)相似;但是,空間基團(tuán)可能包含于雙官能偶合劑中,這樣,抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)保持易結(jié)合狀態(tài)。
在純化過程中,HCV的存在可以通過采用從圖1-32中所顯示的HCVcDNA順序族或從前述的互相重疊的HCVcDNA順序中衍生的多核苷酸作為探針的核酸雜交而檢測或證實(shí)。在這種情況下,在能引起病毒顆粒分裂的條件下處理組分,例如,在螯合劑存在下用界面活性劑處理,且病毒核酸的存在采用Ⅱ.H.章節(jié)中所描述的雜交技術(shù)測定。分離了的顆粒是誘導(dǎo)HCV的成分進(jìn)一步的證實(shí)可以通過用分離了的病毒顆粒感染黑猩猩,然后測定是否由感染而引起NANBV癥狀而獲得。
然后,可進(jìn)一步表示純化制備得的病毒顆粒的特征?;蚪M的核酸已經(jīng)進(jìn)行了純化。根據(jù)它對于核糖核酸酶敏感,而對于DNA酶不敏感,即顯示了病毒是由RNA基因組組成的。見后面的實(shí)例Ⅳ.C.2.。采有現(xiàn)有技術(shù)中已知的技術(shù),例如,通過電子顯微鏡進(jìn)行肉眼觀察,或在密度梯度中移動(dòng)和沉積特性可以確定它是線狀和環(huán)狀或非環(huán)狀。根據(jù)所控制的HCV基因組可以與HCVcDNAs的負(fù)鏈雜交,可以看到HCV可能包含RNA基因組正鏈(見Ⅳ.H.1章節(jié))。這種技術(shù)在例如,《酶法》(METHODSINENZYMOLOGY)中業(yè)已進(jìn)行了描述。此外,純化的核酸可以通過已知的技術(shù)(包括反轉(zhuǎn)錄等)進(jìn)行克隆和測序,因?yàn)榛蚪M材料是RNA。例如,可參考Maniatis(1982)和Glover(1985)。利用從病毒顆粒中衍生的核酸,測定整個(gè)基因組順序是可能的,而不管它是不是片段的。
檢查通過39c(見圖26)而得到的組合克隆14i的連續(xù)ORF中編碼的多肽的同源性,顯示出HCV多肽含有與黃病毒蛋白保守區(qū)的相應(yīng)蛋白質(zhì)同源的區(qū)域。它的一個(gè)實(shí)例在Ⅳ.H.3章節(jié)中進(jìn)行了描述。該發(fā)現(xiàn)具有很多重要的結(jié)果。第一,將該事實(shí)與表明HCV包含大小約為10,000個(gè)核苷酸的正鏈基因組的結(jié)果相聯(lián)系,表明它與HCV是一種黃病毒或類黃病毒的設(shè)想是一致的。一般說來,黃病毒的病毒體和它們的基因組具有相對一致的結(jié)構(gòu)和組織,它們是已知的。見Rice等人,(1988)和Brinton,M.A.(1988)。因此,編碼多肽C,pre-M/M和E的結(jié)構(gòu)基因可能固定于克隆14i的基因組上游的5′末端。更進(jìn)一步地,可以通過與其他黃病毒的比較,而預(yù)先確定編碼這些蛋白質(zhì)的順序的精確的位置。
在克隆14i中上游順序的分離可以通過這里所給出的信息中的幾種方法來達(dá)到,這對于該技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是明顯的。例如,基因組“移動(dòng)”(Walking)技術(shù)可用于分離5′到克隆14i中,但與該克隆互相重疊的那些順序;這樣依次導(dǎo)致了其他順序的分離。該技術(shù)將在下面的Ⅳ.A章節(jié)中進(jìn)一步論證。例如,人們也已知道黃病毒具有保守的表位和保守的核酸順序區(qū)域。含有保守的順序的多核苷酸可以用作為結(jié)合HCV基因組的探針,這樣,就使其可以分離。此外,采用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù),這些保守的順序與從圖22所顯示的HCVcDNAs衍生的順序一起,可用于設(shè)計(jì)在放大克隆14i的上游基因組順序的系統(tǒng)中有用的引物。它的一個(gè)實(shí)例將在下面描述。
HCV的結(jié)構(gòu)可以被測定,且它的組分可以分離。例如,其形態(tài)和大小可以用,例如電子顯微鏡來檢測。特異病毒多肽抗原(如外殼或外膜抗原)或內(nèi)抗原(如核酸結(jié)合蛋白質(zhì))、核心抗原和多核苷酸聚合酶的識(shí)別和位置也可以測定,例如,測定抗原是否以主要或次要病毒組分存在,以及采用直接抗分離的cDNAs中編碼的特定抗原的抗體作為探針。該信息可用于設(shè)計(jì)疫苗,例如,較佳地是將一外抗原包含于疫苗制劑中。多價(jià)疫苗可以含有,如從編碼結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的基因組衍生的多肽,如E以及得自基因組的其它部分的多肽,如非結(jié)構(gòu)的或結(jié)構(gòu)的多肽。
Ⅱ.K.用于HCV復(fù)制的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和動(dòng)物模型系統(tǒng)HCV是一種黃病毒或類黃病毒的設(shè)想也提供了使HCV生長的方法的信息。術(shù)語“類黃病毒”意指該病毒與已知的黃病毒的保守區(qū)具有很大的同源性,且其主要的基因組是單個(gè)ORF。培養(yǎng)黃病毒的方法是該技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員共知的(例如,可參考(Brinton等人的綜述(1986))。通常,培養(yǎng)HCV的合適細(xì)胞或細(xì)胞系可以包括已知的能支持黃病毒復(fù)制的那些,如下面的那些猴腎細(xì)胞系(如MK2,uFRO);豬腎細(xì)胞系(如PS);幼倉鼠腎細(xì)胞系(如BHK);鼠類巨噬細(xì)胞系(如P388 D1、MK1、Mm1);人體巨噬細(xì)胞系(如u-937);人體外周血液白細(xì)胞;人體粘連單細(xì)胞;肝細(xì)胞或肝細(xì)胞系(如Hu H7,Hep G2);胚胎或胚胎細(xì)胞(如雞胚成纖維細(xì)胞);或從無脊椎動(dòng)物,較佳是從昆蟲中得到的細(xì)胞系(如果蠅細(xì)胞系),或較佳地是從節(jié)肢動(dòng)物得到的細(xì)胞系,如蚊子細(xì)胞系(如A.Albopictus,Aedex孢子蟲;Cutex tritaeniorhynchus)或蜱細(xì)胞系(如RME-14革蜱parumapertus)。
培養(yǎng)先前所述的肝細(xì)胞,然后用HCV感染它是可能的;或者,肝細(xì)胞培養(yǎng)物從受感染個(gè)體(如人或黑猩猩)的肝中取得。后者是通過體外傳代并在體內(nèi)感染的細(xì)胞的一個(gè)例子。此外,各種傳統(tǒng)的方法可用于從肝細(xì)胞培養(yǎng)物中獲得細(xì)胞系。例如,先前的肝培養(yǎng)物(在肝細(xì)胞群加營養(yǎng)前和后的)可熔融到各種細(xì)胞中以維持穩(wěn)定性。例如,培養(yǎng)物也可以被轉(zhuǎn)化的病毒感染,或用轉(zhuǎn)化的基因轉(zhuǎn)染以建立永久的或半永久的細(xì)胞系。此外,如在肝培養(yǎng)物中的細(xì)胞可熔融到所建立的細(xì)胞系(如HepG2)中。用于細(xì)胞熔融的方法是該技術(shù)領(lǐng)域已知的,例如,使用熔融試劑,如聚乙二醇,Sendai病毒和Epstein-Barr病毒(非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒)。
如上所述的,HCV是一種黃病毒或類黃病毒。因此,通過該技術(shù)領(lǐng)域已知的用黃病毒感染細(xì)胞的技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞系的HCV感染是可能的。例如,它們包括,在病毒可進(jìn)入細(xì)胞的條件下,用病毒制劑培養(yǎng)細(xì)胞。此外,通過用分離的病毒多核苷酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞來獲得病毒制劑也是可能的。業(yè)已知道,外衣病毒和黃病毒RNAs對于各種脊椎動(dòng)物細(xì)胞系(Pfefferkorn和Shapiro(1974)),和蚊子細(xì)胞系(Peleg(1969))是有感染性的。用RNA復(fù)合物、正鏈RNAs和DNAs(包括cDNAs)來轉(zhuǎn)染組織培養(yǎng)細(xì)胞是該技術(shù)領(lǐng)域中已知的,例如,可包括使用電處理(electroporaion),用DEAE-Dextran或磷酸鈣沉淀的技術(shù)。通過在體外轉(zhuǎn)錄與完全基因組相應(yīng)的HCVcDNA可以獲得豐富的HCVcDNA源。用該物質(zhì)或用克隆的HCVcDNA轉(zhuǎn)染會(huì)引起病毒復(fù)制和體外病毒繁殖。
除培養(yǎng)的細(xì)胞以外,動(dòng)物模型系統(tǒng)可以用于病毒復(fù)制;動(dòng)物系統(tǒng)中的黃病毒是該技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員共知的(例如,可參考Monath的綜述(1986))。這樣,HCV復(fù)制不僅發(fā)生于黑猩猩中,而且還可發(fā)生于其他動(dòng)物,如土撥鼠和幼鼠中。
Ⅱ.L.抗HCV的抗病毒試劑的篩選細(xì)胞培養(yǎng)物和動(dòng)物模型系統(tǒng)對于HCV的有效性使人們能夠篩選可抑制HCV復(fù)制的抗病毒試劑,尤其是可篩選這些試劑,這些試劑在抑制病毒復(fù)制時(shí),可優(yōu)先地允許細(xì)胞生長和繁殖。這些篩選方法是該技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員周知的。通常,采用各種濃度的抗病毒試劑來試驗(yàn)它們在支持病毒復(fù)制的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中防止病毒復(fù)制和以后在動(dòng)物模型系統(tǒng)中抑制感染或病毒繁殖(和低水平毒素)的效果。
這里所提供的用于檢測HCV抗原和HCV多核苷酸的方法和組成可用于篩選抗病毒試劑,其中也提供了可選擇的,可能比細(xì)胞斑分析更靈敏的手段,以檢測病毒復(fù)制中試劑的效果。例如,這里所描述的HCV-多核苷酸探針可用于定在細(xì)胞培養(yǎng)物中所產(chǎn)生的病毒核酸的量。例如,這可以通過將感染的細(xì)胞核酸與標(biāo)記的HCV-多核苷酸探針雜交或競爭雜交而進(jìn)行。例如,使用這里所描述的免疫分析法,抗HCV抗體也可以用于在細(xì)胞培養(yǎng)物中的HCV抗原的定性和定量,此外,因?yàn)楦偁幏治鰰r(shí),在受感染的細(xì)胞培養(yǎng)物中HCV抗原的定量是需要的,所以,這里所描述的在HCVcDNAs中編碼的多肽在這些競爭分析中是有用的。通常,從HCVcDNA中得到的重組HCV多肽被標(biāo)記,因?yàn)樵诩?xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中產(chǎn)生抗原,對于這個(gè)標(biāo)記的多肽與HCV多肽的結(jié)合的抑制進(jìn)行了監(jiān)控。更進(jìn)一步地,當(dāng)HCV在細(xì)胞系中復(fù)制而不引起細(xì)胞死亡時(shí),這些技術(shù)是尤其有用的。
Ⅱ.M.HCV的弱毒菌株的制備除了上述的以外,采用組織培養(yǎng)系統(tǒng)和/或動(dòng)物模型系統(tǒng),就有可能分離HCV的弱毒菌株。這些菌株適用于疫苗或病毒抗原的分離。多次傳代后,在細(xì)胞培養(yǎng)物和/或動(dòng)物模型中弱毒的菌株是可以分離的。采用現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法可以進(jìn)行在受感染的細(xì)胞或個(gè)體中的弱毒菌株的測定,例如,可以包括作為探針的HCV中編碼的一個(gè)或多個(gè)表位的抗體的使用或作為探針的含有至少約8個(gè)核苷酸的HCV順序的多核苷酸的使用。或者,另外的情況為,弱毒菌株可以采用這里所提供的HCV的基因組信息和重組技術(shù)而構(gòu)造。通常,人們希望缺失基因組中編碼與致病因子相關(guān),而又允許病毒復(fù)制的多肽區(qū)域。此外,基因組結(jié)構(gòu)應(yīng)可以表達(dá)能夠使HCV的抗體失效的表位。然后,改造過的基因組可用于轉(zhuǎn)化允許病毒復(fù)制的細(xì)胞,且細(xì)胞在病毒可復(fù)制的條件下生長。弱毒HCV菌株不僅可用于疫苗,而且也可以作為病毒抗原的商業(yè)制品的來源,因?yàn)檫@些病毒的生產(chǎn)對于病毒生產(chǎn)和/或病毒產(chǎn)品生產(chǎn)中的雇員來說,不需要很嚴(yán)格的保護(hù)措施。
Ⅲ.通常的方法從病毒中抽提基因組、制備和探查cDNA庫、測克隆的順序、構(gòu)造表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化細(xì)胞、進(jìn)行諸如放射免疫分析和ELISA分析的免疫分析、使細(xì)胞在培養(yǎng)物中生長等一般技術(shù)是現(xiàn)有技術(shù)中已知的,實(shí)驗(yàn)室手冊詳細(xì)地描述了這些技術(shù)。但是,作為一般的指導(dǎo),下面提出了一些可有效地用于這些過程的方法和可用于進(jìn)行這些過程的材料。
Ⅲ.A.宿主和表達(dá)控制順序當(dāng)與所指定的宿主相容的合適的控制順序被使用時(shí),原核和真核宿主細(xì)胞均可用于表達(dá)所需要的編碼順序。原核宿主中,大腸桿菌是最常使用的。原核細(xì)胞的表達(dá)控制順序包括啟動(dòng)子,較佳地是還含有操縱基因部分和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。與原核宿主相容的轉(zhuǎn)移載體通常是從諸如pBR322一種含有載有氨芐青霉素和四環(huán)素抗性的操縱子的質(zhì)粒中衍生出來的,和含有提供抗生素抗性標(biāo)記的順序的各種pUC載體。這些標(biāo)記可用于篩選時(shí)獲得成功的轉(zhuǎn)化體。通常所使用的原核控制順序包括β-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)(Chang等人,(1977))。色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)(Goeddel等人,(1980))和λ-衍生PL啟動(dòng)子和N-基因核糖體結(jié)合位點(diǎn)(Shimatake等人(1981))和從trp和lac UV5啟動(dòng)子的順序中衍生的雜合tac啟動(dòng)子(De Boer等人(1983))。前面的系統(tǒng)與大腸桿菌是十分相容的;如果需要的話,其他原核宿主,如具有相應(yīng)的控制順序的芽孢桿菌或假單孢菌的菌株也可以使用。
真核宿主包括在培養(yǎng)系統(tǒng)中的酵母和哺乳動(dòng)物的細(xì)胞。啤酒酵母和卡氏酵母是最常用的酵母宿主,也是合適的真菌宿主。酵母相容載體攜帶標(biāo)記,通過提供原營養(yǎng)給營養(yǎng)缺陷型突變株或給野生型菌株提供抗重金屬抗性,所述的標(biāo)記就可以選擇成功的轉(zhuǎn)化體。酵母相容載體可以采用2微米的復(fù)制起點(diǎn)(Broach等人(1983)),CEN3和ARS1的結(jié)合體或可保證復(fù)制的其他手段,如會(huì)引起將合適的片段插入宿主細(xì)胞基因組的順序。酵母載體的控制順序是現(xiàn)有技術(shù)中已知的,它包括合成糖酵解酶的啟動(dòng)子(Hess等人(1968);Holland等人(1978)),其中包括了磷酸甘油酸激酶的啟動(dòng)子(Hitzmen(1980))。還可能包含終止了,如從烯醇化酶基因中衍生的終止子(Holland(1980))。尤其有用的控制系統(tǒng)是包含3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)啟動(dòng)子或乙醇脫氫酶(ADH)可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子、也是從GAPDH衍生出來的終止子。如果需要分泌,則還可包含來自酵母α因子的前導(dǎo)順序。此外,可操縱連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)和轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)可以不是野生型中天然的相關(guān)狀態(tài)。這些系統(tǒng)已在EPO120,551(1984年10月3日公開);EPO116,201(1984年8月22日公開);和EPO164,556(1985年12月18日公開)中詳細(xì)描述了,它們均轉(zhuǎn)讓給了本受讓者(發(fā)明人),這里均列為參考。
可用作表達(dá)宿主的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系是現(xiàn)有技術(shù)中已知的,它包括可從美國典型培養(yǎng)物中心(ATCC)中得到的很多永存的細(xì)胞系,其中包括HeLa細(xì)胞、中國大田鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系、幼鼠腎(BHK)細(xì)胞和許多其他的細(xì)胞系。與哺乳動(dòng)物細(xì)胞適應(yīng)的啟動(dòng)子也是現(xiàn)有技術(shù)中已知的,包括病毒啟動(dòng)子,如猿猴病毒40(SV40)(Fiers(1978))、羅氏肉瘤病毒(RSV)、腺病毒(ADV)和牛乳頭狀瘤病毒(BPV)的啟動(dòng)子。哺乳動(dòng)物細(xì)胞還需要終止順序和多聚腺苷酸附加順序;可增強(qiáng)表達(dá)的增強(qiáng)子順序也可包含在內(nèi),和能導(dǎo)致基因放大的順序也是需要的。這些順序均是現(xiàn)有技術(shù)中已知的。適于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制的載體包括病毒復(fù)制子或能保證將相應(yīng)的編碼NANBV表位的順序整合進(jìn)宿主基因組中的順序。
Ⅲ.B.轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化是采用任何已知的方法將多核苷酸引入宿主細(xì)胞,包括,如將多核苷酸包裝入病毒,通過直接攝入多核苷酸的方法用該病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞。所用的轉(zhuǎn)化過程取決于欲轉(zhuǎn)化的宿主。例如,用含有BB-NANBV順序的λ-gt11轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主細(xì)胞將在下面的實(shí)例中討論。通過直接攝入的細(xì)菌轉(zhuǎn)化通常采用氯化鈣和氯化銣的處理方法Cohen(1972);Maniatis(1982))。直接攝入的酵母轉(zhuǎn)化可采用Hinnen等(1978)的方法而進(jìn)行。直接攝入的哺乳動(dòng)物的轉(zhuǎn)化可以采用Graham和VanderEb(1978)的磷酸鈣沉淀法或各種已知的修飾法來進(jìn)行。
Ⅲ.C.載體構(gòu)造載體構(gòu)造采用現(xiàn)有技術(shù)中已知的技術(shù)。采用一合適的限制酶,通常在這些商業(yè)可購得的酶的制造商指定的條件下進(jìn)行專一位點(diǎn)的DNA裂解。通常,1個(gè)單位的酶于20微升緩沖液中,在37℃培養(yǎng)1-2小時(shí),可切開約1微克質(zhì)?;駾NA順序。用限制酶保溫后,蛋白質(zhì)通過用苯酸/氯仿抽提而去除,DNA用乙醇沉淀而復(fù)得。根據(jù)《酶學(xué)》(Enzymology)(1980)65499-560中所揭示的一般的方法,裂解后的片段可采用聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)而得以分離。
在合適的脫氧核苷三磷酸(dNTPs)存在于混合物中的情況下,采用大腸桿菌DNA聚合酶I(Klenow)可以使裂解片段的粘性末端變?yōu)殁g化末端。也可用S1核酸酶處理,結(jié)果導(dǎo)致任何的單鏈DNA部分水解。
連接是在標(biāo)準(zhǔn)的緩沖液和溫度條件下,采用T4DNA連接酶和ATP而進(jìn)行的;粘性末端的連接比鈍化末端的連接需要更少的ATP和更少的連接酶。當(dāng)載體片段被用作連接混合物的部分時(shí),通常用細(xì)菌堿性磷酸酯酶(BAP)或牛小腸堿性磷酸酯酶處理載體片段以除去5′-磷酸,這樣就防止了載體的再連接。另外,不要的片段的限制性酶解可用于阻止再連接。
將連接混合物轉(zhuǎn)化到合適的克隆宿主,如大腸桿菌中,并通過抗生素抗性而選擇成功的轉(zhuǎn)化體和篩選出正確的構(gòu)造。
Ⅲ.D.需要的DNA順序的構(gòu)造采用Warner(1984)所描述的自動(dòng)寡核苷酸合成器可以制備合成的寡核苷酸。如果需要,可采用32P-ATP存在下的多核苷酸激酶,在反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)條件下處理而將合成鏈“打上”32P的標(biāo)記。
包括從cDNA庫中分離出來的DNA順序在內(nèi)的DNA順序可以采用已知的技術(shù)而修飾,如在Zoller(1982)中所描述的定點(diǎn)誘變法。簡單地說,將欲修飾的DNA包裝到噬菌體內(nèi)作為一個(gè)單鏈順序,將采用與欲修飾的DNA部分互補(bǔ)的具有所需要的修飾順序的合成寡核苷酸作為引物,在DNA聚合酶的作用下將其轉(zhuǎn)化為雙鏈DNA。將所得到的雙鏈DNA轉(zhuǎn)化到維持噬菌體的宿主細(xì)菌中。將含有噬菌體的每一條鏈的復(fù)制產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌培養(yǎng)物涂布于瓊脂上以獲得噬菌斑。理論上來說,50%的新的噬菌斑含有具有突變順序的噬菌體,而50%則保留原來的順序。在雜交可進(jìn)行的溫度和條件下,噬菌斑的復(fù)制體與標(biāo)記的合成探針雜交,與校正的鏈,而不是與未修飾的順序進(jìn)行。雜交鑒定的順序被重新得到和克隆。
Ⅲ.E.采用探針雜交DNA庫可以用Grunstein和Hogness(1975)的方法進(jìn)行探查。簡單地說,在該方法中,將欲探查的DNA固定于硝酸纖維素濾紙上,變性后用含有0-50%甲酰胺、0.75M Na Cl、75mM檸檬酸鈉、0.02%(Wt/V)每一種牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、Ficoll、50mM磷酸鈉(PH6.5)、0.1%十二烷基磺酸鈉(SDS)和100微克/ml載體變性DNA的緩沖液進(jìn)行預(yù)雜交。在緩沖液中甲酰胺的濃度及預(yù)雜交和隨后的雜交步驟的時(shí)間和溫度都要根據(jù)需要的嚴(yán)度而定。不需要很嚴(yán)格的條件的寡聚物探針通常使用低百分含量的甲酰胺、較低的溫度和較長的雜交時(shí)間。而含有大于30或40個(gè)核苷酸(如從cDNA或基因組順序中衍生的核苷酸)的探針通常使用較高的溫度,如約40-42℃,和較高百分含量的甲酰胺,如50%。預(yù)雜交后,將5′-32P-標(biāo)記的寡核苷酸探針加入緩沖液,濾紙?jiān)谠摶旌衔镏校陔s交條件下培養(yǎng)。洗滌后,將處理后的濾紙進(jìn)行放射自顯影以顯示雜交探針的位置;在原始瓊脂板上相應(yīng)位置上的DNA被用作為所需DNA的源。
Ⅲ.F.結(jié)構(gòu)和順序的驗(yàn)證對于常規(guī)的載體構(gòu)造來說,連接混合物被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株HB101或其他合適的宿主中,選擇成功的轉(zhuǎn)化體通過抗生素抗性或其他標(biāo)記。然后,根據(jù)Clewell等人(1969)的方法從轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒,然后通常進(jìn)行氯霉素?cái)U(kuò)增(Clewell(1972))。通常用限制酶分析和/或測序分析分離到的DNA。測序可以通過由Sanger等人(1977)以及Messing等人(1981)進(jìn)一步描述的雙脫氧方法而進(jìn)行,也可采用Maxam等人(1980)的方法。根據(jù)Barr等人(1986)的方法,使用T-deazoguanosine可以克服有時(shí)在GC富集區(qū)所觀察到的條帶堆集問題。
Ⅲ.G.酶連免疫吸附分析酶連免疫吸附分析可用于測定抗原或抗體的濃度。該方法是憑借酶和抗原或抗體的結(jié)合,利用結(jié)合酶的活性作為定量的標(biāo)志。為了測定抗體,可將已知的抗原固定于固相(例如,小平板或塑料杯)中,用試驗(yàn)血清稀釋液進(jìn)行保溫,洗滌后,用酶標(biāo)記的抗免疫球蛋白保溫,再洗滌。適用于標(biāo)記的酶是現(xiàn)有技術(shù)已知的,例如,它們包括辣根過氧化物酶。與固相結(jié)合的酶的活性通過加入專一性底物,比色測定所形成的產(chǎn)物或底物的消耗。酶的結(jié)合活性是抗體結(jié)合量的直接函數(shù)。
為了測定抗原,可將已知的特異抗體固定于固相中,加入含有抗原的試驗(yàn)材料,保溫后洗滌固相,并加入第二種酶標(biāo)記的抗體。洗滌后,加入底物,與抗原濃度相關(guān)的酶活性用比色法來估計(jì)。
Ⅳ.實(shí)例下面將對本發(fā)明的實(shí)例進(jìn)行描述,它們只是為了說明本發(fā)明,而非將本發(fā)明局限于此范圍內(nèi)。從本描述中,在權(quán)項(xiàng)的范圍內(nèi)的多個(gè)具體例對于該領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說將是很明顯的。所提出的過程,如在Ⅳ.A.中所提出的,如果需要的話,可以重復(fù),但是不必須根據(jù)本發(fā)明提供的信息而構(gòu)造所需要的核苷酸順序的技術(shù)也是可行的。在大腸桿菌中的表達(dá)進(jìn)行了舉例說明,但是,其他系統(tǒng)也是可用的,如在Ⅲ.A.中提出了更完全的系統(tǒng)。從基因組中衍生的附加的表位也可以制備,并用于產(chǎn)生下面提出的抗體。
Ⅳ.A.HCVcDNA的制備、分離和測順序Ⅳ.A.1.HCVcDNA的制備初始的NANB病毒是從患有慢性NANBH的黑猩猩血漿液中取得的。該黑猩猩已進(jìn)行了從其他患有慢性NANBH的黑猩猩的血的感染實(shí)驗(yàn),而所述的NANBH是通過在從人體匯集血清中一批污染了的因子8濃縮液中HCV感染而得到的。通過將很多含有高水平的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性的單個(gè)血漿樣品混合而制備黑猩猩的血漿庫;該活性從由于HCV感染而損傷的肝臟中產(chǎn)生。因?yàn)?ml 10-6倍稀釋的該混合血清可以通過靜脈注射在其他黑猩猩中引起NANBH,它的CID至少為106/ml,即它具有高感染性的病毒效價(jià)。
高效價(jià)血漿混合液的cDNA庫是這樣產(chǎn)生的。首先,將病毒顆粒從血漿中分離出來;用含有50mMTris-HCl,pH8.0、1mMEDTA、100mMNaCl的310ml溶液來稀釋90ml原液。在15,000xg,20℃下離心20分鐘而將碎片去掉。然后,將所得到的上清液中的病毒顆粒用BeckmanSW28轉(zhuǎn)子,28,000rpm下,于20℃,離心5小時(shí)而制成沉淀。為了釋放出病毒基因組,可以將沉淀懸浮于含有1%十二烷基磺酸鈉(SDS)、10mlEDTA、10mMTris-HCl,pH7.5,或并含有2mg/ml蛋白酶K的15ml溶液中,然后在45℃培養(yǎng)90分鐘使顆粒裂解。加入0.8微克MS2細(xì)菌噬菌體作為載體,用苯酚∶氯仿為1∶1的混合物(苯酚用0.5MTris-HCl,pH7.5、0.1%(V/V)β-巰基乙醇、0.1%(w/v)羥基喹諾酮進(jìn)行飽和)抽提四次,然后再用氯仿抽提二次而將核酸分離出來。水相用1-丁醇濃縮,然后用2.5倍體積的無水乙醇進(jìn)行沉淀,在-20℃過夜。核酸用BeckmanSW41轉(zhuǎn)子,于40,000rpm,40℃下離心90分鐘而得到,并溶解于已用0.05%(v/v)焦碳酸二乙酯處理并高壓滅菌過的水中。
用17.5mM CH3Hg OH將上述過程中所得到的核酸(<2微克)變性;采用Huynh(1985)中所描述的方法利用該變性核酸作為模板而合成cDNA,并將其克隆至噬菌體λ-gtll的EcoRⅠ位點(diǎn),除了在用反轉(zhuǎn)錄酶合成第一條cDNA鏈(Taylor等人(1976)的過程中,用隨機(jī)引物來代替寡胸苷12-18。所得到的雙鏈cDNAs在瓊脂糖CL-4B柱中根據(jù)大小而進(jìn)行分離;將洗脫下來的大小約400、300、200和100個(gè)堿基對分別裝入cDNA容器1,2,3和4。從容器3的cDNA中可產(chǎn)生λ-gt11 cDNA庫。
從容器3的cDNA庫產(chǎn)生的λ-gt11 cDNA庫進(jìn)行表位的篩選,該表位能夠?qū)R坏嘏c從先行進(jìn)行NANBH試驗(yàn)過的病人中取得的血清相結(jié)合。采用Huynh等人(1985)的方法,除了結(jié)合的人體抗體是用已具有125I放射標(biāo)記的羊抗人Ig抗血清來測定,約有10個(gè)噬菌體用病人血清篩選出來了。5個(gè)陽性噬菌體被鑒定和純化。然后,將該5個(gè)陽性噬菌體進(jìn)行專一性結(jié)合試驗(yàn),即將其與從取自先行用NANBH病毒感染的8個(gè)不同的成人的血清相結(jié)合,采用與上述相同的方法。四個(gè)噬菌體所編碼的多肽只能與一個(gè)成人的血清有免疫反應(yīng),即該成人血清是用于初步篩選噬菌體庫的。第5個(gè)噬菌體(5-1-1)編碼的多肽可與8個(gè)試驗(yàn)血清中的5個(gè)有免疫反應(yīng)。而且,該多肽不能與取自7個(gè)正常血液供者的血清進(jìn)行免疫反應(yīng)。因此,很明顯,克隆5-1-1所編碼的多肽能被取自NANB病人的血清專一地免疫地識(shí)別。Ⅳ.A.2.在重組噬菌體5-1-1中HCVcDNA的順序和在該順序內(nèi)編碼的多肽的順序在重組噬菌體5-1-1中的cDNA采用Sanger等人(1977)的方法測序。實(shí)質(zhì)上,cDNA用EcoRⅠ切出,用凝膠電泳進(jìn)行大小分離。將EcoRⅠ限制片斷再克隆進(jìn)M13,mp18和mp19(Messing(1983)載體中,采用Sanger等人(1977)的脫氧鏈終止法進(jìn)行測序。所得到的順序列于表1中。
圖1中編碼的多肽,它是在HCVcDNA中編碼的,其與之相融合的β-半乳糖苷酶N末端部分具有相同的轉(zhuǎn)譯框架。如Ⅳ.A章節(jié)中所示的,5-1-1的轉(zhuǎn)譯“開放讀碼”(ORF)編碼能被受NANBH感染的病人和黑猩猩的血清專一識(shí)別的表位。
Ⅳ.A.3.與克隆5-1-1的cDNA互相重疊的HCVcDNA的分離通過用根據(jù)從克隆5-1-1中的HCVcDNA的順序合成的多核苷酸,篩選如Ⅳ.A.1章節(jié)中所描述的方法建立的相同的λ-gt11庫而獲得與克隆5-1-1的cDNA互相重疊的HCVcDNA,如圖1中所示的。用于篩選的多核苷酸順序是5′-TCCCTTGCTCGATGTACGGTAAGTGCTGAGAGCACTCTTCCATCTCATCGAACTCTCGGTAGAGGACTTCCCTGTCAGGT-3′用該探針,采用Huynh(1985)中所描述的方法,篩選λ-gt11庫。50000個(gè)克隆中約有1個(gè)與該探針雜交。含有與合成的探針雜交的cDNAs的3個(gè)克隆分別命名為81,1-2和91。
Ⅳ.A.4.與克隆5-1-1中的cDNA互相重疊的HCVcDNAs的核酸順序在克隆81、1-2和91中的三個(gè)cDNAs的核酸順序基本上以Ⅳ.A.2章節(jié)中描述的方法而測定。與噬菌體5-1-1的HCVcDNA順序有關(guān)的這些克隆的順序顯示于圖2中,它顯示了編碼需檢測的HCV表位的鏈,其中核酸順序中的同源性是通過順序之間的垂直線而指示出來的。
克隆的HCVcDNAs的順序在互相重疊區(qū)是高度同源的(見圖2)。但是,在兩個(gè)區(qū)中存在差異??寺?-2中核苷酸67是胸苷,而其他三個(gè)克隆則在該位置上是胞苷。但是,應(yīng)該看到,當(dāng)C或T占據(jù)該位置時(shí)可以編碼同樣的氨基酸。
第二個(gè)不同是克隆5-1-1含有28個(gè)在其他三個(gè)克隆中所沒有的堿基對。這些堿基對位于克隆5-1-1的cDNA順序的起點(diǎn)上,并通過小寫字母而指示出來。根據(jù)放射免疫分析的數(shù)據(jù)(將在下面的Ⅳ.D.章節(jié)中討論),HCV表位在這28個(gè)堿基對的區(qū)域中編碼是可能的。
克隆81、1-2和91缺乏5-1-1的28個(gè)堿基對可能意味著在這些克隆中的cDNA是從缺失的HCV基因組中衍生的;或者,28個(gè)堿基對區(qū)可能是克隆5-1-1的末端人工產(chǎn)物。
在克隆81和91的核苷酸順序中的小寫字母的順序簡單地指出了尚未在其他cDNAs中發(fā)現(xiàn)的這些順序,因?yàn)檫@些區(qū)的互相重疊的cDNAs迄今未被分離到。
從克隆5-1-1、81、1-2和91中的互相重疊的cDNAs中衍生的復(fù)合的HCVcDNA順序顯示于圖3中。但是,在該圖中,克隆5-1-1所獨(dú)具的28個(gè)堿基對被省去了。該圖也顯示了在復(fù)合的HCVcDNA的ORF中編碼的多肽的順序。
Ⅳ.A.5.與克隆81的cDNA互相重疊的HCVcDNAs的分離與克隆81的cDNA互相重疊的HCVcDNA部分及其上游順序的分離是這樣進(jìn)行的。采用與克隆81的5′末端順序同源的合成多核苷酸探針雜交而篩選在Ⅳ.A.1中所描述的方法而建立的λ-gt11庫克隆81的順序呈現(xiàn)于圖4中。用于篩選的合成多核苷酸的順序?yàn)?′CTGTCAGGTATGATTGCCGGCTTCCCGGAC3′.
所用的方法基本上按照Huynh(1985)所描述的,除了“庫”的濾紙要在嚴(yán)格的條件下洗滌2次,即洗滌是在5×SSC、0.1%SDS中,于55℃下每次洗滌30分鐘。50,000個(gè)克隆中約1個(gè)與探針雜交。將含有與該順序雜交的cDNA的陽性重組噬菌體分離和純化。該噬菌體現(xiàn)命名為克隆36。
與克隆81中的cDNA的羧酸末端順序互相重疊的下游cDNA順序采用與分離上游cDNA順序相似的方法而分離,除了所制備的合成寡核苷酸探針是與克隆81的3′末端順序同源的。用于篩選的合成多核苷酸的順序?yàn)?′TTTGGCTAGTGGTTAGTGGGCTGGTGACAG3′.
含有與這個(gè)順序后部雜交的cDNA的陽性重組噬菌體被分離和純化,并被命名為克隆32。
Ⅳ.A.6.克隆36中的HCVcDNA的核苷酸順序克隆36中的cDNA的核苷酸順序基本上采用Ⅳ.A.2章節(jié)中描述的方法測定。該cDNA的雙鏈順序、與克隆81的HCVcDNA互相重疊區(qū)域和通過ORF編碼的多肽均顯示于圖5中。
克隆36的ORF與克隆81中編碼的HCV抗原具有相同的轉(zhuǎn)譯框架。因此,在組合時(shí),克隆36和81的ORFs可編碼多肽,該多肽為大HCV抗原部分。該假定的HCV多肽的順序和編碼它的雙鏈DNA順序(它是從克隆36和81的HCVcDNAs的組合的ORFs中衍生的)均顯示于圖6中。
Ⅳ.A.7.克隆32中HCVcDNA的核苷酸順序克隆32中cDNA的核苷酸順序基本上以與Ⅳ.A.2中描述的測定克隆5-1-1順序的相似的方法而進(jìn)行測定。順序的數(shù)據(jù)表明,克隆32重組噬菌體中cDNA是從兩個(gè)不同來源中衍生的。該cDNA的一個(gè)片段是由從HCV基因組衍生物的418個(gè)核苷酸所組成;另一個(gè)片段則由從細(xì)菌噬菌體MS2基因組中衍生的172個(gè)核苷酸所組成,后者在制備λ-gt11血漿cDNA庫時(shí)被作為載體。
與HCV基因組的順序相應(yīng)的克隆32中cDNA的順序顯示于圖7中。圖中也表明了與克隆81的順序互相重疊的順序區(qū)以及由該ORF編碼的多肽。該順序包含一個(gè)連續(xù)的ORF,該ORF與由克隆81編碼的HCV抗原具有相同的轉(zhuǎn)譯框架。
Ⅳ.A.8.與克隆36的cDNA互相重疊的HCVcDNA的分離與克隆36的cDNA互相重疊的HCVcDNA部分及其上游順序的分離采用Ⅳ.A.5章節(jié)中描述的,分離與克隆81cDNA互相重疊的順序的方法而進(jìn)行,除了合成的多核苷酸是根據(jù)克隆36的5′區(qū)。用于篩選的合成多核苷酸的順序是5′AAGCCACCGTGTGCGCTAGGGCTCAAGCCC3′.
50,000個(gè)克隆中約1個(gè)與探針雜交。含有與該順序雜交的cDNA的重組噬菌體的分離和純化的克隆被命名為克隆35。
Ⅳ.A.9.克隆35中的HCVcDNA的核苷酸順序克隆35中cDNA的核苷酸順序基本上以Ⅳ.A.2章節(jié)中描述的方法進(jìn)行測定。該順序、與克隆36中cDNA的順序互相重疊的部分和這里假定的編碼的多肽,均顯示于圖8中。
很明顯,克隆35含有一單個(gè)的、連續(xù)的ORF,該ORF用與由克隆36、克隆81和克隆32編碼多肽時(shí)相同的轉(zhuǎn)譯框架來編碼多肽。圖9顯示了延伸到克隆35、36、81和32的長的連續(xù)的ORF順序,和假定的由其編碼的多肽。該組合順序已采用從相同的λ-gt11cDNA庫中衍生的其他獨(dú)立的cDNA克隆而加以證實(shí)了。
Ⅳ.A.10.與克隆35的cDNA互相重疊的HCVcDNA的分離與克隆35的cDNA互相重疊的HCVcDNA部分及其上游順序的分離以Ⅳ.A.8中所描述的,分離與克隆36cDNA互相重疊的順序相同的方法進(jìn)行,除了根據(jù)克隆35的5′區(qū)合成多核苷酸。用于篩選合成的多核苷酸的順序?yàn)?′CAGGATGCTGTCTCCCGCACTCAACGT3′50,000個(gè)克隆中約有1個(gè)與探針雜交。含有與該順序雜交的cDNA的重組噬菌體的分離和純化后的克隆被命名為克隆37b。
Ⅳ.A.11.克隆37b中HCV的核苷酸順序在克隆37b中cDNA的核苷酸順序基本上以Ⅳ.A.2中描述的方法測定。該順序及其與克隆35中cDNA的順序互相重疊的部分及其編碼的假定多肽均顯示于圖10中。
克隆35的5′末端核苷酸是T(胸苷),因而在克隆37b中相應(yīng)的核苷酸是A(腺苷)。已測定了在分離克隆37b的過程中分離到的其余三個(gè)獨(dú)立的克隆中的cDNAs的順序(如Ⅳ.A.10章節(jié)中描述的)。這些克隆的cDNAs的該位置上也是A(腺苷)。因此,克隆35中的5′末端T(胸苷)可能是克隆過程中的人工產(chǎn)物。業(yè)已知道,人工產(chǎn)物常常出現(xiàn)在cDNA分子的5′末端。
很明顯,克隆37b含有一個(gè)可編碼多肽的連續(xù)的ORF,該多肽是在經(jīng)過互相重疊的克隆35、36、81和32延伸的ORF中所編碼的多肽的延續(xù)。
Ⅳ.A.12.與克隆32中的cDNA互相重疊的HCVcDNA的分離克隆32的HCVcDNA下游順序的分離是這樣進(jìn)行的。首先,采用以克隆32中的HCVcDNA的核苷酸順序?yàn)榛A(chǔ)的合成雜交探針分離克隆cla。方法基本按照Ⅳ.A.5章節(jié)中所描述的,除了合成探針的順序是5′AGTGCAGTGGATGAACCGGCTGATAGCCTT3′.
利用克隆cla的核苷酸順序,可合成別的合成核苷酸,它具有下列順序5′TCCTGAGGCGACTGCACCAGTGGATAAGCT3′.
用克隆cla衍生的順序作為探針篩選λ-gt11庫,結(jié)果在50,000陽性菌落中約產(chǎn)生1個(gè)探針。與該探針雜交的分離和純化后的克隆被命名為克隆33b。
Ⅳ.A.13.克隆33b中的HCVcDNA的核苷酸順序克隆33b中cDNA的核苷酸順序基本上以Ⅳ.A.2章節(jié)中描述的方法進(jìn)行測定。該順序、及其與克隆32中的cDNA的順序互相重疊的部分和所編碼的假定的多肽均顯示于圖11中。
很明顯,克隆33b含有一個(gè)連續(xù)的ORF,它是在互相重疊的克隆37b、35、36、81和32中的ORFs的延續(xù)。在克隆33b中編碼的多肽與在這些互相重疊的克隆的延伸的ORF中編碼的多肽具有相同的轉(zhuǎn)譯框架。
Ⅳ.A.14.與克隆37b的cDNA以及與克隆33b的cDNA互相重疊的HCVcDNAs的分離為了分離與克隆37b和克隆33b的cDNA互相重疊的HCVcDNAs,根據(jù)這些克隆中的cDNAs順序合成的寡核苷酸探針被用于篩選λ-gt11庫,采用與Ⅳ.A.3章節(jié)中所描述的方法基本相同的方法進(jìn)行。所用探針為5′CAGGATGCTGTCTCCCGCACTCAACGTC3′和5′TCCTGAGGCGACTGCACCAGTGGATAAGCT3′它們用于測定含有分別與克隆37b和33b的順序重疊的HCVcDNA順序的菌落。用每一個(gè)探針,50,000個(gè)菌落中約1個(gè)被檢測到。含有與克隆37b的cDNA互相重疊及其上游的cDNA的克隆被命名為克隆40b。含有與克隆33b的cDNA互相重疊及其下游的cDNA的克隆被命名為克隆25C。
Ⅳ.A.15.在克隆40b和克隆25C中的HCVcDNA的核苷酸順序在克隆40b和克隆25c中的cDNAs的核苷酸順序基本按Ⅳ.A.2章節(jié)中所描述的方法測定。克隆40b和25c的順序、及其與克隆37b和33b的cDNAs互相重疊的部分,以及所編碼的假定的多肽均顯示于圖12(克隆40b)和圖13(克隆25c)中。
克隆40b的5′-末端核苷酸是G(胞苷)。但是,已測定了在分離克隆40的過程中分離到的5個(gè)其他獨(dú)立克隆中得到的cDNAs順序,如Ⅳ.A.14章節(jié)中所描述的。這些克隆中的cDNA在相應(yīng)的位置上含有T(胸苷)。因此,G可看成為克隆的人工產(chǎn)物(見Ⅳ.A.11章節(jié)中的討論)。
克隆25c的5′-末端是ACT,但在克隆cla中該區(qū)的順序(未顯示)和克隆33b中該區(qū)的順序是TCA。該不同也可以看成為克隆的人工產(chǎn)物,正如克隆5-1-1中的28個(gè)多余的5′-末端核苷酸。
很明顯,克隆40b和25c均含有一個(gè)ORF,它是在先前已測定了順序的克隆中連續(xù)的ORF的延續(xù)。在克隆40b、37b、35、36、81、32、33b和25c中延伸的ORF的核苷酸順序,及其所編碼的假定多肽的氨基酸順序均顯示于圖14中。在圖中,潛在的人工產(chǎn)物已從順序中省去了,代之的多重互相重疊的克隆的非5′-末端區(qū)的相應(yīng)的順序被顯示出來了。
ⅣA.16.由克隆36、81和32中的cDNAs制備一種HCVcDNA復(fù)合物復(fù)合HCVcDNA,即C100是如下構(gòu)建的。首先,以EcoRⅠ切斷克隆36、81和32中的cDNAs。把每個(gè)克隆的cDNAEcoRⅠ片段單獨(dú)克隆到載體pGEM3-藍(lán)(PromegaBiotec)的EcORⅠ位點(diǎn)。所得的含有克隆36、81和32中的cDNAs的重組載體分別被稱為pGEM3-藍(lán)/36、pGEM3-藍(lán)/81和pGEM3-藍(lán)/32。用NaeⅠ和NarⅠ消化pGEM3-藍(lán)/81適當(dāng)定向的重組體,并純化大片段(∽2850bp),與來自pGEM3-藍(lán)/36的NaeⅠ/NarⅠ純化限制片段(∽570bp)連結(jié)。這個(gè)來自克隆36和81的復(fù)合cDNAs用于產(chǎn)生另一種pGEM3-藍(lán)載體,它含有包含在這些克隆中的重疊cDNA內(nèi)的連續(xù)HCVORF。然后,用PVuIⅠ和EcoRⅠ消化這種新質(zhì)粒,形成一個(gè)大約680bp的片段。接著與分離適當(dāng)定向的pGEM3-藍(lán)/32質(zhì)粒的PVuIⅠ/EcoRⅠ小片段(580bp)連接。來自克隆36、81和32的復(fù)合cDNA連接在線性化的載體pSODcf1的EcoRⅠ上,這將在Ⅳ.B.1.節(jié)中敘述,它用于在細(xì)菌中表達(dá)克隆5-1-1。選擇含有復(fù)合HCVcDNA(C100)的∽1270bpEcoRⅠ片段的重組體,以EcoRⅠ切斷取自質(zhì)粒的cDNA,并且純化。Ⅳ.A.17.克隆14i、1ib、7f、7e、8h、33c、14c、8f、33f、33g和39c中HCVcDNAs的分離和核苷酸順序采用Ⅳ.A.1.節(jié)中所述的從HCVcDNAs入gt11庫中分離重疊cDNA片段的技術(shù)分離克隆14i、11b、7f、7e、8h、33c、14c、8f、33f、33g和39c的HCVcDNAs。所用的技術(shù)大體上如Ⅳ.A.3.節(jié)中所述,除了所用的探針是根據(jù)最后分離的克隆的核苷酸順序設(shè)計(jì)的,此克隆來自復(fù)合HCV順序的5′至3′末端。與以下所述的探針雜交的克隆頻率每例大約為1/50,000。
克隆14i、7f、7e、8h、33c、14c、8f、33f、33g和39c中的HCVcDNAs核苷酸順序基本上由Ⅳ.A.2節(jié)中所述來測定,除了自這些噬菌體中切斷cDNA被從克隆5-1-1中分離cDNA代替之外。
應(yīng)用基于克隆40b中的核苷酸順序的雜交探針分離克隆33c。圖12所示為克隆40b的核苷酸順序。用于分離33c的探針的核苷酸順序?yàn)?′ATCAGGACCGGGGTGAGAACAATTACCACT3′圖15所示為克隆33C中HCVcDNA順序以及與克隆40b中HCVcDNA重疊的順序,它還表明其中編碼的氨基酸。
應(yīng)用基于克隆33C中的核苷酸順序的探針分離克隆8h。該探針的核苷酸順序?yàn)?′AGAGACAACCATGAGGTCCCCGGTGTTC3′圖16所示為克隆8h中HCVcDNA順序和與克隆33C中的重疊的順序以及其中編碼的氨基酸。
應(yīng)用基于克隆8h中的核苷酸順序的探針分離克隆7e。該探針的核苷酸順序?yàn)?′TCGGACCTTTACCTGGTCACGAGGCAC3′圖17所示為克隆7e中的HCVcDNA順序和與克隆8h中的重疊的順序以及其中編碼的氨基酸。
用基于克隆25c中的核苷酸順序的探針分離克隆14C。圖13所示為克隆25C的順序。分離克隆14C的探針的順序?yàn)?′ACCTTCCCCATTAATGCCTACACCACGGGC3′圖18所示為克隆14C中的HCVcDNA順序和其與克隆25C中的重疊的順序以及其中編碼的氨基酸。
用基于克隆14C中的核苷酸順序的探針分離克隆8f。該探針的核苷酸順序?yàn)?′TCCATCTCTCAAGGCAACTTGCGCCGCTAA3′圖19所示為克隆8f中的HCVcDNA順序和其與克隆14C中的重疊的順序以及其中編碼的氨基酸。
用基于克隆8f中的核苷酸順序的探針分離克隆33f。該探針的核苷酸順序?yàn)?′TCCATGGCTGTCCGCTTCCACCTCCAAAGT3′圖20所示為克隆33f中的HCVcDNA順序和其與克隆8f中的重疊的順序以及其中編碼的氨基酸。
用基于克隆33f中的核苷酸順序的探針分離克隆33g。該探針的核苷酸順序?yàn)?′GCGACAATACGACAACATCCTCTGAGCCCG3′圖21所示為克隆33g中的HCVcDNA順序和其與克隆33f中的重疊的順序以及其中編碼的氨基酸。
用基于克隆7e中的核苷酸順序的探針分離克隆7f。該探針的核苷酸順序?yàn)?′CACCTATGTTTATAACCATCTCACTCCTCT3′圖23所示為克隆11b中的HCVcDNA順序和其與克隆7f中的重疊的順序以及其中編碼的氨基酸。
用基于克隆11b中的核苷酸順序的探針分離克隆14i。該探針的核苷酸順序?yàn)?′CTCTGTCACCATATTACAAGCGCTATATCA3′圖24所示為克隆14i中的HCVcDNA順序和其與克隆11b中的重疊的順序以及其中編碼的氨基酸。
用基于克隆33g中的核苷酸順序的探針分離克隆39C。該探針的核苷酸順序?yàn)?′CTCGTTGCTACGTCACCACAATTTGGTGTA3′圖25所示為克隆39C中的HCVcDNA順序和其與克隆33g中的重疊的順序以及其中編碼的氨基酸。Ⅳ.A.18.來自含HCVcDNA的分離克隆的復(fù)合HCVcDNA順序。
上述的分離克隆中的HCVcDNA順序已被連結(jié)形成復(fù)合HCVcDNA順序。從5′至3′方向排列好的分離克隆是14i、7f、7e、8h、33c、40b、37b、35、36、81、32、33b、25c、14c、8f、33f、33g以及39c。圖26所示為來自分離克隆的復(fù)合HCVcDNA順序以及其中編碼的氨基酸。
在建立該復(fù)合順序中,業(yè)已考慮到以下順序的異質(zhì)性??寺?3C含有一個(gè)800bp的HCVcDNA,它與克隆40b和37c中的cDNAs重疊。在克隆33c以及5種其他重疊克隆中,核苷酸#789為G。然而,在克隆37b(參見Ⅳ.A.11節(jié))中,相應(yīng)的核苷酸為A。這種順序的差異使其中編碼的氨基酸中形成一種明顯的異質(zhì)性,它對G或A來說分別為CYS或TYR。這種異質(zhì)性對蛋白質(zhì)折疊可能具有重要的分岐。故而,圖26已表明了這種順序異質(zhì)性,也表示了該復(fù)合HCVcDNA。
克隆8h中HCVcDNA中的核苷酸殘基#2為T。然而,如下所述,克隆7e中的相應(yīng)殘基為A;此外,在3種其他分離重疊克隆中也發(fā)現(xiàn)這個(gè)位置上為A。故而,克隆8h中的T殘基可以代表一種克隆假象。因此,在圖26中,這個(gè)位置中的殘基被指定為A。
克隆8fHCVcDNA中的3′-未端核苷酸為G。但是,克隆33f和2種其他重疊克隆中的相應(yīng)殘基為T。因此,在圖26中,這個(gè)位置上的殘基被指定為T。
克隆33fHCVcDNA中的3′-末端順序?yàn)門TGC。但是,克隆33g和2種其他重疊克隆中的相應(yīng)順序?yàn)锳TTC。因此,在圖26中,相應(yīng)的區(qū)域以ATTC表示。
克隆33gHCVcDNA中的核苷酸殘基#4為T。但是,在克隆33f和2種其他重疊克隆中,相應(yīng)殘基為A。因此,在圖26中,相應(yīng)的殘基被指定為A。
克隆14i的3′-末端為AA,而克隆11b以及3種其他克隆中的相應(yīng)二核苷酸為TA。因此,圖26中繪成TA殘基。
以上討論了其他順序異質(zhì)性的消除。
對復(fù)合HCVcDNA的檢驗(yàn)表明它含有一個(gè)大的ORF。這就表明病毒基因組被轉(zhuǎn)譯成伴隨轉(zhuǎn)譯或者隨后轉(zhuǎn)譯處理的一個(gè)大的多肽。Ⅳ.A.19.克隆12f、35f、19g、26g和15e中HCVcDNAs的核苷酸順序的分離基本上用Ⅳ.A.17.節(jié)中所述的方法分離克隆12f、35f、19g、26g、和15e中的HCVcDNAs,除了探針如下所述之外。在每種情況下,與探針雜交的克隆頻率約為1/50,000?;旧先纰?A.2.節(jié)中所述,測定這些克隆中HCVcDNAs的核苷酸順序,除了以來自所指一些克隆的cDNA代替由克隆5-1-1-中分離的cDNA之外?;诳寺?4i中核苷酸的順序,用一種雜交探針完成克隆12f的分離,它含有圖26中HCVcDNA的cDNA上游。該探針的核苷酸順序?yàn)?′TGCTTCTCCATGATGCTACTCATATCCCAA3′圖27中所示為克隆12f的HCVcDNA順序、其與克隆14i中的順序重疊部分以及其中編碼的氨基酸。
基于克隆39c中核苷酸的順序,用一種雜交探針完成克隆35f的分離,它含有圖26中HCVcDNA的cDNA下游。該探針的核苷酸順序?yàn)?′AGCAGCGGCGTCAAAAGTGAAGGCTAACTT3′圖28中所示為克隆35f順序,其與克隆39c中的順序重疊部分以及其中編碼的氨基酸。
基于克隆35f的3′順序,用一種雜交探針完成克隆19g的分離。該探針的核苷酸順序?yàn)?′TTCTCGTATGATACCCGCTGCTTTGACTCC3′圖29所示為克隆19g的HCVcDNA順序,其與克隆35f中的順序重疊部分以及其中編碼的氨基酸。
基于克隆19g的3′順序,用一種雜交探針完成克隆26g的分離。該探針的核苷酸順序?yàn)?′TGTGTGGCGACGACTTAGTCGTTATCTGTG3′圖30所示為克隆26g的HCVcDNA順序、其與克隆19g中的順序重疊部分以及其中編碼的氨基酸。
基于克隆26g的3′順序,用一種雜交探針分離克隆15e。該探針的核苷酸順序?yàn)?′CACACTCCAGTCAATTCCTGGCTAGGCAAC3′圖31所示為克隆15e的HCVcDNA順序、其與克隆26g中的順序重疊部分以及其中編碼的氨基酸。
本節(jié)中所述的一些克隆業(yè)已按Ⅱ.A.節(jié)中所述的條款和條件在ATCC保藏,登記號(hào)如下λ-gt11ATCC編號(hào)保藏日期克隆12f405141988年11月10日克隆35f405111988年11月10日克隆15e405131988年11月10日克隆kq-1405121988年11月10日在一些分離的克隆中的HCVcDNA順序被連結(jié)形成復(fù)合HCVcDNA順序。在5′至3′方向上被連結(jié)的一些分離克隆是12f、14i、7f、7e、8h、33c、40b、37b、35、36、81、32、33b、25c、14c、8f、33f、33g、39c、35f、19g、26g、以及15e。圖32所示為來自一些分離克隆的復(fù)合HCVcDNA順序以及其中編碼的氨基酸。
Ⅳ.A.20.分離克隆12f中的HCVcDNA順序的cDNA順序上游的可供選擇的方法基于來自克隆12f中的HCVcDNA的圖32中的大多數(shù)5′HCV順序,合成逆轉(zhuǎn)錄酶的小合成寡核苷酸引物并且用于結(jié)合到相應(yīng)于上游順序的引物逆轉(zhuǎn)錄的HCV基因組RNA中的順序。引物順序是與公知克隆125的5′未端順序近端的,但是要下游到足以允許引物的探針順序上游的設(shè)計(jì)。采用引發(fā)和克隆的公知的標(biāo)準(zhǔn)方法。用引發(fā)位點(diǎn)的順序上游篩選所得的cDNA庫(如從克隆12f中的說明的順序中減去)。從NANBH黑猩猩或者從NANBH人的類似樣本中的質(zhì)?;蛘吒螛颖局蝎@得HCV基因組RNA。
Ⅳ.A.21.利用后接使順序與HCV基因組的5′未端區(qū)分離的可供選擇的方法為了分離HCVRNA基因組的未端5′未端順序,用Oligoc后接逆轉(zhuǎn)錄第一循環(huán)的cDNA產(chǎn)物,它具有兩倍模板RNA。這通過培養(yǎng)在CTP存在下具有未端轉(zhuǎn)移酶完成。利用Oligoc作為一種逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)的引物完成cDNA合成的第二循環(huán),其中獲得cDNA第一條鏈的補(bǔ)體。基因組HCVRNA的來源如Ⅳ.A.20節(jié)中所述。以未端轉(zhuǎn)移酶后接以及逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)的方法如Maniatis等人(1982)中所述。然后,cDNA產(chǎn)物被克隆、篩選以及排順序。
Ⅳ.A.22.利用后接使順序與HCV基因組的3′未端區(qū)分離的可供選擇的方法本方法是基于前面所用的克隆黃熱病毒RNA的cDNAs。在本方法中,RNA經(jīng)狀態(tài)變性去除3′未端上第二構(gòu)建,然后用rATP作為底物,以polyA多聚酶后接。再用OligodT作為引物,由逆轉(zhuǎn)錄酶催化polyA后接的RNA的逆轉(zhuǎn)錄。合成cDNA的第二條鏈,cDNA產(chǎn)物被克隆、篩選以及排順序。
Ⅳ.A.23.建立含有較大cDNA插入體的λ-gt11HCVcDNA庫用于建立和篩選λ-gt11庫的方法基本上如Ⅳ.A.1.節(jié)中所述,除了該庫由自SepharoseCL-4B柱中洗脫的較大尺寸cDNAs的匯集體形成之外。
Ⅳ.A.24.用合成低聚物作為引物建立HCVcDNA庫由來自Ⅳ.A.1.節(jié)中所述的感染黑猩猩質(zhì)粒庫的RNA以及由來自該感染動(dòng)物的肝的polyARNA部分制備新的HCVcDNA庫。基本上如Gubler和Hoffman(1983)所述構(gòu)建cDNA,除了第一cDNA鏈合成用的引物是兩種基于上述的HCV基因組的合成低聚物之外。基于克隆11b和7e的順序的引物分別為5′CTGGCTTGAAGAATC3′和5′AGTTAGGCTGGTGATTATGC3′把所得cDNAs克隆到入噬菌體載體中,再用其他不同的合成低聚物篩選,該低聚物順序基于圖32中所示的HCV順序。
Ⅳ.B.編碼在HCVcDNAs內(nèi)的多肽的表達(dá)和作為HCV誘導(dǎo)抗原的表達(dá)產(chǎn)物的識(shí)別Ⅳ.B.1.編碼在克隆5-1-1中的多肽的表達(dá)編碼在克隆5-1-1中的HCV多肽(參見上述Ⅳ.A.2.節(jié))在過氧化物岐化酶(SOD)的作用下表達(dá)為融合多肽。這一過程是通過把克隆5-1-1cDNA插入體再克隆到如下所述的表達(dá)載體pSODcfl[Steimer等人(1986年)],中完成的。
首先,用BamH1和EcoRⅠ處理自pSODcf1中分離的DNA,再把以下接頭連到經(jīng)限制性酶切的線性DNA上
5′GATCCTGGAATTCTGATAA3′3′GACCTTAAGACTATTTTAA5′克隆以后,分離含有插入體的質(zhì)粒。
用EcoRⅠ酶切含有插入體的質(zhì)粒,以EcoRⅠ切斷克隆5-1-1中的HCVcDNA插入體,再連到經(jīng)EcoRⅠ酶切的線性質(zhì)粒DNA上。DNA混合物被用來轉(zhuǎn)化E.Coli菌株D1210[Sadler等人(1980)]。圖1顯示了在正確的ORF表達(dá)方向中的5-1-1cDNA重組子,此重組子可被限制性酶譜和核苷酸順序識(shí)別。
通過使細(xì)菌在IPTG存在下生長,來自一種克隆的重組體細(xì)菌可被誘導(dǎo)表達(dá)SOD-NAN B5-1-1多肽。
Ⅳ.B.2.克隆81中編碼的多肽的表達(dá)克隆81中的HCV cDNA表達(dá)SOD-NANB81融合多肽。編碼這種融合多肽的載體的制備方法與形成編碼SOD-NANB5-1-1的載體的方法相似,除了HCV cDNA的來源是克隆81之外,它的分離如Ⅳ.A.3.節(jié)中所述,而測定cDNA順序如Ⅳ.A.4.節(jié)中所述。圖4所示為克隆81中的HCV cDNA的核苷酸順序以及其中編碼的多肽的推測氨基酸順序。
以EcoRⅠ切斷克隆81中插入的HCVcDNA,并連到含有接頭(參見Ⅳ.B.1)并用EcoRⅠ處理后線性化的pSODcf1上。DNA混合物被用來轉(zhuǎn)化E.Coli菌株D1210。圖4顯示了在正確的ORF表達(dá)方向中的克隆81HCVcDNA重組子,此重組子可被限制性酶譜和核苷酸順序識(shí)別。
通過使細(xì)菌在IPTG存在下下生長,來自一種克隆的重組體細(xì)菌可被誘導(dǎo)表達(dá)SOD-NANB81多肽。
Ⅳ.B.3.編碼在克隆5-1-1內(nèi)的多肽作為HCV和NANBH相關(guān)的抗原的識(shí)別通過證明用NANBH感染的黑猩猩和人的血清與融合多肽、SOD-NANB5-1-1有免疫反應(yīng),可以識(shí)別編碼在克隆5-1-1的HCV cDNA內(nèi)的多肽為一種NANBH相關(guān)抗原SOD-NANB5-1-1是由在其N-末端上的過氧化物岐化酶和C-末端的結(jié)構(gòu)內(nèi)5-1-1抗原組成,這一過程由如下的“Western”印跡(“Western”blotting)[Towbin等人(1979)]來完成。
通過在IPTG存在下生長,用編碼Ⅳ.B.1.節(jié)中所述的SOD-NANB5-1-1多肽的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌重組菌株被誘導(dǎo)表達(dá)融合多肽。根據(jù)Laemmli(1970)法,在SDS存在下總的細(xì)菌溶菌液在聚丙烯酰胺凝膠上電泳。把分離的多肽轉(zhuǎn)移在硝酸纖維濾紙上[Towbin等人(1979)]。然后,把濾紙切成薄條帶,每一條帶單獨(dú)地與不同的黑猩猩和人的血清培養(yǎng)。如Ⅳ.A.1.節(jié)中所述,再與125I-標(biāo)記的羊抗人Ig培養(yǎng)檢測結(jié)合的抗體。
圖33所示為用于Western印跡的黑猩猩血清的特性以及在放射性自顯影條帶的照片上所示的結(jié)果。在急性NANBH(Hutchinson菌株)感染(1-16道)、肝炎A感染(17-24道和26-33道)以及肝炎B感染(34-44道)期間,在不同的時(shí)間從黑猩猩采集血清與含有多肽的硝酸纖維條帶一起培養(yǎng)。25和45道表示陰性對照,其中免疫印跡(immunoblots)是用在λ-gt11cDNA庫的原始篩選中用以識(shí)別重組克隆5-1-1(參見Ⅳ.A.1)的病人血清進(jìn)行培養(yǎng)。
在圖23中對照道25和45中的可見帶反映3抗體與SOD融合多肽的NANB5-1-1部分的結(jié)合。這些抗體并不顯示僅僅與SOD結(jié)合,因?yàn)樵谶@些樣本中的陰性對照也包括在內(nèi),而且表現(xiàn)為遷移速度比SOD-NANB5-1-1融合多肽快得多的帶。
圖33的1-16道表示4只黑猩猩的血清樣本中的抗體的結(jié)合;該血清采自NANBH感染之前以及接著的急性感染期中。由圖可見,與SOD-NANB5-1-1多肽發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體不在感染HCV之前感染的早期急性階段的血清樣本中,4只動(dòng)物都在急性后期或者緊接急性期階段誘發(fā)針對這種多肽的循環(huán)抗體。
在3號(hào)和4號(hào)黑猩猩中,在免疫印跡中所觀察到的附加帶是由于背景與宿主細(xì)菌蛋白質(zhì)結(jié)合的緣故。
與用以NANBH感染的黑猩猩的血清獲得的結(jié)果相反,在以HAV感染的4只黑猩猩或者以HBV感染的3只黑猩猩中并未觀察到抗融合多肽的NANB5-1-1部分的抗體的形成。在這些樣本中唯一的結(jié)合是背景與宿主細(xì)菌蛋白質(zhì)的結(jié)合,這也出現(xiàn)在HCV感染的樣本中。
圖34所示為用于Western印跡的人血清的特性以及在放射性自顯影條帶的照片上所示的結(jié)果。在NANBH感染(1-21道),HAV感染(33-40道)以及HBV感染(41-49道)期間,在不同的時(shí)間從人體采集的血清,與含有多肽的硝酸纖維素條帶一起培養(yǎng)。25和50道表示陽性對照,其中免疫印跡是用在上述的λ-gt11庫的原始篩選中所用的病人血清進(jìn)行培養(yǎng)。22-24道和26-32道表示“無感染”對照,其中的血清來自“正?!钡墓┭?。
如圖34所示,來自九位NANBH病人的血清,包括用于篩選λ-gt11庫的血清,含有抗融合多肽的NANB5-1-1部分的抗體。三位患NANBH病人的血清不含這些抗體。在這些病人中以后有可能形成抗NANB5-1-1抗體也有可能,那些血清無反應(yīng)的個(gè)體,是具有不同的NANBV致病體,因而不發(fā)生免疫反應(yīng)。
圖34還表明,許多感染HAV和HBV的病人的血清并不含有抗NANB5-1-1抗體,而且這些抗體也不在取自“正?!睂φ战M的血清中。雖然一個(gè)HAV病人(36道)似乎含有抗NANB5-1-1抗體,但是這可能是由于這位病人以前曾感染過HCV,因?yàn)镹ANBH的發(fā)病率是很高的而且往往無癥狀。
血清學(xué)研究指出,克隆5-1-1中的cDNA編碼可被感染BB-NANBV的病人和動(dòng)物的血清特異性識(shí)別的一些表位。此外,cDNA似乎并非從靈長類動(dòng)物基因組中得到。一種由克隆5-1-1或者由克隆81構(gòu)成的雜交針,在獨(dú)特的單拷貝基因可被檢測的情況下,與來自未感染個(gè)體的對照人和黑猩猩基因組DNA的“Southern”印跡(“Southern”blots)。不雜交。這些探針與對照?;蚪MDNA的Southern印跡也不雜交。
Ⅳ.B.4在克隆36、81和32中的HCVcDNAs復(fù)合體中編碼的多肽的表達(dá)編碼在延伸穿過克隆36、81和32的ORF中的HCV多肽在具有SOD時(shí)表達(dá)為一個(gè)融合多肽。這一過程的完成是把復(fù)合cDNA、C100插入含有人體過氧化物岐化酶基因的表達(dá)盒中,再把該表達(dá)盒插入酵母表達(dá)載體中,在酵母中表達(dá)多肽。
表達(dá)盒包含從克隆36、81和32中得到復(fù)合C100、cDNA,它是把∽1270bp EcoRⅠ片段插入載體pS3-56(也稱之為PS356)的EcoRⅠ位點(diǎn),獲得質(zhì)粒pS3-56C100而構(gòu)成的。C100的構(gòu)建如上Ⅳ.A.16節(jié)中所述。
載體pS3-56是pBR322衍生物,它含有一個(gè)表達(dá)盒,該表達(dá)盒由人過氧化物岐化酸基因上游的ADHL/GAPDH雜交酵母啟動(dòng)子下游的GAPDH轉(zhuǎn)錄終止子組成。Cousens等人(1987)已描述了一種相似的盒,它含有這些控制因子和過氧化物岐化酶基因。其中受托者一般占有的共同待批1986年10月1日公開的歐洲專利申請EPO196,056,然而,pS3-56中的盒與Cousens等人(1987)的盒的不同之處在于缺少異種胰島素原基因和免疫球蛋白接點(diǎn),以及接在過氧化物岐化酶的gln154后面是含有EcoRⅠ位點(diǎn)的轉(zhuǎn)接順序。轉(zhuǎn)接順序如下5′-AATTTGGGAATTCCATAATGAG-3′ACCCTTAAGGTATTACTCAGCT當(dāng)含有該盒的載體表達(dá)時(shí),EcoRⅠ位點(diǎn)使插入的異種順序產(chǎn)生多肽,后者通過含有氨基酸順序-asn-leu-gly-ile-arg-的一個(gè)寡肽接頭,而與過氧化物岐化酶融合。
pS356的一樣本業(yè)已在1988年4月29日按照布達(dá)佩斯條約的條款保藏在美國典型培養(yǎng)物收集中心(ATCC),地址12301ParklawnDr.,Rockville,Margland20853,USA,登記號(hào)為67683。有關(guān)該保藏物的可用性和使用以及保藏物的保存條款和條件均與Ⅱ.A.節(jié)中對含有NANBV-CDNAs的菌株所規(guī)定的相同。該保藏物僅為方便,由說明書看來,并不要求實(shí)施本發(fā)明。因此,保藏物在本文中僅供參考。
含有正確方向插入的C100 cDNA的重組子被分離后,用BamHT切斷來自pS3-56C100的含有C100 cDNA的表達(dá)盒,再分離和純化含有該盒的∽3400bp片段。然后,把該片段插入酵母載體pAB24的BamHT位點(diǎn)中。
圖35中顯示了質(zhì)粒pAB24的重要特征,它是一種酵母穿梭載體,它含有完整的2微米復(fù)制順序[Broach(1981)]和pBR322順序。它還含有來自質(zhì)粒YEp24[Botstein等人(1979)]酵母URA3基因以及來自質(zhì)粒pc1/l的酵母LEU2d基因,歐洲專利局公開第116,201號(hào)。質(zhì)粒pAB24是通過用EcoRⅠ消化YEp24以及再消化載體去除部分2微米順序來構(gòu)建的。所得質(zhì)粒YEp24△RⅠ通過用CIaⅠ消化并用業(yè)已用CIaⅠ線性化的完整的2微米質(zhì)連結(jié)線性化。然后,所得的質(zhì)粒pC Bou用XbaⅠ消化以及凝膠上分離8605bp載體片段。這種分離的XbaⅠ片段與含有由pC1/1中分離的LEU基因的4460bp XbaⅠ片段連接;LEU2d基因的取向與URA3基因的方向相同。表達(dá)插入是pBR322順序的唯一BamHⅠ位點(diǎn),這樣,中斷細(xì)菌抗四環(huán)素基因。
把含有SOD-C100表達(dá)盒pAB24C100-3的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌株JSC308以及轉(zhuǎn)化其他的酵母菌株。如Hinnen等人(1978)所述,使細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化并接種在ura-選擇性培養(yǎng)板上。把單個(gè)菌落接種在leu-選擇性培養(yǎng)基中,生長到飽和。通過在含有1%葡糖的YEP中生長,誘發(fā)培養(yǎng)物表達(dá)SOD-C100多肽(被稱之C100-3)。
菌株JSC308具有在ADRⅠ位上整合的基因型MAT,leu2,ura3(del)DM15(GAP/ADR1)。在JSC308中,陽性激活劑基因產(chǎn)物ADR1的過度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致過大去阻遏作用(相對于ADR1野生型對照)以及在通過ADH2USA調(diào)節(jié)系統(tǒng)合成蛋白質(zhì)時(shí)這種表達(dá)的異種蛋白質(zhì)的收獲率相當(dāng)高。酵母菌株JSC308的構(gòu)建在與本文同時(shí)提交的共同待批的美國專利申請(申請?zhí)栠€不知,代理文擋號(hào)2300-0229)中說明,因此,僅供參考。JSC308的一樣本已于1988年5月5日按布達(dá)佩斯條xqy條件保藏在ATCC,登記號(hào)為20879。有關(guān)保藏物的可用性和使用以及保藏物的保存條款和條件均與ⅡA節(jié)中對含有HCVcDNAs菌株所規(guī)定的相同。
編碼在pAB24C100-3中的完整的C100-3融合多肽應(yīng)當(dāng)含有在氨基未端上的154種人的SOD的氨基酸、以及來自含有EcoRⅠ位點(diǎn)的合成的轉(zhuǎn)接體的5種氨基酸殘基、來自C100cDNA的363種氨基酸殘基,以及來自連接克隆32中HCVcDNA順序的MS2核苷酸順序的5種羧基未端氨基酸(參見Ⅳ.A.7.節(jié))。圖36中所示為以SOD的倒數(shù)第二位Ala殘基開始的這種多肽的羧基未端的推測氨基酸順序;它還表明了這部分多肽編碼的核苷酸順序。
Ⅳ.B.5.在C100內(nèi)編碼的多肽作為NANBH相關(guān)的抗原的識(shí)別以大小表示由酵母菌株JSC308中的質(zhì)粒pAB24C100-3表達(dá)的C100-3融合多肽的特征,并通過其與具有慢性NANBH病人的血清的免疫學(xué)反應(yīng)性把在C100內(nèi)編碼的多肽的看作是NANBH相關(guān)抗原。
對如Ⅳ.B.4.節(jié)中所述表達(dá)的C100-3多肽分析如下。用pAB24或者pAB24C100-3轉(zhuǎn)化酵母JSC308細(xì)胞,并且誘導(dǎo)其表達(dá)編碼多肽的異種質(zhì)粒在1ml培養(yǎng)物(OD~20650nm)中,被誘導(dǎo)的酵母細(xì)胞以每分鐘10,000轉(zhuǎn)離心1分鐘,使之沉淀,再使其與2體積溶液和1體積玻璃珠(直徑為0.2毫微米)強(qiáng)力地旋轉(zhuǎn)而溶解。該溶液含有50mM Tris-HCl,pH8.0,1mM EDTA,1mM苯基甲磺酰氟(PMSF)以及1微克/毫升pepstatin。溶菌液中包括C100-3多肽的不溶性物質(zhì)用離心(每分鐘10,000轉(zhuǎn),5分鐘)收集,然后煮沸5分鐘使其溶解在Laemmli SDS試樣緩沖液中(參見Laemmli(1970)]。按照Laemmli(1970)方法,在SDS存在下與0.3毫升誘導(dǎo)的酵母培養(yǎng)物等量的多肽在10%聚丙烯酰胺凝膠上電泳。在該凝膠上同時(shí)電泳標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。用考馬斯亮藍(lán)(coomassie brilliant blue)使含有表達(dá)的多肽的凝膠染色,或者如Ⅳ.B.2.節(jié)中所述,用采自慢性NANBH的病人的血清作“Western”印跡,以測定從pAB24和pAB24C100-3表達(dá)的多肽的免疫學(xué)反應(yīng)性。
圖37所示為其結(jié)果。圖37A中,用考馬斯亮藍(lán)使多肽染色。1道(pAB24)、2道和3道所示分別為來自用pAB24轉(zhuǎn)化的JSC308的不溶性多肽和來自用pAB24C100-3轉(zhuǎn)化的JSC的兩個(gè)不同菌落的不溶性多肽。2道和3道與1道的比較表明,來自用pAB24C100-3轉(zhuǎn)化的JSC308的一種多肽相應(yīng)的分子量為∽54,000道爾頓(dalton)的誘導(dǎo)表達(dá),在以pAB24轉(zhuǎn)化的JSC308中不誘導(dǎo)。箭頭表示所說的多肽。
圖37B所示為用pAB24(1道)或者用pAB24C100-3(2道)轉(zhuǎn)化的JSC308中表達(dá)的不溶性多肽的Western印跡的結(jié)果。
由pAB24表達(dá)的多肽并不與NANBH病人的血清起免疫反應(yīng)。然而,如箭頭所示,用pAB24C100-3轉(zhuǎn)化的JSC308所表達(dá)的分子量為∽54,000道爾頓的多肽,與NANBH病人的血清起免疫反應(yīng)。2道中的其他免疫反應(yīng)性多肽可能是這個(gè)∽54,000道爾頓多肽的降解和(或)聚合的產(chǎn)物。
Ⅳ.B.6.融合多肽C100-3的純化通過抽取表達(dá)多肽的宿主酵母細(xì)胞不溶性部分的分級(jí)提取來純化在N-未端上有SOD和在C-未端上有結(jié)構(gòu)內(nèi)C100HCV-多肽的融合多肽C100-3。
如Ⅲ.B.4.節(jié)中所述,用pAB24C100-3轉(zhuǎn)化的酵母菌珠JSC308可以表達(dá)融合多肽C100-3。然后,通過均化作用使酵母細(xì)胞溶解,在pH12.0下,提取溶菌液中的不溶性物質(zhì),再在含有SDS的緩沖液中,使保留在不溶部分中的C100-3溶解。
酵母溶菌液基本上按照Nagahuma等人的方法(1984)制備。制備酵母細(xì)胞懸液,即把33%(v/v)細(xì)胞懸浮在含有20mMTris-HCl,pH8.0,1mM二硫蘇糖醇以及1mM苯基甲磺酰氟(PMSF)的溶液(緩沖液A)中。使懸浮液(15毫升)與等體積的玻璃珠(直徑0.45-0.50毫米)混合,把混合物放在SuperMixer(LabLineInstruments,Inc.)上以最高速度旋轉(zhuǎn)8分鐘。分離勻漿和玻璃珠,然后,用與一開始裝入細(xì)胞相同體積的緩沖液A洗滌玻璃珠三次。把洗液和勻漿液合并之后,在4℃以7,000×g使勻漿離心15分鐘,沉淀物再懸浮于相當(dāng)于二倍的開始裝入細(xì)胞的體積的緩沖液A中,7,000×g離心15分鐘使之再沉淀,從而獲得溶菌液中的不溶物質(zhì)。這種洗滌工序重復(fù)三次。
在pH12.0下,提取溶菌液中的不溶物質(zhì)。使沉淀懸浮在含有0.5MNaCl、1mMEDTA的緩沖液中,懸液體積等于開始裝入的細(xì)胞時(shí)體積的1.8倍。添加0.2體積0.4MpH12.0的磷酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)懸浮液的pH值?;旌现螅瑧乙涸?℃以7,000×g離心15分鐘,去除上清。重復(fù)提取二次。提取的沉淀通過使其懸浮在0.5MNaCl、1mMEDTA中,用相當(dāng)于二倍的開始裝入細(xì)胞的體積的懸液洗滌,接著在4℃以7,000×g離心15分鐘。
通過用SDS處理,使在提取的沉淀中的C100-3多肽溶解。沉淀懸浮在相當(dāng)于開始裝入細(xì)胞體積的0.9倍的緩沖液A中,再添加0.1體積2%SDS。懸液混合之后,在4℃以7,000×g離心15分鐘。所得沉淀用SDS提取三次以上。匯集所得的含有C100-3的上清。
本過程從酵母勻漿的不溶部分得到10倍以上純化的C100-3,多肽的收獲率大于50%。
按照Laemmli(1970)法用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析融合多肽的純化制劑。據(jù)此分析,多肽的純度大于80%,分子量大約54,000道爾頓。Ⅳ.C.與HCVcDNA雜交的感染個(gè)體中RNA的識(shí)別Ⅳ.C.1.與HCVcDNA雜交的患NANBH的黑猩猩肝中RNA的識(shí)別如下已證明,患NANBH的黑猩猩的肝內(nèi)有一種RNA,通過Northern印跡顯示它能與克隆81內(nèi)HCVcDNA雜交。
采用Maniatis等人(1982)所述的從哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)分離總RNA以及分成poly A+和poly A兩部分的方法,從得到高滴度血漿的黑猩猩活體解剖肝中分離RNA(參見Ⅳ.A.1.節(jié))。這些RNA在甲醛/瓊脂糖凝膠(1%w/v)上電泳并被轉(zhuǎn)移到硝酸纖維紙上[Maniatis等人(1982)]。硝酸纖維紙與來自克隆81的放射性標(biāo)記的HCV cDNA雜交(參見圖4插入的核苷酸順序)。為了制備放射性標(biāo)記探針,用DNA多聚酶Ⅰ通過切口轉(zhuǎn)移,以32P標(biāo)記自克隆81中分離的HCV cDNA插入子[Maniatis等人(1982)]。在一種含有10%(w/v)硫酸葡聚糖、50%(w/v)去離甲酰胺、750mM NaCl、75mM檸檬酸鈉、20m MNa2HPO4(pH6.5)、0.1%SDS、0.02%(w/v)牛血清蛋白(BSA)、0.02%(w/v)Ficoll-400、0.02%(w/v)聚乙烯吡咯烷酮、100微克/毫升用聲處理和變性剪切的鮭精DNA以及106CPM/ml切口轉(zhuǎn)移cDNA探針的溶液中在42℃雜交18小時(shí)。
圖38所示為被探濾紙的放射自顯影。1道含有32P標(biāo)記的限制斷片標(biāo)記物。2-4道含有如下黑猩猩肝RNA∶2道含有30微克總RNA;3道含有30微克polyA-RNA;4道含有20微克polyA′RNA。如圖32所示,患NANBH的黑猩猩的肝含有一種與polyA′RNA分子有關(guān)的異種種群,它可與HCV cDNA探針雜交,其大小似乎由大約5000核苷酸到大約11,000核苷酸組成。這種與HCV cDNA雜交的RNA可能代表病毒基因組和(或)病毒基因組的特殊轉(zhuǎn)錄本。
以下的Ⅳ.C.2.節(jié)中所述的試驗(yàn)與HCV含有RNA基因組的假設(shè)是一致的。
Ⅳ.C.2.受感染個(gè)體的血清中含RNA的HCV的識(shí)別如Ⅳ.A.1節(jié)中所述,從高滴度NANBH黑猩猩血漿中分離的顆粒提取核酸。把分離的核酸的等分試樣(相當(dāng)于1毫升原始血漿)重懸在20微升50mMHepes(pH7.5)、1mmEDTA以及16微克/毫升酵母可溶性RNA的溶液中。煮沸5分鐘后立即冷凍使樣本變性,用RNA酶A[5微升含0.1mg/mlRNA酶A25mMEDTA、40mMHepes(pH7.5)]或DNA酶Ⅰ[5微升含1單位DNA酶、10mMMgCl、25mMHepes(pH7.5)中含有1單位DNA酶Ⅰ]處理;對照樣本在無酶下孵育。孵育后加入230微升含有2微克/毫升酵母可溶性RNA的冰凍2XSSC,樣本在硝酸纖維紙上過濾。濾物與來自克隆81的cDNA探針雜交,該探針以缺口轉(zhuǎn)移法用32P標(biāo)記。圖39所示為濾物的放射性自顯影。在用DNA酶處理的和對照樣本中(分別為2道和1道)檢測到雜交信號(hào),但在用RNA酶處理的樣本(3道)中沒有檢測到。由于用RNA酶A處理破壞了從微粒中分離的核酸,而DNA酶Ⅰ處理并無影響,此充分證明了HCV基因組由RNA組成。
Ⅳ.C.3.從患NANBH黑猩猩的肝和血漿樣品中的HCV核酸順序得到的被放大的HCV核酸順序的檢測應(yīng)用大體上由Saiki等人(1986)所述的多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù),放大存在于患NANBH黑猩猩的肝和血漿以及對照黑猩猩中的HCV核酸。從克隆81或者克隆36和37的HCVcDNA順序得到引物寡核苷酸。通過凝膠電泳和Southem印跡,用兩引物之間,但并不包括兩引物的區(qū)間內(nèi)的順序的合適的cDNA寡聚物作為探針,探測放大順序。
從患NANBH的三只黑猩猩的活體解剖肝中和從二只對照黑猩猩中分離含有受放大系統(tǒng)檢驗(yàn)的HCV順序的RNA樣本。RNA部分的分離按Ⅳ.C.1.節(jié)中所述的硫氰酸胍過程。
還從患NANBH的二只黑猩猩的血漿中、從一只對照黑猩猩中以及對照黑猩猩的血漿庫中分離受放大系統(tǒng)1檢驗(yàn)的RNA樣本。一只受感染的黑猩猩有106或大于106的CID/ml,另一受感染的黑猩猩有105或大于105的CID/ml。
按如下從血漿中提取核酸。用一種含有10微克/毫升多聚腺苷酸的TENB/蛋白酶K/SDS溶液
,把0.1毫升或者0.01毫升血漿稀釋到最終體積為1.0毫升,再在37℃下培養(yǎng)60分鐘。在這種蛋白酶K消化之后,用TE[10.0mMTris-HCl(pH8.0)、1mMEDTA]飽和酚提取,使所得的血漿部分去蛋白。離心分離酚相,用含0.1%SDS的TENB重提取。匯集每次提取的所得水相,再用等體積的酚/氯仿/異戊醇[1∶1(99∶2)]提取二次,然后用等體積氯仿/異戊醇(99∶1)混合物提取二次。接著,離心分離,水相被加至最終濃度為0.2M醋酸鈉中,加入二倍體積乙醇使核酸沉淀。在以38K速度旋轉(zhuǎn)的SW41轉(zhuǎn)子中,4℃超離心60分鐘收集沉淀的核酸。
除了上述之外,按Chomcyzski和Sacchi(1987)法,用50微克polyA載體提取高滴度黑猩猩血漿或是匯集起來的對照血漿。這一過程使用一種酸性硫氰酸胍提取液。在Eppendorf小管中,4℃10,000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘回收RNA。
在兩種情況下,在cDNA以PCR反應(yīng)合成之前,通過結(jié)合和從S和SElutip-R柱中洗脫進(jìn)一步純化用蛋白酶K/SDS/酚方法從血漿中提取的核酸。以下過程按制備者的指導(dǎo)進(jìn)行。
如上所述所制備的,從核酸(總的核酸或者RNA)中得到用作PCR反應(yīng)模板的cDNA。乙醇沉淀后使沉淀的核酸干燥,重懸在經(jīng)DEPC處理的蒸餾水中。在65℃下加溫10分鐘,使核酸中二級(jí)結(jié)構(gòu)破壞,并立即在冰上冷卻樣本。用1-3微克來自肝的,或者從10-100微升血漿中提取的核酸(或RNA)的總黑猩猩RNA合成cDNA。合成使用反轉(zhuǎn)錄酶,而且按照由制備者BRL規(guī)定的議定書,在25微升反應(yīng)液中反應(yīng)。如下所述,cDNA合成的引物是也在PCR反應(yīng)中所用的引物。cDNA合成的所有反應(yīng)混合物含有23單位RNA酶抑制劑-RNASIN(Fisher/Promega)。cDNA合成后,用水稀釋反應(yīng)混合物,煮沸10分鐘,在冰上快速冷卻。
PCR反應(yīng)基本上按照制備者的指導(dǎo)(Cetus-Perkin-Elmer)進(jìn)行,除了添加1微克RNA酶A之外。反應(yīng)的最終體積為100微升。PCR反應(yīng)按37℃、72℃和94℃的規(guī)則完成35個(gè)周期。
從克隆81、克隆36或者克隆37b中的HCVcDNA順序得到合成cDNA和PCR反應(yīng)的引物。(圖4、5和10分別表示克隆81、36和37b的HCVcDNA順序。)從克隆81中得到的兩種16-mer引物的順序?yàn)?′CAATCATACCTGACAG3′和5′GATAACCTCTGCCTGA3′從克隆36中得到的引物的順序?yàn)?′GCATGTCATGATGTAT3′從克隆37b中得到的引物的順序?yàn)?′ACAATACGTGTGTCAC3′在PCR反應(yīng)中,引物對由來自克隆81的兩種16-mer,或者由來自克隆36的16-mer和來自克隆37b的16-mer組成。
采用堿性凝膠電泳,分離PCR反應(yīng)產(chǎn)物,再進(jìn)行Southern印跡,以及用來自與引物不重疊的一段HCV cDNA的32P標(biāo)記內(nèi)部寡核苷酸探針分析PCR反應(yīng)產(chǎn)物。用酚/氯仿提取PCR反應(yīng)混合物,再用鹽和乙醇從水相中沉淀出核酸。離心收集沉淀的核酸,再溶解在蒸餾水中。等分試樣在1.8%堿性瓊脂糖凝膠上電泳。在該凝膠使60、108和161核苷酸長度的單鏈DNA與分子量標(biāo)記物共同電泳。電泳之后,使凝膠中的DNAs轉(zhuǎn)移到Biorad Zeta探針紙上。預(yù)雜交、雜交和洗滌條件均按制備者(Biorad)的規(guī)定。
用于雜交檢測放大的HCVcDNA順序的探針如下。當(dāng)PCR引物對來自克隆81時(shí),該探針為一個(gè)108-mer,其順序與處在兩個(gè)引物間的順序相對應(yīng)。當(dāng)PRC引物對來自克隆36和37b時(shí),該探針是來自克隆35的缺口轉(zhuǎn)譯HCVcDNA插入子。這些引物是來自克隆37b插入子的155-170核苷酸和來自克隆36插入子的208-268核苷酸。克隆35中的HCVcDNA插入子的3′末端與克隆36中的插入子的1-186核苷酸重疊;而克隆35插入子的5′末端與克隆37b中插入子207-269核苷酸重疊。(比較圖5、8和10)這樣,克隆35中的cDNA插入子跨越了部分產(chǎn)生引物的克隆36和37b間的順序,它可被用作一種放大順序的探針,此順序包括這些引物。
對肝樣本中RNA的分析是按照上述過程,運(yùn)用了幾組引物和探針來進(jìn)行的?;糔ANBH的三只黑猩猩的肝中的RNA對預(yù)期大小(161和586核苷酸分別為81和36及37b的)的放大順序產(chǎn)生陽性雜交結(jié)果,而對照黑猩猩則產(chǎn)生陰性雜交結(jié)果。試驗(yàn)重復(fù)三次均得到相同的結(jié)果。
血漿中核酸和RNA的分析也是按照上述過程,運(yùn)用了來自克隆81的引物和探針來進(jìn)行的。血漿取自患NANBH的二只黑猩猩、一只對照黑猩猩,以集對照黑猩猩的血漿庫。兩種NANBH血漿均含有在PCR放大試驗(yàn)中呈陽性結(jié)果的核酸/RNA,而兩種對照血漿均呈陰性結(jié)果。這些結(jié)果已被多次重復(fù)得到。
Ⅳ.D.檢測受感染個(gè)體血清中HCV抗體的放射免疫試驗(yàn)按TSU和Herzenberg(1980)法,研制了檢測抗HCV抗原的抗體的固相放射免疫試驗(yàn)。用含有HCV表位的純化多肽包被微量滴定板(Immulon2,Removawell條帶)。用可能含有抗HCV表位抗體的人的血清樣本或者適當(dāng)?shù)膶φ战M血清樣本與包被的板共同培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中,如有抗體,則免疫性地結(jié)合在固相抗原上。去除未結(jié)合的物質(zhì)、洗滌微量滴定板之后,通過用125I標(biāo)記的羊抗人免疫球蛋白培養(yǎng)檢測人抗體-NANBV抗原復(fù)合物。用吸收去除未結(jié)合的標(biāo)記抗體,洗滌該板。測定每井的放射性;井中結(jié)合的人抗HCV抗體的量與放射性成比例的。
Ⅳ.D.1.融合多肽SOD-NANB5-1-1的純化如Ⅳ.B.1.節(jié)中所述的在重組體細(xì)胞中表達(dá)的融合多肽SOD-NANB5-1-1通過用尿素對細(xì)胞提取物作分級(jí)提取,隨后在陰、陽離子交換柱上層析,從重組E.Coli中進(jìn)行純化。具體如下把1升培養(yǎng)物中的Thawed細(xì)胞重懸在含有0.01M Tris-HCl(pH8.0)的10毫升20%(W/V)蔗糖中,再加入0.4毫升0.5MEDTA(pH8.0)。在0℃下放置5分鐘后,混合物4,000×g離心10分鐘。把所得的沉淀物懸浮在含有0.05M Tris-HCl(pH8.0)、1mM苯基甲磺酰氟(PMSF)和1微克/毫升pepstatin A的10毫升25%(W/V)蔗糖中,接著添加0.5毫升溶菌酶(10毫克/毫升),在0℃下培養(yǎng)10分鐘。在0.05M Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA中加10毫升1%(V/V)Triton X-100之后,混合物在0℃繼續(xù)培養(yǎng)10分鐘偶而搖動(dòng)。在無菌的20號(hào)皮下注射針中培養(yǎng)6次以攪勻所得的粘性溶液,再以13,000×g離心25分鐘。把沉淀物懸浮在5毫升0.01M Tris-HCl(pH8.0)中,以4,000×g離心10分鐘。把含有SOD-NANB5-1-1融合蛋白的沉淀溶在有0.02M Tris-HCl(pH8.0)、1mM二硫蘇糖醇的5毫升6M尿素中(緩沖液A),并且裝入用緩沖液A平衡的Q-瓊脂糖快速流動(dòng)柱。在緩沖液A中用0.0-0.3M NaCl的線性梯度洗脫多肽。洗脫后,在SDS存在下用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析這些部分,以測定其SOD-NANB5-1-1的含量。把含有這種多肽的一些部分匯集起來,并使其在含有0.02M磷酸鈉緩沖液(pH6.0)、1mM二硫蘇醇的6M尿素(緩沖液B)中透析。把透析后的樣本裝入用緩沖液B平衡的S-瓊脂糖速流動(dòng)柱,再在緩沖液B中用0.0-0.3M NaCl線性梯度洗脫。在SOD-NANB5-1-1存在下,用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析這些部分,把適合的部分匯集起來。
在SDS存在下,用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測SOD-NANB5-1-1多肽的最終制劑。基于這種分析,該制備的純度大于80%。
Ⅳ.D.2融合多肽SOD-NANB81的純化通過用尿素使細(xì)胞提取物分級(jí)提取,然后采用分離融合多肽SOD-NANB5-1-1中所述的過程(參見Ⅳ.D.1.節(jié))在陰、陽離子交換柱上層析,從重組E.Coli.中純化如Ⅳ.B.2.節(jié)中所述的在重組細(xì)菌中表達(dá)的融合多肽SOD-NANB81。
在SDS存在下,用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測SOD-NANB81多肽的最終劑。基于這種分析,該制劑的純度大于50%。
Ⅳ.D.3.用固相放射免疫試驗(yàn)檢測抗HCV表位的抗體用放射免疫試驗(yàn)(RIA)分析32名被確診的NANBH病人的血清樣本,檢測抗存在于融合多肽SOD-NANB5-1-1和SOD-NANB81中的BB-NANBV表位的抗體。
用Ⅳ.D.1.節(jié)和Ⅳ.D.2.節(jié)分別純化的SOD-NANB5-1-1和SOD-NANB81包被微量滴定板。試驗(yàn)如下進(jìn)行。
在0.125M硼酸鈉緩沖液(pH8.3)、0.075M NaCl(BBC)中含有0.1-0.5微克SOD-NAMB5-1-1或者SOD-NANB81,將此溶液的100微升等分試樣加入到微量滴定板的每個(gè)井中(Dynatech Immulon 2,Removawell條帶)。在濕盒內(nèi)、4℃下,使該板培養(yǎng)過夜,之后去除蛋白質(zhì)溶液,用含有0.02% Triton X-100的BBS(BBST)洗滌井三次。為了防止非特異性結(jié)合,每井用在BBS中添加100微升5毫克/毫升BSA溶液的牛血清白蛋白(BSA)包被,接著在室溫下培養(yǎng)1小時(shí);培養(yǎng)后棄去BSA溶液。使包被在井上的多肽與血清反應(yīng),該血清中加有100微升在0.01M磷酸鈉緩沖液(pH7.2)、0.15M NaCl(PBS)及含10mg/ml BSA的溶液中以1∶100稀釋的血清樣本,有血清的井在37℃下培養(yǎng)1小時(shí)。培養(yǎng)之后,吸去血清樣本,用BBST洗滌井五次。通過把125I-標(biāo)記的F′(ab)2羊抗人Ig G連在包被的井上,測定結(jié)合在融合多肽上的抗-NANB5-1-1和抗-NANB81。將100微升標(biāo)記探針的等分試樣(比活性5-20微居里/微克)加入到每個(gè)井中,在37℃下使該板培養(yǎng)1小時(shí),接著吸去多余探針,用BBST洗滌5次。在7放射線的計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù),測定每個(gè)井中結(jié)合的放射活性量。
表1所示為患NANBH個(gè)體中抗-NANB5-1-1和抗-NANB81的檢測結(jié)果。
表1NANB、HAV和HBV肝炎病人血清中抗-5-1-1和抗-81的檢測病人參考S/N數(shù)及編號(hào)診斷抗-5-1-1抗-811.281慢性 NANB,IVD20.77 4.20慢性NANB,IVD1.145.14慢性NANB,IVD2.114.052.291AVH3,NANB,散發(fā)的 1.09 1.05慢性,NANB33.8911.39慢性NANB36.2213.673.301AVH,NANB,IVD 1.90 1.54慢性NANB,IVD34.1730.28慢性NANB,IVD32.4530.844.31 慢性 NANB,PT416.09 8.055.321晚期 AVH NANB,IVD 0.69 0.94晚期AVHNANB,IVD0.730.686.331AVH,NANB,IVD 1.66 1.96AVH,NANB,IVD1.530.567.341慢性 NANB,PT 34.40 7.55慢性NANB,PT45.5513.11慢性NANB,PT41.5813.45慢性NANB,PT44.2015.488.351AVH NANB,IVD 31.92 31.95新近“痊愈”6.874.45NANB,AVH9.36LateAVHNANBPT11.845.7910.37AVHNANB,IVD6.521.3311.38晚期AVHNANB,PT39.4439.1812.39慢性NANB,PT42.2237.5413.40AVH,NANB,PT1.351.1714.41慢性NANB?PT0.350.28
病人參考S/N數(shù)及編號(hào)診斷抗-5-1-1抗-8115.42AVH,NANB,IVD6.252.3416.43慢性NANB,PT0.740.6117.44AVH,NANB,PT5.401.8318.45慢性,NANB,PT0.520.3219.46AVH,NANB23.354.4520.47AVH,TypeA1.601.3521.48AVH,TypeA1.300.6622.49AVH,TypeA1.440.7423.50最近分辨AVH,0.480.56TypeA24.51AVH,TypeA0.680.64最近分辨AVH,TypeA0.800.6525.52最近分辨AVH,1.381.04TypeA最近分辨AVH,0.800.65TypeA26.53AVH,TypeA1.851.16最近分辨AVH,1.020.88TypeA27.54AVH,TypeA1.350.7428.55晚期AVH,HBV0.580.5529.56慢性liCHBV0.841.0630.57晚期AVH,HBV3.201.6031.58慢性HBV0.470.4632.591AVH,HBV 0.73 0.60痊愈AVH,HBV0.430.4433.601AVH,HBV 1.06 0.92痊愈AVH,HBV0.750.68
病人參考S/N編號(hào)診斷抗-5-1-1抗-8134.611AVH,HBV 1.66 0.61痊愈AVH,HBV0.630.3635.621AVH,HBV 1.02 0.73痊愈AVH,HBV0.410.4216.631AVH,HBV 1.24 1.31痊愈AVH,HBV1.550.4517.641AVH,HBV 0.82 0.79痊愈AVH,HBV0.530.3738.651AVH,HBV 0.95 0.92痊愈AVH,HBV0.700.5039.661AVH,HBV 1.03 0.68痊愈AVH,HBV1.711.391.取自這些病人的有效的順序血清試樣2.IVD=靜脈內(nèi)給藥者3.AVH=急性病毒肝炎4.PT=轉(zhuǎn)輸后由表1可見,就抗存在于SOD-NANB5-1-1和SOD-NANB81中的HCV表位的抗體而論,取自被診斷為患NANBH的病人的32份血清中的19份是陽性的。
然而,陽性的血清樣本并不等于與SOD-NANB5-1-1和SOD-NANB81有免疫學(xué)反應(yīng)。1號(hào)病人的血清樣本對SOD-NANB81是陽性的,但是對SOD-NANB5-1-1就不是陽性的。10號(hào)、15號(hào)和17號(hào)病人的血清樣本對SOD-NANB5-1-1是陽性的,但是對SOD-NANB81卻不是。3號(hào)、8號(hào)、11號(hào)和12號(hào)病人的血清樣本同等地與兩種融合多肽反應(yīng),而2號(hào)、4號(hào)、7號(hào)和9號(hào)病人的血清樣本與SOD-NANB5-1-1反應(yīng)比與SOD-NANB81反應(yīng)高2-3倍。據(jù)這些結(jié)果,表明NANB5-1-1和NANB81至少可能含有三種不同的表位;也就是說,可能每種多肽至少含有一個(gè)唯一的表位,而二個(gè)多肽至少可以共有一個(gè)表位。
Ⅳ.D.4針對NANBH的固相RIA的特異性針對NANBH的固相RIA的特異性是通過分析感染HAV或HBV的病人的血清及對照個(gè)體的血清來測試的。這種運(yùn)用部分純化的SOD-NANB5-1-1和SOD-NANB81的分析基本按Ⅳ.D.3中所描述的方法進(jìn)行,除了血清是來自已經(jīng)確診的帶有HAV或HBV的病人,或者是來自血庫供血者的。表1所列為感染HAV或HBV的病人的血清的分析結(jié)果。用感染HAV的病人的11份血清樣品及感染HBV的病人的20份血清樣品測試RIA,如表1所示,這些血清沒有一個(gè)與含有BB-NANBV表位的融合多肽產(chǎn)生陽性免疫反應(yīng)。采用NANB5-1-1抗原的RIA被用來測定對照組血清的免疫活性。從正常供血者中得到的230個(gè)血清樣品中,只有2個(gè)在RIA中產(chǎn)生陽性反應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。這可能是該兩位供血者的血清樣品事先已接觸過HCV。
Ⅳ.D.5 在NANBH感染過程中NANB5-1-1的活性在2位病人和4只黑猩猩感染NANBH的過程中,抗NANB5-1-1抗體的存在用如Ⅳ.D.3中描述的RIA進(jìn)行測定。另外,該RIA被用來測定黑猩猩在感染HAV和HBV的過程中抗NANB5-1-1抗體的存在與否。
列于表2的結(jié)果顯示,對于黑猩猩和人體,抗NANB5-1-1抗體可在NANBH感染急性階段的初期被檢測出來。在感染HAV或HBV的黑猩猩的血清樣品中都未檢測到抗NANB5-1-1抗體。因此,抗NANB5-1-1抗體可作為個(gè)體接觸HCV的一個(gè)標(biāo)記。
表2用5-1-1抗原的肝炎病人和黑猩猩的連續(xù)血清樣品的血清轉(zhuǎn)化病人/黑猩猩樣品日期(天數(shù))抗-5-1-1ALT(0=接種日)肝炎病毒(S/N)(mu/mL)病人29T0NANB1.091180T+18033.89425T+20836.22-病人30TNANB1.901830T+30734.17290T+79932.45276黑猩猩10NANB0.879760.937111823.671915432.41-黑猩猩20NANB1.005211.0852734.641313825.01-黑猩猩30NANB1.088431.44205531.821415911.876黑猩猩4-3NANB1.1211551.25132836.60-14017.51-黑猩猩50HAV1.504252.39147401.92182681.535黑猩猩6-8HAV0.85-15-106410.811011291.33-黑猩猩70HAV1.177221.60831151.5551391.60-黑猩猩80HAV0.7715261.98130741.7782051.275黑猩猩9-290HBV1.74-3793.2994352.776黑猩猩100HBV2.358111-118備用2.7496-156(備用2052.0592401.7813黑猩猩110HBV1.821128-56備用1.268-100(備用169-92230.5210T=初始取樣日
Ⅳ.E 抗NANB5-1-1的多克隆血清抗體的純化在SOD-NANB5-1-1多肽與NANBH病人的血清樣品中的抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)活性的基礎(chǔ)上,發(fā)展一個(gè)純化與NANB5-1-1中的表位發(fā)生免疫反應(yīng)的血清抗體的方法。該方法運(yùn)用了親和層析法。將純化的SOD-NANB5-1-1多肽(見Ⅳ.D.1)附著在不溶性載體上,這種附著使固定化多肽保留了其對NANB5-1-1的抗體的親和性。血清樣品中的抗體被吸收到帶基質(zhì)的多肽中。在清洗去除非特定結(jié)合物和未結(jié)合的物質(zhì)后,通過改變pH值以及/或者用Chaotropic劑試(比如尿素),結(jié)合的抗體就被從結(jié)合的SOD-HCV多肽中釋放出來。
含有SOD-NANB5-1-1的硝酸纖維素膜按下法制備,將0.2微米孔徑的2.1cm Sartorius硝酸纖維素膜用BBS洗滌3次,每次3分鐘。在室溫時(shí)將純化制劑在BBS中培養(yǎng)2小時(shí),或者在4℃下培養(yǎng)過夜,SOD-NANB5-1-1被連到膜上。去除含有未結(jié)合抗原的溶液,濾液用BBS洗滌三次,每次3分鐘。通過與5mg/mlBSA溶液培養(yǎng)30分鐘,用BSA結(jié)合膜上剩余活性位點(diǎn)。再用BBS洗滌5次和用蒸餾水洗滌3次洗去過量的BSA。然后將含有病毒抗原和BSA的膜用0.05M甘氨酰鹽酸,pH2.5,0.10MNa Cl(GlyHCl)處理15分鐘,再用PBS洗3次,每次3分鐘。
將含有NANBH病人血清的融合多肽的膜培養(yǎng)2小時(shí),以分離多克隆抗NANB5-1-1抗體。在培養(yǎng)后,用BBS洗滌濾液5次,再用蒸餾水洗滌2次。GlyHCl洗脫5次,每次3分鐘,將結(jié)合的抗體從各濾液中洗脫出來。把每次洗脫液收集在含有2.0M Tris HCl,pH8.0的試管中,再將洗脫液的pH值調(diào)節(jié)到pH=8.0。親和層析后,抗NANB5-1-1抗體的回收率近似50%。
含有結(jié)合的病毒抗原的硝酸纖維素膜可使用多次而結(jié)合力不會(huì)有明顯的降低。為了重復(fù)使用該膜,在抗體被洗脫之后將膜用BBS洗滌3次,每次3分鐘。然后,將其保存在4℃的BBS中。
Ⅳ.F利用純化的人體多克隆抗HCV抗體從感染血漿中獲得HCV顆粒;以獲得顆粒中的核酸與HCVcDNA雜交Ⅳ.F.1利用人體多克隆抗HCV抗體從感染血漿中獲得HCV顆粒將存在于患NANBH的黑猩猩的感染血漿中的蛋白質(zhì)-核酸混合物用結(jié)合在聚苯乙烯珠上的純化的人體多克隆抗HCV抗體進(jìn)行分離。
用編碼在克隆5-1-1中的SOD-HCV多肽將多克隆抗NANB5-1-1抗體從患NANBH的病人血清中提純出來,該純化方法已在Ⅳ.E中描述過。
通過各自用1毫升抗體在室溫下孵育過夜,(1微克/毫升抗體在硼酸鹽緩沖液中,pH8.5)將純化的抗NANB5-1-1抗體結(jié)合到聚苯乙烯珠上(1/4″的直徑,光潔的,精細(xì)塑料球公司,Chicago,Illinois)。培養(yǎng)過夜后,將球珠用TBST[50mM Tris HCl,pH8.0,150mM Na Cl,0.05%(V/V)Tween 20]清洗一次,然后用含有10mg/ml BSA的磷酸鹽緩沖鹽(PBS)清洗。
對此球珠的制備除了用總?cè)梭w免疫球蛋白代替純化的抗NANB5-1-1抗體外,其他的以相同的方式進(jìn)行。
用結(jié)合到球珠上的抗NANB5-1-1抗體,從感染NANBH的黑猩猩血漿中獲得HCV是如下完成的,所用的患NANBH的黑猩猩血漿是如Ⅳ.A.1中描述的。將1ml的感染NANBV的黑猩猩血漿與5個(gè)用抗NANB5-1-1抗體包被的,或用對照的免疫球蛋白包被的球珠在37℃下培養(yǎng)3小時(shí)。該球珠用TBST洗3次。
Ⅳ.F.2獲得的顆粒中的核酸與NANBV-cDNA的雜交從用抗NANB5-1-1抗體獲得的顆粒中釋放出來的核酸組分被用來與來自克隆81的HCV cDNA雜交。
HCV顆粒是從感染NANBH的黑猩猩血漿中獲得的,如Ⅳ.F.1中所述。為了從顆粒中釋放核酸,在37℃下用每球珠0.2毫升的含有蛋白酶k(mg/ml),10mM Tris HCl,pH7.5,10mM EOTA,0.25%(w/v)SDS,10微克/毫升可溶性酵母RNA的溶液與經(jīng)洗滌的球珠培養(yǎng)60分鐘,移去上清液。用苯酚和氯仿抽提上清液,用乙醇在-20℃沉淀核酸過夜。離心收集核酸沉淀液,干燥,再溶于50mM Hepes,pH7.5。將雙份的從用抗NANB5-1-1抗體包被的球珠和用含有總?cè)梭w免疫球蛋白包被的對照球珠中得到的樣品可溶性核酸在硝酸纖維素濾紙上過濾。將濾紙與32P標(biāo)記的,用純化的克隆81中的HCV cDNA片段制成的切口轉(zhuǎn)移探針雜交。該探針的制備方法及雜交方法如ⅢC.1.描述的。
如圖34所示為含有核酸的探針濾液的放射自顯影圖。該核酸來自用含有抗NANB5-1-1抗體的球珠獲得的顆粒。用抗NANB5-1-1抗體得到的抽提液(A1,A2)可得到相對于對照抗體抽提液(A3,A4)和對照酵母RNA(B1,B2)的清晰的雜交信號(hào)。包括Ipg,5pg和10pg的純化的克隆81cDNA片段在內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)分別列于C1-3中。
這些結(jié)果揭示了用抗NANB5-1-1抗體從NANBH血漿中獲得的顆粒包含了核酸,該核酸與克隆81中的HCV cDNA雜交,因此進(jìn)一步證明了這些克隆中的cDNAs是來自于NANBH的病原體。
Ⅳ.G.C100-3與純化的抗NANB5-1-1抗體的免疫反應(yīng)性C100-3融合多肽與抗原NANB5-1-1抗體的免疫反應(yīng)性是用放射免疫測定法進(jìn)行測定的,在該方法中,結(jié)合在固相上的抗原被純化的抗NANB5-1-1抗體攻擊,用125I-標(biāo)記的羊抗人抗體可檢測抗原-抗體復(fù)合物。將C100-3多肽的免疫反應(yīng)性與SOD-NANB5-1-1抗原的進(jìn)行了比較。
融合多肽C100-3的合成和純化是分別按照Ⅳ.B.5和Ⅳ.B.6中描述的方法進(jìn)行的。融合多肽SOD-NANB5-1-1的合成和純化是分別按照Ⅳ.B.1和Ⅳ.D.1中描述的方法進(jìn)行的。純化的抗NANB5-1-1抗體的獲得如Ⅳ.E.中所描述的。
將一百微升含有不同量的純化的C100-3抗原,并含0.125M硼化鈉緩沖液,pH8.3,0.075M NaCl(BBS)的溶液加到微量滴定板的各個(gè)井中(Dynatech lmmnlon 2 Removawell Strips)。將該板置于4℃的濕盒內(nèi)培養(yǎng)過夜,之后,移去蛋白質(zhì)溶液,用含有0.02% Triton X-100的BBS(BBST)洗滌3次。為了防止非特定的結(jié)合,用BSA包被井,即在BBS中加入100微升5mg/ml的BSA溶液,在室溫培養(yǎng)1個(gè)小時(shí)之后,將過量的BSA溶液除去。包被井中的多肽與純化的抗NANB5-1-1抗體(以每井1微克抗體)反應(yīng),樣品在37℃下培養(yǎng)1小時(shí)。培養(yǎng)后,吸去多余的溶液,再用BBST洗滌井5次。結(jié)合在融合多肽上的抗NANB5-1-1的測定是通過將125I標(biāo)記的F′(ab)2羊抗人Ig G鍵接到包被井上進(jìn)行的。將100微升標(biāo)記探針(比活5-20微居里/微克)加到各井中,測定板在37℃下培養(yǎng)1小時(shí),吸去多余的探針,并用BBST洗滌5次。各井中結(jié)合的放射活性量用檢測γ-射線的計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。
C100-3與純化的抗NANB5-1-1抗體的免疫反應(yīng)性同NANB5-1-1與純化的抗體的相比的結(jié)果列于表3。
表3用放射免疫測定法得到的C100-3及NANB5-1-1的免疫反應(yīng)性RIA(cpm/測定法)AG(ng)400320240160600
NANB5-1-17332 6732 4954 4050 3051 57C100-37450698559205593409667表3中的結(jié)果顯示,抗NANB5-1-1識(shí)別在C100-3多肽的C100部分中的表位,因此,NANB5-1-1與C100具有一個(gè)共同的表位。此結(jié)果提出,編碼NANBH表位的cDNA順序既存在于克隆5-1-1中又存在于克隆81中。
Ⅳ.HCV的特性Ⅳ.H.1HCV基因組線狀的特性考慮到HCV基因組的線狀(Strandetness),HCV基因組的定性是通過分離在用抗NANB5-1-1抗體包被的聚苯乙烯球珠上獲得顆粒的核酸部分,并測定分離的核酸是否與HCV cDNA的正鏈和/或負(fù)鏈雜交來進(jìn)行的。
顆粒是來自感染HCV的黑猩猩血漿如Ⅳ.F.1中所描述的,采用包被免疫純化的抗NANB5-1-1抗體的聚苯乙烯球珠。用Ⅳ.F.2中描述的方法釋放顆粒中的核酸組分。將相當(dāng)于3mls高滴度血漿的已分離的基因組核酸印跡到硝酸纖維素濾紙上。作為對照,來自克隆81的變性HCV cDNA也印跡到相同的濾紙上。用32P標(biāo)記的從HCV cDNAs克隆的單股DNA的正鏈或負(fù)鏈混合物來探測該濾紙,該cDNAs是從克隆40b,81和25c切下的。
單鏈探針是通過用EcoRⅠ切下克隆81,40b,和25c的HCVcDNAs,并且在M13載體,mp18及mp19中克隆cDNA片段而得到的[Messing(1983)]。將M13克隆定序以測定它們是否包含來自HCVcDNAs的DNA的正鏈或負(fù)鏈。定序是按Sanger等的雙脫氧鏈終止法進(jìn)行的(1977)。
一套含有從獲得的顆粒中分離出來的HCV基因組的重復(fù)的濾紙中的每張濾紙與來自HCVcDNAs的正鏈或負(fù)鏈探針雜交。圖41顯示了用來自克隆81,40b和25c的探針混合物檢測NANBV基因組所得的放射自顯影結(jié)果。該混合物是用來提高雜交試驗(yàn)的靈敏度。在名單Ⅰ中,樣品與正鏈探針混合物雜交,在名單Ⅱ中,樣品與負(fù)鏈探針混合物雜交而被檢測。免疫印跡法的名單中樣品的組成被列于表4表4通道AB1HCV基因組*2-*3*cDNA814-cDNA81*是指未描述的樣品。
如圖35的結(jié)果所示,只有負(fù)鏈DNA探針與分離的HCV基因組雜交。將該結(jié)果與基因組對RNA酶而不是DNA酶敏感(見Ⅳ.C.2)的結(jié)果綜合起來看,表明NANBV基因組是正鏈RNA。
這些數(shù)據(jù),以及其他有關(guān)假定的NANBV(s)的物理化學(xué)性質(zhì)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),與HCV可能是黃熱病病毒酶的一種的假設(shè)是一致的。然而,HCV代表了一類新病毒體的可能性依然存在。
Ⅳ.H.2獲得的顆粒的順序檢測,當(dāng)用PCR放大時(shí),此顆??膳c來自克隆81的HCVcDNA雜交。
捕獲的顆粒中的RNA如Ⅳ.H.1中所述的得到,與來自克隆81的HCVcDNA雜交的順序的分析是利用如Ⅳ.C.3所述的PCR放大過程進(jìn)行的,除了雜交探針是來自克隆81cDNA順序的激酶寡聚核苷酸。其結(jié)果顯示,放大的順序與產(chǎn)生HCVcDNA探針的克隆81雜交。
Ⅳ.H.3登革熱黃熱病病毒(MNWWVD1)的非結(jié)構(gòu)型蛋白質(zhì)和克隆14i至39c的聯(lián)合ORF編碼的HCV多肽之間的同源性克隆14i至39c的聯(lián)合HCVcDNAs包含一個(gè)連續(xù)ORF,如圖26所示。比較了其編碼的多肽與登革熱黃熱病病毒(MNWVD1)中非結(jié)構(gòu)型多肽的區(qū)域的順序的同源性。這一分析使用了Dayhoff蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,并用計(jì)算機(jī)來完成。結(jié)果顯示在圖42中,其中符號(hào)()表示一個(gè)真正的同源,符號(hào)(·)表示順序中的一個(gè)保守性置換;破折號(hào)表示順序中一個(gè)空間,以達(dá)到最高同源。如圖中所示,編碼在HCVcDNA中的順序與登革熱病毒的非結(jié)構(gòu)型多肽之間有著顯著的同源性。除了圖42中所示的同源性外,編碼在靠近c(diǎn)DNA3′-末端的區(qū)域的多肽片段經(jīng)分析也包含了與登革熱聚合酶順序同源的順序。重要的是,發(fā)現(xiàn)被認(rèn)為對RNA依賴性RNA聚合酶必需的典型Gly-Asp-Asp(GDD)順序被包含在HCVcDNA編碼的多肽中,其位置與在登革熱2號(hào)病毒中的一致(未給出數(shù)據(jù))。
Ⅳ.H.4HCV-DNA在感染的組織中是不可測的兩種類型的研究所提供的結(jié)果指出,HCV-DNA在患NANBH個(gè)體的組織中是不可測的。這些結(jié)果連同在Ⅳ.C和Ⅳ.H.1及Ⅳ.H.2中所述的提供了一種跡象,即HCV不是含有病毒的DNA,其復(fù)制物也不含有cDNA。
Ⅳ.H.4.a南印跡過程為了測定感染NANBH的黑猩猩肝是否含有可檢測的HCV-DNA(或HCV-cDNA),從這個(gè)源分離出來的DNA的限制酶片段是南印跡的,該印跡物用32P=標(biāo)記HCV cDNA探查。結(jié)果顯示出標(biāo)記的HCV cDNA未雜交至來自感染的黑猩猩肝的印跡DNA,也未雜交至來自正常黑猩猩肝的對照印跡DNA。相比較,在陽性對照中,β-干擾素基因的標(biāo)記探針緊固地雜交至限制酶消化的人體胎盤DNA的南印跡物。這些體系被設(shè)計(jì)成檢測用標(biāo)記探針不能測得的基因復(fù)制的信號(hào)。
DNAs是從兩個(gè)患NANBH黑猩猩的肝中分離出來的。對照DNAs是從未感染的黑猩猩肝以及人體胎盤中分離出來的。抽提DNA的方法基本按照Maniatis等的(1982),DNA樣品是在分離過程中用RNA酶處理的。
按生產(chǎn)廠家的指導(dǎo)將各個(gè)DNA樣品用EcoRⅠ,MboⅠ或HincⅡ(12微克)處理。將消化的DNAs在1%中性瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳,南印跡到硝酸纖維素上,印跡材料與合適的切口轉(zhuǎn)移探針cDNA(3×106cpm/ml的雜交混合)雜交。來自感染的黑猩猩肝和正常肝的DNA與來自克隆36加81的32P=標(biāo)記的HCV cDNA雜交;人體胎盤與來自β-干擾素基因的32P=標(biāo)記的DNA雜交。雜交后,在嚴(yán)格的條件下洗滌印跡物,比如,在65℃,用含有0.1×SSC,0.1%SDS的溶液洗滌。
β=干擾素基因的制備如Houghton等所述的(1981)。
Ⅳ.H.4.6運(yùn)用PCR技術(shù)的放大為了確定HCV-DNA是否能在患NANBH的黑猩猩的肝中檢測到,將DNA從組織中分離出來,并進(jìn)行使用從克隆81的HCVcDNA衍生而來的引物和探針聚核苷酸的PCR放大檢測技術(shù)。陰性對照物是從未感染的HepG2組織培養(yǎng)細(xì)胞中分離出來的和從推測未感染的人體胎盤中分離出來的DNA樣品。陽性對照物是陰性對照物中加入克隆81的已知相對較小量(250分子)的HCVcDNA插入物的樣品。
另外,為了證實(shí)從同樣患NANBH的黑猩猩肝中分離出來的RNA斷片包含互補(bǔ)于HCV-cDNA探針的順序,PCR放大檢測體系也就被用在分離的RNA樣品上。
在該研究中,DNAs是用Ⅳ.H.4.a中所述的方法分離的,RNAs是基本按Chirgwin等所述的(1981)提取的。
DNA樣品從2個(gè)感染的黑猩猩肝,未感染的HepG2細(xì)胞,以及人體胎盤中分離出來的。按照生產(chǎn)廠家的指導(dǎo),各種DNA各取1微克用HindⅢ進(jìn)行消化?;旧习储?C.3中所述將消化的樣品進(jìn)行PCR放大并檢測放大的HCVcDNA,除了反轉(zhuǎn)錄步驟被略去。PCR引物和探針是來自克隆81的HCVcDNA,在Ⅳ.C.3中已有描述。在放大之前,對于陽性對照物,通過加入250摩爾從克隆81分離而來的HCVcDNA插入物來使各個(gè)DNA的1微克樣品增效。
為了確定HCV順序是否在從患NANBH的黑猩猩肝分離出來的RNA中存在,將含有0.4微克的總RNA的樣品進(jìn)行基本如Ⅳ.C.3中所述的放大過程,除了反轉(zhuǎn)錄酶從某些作為陰性對照的樣品中略去了。PCR引物和探針是來自克隆81的HCVcDNA,如前所述。
結(jié)果顯示出互補(bǔ)于HCVcDNA探針的放大順序在來自感染的黑猩猩肝的DNAs中不能檢測到,也不能從陰性對照物中檢測到。相反,當(dāng)樣品(包括來自感染的黑猩猩肝的DNA)是在放大前用HCVcDNA增效的,在所有陽性對照物中檢測出克隆81順序。此外,在RNA的研究中,放大的克隆81的HCVcDNA順序只在使用反轉(zhuǎn)錄酶時(shí)才檢測到,由此足以推斷,其結(jié)果不是因?yàn)镈NA的傳染造成。
這些結(jié)果表明,患NANBH黑猩猩的肝細(xì)胞不含或含有測不出程度的HCVDNA?;谠鲂а芯?,如果存在HCVDNA的話,它處于遠(yuǎn)遠(yuǎn)低每個(gè)肝細(xì)胞0.06拷貝的程度。相反,來自相同肝樣品的總RNA中的HCV順序很容易用PCR技術(shù)檢測到。
Ⅳ.I.以HCVC100-3作為測試抗原,用于HCV感染的ELISA測定法所有的樣品用HCVC100-3ELISA測定。這個(gè)測定法利用HCVC100-3抗原(其合成和純化如Ⅳ.B.5中所描述的)及一個(gè)鼠單克隆抗人IgG的辣根過氧化酶(HRP)結(jié)合物。
用HCVC100-3抗原包被的板按下述方法制備。先配制一種含有包被緩沖劑(50mM硼酸鈉,pH9.0)21毫升/板,BSA(25微克/毫升)C100-3(2.50微克/毫升的溶液再加到RemoveawellImmlonI板(Dynatech公司提供)中?;旌?分鐘后,將溶液以每井0.2ml加到板上,蓋好,于37℃培養(yǎng)2個(gè)小時(shí),之后吸去溶液。用400微升的洗滌緩沖液(100mM磷酸鈉,pH7.4,140mM氯化鈉,0.1%(w/v)酪朊,1%(w/v)TritonX-110,0.01%(w/v)硫柳汞)洗井一次。棄去洗滌液后,每井加入200微升的包被后溶液(100mM磷酸鈉,pH7.2,150mM氯化鈉,0.1%(w/v)酪朊和2mM苯基甲基磺酰氯(PMSF),將板輕輕蓋上以防蒸發(fā),并于室溫下放置30分鐘。然后,吸去溶液,低壓凍干過夜,無自加熱。制備好的板可以在2-8℃下在密封的鋁袋中貯存。
為了完成ELISA測定,將20微升血清樣品或?qū)φ諛悠芳拥胶?00微升樣品稀釋液(100mM磷酸鈉,pH7.4,500mM氯化鈉,1mM EOTA,0.1%(w/v)酪朊,0.015(w/v)硫柳汞,1%(w/v)Triton X-100,100微升/毫升酵母抽提液)的井中。密封該板,于37℃培養(yǎng)2小時(shí),吸去溶液,用400微升洗滌液(含有0.05% Tween20的磷酸緩沖鹽(PBS)洗滌井。洗滌過的井用200微升包含在Ortho結(jié)合稀釋液(10mM磷酸鈉,pH7.2,150mM氯化鈉,50%(v/v)胎牛血清,1%(v/v)熱處理過的馬血清,1mMK3Fe(CN)6,0.05%(w/v)Tween 20,0.02%(w/v)硫柳汞)中的鼠抗人體Ig G-HRP結(jié)合物處理。該處理于37℃下進(jìn)行1小時(shí),吸去溶液,用洗滌緩沖液洗滌井,之后也用同法吸去洗滌液,為測量酶結(jié)合物的結(jié)合量,加入200微升底物溶液(每5ml展開液10mgo-苯二胺二氯化氫)展開液包含50mM用磷酸調(diào)節(jié)至pH5.1的檸檬酸鈉,和0.6微升/毫升的30% H2O2。含有底物溶液的板于室溫在暗處培養(yǎng)30分鐘,加入50微升/毫升4N硫酸終止反應(yīng),測定ODs。
下面提供的實(shí)例顯示以HCVC100-3為抗原的微量滴定板ELISA具有高度特異性,證據(jù)為反應(yīng)初始速率約為1%,隨機(jī)的供血者的重復(fù)反應(yīng)速率約5%的跡象所示。該測試法既能檢測感染后期急性階段及疾病慢性階段的免疫應(yīng)答。另外,該測試法能檢測某些在NANBH替代試驗(yàn)中顯示陰性的樣品,這些樣品來自患有NANBH歷史的病人,或來自與NANBH傳播有牽連的供血者。
在下述例子中,使用了下列縮寫ALI丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶Anti-HBc抗HBc的抗體Anti-HBsAg抗HBsAg的抗體HBc肝炎B核心抗原HBsAg肝炎B表面抗原IgG免疫球蛋白GIgM免疫球蛋白MIu/L國際單位/升NA不可測得NT未測過N樣品大小Nep陰性O(shè)D光密度Pos陽性
S/CO信號(hào)臨界SD標(biāo)準(zhǔn)偏差X平均或中值WNL在正常范圍之內(nèi)Ⅳ.1.1隨機(jī)供血者群體中的HCV感染來自隨機(jī)供血者的一組1,056個(gè)樣品(新鮮血清)是從加利福尼亞州舊金山IrwinMemorial血庫得到的。這些樣品的測試結(jié)果歸總在顯示OD值分布的矩形圖中(圖37)。如圖37所示,4個(gè)樣品的讀數(shù)>3,1個(gè)樣品的讀數(shù)在1到3之間,5個(gè)樣品的讀數(shù)在0.4到1之間,其余的1,046個(gè)樣品讀數(shù)<0.4,其中90%以上的樣品的值<0.1。
反應(yīng)活性隨機(jī)樣品的結(jié)果列于表5,用一個(gè)等于平均值加5標(biāo)準(zhǔn)偏差的切斷值,1,056(0.95%)個(gè)樣品中的10個(gè)樣品具初始反應(yīng)活性,其中,5個(gè)樣品(0.47%)在用ELISA對其進(jìn)行第二次測試時(shí)重現(xiàn)反應(yīng)活性。表5還顯示出對各個(gè)重現(xiàn)反應(yīng)活性的樣品的AIT和Anti-HBd狀態(tài)。特別有趣的是所有5個(gè)重復(fù)反應(yīng)活性的樣品在二個(gè)NANBH置換試驗(yàn)中均顯陰性,而在HCVELISA中顯陽性。
表5反應(yīng)活性隨機(jī)樣品的結(jié)果N=1051X=0.049*SD=±0.074切斷X+5SD=0.419(0.400+陰性對照)Initial初始反應(yīng)活性重復(fù)反應(yīng)活性Anti樣品 OD OD ALT**HBc***(IU/L)(OD)42270.4620.084NANA62920.5690.294NANA61880.6990.326NANA61570.7350.187NANA62770.8830.152NANA63971.5671.39230.141.4336019>3.000>3.00046.481.0576651>3.000>3.00048.531.3436669>3.000>3.00060.531.6154003 >3.000 >3.000 WNL****陰性10/1056=0.95%5/1056=0.47%*樣品的讀數(shù)>1,5的未包括在平均值和SD的計(jì)算之中**ALT≥68IU/L是在正常范圍以上***Anti-HBc<<0.535(競爭性試驗(yàn))被認(rèn)為陽性****WML在正常范圍之內(nèi)
Ⅳ.I.2黑猩猩血清樣品以HCVC100=3ELISA測試了來自11只黑猩猩的血樣品。這些黑猩猩中的4個(gè)由于一批污染的因子Ⅷ(假定為Hutchinson株)而感染NANBH,試驗(yàn)按在疾病控制中心與DanielBradley博士合作時(shí)規(guī)定的程序進(jìn)行,4個(gè)感染HAV的黑猩猩,3個(gè)感染HBV的黑猩猩為對照,在感染后的不同時(shí)間取得血清樣品。
歸總在表6的結(jié)果證明了被NANBH的Hutchinson株感染的所有黑猩猩中的抗體血清轉(zhuǎn)化。感染后急性階段(其特征為ALT明顯上升又隨即回復(fù)到正常后),抗HCVC100-3的抗體可以在4/4NANBH感染的黑猩猩的血清中檢測到。這些樣品先前已經(jīng)給出過,如在Ⅳ.B.3中所述的,用Western分析法,和RIA時(shí)顯示陽性。相反,感染HCV或HBV的對照黑猩猩,在ELISA中沒有一個(gè)顯示出反應(yīng)性。
表6黑猩猩血清樣品ALTODS/CO接種日取血日(lU/L)注入物負(fù)對比0.001正對比1.507切斷0.401黑猩猩1-0.0070.0005/24/8405/24/849NANB0.0030.0108/07/8771>3.000>7.4809/18/8419>3.000>7.4810/24/84-黑猩猩2--06/07/84--NANB-0.0030.0005/31/845-0.0050.0006/28/84520.9452.3008/20/8413>3.000>7.4810/24/84-黑猩猩30.0050.0103/14/8503/14/858NANB0.0170.0404/26/852050.0060.0105/06/85141.0102.5208/20/856黑猩猩4-0.0060.0003/11/8503/11/8511NANB0.0030.0105/09/851320.5231.3106/06/85-1.5743.9308/01/85-黑猩猩5-0.0060.0011/21/8011/21/804HAV0.0010.0012/16/801470.0030.0112/30/80180.0060.0107/29-08/21/815黑猩猩6--05/25/82--HAV-0.0050.0005/17/82-0.0010.0006/10/82106-0.0040.0007/06/82100.2900.7210/01/82-黑猩猩7-0.0080.0005/25/8205/25/827HAV-0.0040.0006/17/8283-0.0060.0009/16/8250.0050.0110/09/82-
表6(續(xù))黑猩猩血清樣品(Cont′d)ALTODS/CO接種日取血日(lU/L)注入物黑猩猩8-0.0070.0011/21/8011/21/8015HAV0.0000.0012/16/801300.0040.0102/03/8180.0000.0006/03-06/10/814.5黑猩猩9--07/24/80--HAV0.0190.0508/22-10/10/79---03/11/81570.0150.0407/01-08/05/8190.0080.0210/01/816黑猩猩10--05/12/82--HBV0.0110.0304/21-05/12/8290.0150.0409/01-09/08/821260.0080.0212/02/8290.0100.0201/06/8313黑猩猩11--05/12/82--HBV0.0000.0001/06-05/12/8211--06/23/82100-0.0030.0006/09-07/07/82--0.0030.0010/28/829-0.0030.0012/20/8210
Ⅳ.I.3名單1來自慢性人體NANBH攜帶者的已被證實(shí)的感染性血清一份編了號(hào)的名單包括22個(gè)獨(dú)立樣品,每個(gè)樣品為二份,總數(shù)為44個(gè)樣品。這些樣品來自被證實(shí)的慢性人體NANBH攜帶者感染性血清,有關(guān)聯(lián)的供血者的感染性血性,及急性期NANBH病人的感染性血清。另外,這些樣品還來自高度純種的陰性對照及其他疾病對照。這個(gè)名單由馬里蘭,貝塞斯達(dá),國立衛(wèi)生研究院,健康和醫(yī)療部的H·Alter博士提供。這個(gè)名單是Alter博士幾年前建立的,并被Alfer博士用作為令人滿意的假設(shè)NANBH測量法的名單。(參考引證了Alfer的文章)。
整個(gè)名單用ELISA測定法測定二次,并把結(jié)果送到Alfer博士那里評定。評定的結(jié)果如表7所示。盡管表中只報(bào)道了雙份名單中的一組,在雙份樣品中二組得到了相同的結(jié)果。
如表7所示,6份在一個(gè)黑猩猩中被證實(shí)的感染性血清是強(qiáng)陽性。來自一例急性NANBH的第7份感染性血清在該ELISA測定中是非反應(yīng)性的。正常ALT水平的和在黑猩猩研究中結(jié)果不明確的一個(gè)相關(guān)供血者的樣品在測量中是非反應(yīng)性的。來自一個(gè)急性NANBH病人的三個(gè)其他系列樣品也是非反應(yīng)性的。從至少捐血10次而不與肝炎有牽連的供血者而得到的所有來自高度純種的陰性對照的樣品,在ELISA測定中是非反應(yīng)性的。最后,測試樣品中的四個(gè)樣品在由別人發(fā)展的假定NANBH測定法中已被認(rèn)為是陽性的,但是這些測定法是不可信的。用HCVELISA測量法,這四個(gè)樣品的結(jié)果是陰性。
表7H.ALTER的名單1名單第一次結(jié)果第二次結(jié)果1)由黑猩猩傳染的被證實(shí)了的感染A.慢性NANB后-TxJF++EB++PG++B.帶升高了的ALT的有關(guān)連的供血者BC++JJ++BB++C.急性NANB后-TxWll--2)由黑猩猩傳染不明確的感染帶正常ALT的有關(guān)連的供血者A.帶正常ALT的有關(guān)連的供血者CC--3)急性NANB后-TxJL1周JL2周JL3周4)對照疾病A.初期膽汁性肝硬變EK--B.恢復(fù)中的酒精性肝炎llB--5)純種陰性對照DH--DC--LV--HL--All--6)潛在NANB“抗原”JS-80-OLT-O(lslllDA)--∧STERIX(TREPO)--ZURTZ(∧RNOLD)--BECASSDlHE(TREPO)--
Ⅳ.I.4.名單2供血者/受血者NANBH編號(hào)的名單中包括10個(gè)與NANBH有關(guān)的明確的供血者-受血者輸血病例,總共有188個(gè)樣品。每例包括了一些或全部的輸給受血者的供血者的樣品,及來自受血者的系列樣品(在輸血后的3,6及12個(gè)月抽出的)。還包括在輸血前的受血者的原血樣。編碼名單由NIH的H.Alter博士提供,結(jié)果也送給他進(jìn)行評定。
歸總于表8的結(jié)果顯示出ELISA測量法檢測到10例與輸血有關(guān)的NANBH中9例的抗體血清轉(zhuǎn)化。例4的樣品(未檢測到血清轉(zhuǎn)化)在ELISA測量法中始終反應(yīng)很弱,10個(gè)受血體樣品中的2個(gè)在輸血后3個(gè)月時(shí)是反應(yīng)性的;6個(gè)月時(shí),8個(gè)受血體樣品是反應(yīng)性的;在12個(gè)月時(shí),除了例4之外,所有的樣品是反應(yīng)性的。另外,10例中的7例發(fā)現(xiàn)至少有一個(gè)抗體陽性供血者,例10有二個(gè)陽性供血者。在例10中也發(fā)現(xiàn)受血體的原血樣對HCV抗體是陽性的,該受血體的1個(gè)月的血下降到反應(yīng)性水平的臨界線,而其4個(gè)和10個(gè)月的血上升至陽性。一般地,S/CO為0.4時(shí)被認(rèn)為是陽性的。因此,這種情形可能表示HCV病人的前期感染。
所有反應(yīng)性(即陽性)樣品的ALT和HBc狀況匯總在表9。從表中可見,1/8供血者的樣品對代用的標(biāo)記是陰性的,在HCV抗體ELISA中是反應(yīng)性的。另一方面,受血體樣品(直到輸血后12個(gè)月)要么有升高的ALT,要么有陽性抗HBc,或者兩者都有。
表9H.ALTER名單1中反應(yīng)和性樣品的ALT和HBC狀況抗-樣品ALT*HBc**供血者實(shí)例3正常陰性實(shí)例5升高陽性實(shí)例6升高陽性實(shí)例7不可測得陰性實(shí)例8正常陽性實(shí)例9升高不可測實(shí)例10正常陽性實(shí)例10正常陽性受血者實(shí)例16個(gè)月升高陽性12個(gè)月升高未測得實(shí)例26個(gè)月升高陰性12個(gè)月升高未測得實(shí)例36個(gè)月正常未測得***12個(gè)月升高未測得***實(shí)例56個(gè)月升高未測得12個(gè)月升高未測得實(shí)例63個(gè)月升高陽性6個(gè)月升高陰性12個(gè)月升高未測得實(shí)例76個(gè)月升高陰性12個(gè)月升高未測得實(shí)例86個(gè)月正常陽性12個(gè)月升高未測得實(shí)例912個(gè)月升高未測得實(shí)例104個(gè)月升高未測得10個(gè)月升高未測得
*ALT≥45IU/L為上述正常限度**抗HBc≤50%(競爭測量法)被認(rèn)為陽性***原血和3個(gè)月樣品對HBc為陰性Ⅳ.I.5高危險(xiǎn)組樣品中的HCV感染的測定用ELISA檢測高危險(xiǎn)組樣品,以確定對HCVC100-3的反應(yīng)性。這些樣品從Kansas市,CommunityBloodBank的GaryTegtmeier博士那里得到。結(jié)果匯總在表10。
如表中所顯示的,具有最高反應(yīng)性的樣品是從血友病得到的(76%)。另外,帶升高的ALT和抗HBc陽性的病人樣品的反應(yīng)性為51%,該值與這組的NANBH流行和臨床數(shù)據(jù)估計(jì)值一致??笻CV抗體的發(fā)生率在下列情況下也是高的,如在只帶升高的ALT的供血者血液中,或只對乙型肝炎核心抗體陽性的供血者血液中,或當(dāng)與隨機(jī)態(tài)愿供血者相比,除高ALT或抗核心抗體外,沒有其它變化的供血者中。
表10NANB高危險(xiǎn)組件樣品分布組NNOD反應(yīng)性百分率升高有ALT的353>3.00011.4%10.728抗HBC的245>3.00020.8%升高的ALT,抗HBC的3312>3.00051.5%12.76812.32410.93910.95110.906排斥的供血者的255>3.00020.0%有肝炎歷史的供血者的15019>3.00014.7%10.83710.71410.469血友病的5031>3.00076.0%12.56812.48312.00011.97911.49511.20910.819
Ⅳ.I.6在HCVC100-3ELISA中用抗IgGa或IgM的單克隆抗體,或多克隆抗體作為二級(jí)抗體的比較研究對用抗IgG單克隆結(jié)合物的ELISA測定法的靈敏度與用抗IgM單克隆結(jié)合物的比較,或以據(jù)報(bào)道是特異性重鏈和輕鏈的多克隆抗血清代替上述兩者的比較,進(jìn)行了以下研究。
Ⅳ.I.6.a來自血清轉(zhuǎn)化的系列樣品利用酶結(jié)合物的或用多克隆抗血清的HCVC100-3ELISA試驗(yàn)研究了3例NANB血清轉(zhuǎn)化的系列樣品,該酶結(jié)合物為只與抗IgG單克隆結(jié)合的,或?yàn)榻Y(jié)合進(jìn)抗IgM單克隆的。樣品由紐約,紐約市,紐約血液中心的CladdStevens博士提供。樣品的資料列在表11中。
利用抗IgG單克隆抗體-酶結(jié)合物得到的結(jié)果列于表12中。其數(shù)據(jù)顯示,最初檢測到的強(qiáng)的反應(yīng)性分別在例1,2和3的樣品1-4,2-8和3-5中。
用聯(lián)合的抗Ig單克隆結(jié)合物及抗IgM結(jié)合物所得結(jié)果列于表13。測試3個(gè)不同比例的抗IgG與抗IgM,抗IgG的1∶10,000稀釋液保持不變。測試的抗IgM單克隆結(jié)合物的稀釋液為1∶30,000、1∶60,000和1∶120,000。其數(shù)據(jù)表明,與僅用抗IgG的研究相一致,在樣品1-4,2-8和3-5中檢測到初始強(qiáng)反應(yīng)性。
用抗IgG單克隆結(jié)合物(1∶10,000稀釋),或Tago多克隆結(jié)合物(1∶80000稀釋),或Jackson多克隆結(jié)合物(1∶80,000稀釋)的ELISA所得到的結(jié)果列于表14中。從其數(shù)據(jù)可看出,用這三種構(gòu)型在樣品1-4,2-8和3-5中檢測到初期強(qiáng)反應(yīng)性;Tago多克隆抗體產(chǎn)生最小信號(hào)。
上述結(jié)果表明,所有三種構(gòu)型在疾病急性期(以ALT升高為指標(biāo))后的相同時(shí)間檢測出反應(yīng)性樣品。而且,結(jié)果意示著用抗IgG單克隆酶結(jié)合物的HCVC100-3ELISA的靈敏度相當(dāng)于或高于用其他酶結(jié)合物的測試構(gòu)型所得的。
表11CLADD9STEVENS名單上的樣品的情況日期HBsAg抗-HBs抗-HBsALT膽紅素實(shí)例11-18/5/811.091.712.940.0-1.01-29/2/811.0121.015.1274.01.41-310/7/811.064.023.8261.00.91-411/19/811.067.333.875.00.91-512/15/811.050.527.671.01.0實(shí)例22-110/19/811.01.0116.217.0-1.02-211/17/811.00.889.546.01.12-312/02/811.01.278.363.01.42-412/14/811.00.990.6152.01.42-512/23/811.00.893.6624.01.72-61/20/821.00.892.966.01.52-72/15/821.00.886.770.01.32-83/17/821.00.969.824.0-1.02-94/21/821.00.967.153.01.52-105/19/821.00.574.895.01.62-116/14/821.00.882.937.0-1.0實(shí)例33-14/7/811.01.288.413.0-1.03-25/12/811.01.1126.2236.00.43-35/30/811.00.799.9471.00.23-46/9/811.01.2110.8315.00.43-57/6/811.01.189.9273.00.43-68/10/811.01.0118.2158.00.43-79/8/811.01.0112.384.00.33-810/14/811.00.9102.3180.00.53-911/11/811.01.084.6154.00.3
表12用抗IgG單克隆結(jié)合物得到的ELISA結(jié)果樣品日期ALTODS/CO陰性對照.076切斷.476PC(1128)1.390實(shí)例#11-108/05/8140.0.178.371-209/02/81274.0.154.321-310/07/81261.0.129.271-411/19/8175.0.9371.971-512/15/8175.0>3.000>6.30實(shí)例#22-110/19/8117.0.0580.122-211/17/8146.0.0500.112-312/02/8163.0.0470.102-412/14/81152.0.0590.122-512/23/81624.0.0700.152-601/20/8266.0.0510.112-702/15/8270.0.1390.292-803/17/8224.01.8673.922-904/21/8253.0>3.000>6.302-1005/19/8295.0>3.000>6.302-1106/14/8237.0>3.000>6.30實(shí)例#33-104/07/8113.0.090.193-205/12/81236.0.064.133-305/30/81471.0.079.173-406/09/81315.0.211.443-507/06/81273.01.7073.593-608/10/81158.0>3.000>6.303-709/08/8184.0>3.000>6.303-810/14/81180.0>3.000>6.303-911/11/81154.0>3.000>6.30
表13用抗IgG和抗IgM單克隆結(jié)合物所得的ELISA結(jié)果NANBELISAs單克隆單克隆單克隆1GG110K1GG110K1GG110K1GM130K1GM160K1GM1120K樣品日期ALTODS/COODS/COODS/CONEGCONTROL.100.080.079CUTOFFPC(1128)1.0831.3281.197實(shí)例#11-108/05/8140.173.162.0701-209/02/81274.194.141.0791-310/07/81261.162.129.0631-411/19/8175.312.85.7091-512/15/8171>3.00>3.00>3.00實(shí)例#22-110/19/8117.442.045.0852-211/17/8146.102.029.0302-312/02/8163.059.036.0272-412/14/81152.065.041.0252-512/23/81624.082.033.0322-601/20/8266.102.042.0272-702/15/8270.188.068.0962-803/17/82241.7281.6681.5412-904/21/8253>3.002.443>3.002-1005/19/8295>3.00>3.00>3.002-1106/14/8237>3.00>3.00>3.00實(shí)例#33-104/07/8113.193.076.0493-205/12/81236.201.051.0383-305/30/81471.132.067.0523-406/09/81315.175.155.1403-507/06/812731.3351.2381.2603-608/10/81158>3.00>3.00>3.003-709/08/8184>3.00>3.00>3.003-810/14/81180>3.00>3.00>3.003-911/11/81154>3.00>3.00>3.00
表14用多克隆結(jié)合物得到的ELISA結(jié)果NANBELISAs單克隆TAGOJACKSON110K180K180K樣品日期ALTODS/COODS/COODS/CO.076.045.154陰性對照切斷.476.545.654PC(1128)1.390.7272.154實(shí)例#11-108/05/8140.178.37.067.12.153.231-209/02/81274.154.32.097.18.225.341-310/07/81261.129.27.026.05.167.261-411/19/8175.9371.97.324.60.7931.211-512/15/8171>3.00>6.301.7783.27>3.00>4.5g實(shí)例#22-110/19/8117.058.12.023.04.052.082-211/17/8146.050.11.018.03.058.092-312/02/8163.047.10.020.04.060.092-412/14/81152.059.12.025.05.054.082-512/23/81624.070.15.026.05.074.112-601/20/8266.051.11.018.03.058.092-702/15/8270.139.29.037.07.146.222-803/17/82241.8673.92.355.651.4292.192-904/21/8253>3.00>6.30.7481.37>3.00>4.592-1005/19/8295>3.00>6.301.0251.88>3.00>4.592-1106/14/8237>3.00>6.30.9171.68>3.00>4.59實(shí)例#33-104/07/8113.090.19.049.09.138.213-205/12/81236.064.13.040.07.094.143-305/30/81471.079.17.045.08.144.223-406/09/81315.211.44.085.16.275.423-507/06/812731.7073.59.272.501.7732.713-608/10/81 158 >3.00 >6.30 1.347 2.47 >3.00 >4.593-709/08/8184 >3.00 >6.30 2.2944.21>3.00>4.593-810/14/81 180>3.00 >6.30 >3.00 >5.50>3.00>4.593-911/11/81154 >3.00 >6.30 >3.00 >5.50 >3.00 >4.59
Ⅳ.I.6.b隨機(jī)供血者的樣品將來自隨機(jī)供血者血液的樣品用HCVC100-3ELISA篩選HCV感染,其中抗體酶結(jié)合物是抗IgG單克隆結(jié)合物或一個(gè)多克隆結(jié)合物。對于多克隆結(jié)合物和單克隆結(jié)合物,篩選的樣品總數(shù)分別為1077和1056。篩選結(jié)果匯總在表15中,樣品的分布顯示在圖44的短形圖中。
平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)偏差的計(jì)算排除了那些給出超過1.5信號(hào)的樣品,即1073OD值用作使用多克隆結(jié)合物的計(jì)算,1051用作使用抗IgG單克隆結(jié)合物的計(jì)算。如表15所示,當(dāng)使用多克隆結(jié)合物時(shí),平均數(shù)從0.0493移至0.0931,標(biāo)準(zhǔn)偏差從0.074增加至0.0933。而且,結(jié)果還顯示,如果用X+5SD的標(biāo)準(zhǔn)來定義測量法的臨界,ELISA中的多克隆-酶結(jié)合構(gòu)型就要求一個(gè)較高的臨界值。這意味著與單克隆體系相比試驗(yàn)的特異性降低了。另外,如圖44中描繪的矩形圖,在隨機(jī)供血者血液用抗IgG單克隆結(jié)合物的ELISA測量法篩選中與用商品化的多克隆標(biāo)記的測量法中的相比時(shí),陰性和陽性分布的結(jié)果發(fā)生了較大的分離。
表15測試隆機(jī)供血者血樣二個(gè)ELISA構(gòu)型的比較結(jié)合物多克隆抗IgG單克隆(Jackson)樣品數(shù)10731051平均數(shù)(x)0.09310.04926標(biāo)準(zhǔn)編差(SD)0.09330.074275SD0.46660.3714臨界(5SD+x)0.55960.4206
Ⅳ.J來自不同地理位置的NANBH病人中HCV血清轉(zhuǎn)化的檢測用基本如Ⅳ.D所述的RIA法篩選來自因ALT水平升高而被凝有NANBH的血清及來自HAV和HBV測試時(shí)為陰性的血清,除了HCVC100-3抗原被用作為微滴定板中的篩選抗原。如表16中所列的結(jié)果表明,RIA檢查出高百分率的陽性樣品。
表16在不同國家的NANBH病人中抗-C100-3的血清轉(zhuǎn)化頻率國家荷蘭意大利日本檢查數(shù)53626陽性數(shù)32919陽性百分?jǐn)?shù)(%)608073Ⅳ.K患群體獲得性(“CommunityAcquired”)NANBH的病人中的HCV血清轉(zhuǎn)化的檢測從100個(gè)患NANBH的病人得到的血清由疾病控制中心的M.Alter博士和哈佛大學(xué)的J.Dienstag博士提供,對于這些病人無明顯的傳染途徑(比如輸血、用藥,性亂交等這些被認(rèn)為附著在危險(xiǎn)因素)。除了HCVC100-3抗原被用作為附著在微滴定板上的篩選抗原,這些樣品是用基本如Ⅳ.D.中所述的RIA法篩選。結(jié)果表明100個(gè)血清樣品中,55個(gè)含有與HCVC100-3抗原有免疫反應(yīng)的抗體。
上述結(jié)果提出,群體獲得性(“CommunityAcquired”)NANBH也是由于HCV引起的。然而,因?yàn)橐炎C實(shí)了HCV與黃熱病有關(guān),大多數(shù)是通過節(jié)肢動(dòng)物傳染的,因此,認(rèn)為在“群體獲得性”病例中的HCV傳染也是節(jié)肢動(dòng)物的傳染的結(jié)果。
Ⅳ.L與NANBH傳染有關(guān)的供體中的HCV抗體的產(chǎn)生與代用指標(biāo)的比較進(jìn)行預(yù)期的研究以測定接受來自疑有NANBH陽性的供血者的受血者是否發(fā)展了NANBH,將血清轉(zhuǎn)化成陽性抗-HCV抗體。對供血者檢查其代用指標(biāo)非正常性,比如,ALT水平的提高及抗核抗體的存在。另外,還對供血者檢查其抗HCV抗體的存在??笻CV抗體的存在的測定是用如Ⅳ.K.中所述的放射免疫法測定的。研究結(jié)果列于表17,其表明,病人數(shù)(第1列),病人血清中的抗HCV抗體的存在(第2列),從病人那里得到的血制品數(shù),各個(gè)血制品出自不同的供血者(第3列),供血者血清中抗HCV抗體的存在(第4列),供血者替代正常性(第5例)(NT表示未測定)(ALT是增加了的傳染,ANTI-HBc是抗核抗體)。
表17中的結(jié)果證實(shí)HCV抗體檢查在檢測感染的血清提供者方面比接體標(biāo)記檢查更精確。10個(gè)增加了NANBH癥狀的病人中,有9測出陽性抗HCV抗體血清轉(zhuǎn)化。11個(gè)懷疑供血者中(病人6接受了來自2個(gè)疑是NANBH載體個(gè)體的血制品),9個(gè)是陽性抗HCV抗體,1個(gè)是臨界陽性,因而是不明確(對病人1的供血者)。相反,用ALT升高的檢查法查出10個(gè)供血者中6個(gè)是陰性,用抗核抗體檢查法查出10個(gè)供血者中5個(gè)是陰性。更重要的是,在三個(gè)例子中(對病人8,9和10的供血者)ALT檢查與抗-HBc檢查的結(jié)果不一致。
Ⅳ.M利用PCR和來自黃熱病毒順序的保守區(qū)域的引物擴(kuò)大HCVcDNA順序克隆上面結(jié)果表明,HCV為黃熱病病毒或類黃熱病病毒,承認(rèn)了一個(gè)克隆未定性HCVcDNA順序的策略,該策略運(yùn)用了PCR技術(shù),及來自黃熱病病毒中編碼保守的氨基酸順序的區(qū)域的引物。通常,引物中的一個(gè)來自規(guī)定的HCV基團(tuán)組順序,其他側(cè)面相接在未定序HCV多核苷酸區(qū)段的引物是來自黃熱病病毒基團(tuán)的保守區(qū)段。已知黃熱病病毒基因含有在NS1和E多肽內(nèi)的保守順序,編碼在黃熱病病毒基因的5′區(qū)段。編碼這些區(qū)域的相應(yīng)順序如圖26所示,在HCVcDNA的上游,因此,為了分離從HCV基因組的這一區(qū)段來的cDNA順序,設(shè)計(jì)了上游引物,該引物來自黃熱病病毒多肽中的保守順序。下游引子來自HCVcDNA已知部分的上游未端。
由于密碼的變化,有可能產(chǎn)生黃熱病病毒探針和相應(yīng)的HCV基因組順序之間的錯(cuò)誤配段,因此,就使用一個(gè)與Lee在1988年描述的相似的策略。Lee方法是應(yīng)用與一段氨基酸順序的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補(bǔ)的混合寡核苷酸引物,該混合引物內(nèi)的順序考慮到保守的氨基酸順序的每個(gè)密碼子的變化。
在氨基酸同源性的基礎(chǔ)上產(chǎn)生了三組引物混和物,這些同源性發(fā)現(xiàn)于幾種黃熱病病毒中,包括登革熱-2,4(D-2,4),日本腦炎病毒(JEV),黃熱病(YF),和西聶爾病毒(WN)。從最上游的保守順序(5′-1)衍生而來的引物混合物的氨基酸順序?yàn)間ly-trp-gly,該順序是在D-2,JEV,YF和WN的E蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的保守順序asp-arg-gly-trp-gly-aspN的一部分,下一個(gè)引物混合物(5′-2)是基于E蛋白質(zhì)中一個(gè)下游的保守順序,phe-asp-gly-asp-ser-tyr-ileu-phe-gly-asp-ser-tyr-ileu是從phe-gly-asp衍生而來的,此保守順序存在于D-2,JEV,YF和WN中。第三個(gè)引物混合物(5′-3)是基于氨基酸順序arg-ser-cys,該順序是D-2,D-4,JEV,YF和WN的NS1蛋白質(zhì)中的保守順序cys-cys-arg-ser-cys的一部分。組成5′-3的混合物的各個(gè)引物如圖45所示。除了從保守區(qū)段衍生來的可變順序外,每個(gè)混合物中的每個(gè)引物還包含一個(gè)在5′端的恒定區(qū)段,該區(qū)段含有編碼內(nèi)切酶,HindⅢMboⅠ和EcoRⅠ的位點(diǎn)的順序。
下游引物,ssc5h20A,是來自克隆5h中的核苷酸順序,它含有HCVcDNA順序,其順序與克隆14i和11b順序重迭。ssc5h20A順序?yàn)?′GTAATATGGTGACAGAGTCA3′也可以用一個(gè)代替的引物ssc5h34A。該引物來自克隆5h中的順序,并還包括在5′端的產(chǎn)生內(nèi)切酶位點(diǎn)的核苷酸,由此促進(jìn)克隆。ssc5h34A的順序?yàn)?′GATCTCTAGAGAAATCAATATGGTGACAGAGTCA3′首先由Saiki等在1986描述的PCR反應(yīng)基本上按Lee等在1988描述的進(jìn)行,除了cDNA的模板是如Ⅳ.c.2中所述從感染HCV的黑猩猩肝中分離出來的RNA或如Ⅳ.A.1中所述從感染HCV的黑猩猩血清中分離出來的病毒顆粒。另外,復(fù)性條件在第一輪擴(kuò)大中不是嚴(yán)格的(0.6MNaCl,25℃),因?yàn)閷⒁獜?fù)性為HCV順序的部分引物僅僅是9個(gè)核苷酸,可能會(huì)錯(cuò)誤配段。然而,如果用ssc5h34A,不是來自HCV基因組的附加順序就傾向于動(dòng)搖引物模板的雜交。第一次放大后,復(fù)性條件可以嚴(yán)格些(0.066MNaCl,32℃~37℃,因?yàn)楝F(xiàn)在被放大的順序含有與引物互補(bǔ)或相同的區(qū)域。還有,初始10次的放大是用Klenow酶Ⅰ進(jìn)行,并在對該酶合適的PCR條件下。在這幾次完成后,抽提樣品,再如Cetus/PerkinElmer完成的,按試劑盒中的說明,用Tag多聚酶進(jìn)行。放大以后,用來自克隆5h的探針的雜交來檢測放大的HCVcDNA順序。這個(gè)探針是來自產(chǎn)生引物的上游順序,與產(chǎn)生引物的克隆5h中的順序不重疊。該探針順序?yàn)?′CCCAGCGGCGTACGCGCTGGACACGGAGGTGGCCGCGTCGTGTGGCGGTGTTGTTCTCGTCGGGTTGATGGCGC3′Ⅳ.N.1由感染NANBH的黑猩猩肝建立HCVcDNA庫由從建立Ⅳ.A.1.節(jié)中HCVcDNA庫的黑猩猩的肝建立一個(gè)HCVcDNA庫。建立該庫的技術(shù)相似于Ⅳ.A.24節(jié)中所述,除了RNA的來源不同,以及采用基于克隆11b中的HCVcDNA順序的引物。該引物的順序?yàn)?′CTGGCTTGAAGAATC3′Ⅳ.N.2使克隆k9-1中的HCVcDNA與克隆11b中cDNA重疊的分離和核苷酸順序如Ⅳ.A.25,節(jié)中所述,使克隆k9-1與由NANBH感染的黑猩猩的肝建立的HCVcDNA庫分離。采用在5′末端上重疊克隆11b的克隆-克隆11e,從該庫中篩選重疊克隆11b中順序的克隆。圖23所示為克隆11b的順序。分離陽性克隆的頻率為1/50,000。一種分離的克隆k9-1要進(jìn)一步研究。通過用克隆Alex46探測克隆,證實(shí)了克隆k9-1中HCVcDNA與圖26中的HCVcDNA順序的5′末端的重疊性;如上所述,后者克隆含有相應(yīng)于在克隆14i中的HCVcDNA的5′末端上的堿基對的30堿基對的HCVcDNA順序。
采用上述的技術(shù)測定與克性k9-1分離的HCVcDNA核苷酸順序。圖46所示為克隆k9-1中的HCVcDNA的順序、與圖26中的HCVcDNA重疊部分以及其中編碼的氨基酸。
使克隆k9-1中的HCVcDNA順序與Ⅳ.A.19中所述的克隆的順序一致,以便用位于圖32中所示的順序上游的k9-1順序建立復(fù)合HCVcDNA順序,圖47所示為含有k9-1順序的復(fù)合HCVcDNA以及其中編碼的氨基酸。關(guān)于疏水性和親水性的區(qū)域外形,如上所述,以圖47中所示的HCVcDNA的5′區(qū)中編碼的氨基酸順序于Dengue病毒的其中一個(gè)菌株的相應(yīng)區(qū)作比較。比較表明,來自在相應(yīng)于編碼入NS1(或者其一部分)的區(qū)中編碼的HCV和Dengue的多肽具有相似的疏水的/親水的外形。
以下提供的資料能夠識(shí)別HCV菌株。其他HCV菌株的分離和鑒定可以通過使核酸與含有病毒顆粒的主組分分離、用基于以下所述的HHCVcDNA探針的多核苷酸探針建立cDNA庫、從該庫中篩選含有以下所述的HCVcDNA順序的克隆以及來自新的分離體的HCVcDNA與以下所述的cDNA作比較來完成。利用上述的多肽和抗體,對免疫交叉反應(yīng)性可以監(jiān)控其中或者在病毒基因組內(nèi)編碼的多肽。如以上定義章節(jié)中所述,HCV的參量中固定的菌株是可易于識(shí)別的?;诒疚乃峁┑馁Y料,識(shí)別HCV菌株的其他方法對本領(lǐng)域中的技術(shù)人員來說將是顯而易見的。
工業(yè)應(yīng)用此公開的本發(fā)明的各種各樣的揭示有許多工業(yè)用途,下列其中的幾種。HCVcDNAs可用作檢測樣品中HCV核酸的探針的設(shè)計(jì)。來自cDNAs的探針可用來檢測比如在化學(xué)合成反應(yīng)中的HCV核酸。它們還可用在篩選抗病毒試劑的方案以確定該試劑在阻止細(xì)胞培養(yǎng)體系及動(dòng)物類體系中病毒的復(fù)制的效果,HCV聚核苷酸探針在檢測人體中的病毒核苷酸也是有用的,這樣,反過來可以作為人體感染HCV的診斷基礎(chǔ)。
除了上述的以外,在此提出的cDNAs提供了合成含有HCV表位的多肽的信息和方法,這些多肽在檢測對HCV抗原的抗體中是上有用的。一系列感染HCV的免疫測定法基于含有在此所述的HCV表位的重組合多肽,并將發(fā)現(xiàn)在診斷HCV引起的NANBH中,在篩選血庫中HCV引起的感染性肝炎的供血者中以及檢測來自感染性供血者的污染血液中是可行有用的。病毒抗原還有在監(jiān)測動(dòng)物類體系中抗病毒劑的功效方面的用途。此外,在此公開的來自HCVcDNAs的多肽可用作治療感染HCV的疫苗。
來自HCVcDNAs的多肽除了上述用途外,對提高抗HCV抗體也是有用的。這樣,它們就可被用在抗HCV疫苗中。然而,作為與HCV多肽免疫的結(jié)果而產(chǎn)生的抗體在檢測樣品中病毒的存在也是有用的,因此,它們可用于測量化學(xué)體系中HCV多肽的產(chǎn)物??笻CV抗體還可被用于監(jiān)測篩選方案中抗病毒試劑的功效,這些試劑在該方案中是在組織培養(yǎng)體系里檢查的。它們還可用于被動(dòng)免疫療法,及通過施行血液供給者和接受者中病毒抗原的檢查來治療HCV引起的NANBH??笻CV抗體另一個(gè)重要用途是在用于病毒和病毒多肽的純化的親合層析法方面。純化的病毒和病毒多肽制備可用在疫苗中。然而,純化的病毒還對細(xì)胞培養(yǎng)體系的改善是有用的,在該體系中HCV進(jìn)行復(fù)制。
含有感染HCV細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)體系可有許多用途。它們可用于相對大規(guī)模生產(chǎn)的HCV,其通常情況下是低效價(jià)病毒。這些體系還可用來闡明病毒的分子生物學(xué),并引導(dǎo)抗病毒試劑的發(fā)展。細(xì)胞培養(yǎng)體系在篩選抗病毒試劑功效方面也是有用的。另外,HCV容納細(xì)胞培養(yǎng)體系對稀釋HCV株的制備是有用的。
為了方便起見,抗HCV抗體和HCV多肽,要么是天然的,要么是重結(jié)合的,可包裝在盒里。
用于分離NANBVcDNA的方法,包括在一個(gè)表達(dá)載體中制備一個(gè)來自個(gè)體的感染組織的cDNA庫以及抗體的免疫反應(yīng)性的篩選表達(dá)產(chǎn)物,該抗體含有來自第二次感染的個(gè)體的軀體組分;該方法對分離來自其它前述的未定性疾病病原體的cDNAs也是有效的,這些病原體由基因組成分組成。這樣,反過來可以引起對這些病原體的分離和定性,以及制備針對這些疾病病原體的診斷試劑和疫苗。
權(quán)利要求
1.一種純化HCV多核苷酸。
2.一種重組HCV多核苷酸。
3.一種重組多核苷酸,其特征在于它包括來自HCV基因組或者來自HCV cDNA的順序。
4.一種重組多核苷酸,其特征在于它編碼HCV的表位。
5.一種重組載體,其特征在于它含有如權(quán)利要求2、或者權(quán)利要求3、或者權(quán)利要求4所述的多核苷酸。
6.一種用權(quán)利要求5的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
7.一種重組表達(dá)系統(tǒng),其特征在于它包括來自HCV基因組或者來自HCV cDNA的DNA開放讀碼(ORF),其中開放讀碼切實(shí)可行地被連接在與要求的宿主相容的控制順序上。
8.一種用權(quán)利要求7所述的重組表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
9.一種由權(quán)利要求8所述的細(xì)胞形成的多肽。
10.純化的HCV。
11.由權(quán)利要求10所述的HCV制備的多肽制劑。
12.一種純化HCV多肽。
13.一種純化多肽,其特征在于它包括免疫學(xué)上可與HCV中所含的表位區(qū)別的表位。
14.一種重組HCV多肽。
15.一種重組多肽,其特征在于它包含來自HCV基因組或者來自HCV cDNA的順序。
16.一種重組多肽,其特征在于它包含HCV表位。
17.一種融合多肽,其特征在于它包含HCV多肽。
18.一種單克隆抗體,其特征在于它抗HCV表位。
19.一種抗HCV的多克隆抗體的純化制備。
20.一種抗HCV感染的致免疫的微粒,其特征在于它包括具有在真核宿主中產(chǎn)生所說的順序時(shí),能夠形成微粒的氨基酸順序的非HCV多肽以及HCV表位。
21.一種HCV多核苷酸探針。
22.一種用于分析樣本中存在來自HCV的多核苷酸的藥盒,其特征在于所說藥盒包括盛在合適容器中的包含來自大約8或8個(gè)以上核苷酸的HCV的核苷酸順序的多核苷酸探針。
23.一種用于分析樣本中存在HCV抗原的藥盒,其特征在于所說藥盒包括盛在合適容器中的抗被檢測的HCV抗原的抗體。
24.一種用于分析樣本中存在抗HCV抗原的抗體的藥盒,其特征在于所說藥盒包括盛在合適容器中的包含在HCV抗原中存在的HCV表位的多肽。
25.一種多肽,其特征在于它包含連接在固體底物上的HCV表位。
26.一種抗體,其特征在于它抗連接在固體底物上的HCV表位。
27.一種含有HCV表位的多肽的制備方法,其特征在于所說的方法包括在允許表達(dá)所說的多肽的條件下,培養(yǎng)由含有編碼包含HCV表位的多肽的順序的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
28.一種含有HCV表位的多肽,其特征在于它由權(quán)利要求27的方示制備。
29.一種樣本中HCV核酸的檢測方法,其特征在于所說的方法包括(a)使樣本的核酸在允許探針和樣本中的HCV核酸之間生成多核苷酸復(fù)合體的條件下與HCV多核苷酸探針反應(yīng);以及(b)檢測含有探針的多核苷酸復(fù)合體。
30.一種HCV抗原的檢測免疫試驗(yàn),其特征在于所說的試驗(yàn)包括(a)在允許生成抗原-抗體復(fù)合體的條件下,將懷疑含有HCV抗原的樣本與抗被檢測的HCV抗原的探針抗體一起培養(yǎng);以及(b)檢測含有探針抗體的抗原、抗體復(fù)合體。
31.一種抗HCV抗原的檢測免疫試驗(yàn),其特征在于所說的試驗(yàn)包括(a)在允許生成抗原、抗體復(fù)合體的條件下,將懷疑含有抗HCV抗體的樣本與含HCV的表位的探針多肽一起培養(yǎng);以及(b)檢測含有探針抗原的抗體、抗原復(fù)合體。
32.一種HCV感染的治療疫苗,其特征在于所說的疫苗包括以藥物學(xué)上有效的劑量存在于制藥學(xué)上可接受的賦形劑中的,含有HCV表位的致免疫多肽。
33.一種HCV感染的治療疫苗,其特征在于所說的疫苗包括以藥物學(xué)上有效劑量存在于制藥學(xué)上可接受的賦形劑中的失活HCV。
34.一種HCV感染的治療疫苗,其特征在于所說的疫苗包括以藥物學(xué)上有效劑量存在于制藥學(xué)上可接受的賦形劑中的減毒HCV。
35.一種以HCV感染的組織培養(yǎng)生長細(xì)胞。
36.如權(quán)利要求35所述的細(xì)胞,其特征在于所說的細(xì)胞屬于人巨噬細(xì)胞系或者為肝細(xì)胞細(xì)胞系、或者為蚊子細(xì)胞細(xì)胞系,或者為蜱細(xì)胞細(xì)胞系、或者為鼠巨噬細(xì)細(xì)胞細(xì)胞系、或者為胚胎細(xì)胞。
37.如權(quán)利要求35所述的HCV感染細(xì)胞,其特征在于所說的細(xì)胞為來自HCV感染個(gè)體的肝的細(xì)胞系。
38.一種抗HCV抗體的產(chǎn)生方法,其特征在于所說的方法包括把足以產(chǎn)生免疫響應(yīng)的數(shù)量的含有HCV表位的分離致免疫的多肽供給個(gè)體。
39.一種抗HCV抗體的產(chǎn)生方法,其特征在于所說的方法包括把權(quán)利要求11的多肽制劑供給個(gè)體,其中制劑含有至少一種致免疫的多肽,以及供給足以產(chǎn)生免疫響應(yīng)的數(shù)量。
40.一種來自未識(shí)別的感染物的基因組的cDNA分離方法,其特征在于所說的方法包括(a)提供用含有由該物感染的組織中分離的核酸制備的cDNA庫的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞以及使所說的宿主細(xì)胞于允許在cDNA中編碼的多肽表達(dá)的條件下生長;(b)使cDNA的表達(dá)產(chǎn)物在允許免疫反應(yīng)的條件下與含有以所說感染物感染的個(gè)體的主組份的抗體相互作用,以及檢測由相互作用而生成的抗體-抗原復(fù)合體;(c)在允許它們生長成個(gè)體克隆的條件下,使表達(dá)在步驟(b)中生成抗體-抗原復(fù)合體的多肽的宿主細(xì)胞生長以及分離所說的克隆;(d)在允許表達(dá)在cDNA內(nèi)編碼的多肽的條件下,使來自(c)的克隆的細(xì)胞生長,以及使表達(dá)產(chǎn)物與含有與以感染物感染的和未以該物感染的對照的步驟(a)中的個(gè)體相區(qū)別的個(gè)體的主組份的抗體相互作用,以及檢驗(yàn)由相互作用而生成的抗體-抗原復(fù)合體;(e)在允許它們生長成個(gè)體克隆的條件下,使與含有感染個(gè)體和懷疑感染的個(gè)體的主組份的抗體而與非對照個(gè)體的所說組份的抗體生成抗體-抗原復(fù)合體的多肽的表達(dá)宿主細(xì)胞生長,以及分離所說的克隆;以及(f)使cDNA與步驟(e)中的宿主細(xì)胞克隆分開。
全文摘要
本發(fā)明提供了來自肝炎C病毒(HCV)的一族CDNA順序。這些順序編碼免疫學(xué)上與在患非A非B肝炎(NANBH)的個(gè)體中存在的抗體反應(yīng)的抗源,但它通常不在以肝炎A病毒(HAV)或肝炎B病毒(HBV)感染的個(gè)體中,也不在對照個(gè)體中。這些CDNA順序與基因庫中順序及與肝炎△病毒(HDV)和HBV的順序的比較表明缺乏實(shí)質(zhì)的同源性。CDNA中編碼的氨基酸順序與黃熱病毒順序比較指出HCV是黃熱病毒或類黃熱病毒。
文檔編號(hào)C12P21/02GK1035679SQ88107988
公開日1989年9月20日 申請日期1988年11月18日 優(yōu)先權(quán)日1987年11月18日
發(fā)明者霍頓·邁克爾, 周麒麟, 庫·喬治 申請人:希龍股份有限公司