本發(fā)明涉及一種厭氧酒糟有機(jī)肥浸提液的制備及應(yīng)用，屬于堆肥提取液技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

堆肥提取液(compost tea或者compost extracts)是指堆制腐熟的有機(jī)物料經(jīng)過不同方法提取后的提取液。目前堆肥提取液的生產(chǎn)主要有兩種工藝，但各有其優(yōu)缺點(diǎn)。其中一種是好氣提取堆肥提取液(Aerated fermentation extracts compost，即AFEC)，特點(diǎn)是提取時間短，但是需要外在能源(氧氣，糖蜜，魚乳膠物0.5mol·L^-1，腐殖物質(zhì)，植物提取物等)的補(bǔ)充；而另一種則是厭氣提取堆肥提取液(Non-aerated fermentation extracts compost，即NAFEC)，特點(diǎn)是不需要外在的能源供應(yīng)，但是提取時間比較長。

越來越多的研究表明，堆肥提取液不僅能夠?yàn)樽魑锾峁B(yǎng)分和有益的有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)，而且還能夠抑制作物病害和改良土壤結(jié)構(gòu)。然而，目前關(guān)于堆肥提取液中物質(zhì)成分和結(jié)構(gòu)特征研究的報道較少。到目前為止，很少有文獻(xiàn)報道好氣提取酒糟堆肥提取液(AFEC)和厭氣提取酒糟堆肥提取液(NAFEC)與直接提取酒糟堆肥提取液(DEC：提取時間短，不需要外加物質(zhì)和能源)的物質(zhì)成分與結(jié)構(gòu)特征及其對作物促生效果的差異。

特別是以酒糟堆肥為原料，好氣提取和厭氣提取工藝對酒糟堆肥提取液中營養(yǎng)成分不清、可培養(yǎng)微生物數(shù)量以及細(xì)菌結(jié)構(gòu)功能多樣性的影響目前均不清楚。因此，無法針對性的根據(jù)作物實(shí)際需要來提供不同的酒糟浸提液。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：提供一種厭氧酒糟有機(jī)肥浸提液的制備及應(yīng)用，制備的浸提液不僅能夠獲得較多的氮磷鉀養(yǎng)分，而且特別適合作為作物根施施用，可以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。

本發(fā)明的技術(shù)方案：一種厭氧酒糟有機(jī)肥浸提液的制備方法，將酒糟堆肥與水按1:8的質(zhì)量比例充分混勻后置于塑料桶內(nèi)，然后密封塑料桶并蓋好蓋子，在20℃～25℃下保存7天，再經(jīng)紗布過濾后即得酒糟有機(jī)肥浸提液。

所述酒糟堆肥中含有機(jī)質(zhì)74.8％、全氮3.57％、全磷2.18％和全鉀1.23％。

所述酒糟有機(jī)肥浸提液在作物根施上的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明厭氧方法所制備的浸提液，與好氧和直接提取方法相比，在有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷和全鉀含量方面提高顯著，養(yǎng)分速效性較好；同時由于本浸提液的活性較差，因此特別適合作物根施使用，可利用根系土壤中的細(xì)菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化從而被作物吸收。

附圖說明

圖1為不同提取比例和通氣條件對酒糟堆肥提取液養(yǎng)分含量的影響；

圖2不同浸提比例和通氣條件對可浸提主要成分提取率的影響(25℃)；

圖3為不同提取工藝酒糟堆肥提取液中細(xì)菌16S rDNA V3片段PCR產(chǎn)物的DGGE圖譜；

圖4為不同提取工藝酒糟堆肥提取液細(xì)菌DGGE圖譜系統(tǒng)分析。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。

一、實(shí)施例：

1、材料準(zhǔn)備

酒糟堆肥由金沙加孟農(nóng)業(yè)專業(yè)合作社提供，其基本性質(zhì)如下：有機(jī)質(zhì)(OM)：74.8％；全氮(TN)：3.57％；全磷(TP)：2.18％和全鉀(TK)：1.23％。

2、浸提液制備

將酒糟堆肥與水按1:8的質(zhì)量比例充分混勻后置于塑料桶內(nèi)，然后密封塑料桶并蓋好蓋子，在20℃～25℃下保存7天，再經(jīng)雙層紗布過濾后即得酒糟有機(jī)肥浸提液，在4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

3、浸提液使用

在作物生長階段，可將該浸提液作為根施施用，以利于作物根系的生長，進(jìn)而起到促生作用。

二、設(shè)計(jì)試驗(yàn)及分析方法

1、材料準(zhǔn)備

原料酒糟堆肥如前所述。

2、不同提取工藝酒糟堆肥提取液制備

將堆肥與水(堆肥與水質(zhì)量比為1：8)充分混勻，連續(xù)攪拌15min，靜置片刻，雙層紗布過濾后，濾液(在4℃下保存)備用。這種提取方法所獲得的提取液稱之為直接提取酒糟堆肥提取液(DEC)。

將堆肥與水充分混勻后，密封塑料桶并蓋好蓋子，保存7天(20℃-25℃)，再經(jīng)雙層紗布過濾，濾液(在4℃下保存)備用。這種提取方法所獲得的提取液稱之為厭氣提取酒糟堆肥提取液(NAFEC)。

將堆肥與水充分混勻后，在每個桶中均勻分布地插入三根帶有冒氣頭的氣管，持續(xù)通氣(通氣量為33L·min-1)36h(20℃-25℃)，經(jīng)雙層紗布過濾，濾液(在4℃下保存)備用。這種提取方法所獲得的提取液稱之為好氣提取酒糟堆肥提取液(AFEC)。

每種工藝重復(fù)3次。

3、不同提取工藝酒糟堆肥提取液基本理化性質(zhì)分析

酒糟堆肥提取液理化性質(zhì)分析參照有機(jī)肥養(yǎng)分測定農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(2002)和鮑士旦(2000)主編《土壤農(nóng)化分析》。分析前，需將堆肥提取液經(jīng)中速定量濾紙(直徑為11cm)過濾。有機(jī)質(zhì)含量的測定采用重鉻酸鉀容量法。

TN、TP和TK的前處理：取2mL酒糟堆肥提取液，雙氧水-濃硫酸消煮，定容到100毫升待測。

TN：用連續(xù)流動自動分析儀(Auto Analyzers 3，Bran+Luebbe Germany)測定；TP：用鉬銻抗比色法722分光光度計(jì)測定；TK：用FP6400火焰光度計(jì)測定。

電導(dǎo)率(EC)和pH的測定：酒糟堆肥提取液經(jīng)濾紙過濾后用電導(dǎo)儀(WTW，LF91，Germany)和pH計(jì)(PB-10，Sartorius)直接測定。

以上各樣品分析重復(fù)5次。

總水溶性有機(jī)碳(TWSOC)和腐殖酸碳：TWSOC和Humic-C含量采用TOC儀測定(Elementar Liquid TOCⅡ，德國)，重復(fù)3次。

4、不同提取工藝酒糟堆肥提取液微生物區(qū)系和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

①不同提取工藝酒糟堆肥提取液可培養(yǎng)微生物區(qū)系分析

采用連續(xù)稀釋培養(yǎng)法(Ren等，2008)。堆肥提取液可培養(yǎng)微生物計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：細(xì)菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；放線菌用高氏1號培養(yǎng)基；真菌用馬丁氏培養(yǎng)基。

②不同提取工藝酒糟堆肥提取液細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性分析

土壤DNA的提取和純化方法參考：張瑞福等(2003)；黃婷婷等(2004)方法，并稍作修改。具體方法如下：

稱取5mL堆肥提取液樣品，與13.5mL DNA提取緩沖液混合，加入100μL蛋白酶K(10mg·mL-1)，于37℃搖床上振蕩30min(225r·min-1)；再加入1.5mL的200g·L-1十二烷基硫酸鈉(SDS)，65℃水浴2h，其間每隔15-20min輕輕顛倒混勻；迅速置于-70℃冰凍30min，取出后于65℃水浴融化，如此反復(fù)2-3次裂解細(xì)胞；室溫離心(12000rpm)10min，收集上清液，轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，樣品沉淀再加入4.5mL提取液和0.5mL的200g·L-1SDS，渦旋10s，65℃水浴10min，室溫離心(12000rpm)10min，收集上清液并與前次上清液合并。上清液用等體積的氯仿-異戊醇(v：v＝24：1)抽提，離心后吸取水相轉(zhuǎn)移至另一50mL離心管中，以0.6體積異丙醇室溫沉淀1h，室溫離心(12000rpm)20min，收集核酸沉淀，用冷的700ml·L-1乙醇洗滌沉淀，吹干，溶解于滅菌的超純水中，最終體積為200μL。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)參考Nakatsu等(2000)方法。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：10×緩沖液2.5μL，dNTP(25mmol·L-1)2μL，引物1(25pmol·ìL-1)0.5μL，引物2(25pmol·ìL-1)0.5μL，Mg2+(25mmol·L-1)2.5μL，模板(適當(dāng)稀釋的土壤DNA)1μL，Taq DNA聚合酶1μL，雙蒸水15μL，總體積25μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸15s，72℃保持5min，共循環(huán)35次，4℃保溫。

引物為細(xì)菌通用引物：引物1：PRBA338F Bacteria V3region(338-358)5-AC TCC TAC GGG AGG CAG CAG-3；引物2：PRUN518R Universal V3region(534-518)5-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3；GC clamp：5-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G-3。

DGGE及DGGE凝膠的分析參考Asakawa等(2008)，Nakatsu等(2000)和Navarro-Noya等(2010)。

堆肥提取液中DNA經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，采用D-Code突變檢測系統(tǒng)(Bio-Rad)對樣品進(jìn)行DGGE分析。所用的聚丙烯酰胺凝膠濃度為8％，變性梯度為40％-60％，80V恒溫60℃，1×TAE中電泳16h，銀染后掃描，采用Quantity One(Bio-Rad)分析結(jié)果。

③不同提取工藝酒糟堆肥提取液細(xì)菌群落功能多樣性指數(shù)

準(zhǔn)確稱取10mL堆肥提取液樣品，加入到加入90mL無菌生理鹽水(0.85％NaCl)中稀釋，在搖床里振搖30min，靜止沉淀3～5min，然后進(jìn)行100倍稀釋，以每孔150μL稀釋液加入微孔板中，將制備好的菌懸液倒入無菌移液槽中，使用八孔移液器將其接種于Ecoplate的96孔中，放入Biolog Omnilog儀中28℃恒溫培養(yǎng)，每15min自動測定波長為590nm和750nm的顏色與濁度。

計(jì)算土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)分別由Shannon多樣性指數(shù)(H)、Simpson優(yōu)勢度指數(shù)(D)—和McIntosh均勻度指數(shù)(U)來表示[11]。

H＝-ΣPiln Pi；

其中Pi為第i孔相對吸光度值與整個平板相對吸光度值總和的比率；

其中，ni為第i孔的相對吸光值，N為相對吸光度值總和。

5、數(shù)據(jù)處理

可浸提主要成分提取率(％)＝(堆肥浸提液中全氮含量×全氮所占權(quán)重+全磷含量×全磷所占權(quán)重+全鉀含量×全鉀所占權(quán)重)/(試驗(yàn)所用堆肥中全氮含量×全氮所占權(quán)重+全磷含量×全磷所占權(quán)重+全鉀含量×全鉀所占權(quán)重)×100。

某一成分所占權(quán)重＝堆肥浸提液中某一成分的量/全部成分的量。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用采用Microsoft Excel 2003處理，顯著性分析采用SPSS Base Ver.13.0統(tǒng)計(jì)軟件(SPSS,IL,Chicago,USA)進(jìn)行Duncan多重比較(P≤0.05)。

6、結(jié)果與分析

6.1不同提取比例及通氣條件對酒糟堆肥提取液的養(yǎng)分含量的影響

從圖1可以看出，不同提取比例和通氣條件都能在一定程度上影響酒糟堆肥提取液中的主要養(yǎng)分含量。對于浸提液全氮量而言，不管好氣條件和厭氧條件下1:4處理的全氮含量與1:8處理之間無明顯差異但顯著高于1:10處理，比1:10處理增加39.2％(好氣條件)和40.8％(厭氧條件)。對于浸提液全磷量而言，在好氣條件下，不論提取比例如何，好氣提取酒糟堆肥提取液中的有機(jī)質(zhì)和全磷含量均高于厭氣提取酒糟堆肥提取液中的有機(jī)質(zhì)和全磷含量。而好氣提取酒糟堆肥提取液和厭氣提取酒糟堆肥提取液中的全氮和全鉀含量相當(dāng)。對于不同提取比例而言，堆肥與水的比例為1：8和1：5處理的酒糟堆肥提取液中主要養(yǎng)分含量相對較高(圖2)。

6.2厭氧條件下不同浸提時間對酒糟堆肥提取液的養(yǎng)分含量的影響

從表1可以看出，在厭氣條件下，隨著提取時間的延長，酒糟堆肥提取液中主要養(yǎng)分含量逐漸增加。提取5天、6天和7天的酒糟堆肥提取液中有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷和全鉀含量差異不顯著，但是提取7天的酒糟堆肥提取液中有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷和全鉀含量最高。提取7天的酒糟堆肥提取液中有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀含量比提取1天和2天的酒糟堆肥提取液中有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀含量分別增加了65.9％和41.6％、103.6％和74.1％、150.0％和78.9％、25.1％和14.8％。

表1不同時間對厭氣提取酒糟堆肥提取液中主要養(yǎng)分含量的影響

注：每列數(shù)值后標(biāo)不同字母表示在5％水平差異顯著(鄧肯檢驗(yàn))。

6.3不同提取工藝酒糟堆肥提取液可培養(yǎng)微生物區(qū)系分析

表2為不同提取工藝酒糟堆肥提取液可培養(yǎng)微生物區(qū)系，從表3可以看出，DEC中可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量分別比AFEC和NAFEC增加了163.6％和217.8％，而DEC和NAFEC中可培養(yǎng)放線菌數(shù)量分別比AFEC提高了256.1％和166.4％，DEC中可培養(yǎng)真菌數(shù)量分別比AFEC和NAFEC增加了100.1％和448.8％，且處理間差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

表2不同提取工藝酒糟堆肥提取液可培養(yǎng)微生物區(qū)系

注：每列數(shù)值后標(biāo)不同字母表示在5％水平差異顯著(鄧肯檢驗(yàn))。

6.4不同提取工藝酒糟堆肥提取液細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性分析

圖3為不同提取工藝酒糟堆肥提取液中細(xì)菌16S rDNAV3片段PCR產(chǎn)物的DGGE圖譜，從該圖中可看出，與DEC中的細(xì)菌DGGE條帶數(shù)相比，AFEC和NAFEC細(xì)菌DGGE條帶數(shù)明顯減少，但是AFEC細(xì)菌DGGE條帶數(shù)又多于NAFEC細(xì)菌DGGE條帶數(shù)。DGGE條帶圖案相似性系統(tǒng)樹由Quantity One軟件根據(jù)戴斯系數(shù)按照Neighbor Joining計(jì)算繪出，戴斯系數(shù)的范圍從0(沒有共同條帶)到1(所有條帶相同)。用戴斯系數(shù)計(jì)算出的各泳道樣品相似性矩陣，用它可以對DGGE圖譜中各泳道樣品間的相似性進(jìn)行比較。鄰接法分析(Neighbor Joining)表明(圖4)，三種酒糟堆肥提取液樣品的細(xì)菌分為兩大族群，DEC為一個族群，AFEC和NAFEC為另一個族群，且AFEC和NAFEC族群的相似度達(dá)到0.51。

6.5不同提取工藝酒糟堆肥提取液細(xì)菌群落功能多樣性分析

表3表示不同提取工藝酒糟堆肥提取液細(xì)菌DGGE群落結(jié)構(gòu)多樣性分析結(jié)果。從表中可以看出，AFEC和NAFEC細(xì)菌豐度指數(shù)分別比DEC減少了15.0％和45.0％，而NAFEC細(xì)菌豐度指數(shù)比AFEC減少了35.3％。三種酒糟堆肥提取液細(xì)菌多樣性指數(shù)的變化趨勢同細(xì)菌豐度指數(shù)的變化趨勢，DEC細(xì)菌多樣性指數(shù)分別比AFEC和NAFEC增加了7.9％和19.0％，而AFEC細(xì)菌多樣性指數(shù)比NAFEC增加了13.7％。然而，三種酒糟堆肥提取液細(xì)菌均度指數(shù)則沒有顯著差異。對于不同提取工藝酒糟堆肥提取液細(xì)菌穩(wěn)定性指數(shù)，DEC和AFEC細(xì)菌穩(wěn)定性指數(shù)比NAFEC分別增加了51.0％和54.2％，而DEC細(xì)菌穩(wěn)定性指數(shù)與AFEC細(xì)菌穩(wěn)定性指數(shù)相當(dāng)。

表3不同提取工藝酒糟堆肥提取液細(xì)菌DGGE群落結(jié)構(gòu)多樣性分析

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。