專利名稱：聚乙二醇化重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)基因工程藥物的方法，具體涉及聚こニ醇化重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(PEG-rhG-CSF或PEG-G-CSF)的純化方法，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)是造血因子之一，由175個(gè)氨基酸組成，是ー種水溶性的蛋白，具有疏水性。它的主要作用是刺激中性粒細(xì)胞系造血細(xì)胞的増殖、分化，増加外周血中性粒細(xì)胞數(shù)量，活化中性粒細(xì)胞功能，在預(yù)防和治療多因素引起的中性粒細(xì)胞減少癥及其并發(fā)癥(如發(fā)熱、感染等)方面療效顯著。1991年，Amgen(安姆根)公司的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)被FDA批準(zhǔn)上市用于化療引起的中性粒細(xì)胞減少癥的治療。但作為ー種生物大分子藥物，rhG-CSF像大多數(shù)生物制品一祥，在臨床應(yīng)用中存在體內(nèi)半衰期短，易被酶水解和腎臟清除等問題。在化療過程中，需要長(zhǎng)達(dá)兩周的持續(xù)每日靜脈或 皮下注射，造成病人依從性較差。聚こニ醇(PEG)修飾是實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)藥物長(zhǎng)效的ー種應(yīng)用較為廣泛的方法，PEG修飾的蛋白質(zhì)和多肽類藥物半衰期明顯延長(zhǎng)，溶解度和穩(wěn)定性得到改善，免疫原性降低，生物利用度增強(qiáng)，毒副作用減少。PEG修飾的rhG-CSF實(shí)現(xiàn)了長(zhǎng)效增加外周血中性粒細(xì)胞數(shù)的目的，2002年，F(xiàn)DA又批準(zhǔn)了 Amgen公司的聚こニ醇化粒細(xì)胞集落刺激因子(PEG-G-CSF)上市，商品名Neulasta。PEG-G-CSF是由單甲氧基聚こニ醇丁醛與大腸桿菌表達(dá)純化的蛋氨酰化的粒細(xì)胞集落刺激因子N-末端賴氨酸氨基共價(jià)連接而成，與G-CSF相比其在體內(nèi)的半衰期明顯延長(zhǎng)，因而可以減少治療時(shí)的注射次數(shù)，減少病人的痛苦。在PEG-G-CSF的純化過程中，需要去除PEG與G-CSF交聯(lián)反應(yīng)液中的交聯(lián)劑、ニ交聯(lián)的G-CSF及未交聯(lián)的G-CSF等。由于交聯(lián)產(chǎn)生的多種不同交聯(lián)蛋白異構(gòu)體，除了分子量有所區(qū)別外，其他性質(zhì)如表面電荷、疏水性等差別較小，因此，分離純化交聯(lián)蛋白產(chǎn)物，成為聚こニ醇化技術(shù)的難點(diǎn)之一。安姆根公司在專利CN1071760C中公開了 N-末端PEG化rh-G-CSF的純化方法,將交聯(lián)反應(yīng)混合物上樣于陽離子交換層析柱Sepharose FF柱，以醋酸鈉緩沖液平衡后進(jìn)行線性洗脫，收集洗脫液；將洗脫液再進(jìn)行分子篩層析的方法來純化。雖然，分子篩層析能夠去除分離各種交聯(lián)異構(gòu)體，但是由于分子篩很難在エ業(yè)中實(shí)現(xiàn)放大，因此國內(nèi)大多數(shù)的純化方法是根據(jù)表面電荷的差異，采用離子交換層析進(jìn)行分離純化，例如CN1663962A公開了 PEG-G-CSF的一步純化方法，采用陽離子交換層析柱SP SepharoseF.F.裝柱后用こ酸-こ酸鈉緩沖液平衡，再用不同pH值的こ酸-こ酸鈉緩沖液洗脫。此純化工藝雖然可以實(shí)現(xiàn)エ業(yè)上的放大，但由于采用的是作用比較單ー的陽離子交換介質(zhì)進(jìn)行吸附-解析來進(jìn)行分離，其內(nèi)毒素很難控制，導(dǎo)致終產(chǎn)品中內(nèi)毒素含量不容易控制，影響了產(chǎn)品的質(zhì)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種聚こニ醇化重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的純化方法，本發(fā)明的發(fā)明人對(duì)各種層析方法進(jìn)行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)利用脫鹽層析、離子交換串聯(lián)層析和脫鹽層析順序組合純化，能夠獲得高純度的聚こニ醇化重組人粒細(xì)胞集落刺激因子。本發(fā)明純化工藝充分利用了目的蛋白在表面電荷和疏水性上的特點(diǎn)，先通過ー個(gè)陰離子交換層析柱，有效的去除了內(nèi)毒素，増加了エ藝的可控性；第二步層析充分利用目的蛋白的強(qiáng)疏水性，實(shí)現(xiàn)了串聯(lián)層析，將內(nèi)毒素的去除和蛋白的純化兩個(gè)步驟合并為ー個(gè)步驟。本エ藝不僅可以有效去除內(nèi)毒素，并且簡(jiǎn)化了操作步驟，節(jié)省了生產(chǎn)時(shí)間，提高了生產(chǎn)效率，十分適合大規(guī)模エ業(yè)化放大生產(chǎn)。實(shí)施本發(fā)明的前期步驟為現(xiàn)有技術(shù)可以采用CN1071760C中公開的方法來獲得聚こニ醇化重組人粒細(xì)胞集落刺激因子交聯(lián)液，將該交聯(lián)液作為后續(xù)處理的對(duì)象。該方法主要步驟在于將經(jīng)過脫鹽后的聚こニ醇化重組人粒細(xì)胞集落刺激因子交聯(lián)液順次通過陰離子交換層析柱與多結(jié)合型離子交換層析柱串聯(lián)層析系統(tǒng)，利用內(nèi)毒素與陰離子交換層析柱的高度吸附作用達(dá)到去除內(nèi)毒素的目的；之后采用添加了氯化鈉的緩沖液単獨(dú)對(duì)多結(jié)合型離子交換層析柱進(jìn)行洗脫，收集洗脫后的目的蛋白液；更進(jìn)一歩的，本發(fā)明的具體處理步驟如下(I)聚こニ醇化重組人粒細(xì)胞集落刺激因子交聯(lián)液經(jīng)過葡聚糖凝膠G-25 (Sephadex G-25)脫鹽，得脫鹽液；(2)脫鹽液順次通過陰離子交換層析柱與多結(jié)合型離子交換層析柱串聯(lián)層析系統(tǒng)，使內(nèi)毒素結(jié)合到陰離子交換層析柱上，至上樣完畢；(3)采用添加了氯化鈉的緩沖液単獨(dú)對(duì)多結(jié)合型離子交換層析柱進(jìn)行洗脫，收集洗脫后的目的蛋白液；(4)洗脫后的目的蛋白液經(jīng)過葡聚糖凝膠G-25 (Sephadex G-25)脫鹽柱脫鹽去除Na+、Cl-,得到高純度的蛋白樣品。上述過程中，步驟(I)和(2)中的葡聚糖凝膠G-25脫鹽層析柱和陰離子交換層析柱與多結(jié)合型離子交換層析柱串聯(lián)層析洗脫在上樣前均采用PH6. 0-8. 5，濃度為IOmmol/L lOOmmol/L的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行平衡；其中優(yōu)選采用pH7. 0-8. O、濃度為20mmol/L 50mmol/L的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行平衡；步驟(2)中采用的陰離子交換層析柱的層析介質(zhì)包括瓊脂糖凝膠(S印harose)類、聚苯こ烯(SOURCE)類，配基為季氨基Q或ニこ基氨こ基DEAE ;優(yōu)選層析介質(zhì)為瓊脂糖凝膠類，配基為季氨基Q或ニこ基氨こ基DEAE ;最優(yōu)選的層析介質(zhì)為瓊脂糖凝膠類，配基為李氨基 Q (Sepharose Q Fast Flow)；步驟(2)中的多結(jié)合型離子交換層析柱的層析介質(zhì)為高流速瓊脂糖凝膠類、聚苯こ烯類或硅顆粒類，配基為帶部分疏水基團(tuán)的離子交換配基；其中優(yōu)選配基為N-苯甲基-N-甲基こ醇胺、帶疏水基團(tuán)的季氨基和帶疏水基團(tuán)的磺酸基；最優(yōu)選優(yōu)選層析介質(zhì)為高流速瓊脂糖類，配基為N-苯甲基-N-甲基こ醇胺(Captro adhere)；這種多結(jié)合型離子交換層析介質(zhì)相較于単一性質(zhì)的分離層析介質(zhì)，同時(shí)具有離子 交換功能基團(tuán)和疏水作用功能基團(tuán)，可以通過兩種作用方式，將蛋白吸附在層析介質(zhì)上，從而實(shí)現(xiàn)通過多種性質(zhì)進(jìn)行目的蛋白的純化、分離。而步驟(2)中所述的脫鹽液可以連續(xù)通過陰離子交換層析柱和多結(jié)合型離子交換層析柱串聯(lián)層析系統(tǒng)；同樣的步驟(2)中所述的脫鹽液也可以首先通過陰離子交換層析柱之后收集，再集中通過多結(jié)合型離子交換層析柱。步驟(3)中所述的添加氯化鈉的緩沖液為Tris-HCl或醋酸鈉緩沖液，緩沖液pH為4. O 7. O,緩沖液濃度為10mmol/L 100mmol/L ;優(yōu)選緩沖液濃度為20mmol/L 50mmol/L,而其中所添加氯化鈉的緩沖液中氯化鈉的濃度為100mmol/L I. Omol/L ;優(yōu)選氯化鈉的濃度為100mmol/L 600mmol/L?？刂坡然c的濃度可以使得緩沖液的離子強(qiáng)度發(fā)生變化，從而使吸附在陽離子交換層析柱上的目標(biāo)蛋白解吸，達(dá)到了分離的目的。
所述步驟(4)中的葡聚糖凝膠G-25脫鹽層析柱在上樣前，需采用pH4. O的20mM的醋酸鈉緩沖液進(jìn)行平衡。采用這種技術(shù)后，通過采用合適的緩沖體系和層析介質(zhì)，將兩步層析進(jìn)行了串聯(lián)，簡(jiǎn)化了層析步驟，節(jié)省了層析時(shí)間和エ藝成本，并提高了エ藝的處理量。PEG-G-CSF的等電點(diǎn)為5. O 5. 3左右，如果通過陰離子交換層析采用流穿的方式進(jìn)行內(nèi)毒素的去除，傳統(tǒng)エ藝需要將緩沖液的PH值調(diào)整為5. O以下，但是那樣會(huì)使去除內(nèi)毒素的效果大大減弱。通過選擇合適的磷酸鹽緩沖液和pH值，將目的蛋白在高pH的條件下，仍能穿過陰離子交換層析，確保了去內(nèi)毒素效果，減輕了后續(xù)純化步驟的負(fù)荷，提高了エ藝穩(wěn)定性；PEG-G-CSF的疏水性較強(qiáng)，采用帶疏水基團(tuán)的多結(jié)合型離子交換層析介質(zhì)，在低離子強(qiáng)度條件下將目的蛋白吸附在多結(jié)合型離子交換層析介質(zhì)上，并將內(nèi)毒素去除和蛋白純化兩步層析實(shí)現(xiàn)了串聯(lián)。同時(shí)，通過內(nèi)毒素去除和蛋白純化的蛋白液，可以再經(jīng)過最后一歩的脫鹽層析改變串聯(lián)層析后所得蛋白液的緩沖體系，之所以這樣設(shè)計(jì)，主要是由于純化步驟采用了添加了氯化鈉的緩沖液，所得的蛋白液也含有這種緩沖液，為了去除其中的氯化鈉，需再經(jīng)過脫鹽層祈，可以用適合于制劑生產(chǎn)的緩沖液洗脫，這樣就使緩沖體系改變了，所得目的蛋白液可以不再經(jīng)過其他處理，純度高達(dá)99%以上，可以直接用于制劑生產(chǎn)。綜上所述，本發(fā)明采用的純化工藝充分利用了目的蛋白在表面電荷和疏水性上的特點(diǎn)，先通過ー個(gè)陰離子交換層析柱，有效的去除了內(nèi)毒素，増加了エ藝的可控性；第二步層析充分利用目的蛋白的強(qiáng)疏水性，實(shí)現(xiàn)了串聯(lián)層析，將內(nèi)毒素的去除和蛋白的純化兩個(gè)步驟合并為ー個(gè)步驟。本エ藝不僅可以有效去除內(nèi)毒素，并且簡(jiǎn)化了操作步驟，エ藝設(shè)計(jì)合理，エ藝過程簡(jiǎn)單，易于控制，便于操作，重復(fù)性好；目的蛋白損失少，蛋白收率和質(zhì)量有明顯提高；一次性處理蛋白量大，エ藝穩(wěn)定性強(qiáng)，適合于大規(guī)模エ業(yè)生產(chǎn)。


圖I為Captro adhere離子交換層析圖譜；圖2為Captro adhere離子交換層析電泳圖譜；圖中 I 為ニ交聯(lián) mPEG-G-CSF，2 為 mPEG-G-CSF，3 為 G-CSF。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例將進(jìn)ー步說明本發(fā)明，這些實(shí)例不應(yīng)作為本發(fā)明的限制。聚こニ醇化重組人粒細(xì)胞集落刺激因子交聯(lián)液可由現(xiàn)有技術(shù)直接獲得，如CN1071760C中公開的方法。
實(shí)施例II、采用ρΗ8· 5的IOOmM磷酸鹽緩沖液平衡葡聚糖凝膠G_25 (Sephadex G-25)脫鹽層析柱，將PEG-G-CSF交聯(lián)液上樣完畢，收集脫鹽液。2、先將陰離子交換層析柱和多結(jié)合型離子交換層析柱進(jìn)行串聯(lián)，陰離子交換層析柱的層析介質(zhì)為瓊脂糖凝膠(sepharose Q Fast Flow),多結(jié)合型離子交換層析柱的層析介質(zhì)為高流速瓊脂糖凝膠(Captro adhere)。3、用pH8. 5的IOOmM磷酸鹽緩沖液平衡對(duì)串聯(lián)層析柱進(jìn)行平衡，將收集的脫鹽液上樣，完畢后，再用PH8. 5的IOOmM磷酸鹽緩沖液沖洗至基線。然后將陰離子交換層析柱與多結(jié)合型離子交換層析柱分開，用pH7. O的IOOmM Tris-HCl緩沖液平衡Captro adhere離子交換層析柱，然后用含O. I I. Omol/L氯化鈉的pH7. O的IOOmM Tris-HCl緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集目的蛋白液，用醋酸將其PH調(diào)整至4. 5左右。
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4、用ρΗ4· O的20mM的醋酸鈉緩沖液平衡葡聚糖凝膠G-25 (Sephadex G-25)脫鹽柱，將目的蛋白液上樣，用平衡緩沖液繼續(xù)洗脫，收集蛋白峰得到高純度蛋白樣品。5、在百級(jí)層流罩下進(jìn)行除菌過濾，即為PEG-G-CSF原液，取樣進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)純度平均可達(dá)97%以上，串聯(lián)柱收率可達(dá)68%以上。實(shí)施例2I、采用ρΗ6· O的IOmM磷酸鹽緩沖液平衡葡聚糖凝膠G-25 (Sephadex G-25)脫鹽層析柱，將PEG-G-CSF交聯(lián)液上樣完畢，收集脫鹽液。2、先將陰離子交換層析柱和多結(jié)合型離子交換層析柱進(jìn)行串聯(lián)，陰離子交換層析柱的層析介質(zhì)為瓊脂糖凝膠(sepharose Q Fast Flow),多結(jié)合型離子交換層析柱的層析介質(zhì)為高流速瓊脂糖凝膠(Captro MMC)。3、用pH6. O的IOmM磷酸鹽緩沖液平衡對(duì)串聯(lián)層析柱進(jìn)行平衡，將收集的脫鹽液上樣，完畢后，再用PH6. O的IOmM磷酸鹽緩沖液沖洗至基線。然后將陰離子交換層析柱與多結(jié)合型離子交換層析柱分開，用pH4. O的IOOmM醋酸鈉緩沖液平衡Captro MMC離子交換層析柱，然后用含0. lmol/L I. 0mol/L氯化鈉的pH4. O的20mM醋酸鈉緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集目的蛋白液。4、用ρΗ4· O的20mM的醋酸鈉緩沖液平衡葡聚糖凝膠G-25 (Sephadex G-25)脫鹽柱，將目的蛋白液上樣，用平衡緩沖液繼續(xù)洗脫，收集蛋白峰得到高純度蛋白樣品。5、在百級(jí)層流罩下進(jìn)行除菌過濾，即為PEG-G-CSF原液，取樣進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)純度平均可達(dá)97%以上，串聯(lián)柱收率可達(dá)70%以上。實(shí)施例3I、采用ρΗ8· O的20mM磷酸鹽緩沖液平衡葡聚糖凝膠G_25 (Sephadex G-25)脫鹽層析柱，將PEG-G-CSF交聯(lián)液上樣完畢，收集脫鹽液。2、先將陰離子交換層析柱和多結(jié)合型離子交換層析柱進(jìn)行串聯(lián)，陰離子交換層析柱的層析介質(zhì)為瓊脂糖凝膠(sepharose DEAE Fast Flow),多結(jié)合型離子交換層析柱的層析介質(zhì)為高流速瓊脂糖凝膠(Captro adhere)。3、用pH8. O的20mM磷酸鹽緩沖液平衡對(duì)串聯(lián)層析柱進(jìn)行平衡，將收集的脫鹽液上樣，完畢后，再用PH8. O的20mM磷酸鹽緩沖液沖洗至基線。然后將陰離子交換層析柱與多結(jié)合型離子交換層析柱分開，用pH6. O的20mM Tris-HCl緩沖液平衡Captro adhere離子交換層析柱，然后用含100mmol/L 600mmol/L氯化鈉的pH7. O的20mM Tris-HCl緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集目的蛋白液，用醋酸將其PH調(diào)整至4. 5左右。4、用ρΗ4· O的20mM的醋酸鈉緩沖液平衡葡聚糖凝膠G-25 (Sephadex G-25)脫鹽柱，將目的蛋白液上樣，用平衡緩沖液繼續(xù)洗脫，收集蛋白峰得到高純度蛋白樣品。5、在百級(jí)層流罩下進(jìn)行除菌過濾，即為PEG-G-CSF原液，取樣進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)純度平均可達(dá)99%以上，串聯(lián)柱收率可達(dá)75%以上。實(shí)施例4I、采用ρΗ7· O的20mM磷酸鹽緩沖液平衡葡聚糖凝膠G-25 (Sephadex G-25)脫鹽層析柱，將PEG-G-CSF交聯(lián)液上樣完畢，收集脫鹽液。 2、先將陰離子交換層析柱和多結(jié)合型離子交換層析柱進(jìn)行串聯(lián)，陰離子交換層析柱的層析介質(zhì)為瓊脂糖凝膠(sepharose DEAE Fast Flow),多結(jié)合型離子交換層析柱的層析介質(zhì)為高流速瓊脂糖凝膠(Captro MMC)。3、用pH7. O的20mM磷酸鹽緩沖液平衡對(duì)串聯(lián)層析柱進(jìn)行平衡，將收集的脫鹽液上樣，完畢后，再用PH7. O的20mM磷酸鹽緩沖液沖洗至基線。然后將陰離子交換層析柱與多結(jié)合型離子交換層析柱分開，用pH5. O的20mM醋酸鈉緩沖液平衡Captro MMC離子交換層析柱，然后用含100mmol/L 600mmol/L氯化鈉的pH5. O的20mM醋酸鈉緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集目的蛋白液。4、用ρΗ4· O的20mM的醋酸鈉緩沖液平衡葡聚糖凝膠G-25 (Sephadex G-25)脫鹽柱，將目的蛋白液上樣，用平衡緩沖液繼續(xù)洗脫，收集蛋白峰得到高純度蛋白樣品。5、在百級(jí)層流罩下進(jìn)行除菌過濾，即為PEG-G-CSF原液，取樣進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)純度平均可達(dá)99%以上，串聯(lián)柱收率可達(dá)75%以上。實(shí)施例5I、采用ρΗ7· 5的30mM磷酸鹽緩沖液平衡葡聚糖凝膠G-25 (Sephadex G-25)脫鹽層析柱，將PEG-G-CSF交聯(lián)液上樣完畢，收集脫鹽液。2.先將陰離子交換層析柱和多結(jié)合型離子交換層析柱進(jìn)行串聯(lián)，陰離子交換層析柱的層析介質(zhì)為瓊脂糖凝膠(sepharose Q Fast Flow),多結(jié)合型離子交換層析柱的層析介質(zhì)為高流速瓊脂糖凝膠(Captro adhere)。3、用pH7. 5的30mM磷酸鹽緩沖液平衡對(duì)串聯(lián)層析柱進(jìn)行平衡，將收集的脫鹽液上樣，完畢后，再用PH7. 5的30mM磷酸鹽緩沖液沖洗至基線。然后將陰離子交換層析柱與多結(jié)合型離子交換層析柱分開，用pH6. O的20mM Tris-HCl緩沖液平衡Captro adhere離子交換層析柱，然后用含100mmol/L 600mmol/L氯化鈉的pH6. O的20mM Tris-HCl緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集目的蛋白液，用醋酸將其PH調(diào)整至4. 5左右。4、用ρΗ4· O的20mM的醋酸鈉緩沖液平衡葡聚糖凝膠G-25 (Sephadex G-25)脫鹽柱，將目的蛋白液上樣，用平衡緩沖液繼續(xù)洗脫，收集蛋白峰得到高純度蛋白樣品。5、在百級(jí)層流罩下進(jìn)行除菌過濾，即為PEG-G-CSF原液，取樣進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)純度平均可達(dá)99%以上，串聯(lián)柱收率可達(dá)80%以上。實(shí)施例6I、采用ρΗ6· 5的50mM磷酸鹽緩沖液平衡葡聚糖凝膠G_25 (Sephadex G-25)脫鹽層析柱，將PEG-G-CSF交聯(lián)液上樣完畢，收集脫鹽液。
2、先將陰離子交換層析柱和多結(jié)合型離子交換層析柱進(jìn)行串聯(lián)，陰離子交換層析柱的層析介質(zhì)為瓊脂糖凝膠(sepharose Q Fast Flow),多結(jié)合型離子交換層析柱的層析介質(zhì)為高流速瓊脂糖凝膠(Captro MMC)。3、用pH6. 5的50mM磷酸鹽緩沖液平衡對(duì)串聯(lián)層析柱進(jìn)行平衡，將收集的脫鹽液上樣，完畢后，再用PH6. 5的50mM磷酸鹽緩沖液沖洗至基線。然后將陰離子交換層析柱與多結(jié)合型離子交換層析柱分開，用pH5. O的30mM醋酸鈉緩沖液平衡Captro MMC離子交換層析柱，然后用含100mmol/L 600mmol/L氯化鈉的pH5. O的30mM醋酸鈉緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集目的蛋白液。4、用ρΗ4· O的20mM的醋酸鈉緩沖液平衡葡聚糖凝膠G-25 (Sephadex G-25)脫鹽柱，將目的蛋白液上樣，用平衡緩沖液繼續(xù)洗脫，收集蛋白峰得到高純度蛋白樣品。5、在百級(jí)層流罩下進(jìn)行除菌過濾，即為PEG-G-CSF原液，取樣進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)純度平均可達(dá)99%以上，串聯(lián)柱收率可達(dá)80%以上。
實(shí)施例7I、采用ρΗ8· O的20mM磷酸鹽緩沖液平衡葡聚糖凝膠G_25 (Sephadex G-25)脫鹽層析柱，將PEG-G-CSF交聯(lián)液上樣完畢，收集脫鹽液。2、先將陰離子交換層析柱和多結(jié)合型離子交換層析柱進(jìn)行串聯(lián)，陰離子交換層析柱的層析介質(zhì)為瓊脂糖凝膠(sepharose DEAE Fast Flow),多結(jié)合型離子交換層析柱的層析介質(zhì)為高流速瓊脂糖凝膠(QMA Spherosil LS)。3、用pH8. O的20mM磷酸鹽緩沖液平衡對(duì)串聯(lián)層析柱進(jìn)行平衡，將收集的脫鹽液上樣，完畢后，再用PH8. O的20mM磷酸鹽緩沖液沖洗至基線。然后將陰離子交換層析柱與多結(jié)合型離子交換層析柱分開，用PH6. O的20mM Tris-HCl緩沖液平衡QMA Spherosil LS離子交換層析柱，然后用含100mmol/L 600mmol/L氯化鈉的pH7. O的20mM Tris-HCl緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集目的蛋白液，用醋酸將其PH調(diào)整至4. 5左右。4、用ρΗ4· O的20mM的醋酸鈉緩沖液平衡葡聚糖凝膠G-25 (Sephadex G-25)脫鹽柱，將目的蛋白液上樣，用平衡緩沖液繼續(xù)洗脫，收集蛋白峰得到高純度蛋白樣品。5、在百級(jí)層流罩下進(jìn)行除菌過濾，即為PEG-G-CSF原液，取樣進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)純度平均可達(dá)99%以上，串聯(lián)柱收率可達(dá)75%以上。實(shí)施例8I、采用ρΗ8· O的20mM磷酸鹽緩沖液平衡葡聚糖凝膠G-25 (Sephadex G-25)脫鹽層析柱，將PEG-G-CSF交聯(lián)液上樣完畢，收集脫鹽液。2、先將陰離子交換層析柱和多結(jié)合型離子交換層析柱進(jìn)行串聯(lián)，陰離子交換層析柱的層析介質(zhì)為瓊脂糖凝膠(sepharose Q Fast Flow),多結(jié)合型離子交換層析柱的層析介質(zhì)為高流速瓊脂糖凝膠(QMA Spherosil LS)。3、用pH8. O的20mM磷酸鹽緩沖液平衡對(duì)串聯(lián)層析柱進(jìn)行平衡，將收集的脫鹽液上樣，完畢后，再用PH8. O的20mM磷酸鹽緩沖液沖洗至基線。然后將陰離子交換層析柱與多結(jié)合型離子交換層析柱分開，用PH6. O的20mM Tris-HCl緩沖液平衡QMA Spherosil LS離子交換層析柱，然后用含100mmol/L 600mmol/L氯化鈉的pH7. O的20mM Tris-HCl緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集目的蛋白液，用醋酸將其PH調(diào)整至4. 5左右。4、用ρΗ4· O的20mM的醋酸鈉緩沖液平衡葡聚糖凝膠G_25 (Sephadex G-25)脫鹽柱，將目的蛋白液上樣，用平衡緩沖液繼續(xù)洗脫，收集蛋白峰得到高純度蛋白樣品。5、在百級(jí)層流罩下進(jìn)行除菌過濾，即為PEG-G-CSF原液，取樣進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)純度平均可達(dá)99%以上，串聯(lián)柱收率可達(dá)75%以上。試驗(yàn)例I聚こニ醇化重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的藥效學(xué)研究PEG-G-CSF主要通過PEG的末端醛基與G-CSF的氨基酸殘基反應(yīng)而成的，與G-CSF相比，分子量的増加 ，降低了 PEG-G-CSF在腎小球的濾過率，提高了藥物的穩(wěn)定性。因?yàn)镻EG-G-CSF在清除過程中存在著自我調(diào)節(jié)過程，在中性粒細(xì)胞水平恢復(fù)以前，血清中PEG-G-CSF的水平要高于同等劑量G-CSF的血清水平，從而使半衰期得以延長(zhǎng)，由原來的
3.5小時(shí)延長(zhǎng)到33小吋。藥效學(xué)研究可知，PEG-G-CSF可減少化療期間IV度中性粒細(xì)胞減少的發(fā)生率，升高中性粒細(xì)胞最低值，60、100或200 μ g/kg每個(gè)化療周期給藥I次能較好地預(yù)防中性粒細(xì)胞減少癥。G-CSF的半衰期較短，需要?dú)叭兆⑸?，每個(gè)化療周期至少連續(xù)注射2周；而PEG-G-CSF每療程只需注射I次，且在安全性和療效方面與每日注射G-CSF相仿。這樣以來PEG-G-CSF相對(duì)于G-CSF就具有低給藥頻率和提高病人順應(yīng)性的優(yōu)勢(shì)。比較例I采用實(shí)施例5所述的方法對(duì)聚こニ醇化重組人粒細(xì)胞集落刺激因子進(jìn)行純化，同時(shí)采用現(xiàn)有技術(shù)CN1663962A公開的純化方法進(jìn)行對(duì)比，對(duì)比結(jié)果如下表現(xiàn)有技術(shù)與本發(fā)明技術(shù)參數(shù)對(duì)比
技術(shù)參規(guī)模原液收率原液純度生產(chǎn)周
_____§_
現(xiàn)有技批次量5g40-53% 含有少量聚體，95. 7% 38小時(shí)
_____
本發(fā)明批次量IOg57-68%98. 2%34小時(shí)可見，采用本發(fā)明所述的純化方法，簡(jiǎn)化了操作步驟，縮短處理所需的時(shí)間，エ藝設(shè)計(jì)合理，エ藝過程簡(jiǎn)單，易于控制，便于操作，重復(fù)性好；目的蛋白損失少，蛋白收率和質(zhì)量有明顯提高；一次性處理蛋白量大，エ藝穩(wěn)定性強(qiáng)，適合于大規(guī)模エ業(yè)生產(chǎn)。
權(quán)利要求
1.一種聚乙二醇化重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的純化方法，其特征在于將經(jīng)過脫鹽后的聚乙二醇化重組人粒細(xì)胞集落刺激因子交聯(lián)液順次通過陰離子交換層析柱與多結(jié)合型離子交換層析柱串聯(lián)層析系統(tǒng)，使內(nèi)毒素結(jié)合到陰離子交換層析柱上； 之后采用添加了氯化鈉的緩沖液?jiǎn)为?dú)對(duì)多結(jié)合型離子交換層析柱進(jìn)行洗脫，收集洗脫后的目的蛋白液； 其中所述的步驟(2)中采用的陰離子交換層析柱的層析介質(zhì)為瓊脂糖凝膠類或聚苯乙烯類，配基為季氨基Q或二乙基氨乙基DEAE ； 所述的多結(jié)合型離子交換層析柱的層析介質(zhì)為高流速瓊脂糖凝膠類或聚苯乙烯類或硅顆粒類，其配基為帶部分疏水基團(tuán)的離子交換配基； 所述的添加了氯化鈉的緩沖液為Tris-HCl或醋酸鈉緩沖液，緩沖液pH為4. O 7. O，緩沖液濃度為10mmol/L 100mmol/L ;其中氯化鈉濃度為O. lmol/L I. Omol/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的聚乙二醇化重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的純化方法，其特征在于具體步驟如下 (1)聚乙二醇化重組人粒細(xì)胞集落刺激因子交聯(lián)液經(jīng)過葡聚糖凝膠G-25(SephadexG-25)脫鹽，得脫鹽液； (2)脫鹽液順次通過陰離子交換層析柱與多結(jié)合型離子交換層析柱串聯(lián)層析系統(tǒng)，使內(nèi)毒素結(jié)合到陰離子交換層析柱上，至上樣完畢； (3)采用添加了氯化鈉的緩沖液?jiǎn)为?dú)對(duì)多結(jié)合型離子交換層析柱進(jìn)行洗脫，收集洗脫后的目的蛋白液； (4)洗脫后的目的蛋白液經(jīng)過葡聚糖凝膠G-25(S印hadexG-25)脫鹽柱脫鹽去除Na+、Cl-，得到高純度的蛋白樣品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的聚乙二醇化重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的純化方法，其特征在于所述步驟(I)中的葡聚糖凝膠G-25脫鹽層析柱和步驟(2)中的陰離子交換層析柱與多結(jié)合型離子交換層析柱串聯(lián)層析洗脫在上樣前，均采用PH6. 0-8. 5、濃度為lOmmol/L IOOmmoI/L的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行平衡。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的聚乙二醇化重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的純化方法，其特征在于所述步驟(4)中的葡聚糖凝膠G-25脫鹽層析柱在上樣前需采用pH4. O的20mM的醋酸鈉緩沖液進(jìn)行平衡。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的聚乙二醇化重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的純化方法，其特征在于所述的添加了氯化鈉的緩沖液為Tris-HCl或醋酸鈉緩沖液，緩沖液濃度為20mmol/L SOmmoI /I,;其中氣化納濃度為 O. lmol/L O. Bmmol /I,η
6.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的聚乙二醇化重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的純化方法，其特征在于所述步驟(2)中的陰離子交換層析柱的層析介質(zhì)層析介質(zhì)為瓊脂糖類，配基為季氨基Q或二乙基氨乙基DEAE ； 多結(jié)合型離子交換層析柱的層析介質(zhì)為高流速瓊脂糖類，配基為N-苯甲基-N-甲基乙醇胺。
全文摘要
本發(fā)明提供一種聚乙二醇化重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的純化方法，本發(fā)明的發(fā)明人對(duì)各種層析方法進(jìn)行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)利用脫鹽層析、離子交換串聯(lián)層析和脫鹽層析順序組合純化，能夠獲得高純度的聚乙二醇化重組人粒細(xì)胞集落刺激因子。本發(fā)明純化工藝充分利用了目的蛋白在表面電荷和疏水性上的特點(diǎn)，先通過一個(gè)陰離子交換層析柱，有效的去除了內(nèi)毒素，增加了工藝的可控性；第二步層析充分利用目的蛋白的強(qiáng)疏水性，實(shí)現(xiàn)了串聯(lián)層析，將內(nèi)毒素的去除和蛋白的純化兩個(gè)步驟合并為一個(gè)步驟。本工藝不僅可以有效去除內(nèi)毒素，并且簡(jiǎn)化了操作步驟，節(jié)省了生產(chǎn)時(shí)間，提高了生產(chǎn)效率，十分適合大規(guī)模工業(yè)化放大生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07K1/18GK102850450SQ201110184390
公開日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2011年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月1日
發(fā)明者王晶翼, 孫麗霞, 王克波, 艾現(xiàn)偉, 董婷, 王希菊, 張樂, 王樂 申請(qǐng)人:齊魯制藥有限公司