專利名稱：一種重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子的純化方法。屬于蛋 白質(zhì)純化領(lǐng) 域，是簡(jiǎn)單高效地制備高純度，高收率的藥用rhGM-CSF原液的方法。
背景技術(shù)：
粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)來源于激活的T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維 細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，GM-CSF促使造血細(xì)胞的增殖和成熟；也能增強(qiáng)抗體依賴的細(xì)胞毒活性、 細(xì)胞表面受體抗原表達(dá)，并刺激細(xì)胞因子分泌；特別是能增強(qiáng)腫瘤殺傷細(xì)胞因子如腫瘤壞 死因子(TNF) a和IL-10的釋放，而TNFa和IL-1 0有很強(qiáng)的抗病毒活性。目前重組人 GM-CSF臨床用于治療因放化療引起的白細(xì)胞減少癥，以及用于免疫佐劑。目前報(bào)道的關(guān)于GM-CSF的專利主要針對(duì)以下幾點(diǎn)(1)通過特別的菌體破碎步驟 富集GM-CSF 如美國專利4912200 ； (2)采用親和層析方法純化，如美國專利5391706 ； (3) 采用分泌型表達(dá)宿主菌，如中國專利(申請(qǐng)?zhí)?3137202. 3)，采用畢赤酵母分泌表達(dá)系統(tǒng)， 目標(biāo)蛋白不需要復(fù)性，生物學(xué)比活性可達(dá)到3.4X107IU/mg;中國專利(申請(qǐng)?zhí)?8106057) 報(bào)道了分泌型表達(dá)的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，目的蛋白表達(dá)量占胞周質(zhì)蛋白的40% ；中國專利 (申請(qǐng)?zhí)?00810114685. 7)報(bào)道也使用畢赤酵母作為表達(dá)系統(tǒng)。以上這些報(bào)道，大多是強(qiáng)調(diào)目的蛋白的表達(dá)量和生物學(xué)活性，但是對(duì)于如何獲得 純度高，相關(guān)雜質(zhì)少的純蛋白，卻基本沒有提及。美國專利5391706報(bào)道給出了純化方案， 但這個(gè)純化方案包括了 QAE，親和層析，硫銨沉淀，凝膠過濾，反相色譜層析等多個(gè)步驟，這 一純化方案顯然不符合環(huán)保，經(jīng)濟(jì)等要求。尤其是反相色譜法純化蛋白質(zhì)，需要使用大量的 有機(jī)溶劑，不僅價(jià)格昂貴，而且有殘余溶劑的問題，蛋白質(zhì)也容易變性失活。純化產(chǎn)生的有 機(jī)溶劑，增加廢水污染處理的難度，而且?guī)頋撛诘沫h(huán)境污染風(fēng)險(xiǎn)。本專利要解決的恰恰是如何在不使用任何有機(jī)溶劑的情況下，獲得高純度的 GM-CSF純品，滿足國外藥典中對(duì)于本品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供了一種重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因 子的純化方法，本發(fā)明具有工藝簡(jiǎn)便快速，步驟少，收率高，純度高的特點(diǎn)，在兼顧環(huán)保的同 時(shí)，提高藥品的安全性、可控性和有效性，適合大規(guī)模生產(chǎn)。為達(dá)到上述的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子的純化方法，采用的大腸桿菌表達(dá)重組人 粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子rhGM-CSF為包涵體形式，包括下述純化步驟包涵體超濾復(fù)性 -Capto S陽離子柱層析一Superdex 75凝膠過濾層析一得到藥用重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞 刺激因子rhGM-CSF原液。所述超濾復(fù)性包括如下步驟①取發(fā)酵包涵體溶于包涵體溶解液；②將包涵體溶 解液加入復(fù)性液中混勻，泵入超濾系統(tǒng)儲(chǔ)罐中開始超濾，TMP不大于50psig，要求洗濾液與透過液速度相同，稀釋復(fù)性35 60分鐘；③稀釋完畢濃縮收樣，按6ml/L加5M醋酸鹽調(diào) pH5. 0士0. 05，10000rpm、10°C離心 30min，收集上清。所述的包涵體溶解液配方為鹽酸胍6M ；pH8. 5士0. 05的Tris_HC150mM ； Nacl40mMo所述的復(fù)性液配方為鹽酸胍4M ；pH8. 5士0. 05Tris-HC150mM ；Nacl20mM。所述的Capto S陽離子柱層析步驟中，采用經(jīng)超濾復(fù)性后的樣品，進(jìn)行選擇性洗脫 目標(biāo)蛋白，洗脫條件為50mM醋酸鹽和pH為6. 75 士 0. 05的0. 2M NaCl。所述的Superdex 75凝膠過濾層析步驟中，洗脫液采用20mM磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明的有益效果是(1)采用超濾復(fù)性，以包涵體干重計(jì)算，復(fù)性率可達(dá)到55%以上。(2)工藝簡(jiǎn)單，步驟少嚴(yán)格控制復(fù)性中采用的還原和氧化條件，使復(fù)性后樣品的 純度達(dá)到80%以上；樣品經(jīng)過第1步柱層析(Capto S柱)后，電泳純度和HPLC反相純度 已經(jīng)達(dá)到98%以上，殘余菌體蛋白和殘余細(xì)菌內(nèi)毒素含量均達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)要求，也就是說 1步柱層析將樣品純化至超過《中國藥典》現(xiàn)行版的藥用要求；樣品只經(jīng)過2步純化，即可得 到符合國際標(biāo)準(zhǔn)的原液。(3)原液質(zhì)量反相色譜純度(EP)達(dá)到98%以上，排阻色譜純度達(dá)到99%以上， 殘余工程菌蛋白含量低于0. 005%，低于國家標(biāo)準(zhǔn)的10分之1，細(xì)菌內(nèi)毒素每毫克低于 0. 25EU，僅相當(dāng)于國家標(biāo)準(zhǔn)的120分之1。(4)提高藥品的安全性、可控性和有效性，適合大規(guī)模生產(chǎn)，工藝單批規(guī)?？蛇_(dá)到 50g以上。本發(fā)明的另一個(gè)明顯優(yōu)勢(shì)是完全避免了強(qiáng)有機(jī)溶劑在生產(chǎn)工藝中的使用。乙腈 和甲醇是一種常見的純化用試劑，以達(dá)到蛋白質(zhì)精細(xì)純化，獲得高純度的目的。當(dāng)在規(guī)?；?生產(chǎn)中使用反相色譜方法進(jìn)行蛋白的純化時(shí)，乙腈和甲醇等有機(jī)溶劑的用量很大，它們都 屬于有毒性的溶劑，大量使用有機(jī)溶劑帶來一系列的問題不僅價(jià)格昂貴，生產(chǎn)成本過高； 樣品中的殘余溶劑可能帶來安全性隱患；廢水的處理會(huì)產(chǎn)生大量的環(huán)保處理費(fèi)用；如排放 到環(huán)境中，將對(duì)環(huán)境帶來污染。本工藝在不降低任何收率和純度指標(biāo)的情況下，避免使用有 機(jī)溶劑，優(yōu)點(diǎn)突出。


圖1是本發(fā)明rhGM-CSF原液SDS-PAGE (還原型SDS-PAGE)銀染法電泳圖譜；
圖2是本發(fā)明rhGM-CSF原液SDS-PAGE (非還原型SDS-PAGE)銀染法電泳圖譜；圖3是本發(fā)明rhGM-CSF原液HPLC-RPC圖譜；圖4是本發(fā)明rhGM-CSF原液HPLC-SEC圖譜；圖5是本發(fā)明rhGM-CSF原液SDS-PAGE (非還原型SDS-PAGE)考染法電泳圖譜；圖6是本發(fā)明rhGM-CSF原液SDS-PAGE (還原型SDS-PAGE)考染法電泳圖譜。
具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。本實(shí)施例的一種重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子的純化方法，采用的大腸桿菌表達(dá)重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子rhGM-CSF為包涵體形式，首先進(jìn)行包涵體超濾 復(fù)性①取發(fā)酵包涵體(750g士 10%)溶于包涵體溶解液(鹽酸胍6M ；pH8. 5士0.05的 Tris-HC150mM ；Nacl40mM)中，加還原劑后充氮避光2小時(shí)備用。用0. 5NNa0H溶液清洗 MaxCell UFP-3_C_65超濾系統(tǒng)30min，清洗后用注射水沖洗至中性。②稀釋復(fù)性將包涵 體溶解液加入復(fù)性液(鹽酸胍4M ；pH8. 5士0. 05Tris-HC150mM ；Nacl20mM)中混勻，泵入 超濾系統(tǒng)儲(chǔ)罐中開始超濾，TMP不大于50psig，要求洗濾液與透過液速度相同，(洗濾液 為pH8. 5士0. 05Tris-HCl 50mM ；恒體積透析一邊超濾流出超濾透出液，一邊往復(fù)性罐中 流加等體積的洗濾液，目的是緩慢地降低復(fù)性液中鹽酸胍、DTT還原劑等的濃度)稀釋復(fù) 性35 60分鐘。③收樣稀釋完畢濃縮收樣，按6ml/L加5M醋酸鹽調(diào)pH 5.0士0.05。 10000rpm、10°C離心30min，收集上清，本步驟得到的樣品液電泳純度已達(dá)到80%以上。反 相色譜純度達(dá)到80%以上。復(fù)性液收率蛋白總量(掃描計(jì))已不低于包涵體重量的8%， 以包涵體干重計(jì)算，復(fù)性率不低于55%。其次進(jìn)行CaptoS陽離子柱層析(GM I柱層析)①小100GM I柱層析用0. 5NNa0H 按200士 10% cm/h流速清洗30min，用注射用水按相同流速洗至中性，后用50mM醋酸鹽緩 沖液(pH5. 0 士 0. 05)，按300 士 10% cm/h流速平衡I柱約10倍柱體積。②將超濾復(fù)性后的樣品按300士 10% cm/h流速上樣，上樣完畢，用50mM醋酸鹽 +0. 2M NaCl (PH6. 75士0.05)液按相同流速洗脫，收集目標(biāo)峰，本步驟得到的I柱后樣品，電 泳及液相色譜純度均達(dá)到98%以上。最后進(jìn)行Superdex 75凝膠過濾層析(GMII柱層析)① 200GMII柱層析用 0. 5NNa0H按20 士 10% cm/h流速清洗30min，用20mM磷酸鹽緩沖液按20 士 10% cm/h流速 平衡II柱4倍柱體積。以相同流速上經(jīng)I柱處理后的樣品。②上樣完畢，用20mM磷酸鹽緩沖液按相同流速洗脫，收集目標(biāo)峰，取樣并送檢， rhGM-CSF原液SDS-PAGE (還原型SDS-PAGE)銀染法和SDS-PAGE (非還原型SDS-PAGE)銀染 法電泳純度均符合歐洲藥典的要求，如圖1、2所示。反相色譜純度(EP)法達(dá)到98. 92%， 如圖3所示。排阻色譜純度達(dá)到99. 98%，如圖4所示。SDS-PAGE (還原型SDS-PAGE)考染 法和SDS-PAGE (非還原型SDS-PAGE)考染法電泳純度均達(dá)到99%以上，高于中國藥典的標(biāo) 準(zhǔn)，如圖5，6所示。本步驟后得到的得到藥用重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子rhGM-CSF原液，排阻 色譜純度達(dá)到99%以上，反相色譜純度(EP)法達(dá)到98%以上，殘余工程菌蛋白含量低于 0. 005%，低于國家標(biāo)準(zhǔn)的10分之1，細(xì)菌內(nèi)毒素每毫克低于0. 25EU，僅相當(dāng)于國家標(biāo)準(zhǔn)的 120分之1。
權(quán)利要求
一種重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子的純化方法，采用的大腸桿菌表達(dá)重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子rhGM-CSF為包涵體形式，其特征在于包括下述純化步驟包涵體超濾復(fù)性→Capto S陽離子柱層析→Superdex 75凝膠過濾層析→得到藥用重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子rhGM-CSF原液。
2.如權(quán)利要求1所述的一種重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子的純化方法，其特征在 于所述超濾復(fù)性包括如下步驟①取發(fā)酵包涵體溶于包涵體溶解液；②將包涵體溶解液 加入復(fù)性液中混勻，泵入超濾系統(tǒng)儲(chǔ)罐中開始超濾，TMP不大于50psig，要求洗濾液與透 過液速度相同，稀釋復(fù)性35 60分鐘；③稀釋完畢濃縮收樣，按6ml/L加5M醋酸鹽調(diào) pH5. 0士0. 05，10000rpm、10°C離心 30min，收集上清。
3.如權(quán)利要求2所述的一種重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子的純化方法，其特征在于 所述的包涵體溶解液配方為鹽酸胍6M ；pH8. 5士0. 05的Tris_HCl 50mM ；Nacl 40mM。
4.如權(quán)利要求2所述的一種重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子的純化方法，其特征在于 所述的復(fù)性液配方為鹽酸胍4M;pH8. 5士0. 05Tris-HCl 50mM ；Nacl 20mM。
5.如權(quán)利要求1所述的一種重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子的純化方法，其特征在 于所述的Capto S陽離子柱層析步驟中，采用經(jīng)超濾復(fù)性后的樣品，進(jìn)行選擇性洗脫目標(biāo) 蛋白，洗脫條件為50mM醋酸鹽和pH為6. 75 士 0. 05的0. 2M NaCl。
6.如權(quán)利要求1所述的一種重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子的純化方法，其特征在 于所述的Superdex 75凝膠過濾層析步驟中，洗脫液采用20mM磷酸鹽緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子的純化方法，采用的大腸桿菌表達(dá)重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子rhGM-CSF為包涵體形式，包括下述純化步驟包涵體超濾復(fù)性→Capto S陽離子柱層析→Superdex 75凝膠過濾層析→得到藥用重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子rhGM-CSF原液。本發(fā)明具有工藝簡(jiǎn)便快速，步驟少，收率高，純度高的特點(diǎn)，在兼顧環(huán)保的同時(shí)，提高藥品的安全性、可控性和有效性，適合大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07K1/16GK101830976SQ20101017069
公開日2010年9月15日 申請(qǐng)日期2010年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月7日
發(fā)明者何艷, 余東新, 孫黎, 楊美花, 林崧, 蔡慧麗, 裴廣強(qiáng) 申請(qǐng)人:廈門特寶生物工程股份有限公司