專利名稱：用基因工程方法生產(chǎn)紅細(xì)胞刺激因子/粒細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程，特別是涉及一種用基因工程方法生產(chǎn)紅細(xì)胞刺激因子/粒細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白(EPO/G-CSF)。
紅細(xì)胞刺激因子和粒細(xì)胞集落刺激因子為兩類重要的血細(xì)胞因子。在人類的造血系統(tǒng)中，每一位成年男性平均每年在體內(nèi)生成大約4.5×1011個粒細(xì)胞和紅細(xì)胞，約相當(dāng)于人的總體重(Dexteret al,Bioessay 2,154-158(1985))。血細(xì)胞生長因子是一組蛋白，產(chǎn)生于體內(nèi)，并具有特異性刺激血細(xì)胞生長分化的功能。正常情況下，血液系統(tǒng)細(xì)胞的生長分化是靠造血生長因子(Hemotopoietic Growth Factor)調(diào)節(jié)的，它們包括多功能性集落因子(Multipotent-CSF)，白細(xì)胞介素3(IL-3)，粒巨噬細(xì)胞集落因子(GM-CSF)，粒細(xì)胞集落因子(G-CSF)，紅細(xì)胞生長因子(EPO)，血小板生成素(TPO)，干細(xì)胞因子(SCF)等。這些因子協(xié)調(diào)或單獨(dú)地調(diào)節(jié)造血前階段細(xì)胞的增殖分化活動。
粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)是選擇性和特異性地刺激中性粒細(xì)胞的增殖和分化，其作用機(jī)理是作用于細(xì)胞表面的特異性受體，通過結(jié)合后引起一系列信號傳遞，促使細(xì)胞生長和發(fā)育。在臨床上，用于提高病人的中性粒細(xì)胞數(shù)目及病人抵抗感染的能力。
紅細(xì)胞刺激因子(EPO)能促使幼稚紅細(xì)胞生長分化。對晚期BFU-E(Burst Forming Units-Erythrocytes)及CFU-E(C010ny Forming Units-Erythrocyte)有促進(jìn)分化作用，并使其合成血紅蛋白變成成熟紅細(xì)胞。EPO能促進(jìn)網(wǎng)質(zhì)紅細(xì)胞的提前釋放，并能刺激骨髓巨核細(xì)胞。
對愛滋病和腫瘤化療患者，藥物和化療常常會對患者的造血系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重影響。因在臨床上已有EPO和G-CSF合用，使之增加患者自身的免疫功能和紅細(xì)胞計數(shù)，加快病人的恢復(fù)的例子，同時因為世界范圍內(nèi)的供血緊張，且會有病毒污染血源的可能，如愛滋，肝炎等，所以正如文獻(xiàn)Strauss et al,J.Clin.Apheresis,1995,10:145 Vamavakas et al,J.Clin.Apheresis,1997,12:945 Strauss etal,B100d,1993,81:1675中指出的生產(chǎn)復(fù)合性的血細(xì)胞生成因子具有非常重要的臨床意義。
世界上已有幾種構(gòu)建復(fù)合性血液刺激因子的例子，如IL3/EPO,EPO/IL3,IL3/G-CSF(WO92/06116，專利申請)。實驗證明，IL3/EPO和FPO/IL3具有刺激BFU-E和CFu-E的作用。復(fù)合因子的構(gòu)建和產(chǎn)生是根據(jù)其自身的功能，同時又具有雙重的協(xié)同作用；最新一例證明是有協(xié)同作用的生產(chǎn)紅細(xì)胞刺激因子/粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(EPO/GM-CSF)如文獻(xiàn)Antonio Metal,US Patent 5916773。
本發(fā)明的目的在于為了克服已有的紅細(xì)胞刺激因子或粒細(xì)胞集落刺激因子作用單一的缺點(diǎn)，為了尋找一種與單體EPO與C-CSF相比具有較高的生物活性的、同時具有刺激紅細(xì)胞和粒細(xì)胞的雙重作用，EPO與G-CSF連成一體，既有協(xié)同作用，又不產(chǎn)生抗體的，在臨床上具有實用價值的刺激血細(xì)胞生長功能的復(fù)合性的血細(xì)胞生成因子(一種融合蛋白)，從而提供一種用基因工程方法生產(chǎn)紅細(xì)胞刺激因子/粒細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明提供的用基因工程方法生產(chǎn)紅細(xì)胞刺激因子/粒細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白(以下簡稱EPO/G-CSF融合蛋白)，該EPO/G-CSF融合蛋白，具有其EPO的生物活性為1×105U/mg，和其G-CSF的生物活性為1×107U/mg；具有如下結(jié)構(gòu)紅細(xì)胞生長因子-連接片段-粒細(xì)胞集落刺激因子EPO————LINKER————G-CSF所述的融合蛋白具有圖8的EPO/G-CSF融合蛋白示意圖(一級結(jié)構(gòu))。所述的融合蛋白包括EPO/G-CSF結(jié)構(gòu)(1)通過連接片段把紅細(xì)胞生長因子尾與粒細(xì)胞集落刺激因子的頭連接，即C端——N端連接；還包括G-CSF/EPO結(jié)構(gòu)(2)通過連接片段把粒細(xì)胞集落刺激因子的尾與紅細(xì)胞生長因子的頭連接，即C端——N端連接；所述的EPO/G-CSF融合蛋白是在其兩蛋白中間有一小段連接片段，該連接片段是連接肽，連接肽順序的一級結(jié)構(gòu)用以連接EPO和G-CSF蛋白順序，連接肽具有如圖3的序列，連接肽是10-20個有相同的或不相同的氨基酸連接順序，具有這些連接順序的氨基酸都可以是連接肽，圖3所示的一種序列是最佳的例子。
所述的融合蛋白具有EPO和G-CSF蛋白自然順序，并具有雙重活性，其EPO的生物活性為1×105U/mg，其G-CSF的生物活性為1×107U/mg。
EPO/G-CSF的質(zhì)粒構(gòu)建，其待征在于構(gòu)建中使用設(shè)計合成的引物寡聚脫氧核苷酸P1,P2,P3,P4,P5,P6,P7,P8,它們的核苷酸序列是P1: 5’TGGGGGTGCACGAATGTCCTGC 3’P2: 5, TCATCTGTCCCCTGTCCTGCAGG 3’P3: 5’ATGGCTGGACCTGCCACCCAGAGCC 3’P4: 5, TCAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAGA 3’P5: 5’AAGCTAGGATCCATGGGGGTGCACGAATGTCCTGC 3’P6: 5’AGCTAGAATCCA CCCGCGGATCCA CCTCCTGATCCACCGCTGGACCTG CCACCCAGAGCC 3’
P7: 5’AGCTAGAATCCGGATCCGCGGGTGGTGGATCTGGCGGACACCCCCCTGGGCCCTGCCA 3’P8: 5’AGCTAAAGCTTT CAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAGA 3’本發(fā)明提供的用基因工程方法生產(chǎn)紅細(xì)胞刺激因子/粒細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白，按以下步驟進(jìn)行(1)為了獲得FPO/G-CSF融合基因質(zhì)粒，首先從細(xì)胞中抽取信使核糖核酸(mRNA)，然后利用逆轉(zhuǎn)錄酶-DNA聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法制備單鏈和雙鏈互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)；(2)經(jīng)過分離純化，將FPO的cDAN及G-CSF的cDNA分別克隆到載體上，以此為基礎(chǔ)進(jìn)行融合蛋白的構(gòu)建(見

圖1和2)；(3)利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)我們對二者進(jìn)行了亞克隆和末端改造，以及增加了一小段連接體(見圖3和4)，通過限制性內(nèi)切酶，我們構(gòu)建成了能夠表達(dá)EPO/G-CSF融合蛋白的質(zhì)粒，并將其質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入細(xì)胞株CHO或COS細(xì)胞。轉(zhuǎn)化后的CHO細(xì)胞能生產(chǎn)分泌EPO/G-CSF融合蛋白。
該方法詳細(xì)描述如下材料與方法一．細(xì)胞株包括CHO細(xì)胞株，COS細(xì)胞株。
菌株包括菌株DH5α，菌株HB101等質(zhì)粒包括pTA連接質(zhì)粒(3.9Kb,Ampr),pBR322。
真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒包括pBS1(4.6Kb,DHFRr),pMCM(5.6Kb,Ampr)。
二．酶類DNA聚合酶(Clonetech)；限制性內(nèi)切酶(Promega,Biolab)；T4 DNA連接酶(Life Technologies)；mRNA純化Kit(Invitrogen)；cDNA合成Kit(Strategen)。
主要生化試劑和材料FPO標(biāo)準(zhǔn)品(Amgen)；dNTP(Perkin Elmer)；瓊脂糖(BRL)；氨卞青霉素(Sigma)；蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(Bio-Rad)；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(Life Technologies)；EPO ELISAKit(R&D)。
三．質(zhì)粒的制備1．質(zhì)粒篩選將含有目的質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)物培養(yǎng)到對數(shù)晚期(OD600約0.6)，將含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)液(預(yù)溫到37℃)放入燒瓶內(nèi)，加入對數(shù)晚期培養(yǎng)物，于37℃劇烈振搖培養(yǎng)25小時，所得培養(yǎng)物的OD600值約0.4，于4℃以4000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，棄上清；將細(xì)菌沉淀重懸于用冰預(yù)冷的STE溶液中(STE溶液0.1mol/L NaCl,10mmol/L Tris·Cl,pH8.0,1mmol/L EDTA,pH8.0)，離心收集細(xì)菌細(xì)胞。將收集細(xì)菌的細(xì)胞重懸于用冰預(yù)冷的溶液中含10％蔗糖，50mmol/LTris·Cl,pH8.0溶液中，加溶菌酶溶液，混勻，在冰上放10分鐘，再加10％SDS，混勻，立刻加5mol/LNaCl(終濃度為1mol/L)混勻，在冰上放1小時，離心，將上清用酚氯仿和氯仿各提一次，將水相于室溫加入2倍體積乙醇混勻，于室溫放1-2小時，離心，回收質(zhì)粒。
2．DNA片段的放大用PCR方法將EPOcDNA(以及其它DNA片段)放大，放置在PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增94℃,45秒，55℃,45秒，72℃,1-2分鐘，循環(huán)35次后，72℃,7-10分鐘。(詳見實施例)。
3．DNA片段的連接用相同限制性內(nèi)切酶切質(zhì)粒和EPOcDNA(以及其它DNA片段)，37℃,30-60分鐘，經(jīng)瓊脂糖電泳純化后，用T4 DNA連接酶連接，形成重組質(zhì)粒的構(gòu)造。(詳見實施例)。
4．限制性內(nèi)切酶分析用限制性內(nèi)切酶切重組質(zhì)粒，經(jīng)瓊脂糖電泳純化后，得到EPOcDNA(以及其它DNA片段)，由此證明連接的正確性。
5．DNA 序列分析用Sanger雙脫氧鏈終止法，將dNTP,DNA模板，Klenow，等量加在4個管中，55℃,30分鐘，分別加入ddA,ddG,ddT,ddC，保存于室溫15-20分鐘，按常規(guī)方法處理，用聚丙烯酰胺凝膠電泳測序。
6．SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)電泳等采用常規(guī)方法，均參照文獻(xiàn)(Sambrook Jet al,ALaboratory Methods-Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,2nd Edition,1989；Current Protocol of Molecular Biology,John Wiley & Sons)。
五．細(xì)胞培養(yǎng)從液氮中取出冷凍細(xì)胞，置37℃水浴中迅速融化，將細(xì)胞懸液移入離心管內(nèi)，加入培養(yǎng)基，離心10分鐘，用含10％小牛血清(Life Technologies)的α-MEM(α-Dullbecco’sModified Fagle Medium,Life Technologies)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，然后移入培養(yǎng)瓶內(nèi)，接種3×104cells/cm2，將細(xì)胞置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃,5％CO2，至活細(xì)胞比例＞85％(48-72小時)。
六．樣品蛋白含量測定1．染色液的配制100mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50ml 95％乙醇中，然后與100ml 85％(W/V)磷酸混合，用水稀釋至1000ml；2．測定方法若蛋白量為＞0.2mg/ml，取0.1ml樣品與5ml染色液均勻混合，靜置10-30分鐘后測定A600nm；若蛋白量為5-100mg/ml，取0.8ml樣品與0.2ml染色液均勻混合后進(jìn)行測定；以BSA測得曲線為標(biāo)準(zhǔn)曲線。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明為一種利用基因工程方法生產(chǎn)紅細(xì)胞生長因子(EPO)/粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)融合蛋白(EPO/G-CSF)。通過對紅細(xì)胞生長因子和粒細(xì)胞集落刺激因子的亞克隆和末端改造以及用聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)的方法，把兩個基因通過一小斷多肽連接起來，使之形成表達(dá)質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化進(jìn)入哺乳動物細(xì)胞并得到了高效表達(dá)，融合蛋白具有紅細(xì)胞生長因子和粒細(xì)胞集落刺激因子的雙重活性。經(jīng)過生物活性鑒定，與相同劑量的EPO和G-CSF單體相比，融合蛋白具有較高的生物活性；同時本發(fā)明也提出了連接肽順序，此順序致關(guān)重要，既能將EPO/G-CSF連成一體且有生物活性，同時又不產(chǎn)生抗體。融合蛋白具有EPO和G-CSF蛋白自然順序，并具有雙重活性，其EPO的生物活性為1×105U/mg，其G-CSF的生物活性為1×107U/mg。本發(fā)明在用于相關(guān)患者的血細(xì)胞生長發(fā)育中具有臨床應(yīng)用的實際價值。
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明圖1是EPO cDNA的合成及重組質(zhì)粒的構(gòu)建。
圖2是G-CSF cDNA的合成及重組質(zhì)粒的構(gòu)建。
圖3是中間連接片段的結(jié)構(gòu)一種圖例。
圖4A是通過PCR方法修飾和構(gòu)建的FPO和圖4B是通過PCR方法修飾和構(gòu)建的G-CSF質(zhì)粒，兩個cDNA序列的兩端都得到了修飾，既末端改造。
圖5是構(gòu)建pTrm-EPO-LINKER-G-CSF質(zhì)粒的流程圖。
圖6是重新改造構(gòu)建的pTrm-EPO-LINKER-G-CSF質(zhì)粒。
圖7是pmNAD EPO-LINKER-G-csF質(zhì)粒的構(gòu)建流程圖。
圖8是本發(fā)明的EPO/G-CSF融合蛋白的示意圖(一級結(jié)構(gòu))。
圖9是蛋白純化圖1．標(biāo)準(zhǔn)樣品；2．EPO；3.0。CSF；4．融合蛋白。
表1是EPO/G-CSF融合蛋白生物化學(xué)特征測定。
表2是EPO/G-CSF融合蛋白動物實驗數(shù)據(jù)。
實施例1．引物寡聚脫氧核苷酸的設(shè)計與制備P1: 5’TGGGGGTGCACGAATGTCCTGC 3’P1是從EPO基因起始因子開始，包括信號肽鏈。
P2: 5’TCATCTGTCCCCTGTCCTGCAGG 3，P2是互補(bǔ)于3，末端的寡聚脫氧核苷酸，與P1一起，通過PCR，放大并克隆全長(蛋白編碼)EPOcDNA。
P3: 5’ATGGCTGGACCTOCCACCCAGAGCC 3，P3是從起始因子開始的G-CSF寡聚脫氧核苷酸。
P4: 5’TCAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAGA 3，P4是互補(bǔ)于3，末端的引物，它與P3一起放大并克隆全長(蛋白編碼)的G-CSF cDNA。
P5: 5,AAGCTAGGATCCATGGGGGTGCACGAATGTCCTGC 3,P5的后部分與EPO的起始密碼之后的脫氧核苷酸序列一致。在起始密碼之前，我們加7一個BamHⅠ位點(diǎn)。
P6:5,AGCTAGAATCCA CCC6CGGATCCA CCTCCTGATCCACCGCTGGACCTG CCACCCAGAGCC 3’P6是與EPO cDNA終止密碼之前的序列互補(bǔ)(不包括終止密碼)，并額外加了一段連接肽的核苷酸序列，其中含有一個SacⅡ。在SacⅡ位點(diǎn)之后又加了一個EcoRⅠ位點(diǎn)。
P7: 5,AGCTAGAATCCGGATCCGCGGGTGGTGGATCTGGCGGACACCCCCCTGGGCCCTGCCA 3,P7是與G-CSF成熟蛋白的5’脫氧核苷酸的起始序列一致(在信號下游不包括信號肽)，在上游加了一段連接肽的脫氧核苷酸序列，其中包括了SacⅡ位點(diǎn)，同時在SacⅡ位點(diǎn)前插入了一個EcoRⅠ位點(diǎn)。
P8: 5,AGCTAAAGCTTT CAGGGCTGGGCAAGGTGGCOTAGA 3,P8與G-CSF cDNA的末端互補(bǔ)(包括終止密碼)，并帶有一個HindⅢ位點(diǎn)。
實施例2．人EPO、G-CSF和EPO／G-CSF融合基因全長核苷酸序列的測定為了獲得EPO、G、CSF基因以及EPO/G-CSF融合基因，我們對每一cDNA及改造后序列進(jìn)行了亞克隆和末端改造，并利用常規(guī)方法對每一段cDNA及改造后的融合基因進(jìn)行了核苷酸序列測定詳見實施例1和圖1-7)。
實施例3．EPO和G-CSF cDNA的制備用1μg mRNA為起始物，將mRNA溶入20μl去離子的水中，加熱65℃,10-20分鐘，置于冰浴中備用；然后加入cDNA合成緩沖混合液和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，其中含有1μM mRNA,50mM Tris.HCl(pH8.3),40mM KCl,6mM MgCl2,4mM DTT,0.5mM dNTP,0.1mM poly(dT)12-18,0.1mg/ml BSA。在37℃反應(yīng)一小時。從上面的反應(yīng)液中，取5μl，放入DNA聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的試管中，依次加入100pmol P1和P2的上下游引物，克隆放大EPO基因(見實施例1),5μl PCR緩沖液(10X)，2.5mmol／L的dNTp和5單位的DNA聚合酶(Taq DNA Polymerase)，最終體積為50μl；放置PCR僅中進(jìn)行擴(kuò)增94℃,45秒，55℃,45秒，72℃,1-2分鐘，循環(huán)35次后，72℃,7-10分鐘；反應(yīng)完成后立刻取出，放置冰浴中待用。P3和P4克隆放大G。CSF基因，除P引物外，G-CSF的克隆和放大過程與EPO一樣。
實施例4．EPO和G-CSF重組質(zhì)粒的構(gòu)建按照圖1和圖2,PCR反應(yīng)后，分別從兩個裝有EPO基因和G-CSF基因試管中，各取5μl反應(yīng)液，加入另一試管中，其中含有pTa載體以及T4 DNA連接酶，形成EPO和G-CSF的基本構(gòu)造，成為以后基因改造的基礎(chǔ)。對所有質(zhì)粒均進(jìn)行了限制性內(nèi)切酶的分析以保證序列的正確性。
實施例5．FPO/G-CSF表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建
按照圖3-6流程，經(jīng)過改建和亞克隆后形成EPO/G-CSF重組質(zhì)粒。經(jīng)過對其最后表達(dá)質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶分析和序列測定后，證明其結(jié)構(gòu)與所設(shè)計的結(jié)構(gòu)一致。
實施例6．EPO/G-CSF融合基因在真核細(xì)胞中的高效表達(dá)用于表達(dá)EPO/G-CSF蛋白的真核細(xì)胞株為CHOdhfr-(CHO,DUKXBl)(Urlaub G,et al,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.77:1216)。利用Lipofectin(Life Technologies)將EPO/G-CSF融合基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)化克隆生長于氨甲蝶吟(Methotrexate,Sigma)中；逐漸增加氨甲蝶吟濃度以選擇出高效表達(dá)細(xì)胞株。本實施例用免疫雜交試劑盒EPO ELISA KIT(R&D)和G-CSF ELISA KIT(R&D)對其融合蛋白的活性進(jìn)行了測定。
實施例7．EPO/G-CSF融合蛋白的分離純化收集無血清細(xì)胞培養(yǎng)液(CHO-S-SFMII,Life Technologies)將其濃縮，然后在(20mMTris.HCl,pH6.0,50mM NaCl,1mM EDTA,1mM DTT)溶液中進(jìn)行透析，溫度40℃，透析時間24小時；將透析后的溶液上樣于已平衡后的DEAE-Sepharose柱(5×20cm)用20mMTris.HCl,pH 6.0,50mM NaCl的緩沖液平衡5-10倍柱體積)。用梯度洗脫方法(洗脫液為0.05-1MNaCl)洗脫融合蛋白。分管收集各洗脫峰，經(jīng)活性測定后，收集有活性部份，將其濃縮后，用高壓氣相色譜(HPLC)分離純化，得到純化的融合蛋白。
實施例8．EPO/G-CSF融合蛋白生物化學(xué)特征的測定為了鑒別EPO/G-CSF融合蛋白的生化特征，本實施例做了免疫雜交實驗，其結(jié)果為蛋白分子量在預(yù)定范圍之內(nèi)。生物活性測定方法用Broxmeyeretal(Exp.hemat015,87(1971))和Luetal(Blood 61,250(1983))的方法，測定CFU-GM(C010ny FormingUnits。Granulocyte Macrophage)以及BFU-E的集落數(shù)目；對CFU-GM和BFU-E的集落數(shù)目進(jìn)行比較和分析，EPO/G-CSF融合蛋白具有雙重活性以及協(xié)同作用(見表1)表1中所列四組實驗結(jié)果為一組5只小鼠。
表1CFU-GM(Colonles) BFU-E(Colonies)Medium 0±0 0±0對照組G-CSF 75±5.4 3±1EPO(1U) 0±0 26±1EPO/G-CSF 85±5 83±7
其測定方法為利用低密度粘著于培養(yǎng)皿的骨髓細(xì)胞，對所有集落進(jìn)行測定。低密度細(xì)胞在IMDM(Iscov’s Modifled Dulbecco’s Media)培養(yǎng)液中(含有小牛血清)，37℃，生長1-2小時，按Ficoll-Hypague方法分離(Pharmacia)。
對CFU-GM的測定在1ml瓊脂培的培養(yǎng)皿中(含有McCoy’s培養(yǎng)液和10％加熱處理后的小牛血清)，放置1×105細(xì)胞，培養(yǎng)七天后，檢測其集落數(shù)目和形態(tài)，通過系列稀釋后與標(biāo)準(zhǔn)品對照。
對BFU-E的測定在1ml IMDM培養(yǎng)液中(含有0.8％甲基纖維素，methylcellulose,20％小牛血清，0.05mM巰基乙醇，β-Mercaptoethanol,1U EPO或者EPO/G-CSF融合蛋白)，放置1×105細(xì)胞，培養(yǎng)十四天后，檢測其集落數(shù)目和形態(tài)，通過系列稀釋后與標(biāo)準(zhǔn)品對照。以上為五組獨(dú)立實驗結(jié)果的平均值。從結(jié)果看G-CSF能夠協(xié)同紅細(xì)胞增殖及分化。純化后的EPO/G-CSF，測得其EPO的活性為1×105U/mg,G-CSF的活性為1×107U/mg。
實施例9．動物實驗將24只小老鼠分成4組，每組6只。A組為對照組，皮下注射生理鹽水；B組注射單體EPO(300U/每公斤體重)；C組注射單體G-CSF(5μg/每公斤體重)；D組為實驗組，注射本發(fā)明的融合蛋白(5μg/每公斤體重)。每天注射一次，連續(xù)七天后，檢測血沉和中性細(xì)胞數(shù)量。其結(jié)果如下(表2)表2實驗組 紅細(xì)胞壓積 中性拉細(xì)肥數(shù)目A無變化 無變化B增加1.5％ 無大變化C無大變化 增加4-6倍D增加1％增加約4倍
權(quán)利要求
1．一種用基因工程方法生產(chǎn)紅細(xì)胞刺激因子/粒細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白，其特征在于該EPO/G-CSF融合蛋白具有EPO和G-CSF蛋白自然順序，并具有雙重活性，其EPO的生物活性為1×105U/mg，和其G-CSF的生物活性為1×107U/mg；其結(jié)構(gòu)為通過一連接片段把紅細(xì)胞生長因子與粒細(xì)胞集落刺激因子連接起來，結(jié)構(gòu)如下紅細(xì)胞生長因子-連接片段-粒細(xì)胞集落刺激因子EPO————LINKER————G-CSF或 G-CSF————LINKER————EPO和具有EPO/G-CSF融合蛋白一級結(jié)構(gòu)如下APPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALRAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDRGGSGGGSAAGGSGGTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLVSECATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP
2．按權(quán)利要求1所述的一種用基因工程方法生產(chǎn)紅細(xì)胞刺激因子/粒細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白，其特征在于所述的EPO/G-CSF融合蛋白結(jié)構(gòu)是通過連接片段把紅細(xì)胞生長因子尾與粒細(xì)胞集落刺激因子的頭連接，即C端——N端連接。
3．按權(quán)利要求1所述的一種用基因工程方法生產(chǎn)紅細(xì)胞刺激因子/粒細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白，其特征在于所述的G-CSF/EPO融合蛋白結(jié)構(gòu)是通過連接片段把粒細(xì)胞集落刺激因子的尾與紅細(xì)胞生長因子頭連接，即C端——N端連接。
4．按權(quán)利要求1所述的一種用基因工程方法生產(chǎn)紅細(xì)胞刺激因子/粒細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白，其特征在于所述的EPO/G-CSF融合蛋白的連接片段是連接肽，連接肽順序的一級結(jié)構(gòu)用其連接EPO和G-CSF蛋白順序，連接肽是具有10-20個有相同的或不相同的氨基酸連接順序。
5．按權(quán)利要求4所述的一種用基因工程方法生產(chǎn)紅細(xì)胞刺激因子/粒細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白，其特征在于所述的連接肽具有如下的序列5’-GGT GGA TCA GGA GGT GGA TCC GCG GGT GGT GGA TCT GGC GGA-3’Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Ala Gly Gly Ser Gly Gly
6．按權(quán)利要求1-6中的任意一項權(quán)利要求所述的一種用基因工程方法生產(chǎn)紅細(xì)胞刺激因子/粒細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白，其特征在于所述的E EPO/G-CSF的質(zhì)粒構(gòu)建中使用設(shè)計合成的引物寡聚脫氧核苷酸P1,P2,P3,P4,P5,P6,P7,P8，它們的核苷酸序列是P1: 5’TGGGGGTGCACGAATGTCCTGC 3’P2: 5, TCATCTGTCCCCTGTCCTGCAGG 3’P3: 5’ATGGCTGGACCTGCCACCCAGAGCC 3’P4: 5, TCAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAGA 3’P5: 5’AAGCTAGGATCCATGGGGGTGCACGAATGTCCTGC 3’P6: 5’AGCTAGAATCCA CCCGCGGATCCA CCTCCTGATCCACCGCTGGACCTG CCACCCAGAGCC 3’P7: 5’AGCTAGAATCCGGATCCGCGGGTGGTGGATCTGGCGGACACCCCCCTGGGCCCTGCCA 3’P8: 5’AGCTAAAGCTTT CAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAGA 3’
7．一種制備權(quán)利要求1所述的紅細(xì)胞刺激因子/粒細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白的方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行(1)為了獲得EPO/G-CSF融合基因質(zhì)粒，首先從細(xì)胞中抽取信使核糖核酸mRNA，然后利用逆轉(zhuǎn)錄酶-DNA聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法制備單鏈和雙鏈互補(bǔ)脫氧核糖核酸cDNA；(2)經(jīng)過分離純化，將EPO的cDAN及G-CSF的cDNA分別克隆到載體上，以此為基礎(chǔ)進(jìn)行融合蛋白的構(gòu)建；(3)利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)對二者進(jìn)行了亞克隆和末端改造，以及增加了一小段連接體，通過限制性內(nèi)切酶，構(gòu)建成了能夠表達(dá)EPO/G-CSF融合蛋白的質(zhì)粒，并將其質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入CHO或COS細(xì)胞。轉(zhuǎn)化后的CHO細(xì)胞能生產(chǎn)分泌EPO/G-CSF融合蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及用基因工程方法生產(chǎn)紅細(xì)胞生長因子/粒細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白。通過對紅細(xì)胞生長因子和粒細(xì)胞集落刺激因子的亞克隆和末端改造以及用聚合酶鏈反應(yīng)方法,把兩個基因通過一段多肽連接起來,使之形成表達(dá)質(zhì)粒,將其轉(zhuǎn)化進(jìn)入哺乳動物細(xì)胞并得到了高效表達(dá)。該融合蛋白具有紅細(xì)胞生長因子和粒細(xì)胞集落刺激因子的雙重活性,與相同劑量的EPO和G－CSF單體相比,融合蛋白具有較高的生物活性。本發(fā)明EPO的生物活性為1×10
文檔編號C07K19/00GK1311332SQ0110426
公開日2001年9月5日 申請日期2001年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月27日
發(fā)明者李洪興 申請人:李欣越