專利名稱：抗生素wap－8294a和ax,其制備方法和抗菌組合物的制作方法
本專利申請(qǐng)是CN95115898.8的分案申請(qǐng)；原申請(qǐng)的申請(qǐng)日為1995年8月18日；原申請(qǐng)的發(fā)明名稱為“抗菌素WAP-8294A，其制備方法和抗菌組合物”。
本發(fā)明涉及一種新型的作為治療由病原微生物感染導(dǎo)致的疾病有用的藥劑抗生素WAP-8294A，其制備方法和它們的用途。
自從用于細(xì)菌感染疾病的化學(xué)治療劑的歷史隨著奎寧和灑爾佛散的合成和青霉素的發(fā)現(xiàn)開(kāi)始以來(lái)，人類已經(jīng)受惠于這些化學(xué)治療劑了。然而，最近出現(xiàn)了耐這些化學(xué)治療劑的細(xì)菌，正如由MRSA(抗2，6-二甲氧基苯青霉素金黃色葡萄球菌)所感染的疾病所代表的，對(duì)于這種疾病，化學(xué)治療劑(除了萬(wàn)古霉素和去氫羥丁胺卡那霉素以外)沒(méi)有效果，這就導(dǎo)致了醫(yī)療治療界的混亂并構(gòu)成了嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題。
萬(wàn)古霉素作為一種抗生素是由美國(guó)的Eli LiLLy公司開(kāi)開(kāi)發(fā)的，并已經(jīng)被用于治療MRSA感染的疾病。但是這樣的治療常常伴隨有腎毒性，肝毒性，甚至顱神經(jīng)VIII(第八腦神經(jīng))病癥(耳毒性)，完成巴斯德消毒也需要很長(zhǎng)的時(shí)間，并且懷疑會(huì)再出現(xiàn)耐這種抗生素的細(xì)菌。
另一方面，去氫羥丁胺卡那霉素是一種化學(xué)衍生的抗生素，它具有作為氨基糖苷抗菌素之一的卡那毒素骨架，對(duì)于各種類型的耐藥細(xì)菌有極好的抗菌作用和效果，因此它作為有限的幾種治療MRSA傳染病的化學(xué)治療試劑中的一種來(lái)使用，但是，像氨基糖苷抗生素類特有的副作用一樣，它的使用有時(shí)也會(huì)伴隨有嚴(yán)重的腎毒性和顱神經(jīng)VIII(第八腦神經(jīng))疾病(耳毒性)，因此從醫(yī)學(xué)治療的觀點(diǎn)來(lái)看，它未必是安全的抗生素。
在這種情況下，人們一直期望著發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)一種新型的化學(xué)治療試劑，它(應(yīng)該)具有低的毒性，在短的時(shí)間內(nèi)就能顯示出其抗菌作用并且?guī)缀鯖](méi)有副作用，并且為了解決這一問(wèn)題人們已經(jīng)做了很多研究。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新型的，其有抗菌活性的，滿足上述要求的抗生素。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備該抗生素的方法。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種具有較低毒性或極好選擇毒性的臨床上有用的化學(xué)治療劑。
為了發(fā)現(xiàn)一種新型有用的抗生素，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)進(jìn)行了各種各樣的研究，結(jié)果已經(jīng)成功地從泥土中分離出一種屬于溶菌(lysobacter)屬的菌株作為一種新型的微生物，發(fā)現(xiàn)該菌株產(chǎn)生一種文獻(xiàn)中沒(méi)有敘述過(guò)的抗生素，從而完成了本發(fā)明。
因此本發(fā)明涉及具有下文中將要詳敘的物理化學(xué)性質(zhì)的抗生素WAP-8294A或其藥用鹽。本發(fā)明還涉及制備前述抗生素WAP-8294A的方法，該方法包括下面步驟在一種培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種屬于溶菌(lysobacter)屬并具有產(chǎn)生抗生素WAP-8294A能力的微生物來(lái)生產(chǎn)該抗生素和在培養(yǎng)基中富集該抗生素；然后回收該抗生素；本發(fā)明還涉及一種屬于溶菌屬并且具有產(chǎn)生抗生素WAP-8294A能力的微生物；和一種含有至少一個(gè)選自于抗生素WAP-8294A和其藥用鹽組成的一組抗生素的抗菌組合物。


圖1是當(dāng)抗生素WAP-8294A通過(guò)高性能液相色譜被分離成一系列組份時(shí)觀測(cè)到的色譜圖。
圖2是抗生素WAP-8294A2，(氫氯化物)的紫外吸收光譜(在水中)的示意圖。
圖3是抗生素WAP-8294A2(氫氯化物)的紅外吸收光譜(FT-IR，KBr)的示意圖。
圖4是抗生素WAP-8294A2(氫氯化物)的1H-NMR核磁共振譜(270MHz，D2O)的示意圖。
圖5是抗生素WAP-8294A的酸完全水解產(chǎn)物的二維TLC色層譜。
圖6是當(dāng)抗生素WAP-2894AX通過(guò)高效液相色譜被分離時(shí)觀測(cè)到的色譜圖。
圖7是抗生素WAP-8294AX-8(氫氯化物)的紫外吸收光譜(在水中)的示意圖。
圖8是抗生素WAP-8294AX-8(氫氯化物)的紅外吸收光譜(FT-IR，KBr)的示意圖。
圖9是抗生素WAP-8294AX-8(氫氯化物)的1H-NMR核磁共振譜(270MHz，D2O)的示意圖。
本發(fā)明涉及一種，在一種屬于溶菌(lysobacter)屬的新的菌株的培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的新型的抗生素WAP-8294A。該抗生素WAP-8294A進(jìn)一步被分離成至少七種組份AX，A1，A2，A3，A4，A5和A6，且組份AX進(jìn)一步被分離成至少13種組份AX-1，AX-2，AX-3，AX-4，AX-5，AX-6，AX-7，AX-8，AX-9，AX-10，AX-11，AX-12和AX-13。本文中使用的術(shù)語(yǔ)″抗生素WAP-8294A″意思是指上述組份AX，A1，A2，A3，A4，A5，A6，AX-1，AX-2，AX-3，AX-4，AX-5，AX-6，AX-7，AX-8，AX-9，AX-10，AX-11，AX-12，AX-13或它們的混合物。
除了游離形式的抗生素WAP-8294A以外，本發(fā)明還包括其藥用鹽，例如(其)氫氯化物，硫酸鹽和甲磺酸鹽。
這些物質(zhì)對(duì)于格蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，尤其是抗2，6-二甲氧基苯青霉素金黃色葡萄球菌(MRSA)，顯示出很強(qiáng)的抗菌活性。
抗生素WAP-8294A在C18反相硅膠-高效液相色譜的洗脫條件下[色譜柱YMC A-312(6×150mm)；流動(dòng)相0.05％含三氟乙酸的乙腈∶水(45∶50)；檢測(cè)波長(zhǎng)UV214nm，流速1毫升/分鐘]被分離成保留時(shí)間為4.0-6.1分鐘，8.0分鐘，11.1分鐘，12.5分鐘，16.5分鐘，17.9分鐘和18.8分鐘的餾份，即組份AX，A1，A2，A3，A4，A5和A6)(見(jiàn)圖1)。
如圖6所示，組份AX在C18反相硅膠-高效液相色譜的洗脫條件件下[色譜柱YMC A-312(6×150mm)；流動(dòng)相0.05％含三氟乙酸的乙腈∶水(37∶63)；檢測(cè)波長(zhǎng)UV214nm；流速1毫升/分鐘]被進(jìn)一步分離成保留時(shí)間為5.3分鐘，5.9分鐘，6.2分鐘，6.5分鐘，6.9分鐘，7.3分鐘，8.1分鐘，9.3分鐘，9.8分鐘，11.3分鐘，12.1分鐘，13.7分鐘和15.0分鐘的餾份，即AX-1，AX-2，AX-3，AX-4，AX-5，AX-6，AX-7，AX-8，AX-9，AX-10，AX-11，AX-12和AX-13。
抗生素WAP-8294A，A1，A2和A4紫外吸收光譜(在水中)的λmax為275nm，280nm和287nm。抗生素WAP-8294A2的紫外吸收光譜示于圖2。正如其酸水解產(chǎn)物的分析所證實(shí)的(將在下文中詳敘)，顯然抗生素WAP-8294A，A1，A2和A4在其分子中含有色氨的作為發(fā)色團(tuán)。
抗生素WAP-8294A，A1，A2和A4的紅外吸收光譜分析顯示了它們?cè)?300cm-1處有屬于OH和NH基團(tuán)的吸收，在1720-1715cm-1處有羧基或酯羰基基團(tuán)的吸收；1636和1541cm-1處有屬于酰胺鍵的吸收；和在1207及1137cm-1處有屬于C-O拉伸振動(dòng)的吸收，但它們均沒(méi)有其他任何的特征吸收?？股豔AP-8294A2的紅外吸收光譜示于圖3。
在抗生素WAP-8294A，A1，A2和A4的1H-NMR核磁共振譜中，觀測(cè)到源于甲基、亞甲基、次甲基，和雜環(huán)或芳香環(huán)的一些復(fù)雜的質(zhì)子信號(hào)?？咕豔AP-8294A2的1H-NMR譜各示于圖4。
WAP-8294A1，A2和A4的FAB-質(zhì)譜測(cè)定表明組分A1的(M+H)+離子的m/z為1548.9，組份A2的(M+H)+離子的m/z為1562.9和組份A4的(M+H)+離子的m/z為1576.9，并且組份A1，A2和A4的鈉熔融試驗(yàn)結(jié)果清楚地表明這些組份各為包含有碳，氫，氧和氮元素的化合物。下面表1中列出的分子式是從這些事實(shí)同時(shí)考慮結(jié)構(gòu)估計(jì)和構(gòu)成這些組份的所有氨基酸和脂肪酸的摩爾比(如以后詳敘的)以及高分辨率FAB-質(zhì)量測(cè)定結(jié)果而推斷出的。
表1A1A2A4FAB-質(zhì)量(M+H)+1548.9 1562.9 1576.9FAB-質(zhì)量(M-H)-1546.7 1561.2 1575.4△質(zhì)量單位14質(zhì)量單位 14質(zhì)量單位A1→A2A2→A4分子量 1547.9 1561.9 1575.9HR-FAB-質(zhì)量1548.8088 1562.8224 1576.8363分子式 C72H109O21N17C73H111O21N17C74H113O21N17
抗生素WAP-8294A，A1，A2和A4在茚三酮，艾氏菌素，Rydon-Smith，碘蒸汽，高錳酸鉀水溶液和硫酸反應(yīng)中均呈陽(yáng)性；通過(guò)用紫外燈發(fā)出的254nm的光線照射呈現(xiàn)出猝滅斑點(diǎn)，并且在Molisch反應(yīng)，硝酸銀，氯化鐵和Dragendorff氏反應(yīng)中呈陰性。此外，為了測(cè)定抗生素WAP-8294A，A1，A2和A4的氨基酸組份，將它們每個(gè)均用一種酸完全水解，然后用二維TLC處理并進(jìn)行氨基酸分析，如此得到的結(jié)果表明它們的每一個(gè)均含有天冬氨酸(Asp)，谷氨酸(Glu)，甘氨酸(Gly)，亮氨酸(Leu)，絲氨酸(Ser)，色氨酸(Trp)和鳥(niǎo)氨酸(Orn)以及3個(gè)未知的氨基酸。抗菌素WAP-8294A的二維TLC分析結(jié)果示于圖5。
因此為了確定這些未知的氨基酸，通過(guò)用酸再次水解WAP-8294A將未知氨基酸1，未知氨基酸2和未知氨基酸3分離。根據(jù)各種儀器分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)未知氨基酸1，2和3分別相應(yīng)為β-羥基天冬氨酸，N-甲基α-氨基異戊酸和N-甲基苯基丙氨酸。
另一方面，從由酸水解WAP-8294A1，A2或A4得到的各溶液的醚萃取液中分離出了，3-羥基辛酸，3-羥基-7-甲基辛酸或3-羥基-8-甲基壬酸。
此外，正如從示于圖6中的C18反相硅膠高效液相色譜中所清楚地看到的，抗生素WAP-8294AX被分離成至少13個(gè)組份，即AX-1保留時(shí)間5.3分鐘，AX-2保留時(shí)間5.9分鐘；AX-3保留時(shí)間6.2分鐘；AX-4保留時(shí)間6.5分鐘；AX-5保留時(shí)間6.9分鐘；AX-6保留時(shí)間7.3分鐘；AX-7保留時(shí)間8.1分鐘；AX-8保留時(shí)間9.3分鐘；AX-9保留時(shí)間9.8分鐘；AX-10保留時(shí)間11.3分鐘；AX-11保留時(shí)間12.1分鐘；AX-12保留時(shí)間13.7分鐘；和AX-13保留時(shí)間15.0分鐘。
抗生素WAP-8294AX，AX-8，AX-9和AX-13的紫外吸收光譜(在水中)λmax為273nm，280nm，和289nm。正如通過(guò)其酸水解產(chǎn)物的分析所證實(shí)的(將在下面詳細(xì)敘述)，顯然WAP-8294AX，AX-8，AX-9和AX-13在分子中含有一摩爾的色氨酸作為發(fā)色團(tuán)?？股豔AP-8294AX-8的紫外吸收光譜各示于圖7。
抗生素WAP-8294AX，AX-8，AX-9和AX-13的紅外吸收光譜分析表明在3300cm-1處有屬于OH和NH基的吸收；在1720-1715cm-1處有屬于羧基或酯羰基的吸收；在1636和1541cm-1處有屬于酰氨鍵的吸收；和在1207和1137cm-1處有屬于C-O伸展振動(dòng)的吸收；但它們均沒(méi)有其他任何特征吸收。抗生素WAP-8294AX-8的紅外吸收光譜各示于圖8。
在抗生素WAP-8294AX，AX-8，AX-9和AX-13的1H-NMR核磁共振測(cè)定中，觀察到一些源于甲基，亞甲基，次甲基，和雜環(huán)或芳環(huán)的復(fù)雜的質(zhì)子信號(hào)。抗菌素WAP-8294AX-8的1H-NMR譜各示于圖9。
WAP-8294AX-8，AX-9和AX-13的FAB-質(zhì)量測(cè)定表明，組份AX-8的(M+H)+離子的m/z為1549，組份AX-9的(M+H)+離子的m/z為1549，組份AX-13的(M+H)+離子的m/z為1577，并且組份AX-8，AX-9和AX-13的鈉熔融試驗(yàn)結(jié)果清楚地表明，每一組份均為含有碳、氫、氧和氮元素的化合物。如下面將要詳敘的列于下面表2中的分子式是根據(jù)這些事實(shí)同時(shí)考慮結(jié)構(gòu)估計(jì)和組成這些組份的所有的氨基酸與脂肪酸的摩爾比，以及高分辨率FAB質(zhì)譜測(cè)定的結(jié)果推斷出來(lái)的。
表2AX-8 AX-9 AX-13FAB-質(zhì)量(M+H)+1549 1549 1577FAB-質(zhì)量(M-H)-- 1547 --14質(zhì)量單位-14質(zhì)量單位+14質(zhì)量單位△質(zhì)量單位 A2---->AX-8 A2---->AX-9A2---->AX-13分子量 1548 1548 1576HR-FAB-質(zhì)量1548.8079 1548.8065 1576.8324分子式 C72H109O21N17C72H109O21N17C74H113O21N17抗生素WAP-8294AX，AX-8，AX-9和AX-13在茚三酮反應(yīng)，艾氏菌素反應(yīng)，Rydon-Smith反應(yīng)，碘蒸汽反應(yīng)，高錳酸鉀水溶液反應(yīng)和硫酸反應(yīng)中呈陽(yáng)性；通過(guò)用從紫外燈發(fā)射出的254nm光線照射呈現(xiàn)出驟熄斑點(diǎn)；并且在Molisch反應(yīng)，硝酸銀反應(yīng)，氯化鐵反應(yīng)和Dragendorff氏反應(yīng)中呈陰性。
為了測(cè)定抗生素WAP-8294AX，AX-8，AX-9，和AX-13的氨基的組份，將該每一種抗生素都用酸完全水解，然后進(jìn)行二維TLC分析[纖維素板；溶劑1正丁醇∶醋酸∶水(4∶1∶2)；溶劑2正丁醇∶吡啶∶醋酸∶水(15∶10∶3∶12)；噴顯劑∶茚三酮]和氨基酸分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于在茚三酮反應(yīng)中呈氨基酸陽(yáng)性，所以WAP-8394AX包含天冬氨酸(Asp)谷氨酸(Glu)，甘氨酸(Gly)，β-丙氨酸(β-Ala)，亮氨酸(Leu)，絲氨酸(Ser)，色氨酸(Trp)，鳥(niǎo)氨酸(Orn)，纈氨酸(Val)，N-甲基纈氨酸(N-MeVal)，β-羥基天冬氨酸(β-OH-Asp)，苯基丙氨酸(Phe)和N-甲基苯基丙氨酸(N-MePhe)。
另一方面，抗生素WAP-8294AX的酸完全水解產(chǎn)物的醚萃取液含有3-羥基-7-甲基辛酸也得到證實(shí)。
抗生素WAP-8294AX-8，AX-9和AX-13用與抗生素WAP-8294AX所用的處理方法相同的方法處理，并根據(jù)二維TLC分析，氨基酸分析，和酸完全水解產(chǎn)物的醚萃取液的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析能夠確定組成這些組份的氨基酸和脂肪酸。這些結(jié)果與抗生素WAP-8294A2觀察到的結(jié)果一起列于表3中。
表3構(gòu)成各組份的氨基酸和脂肪酸(括號(hào)中給出的摩爾數(shù))組份 AX-8 AX-9 AX-13 A2(min Component)氨基酸Asp(1)Asp(1) Asp(1)Asp(1)Ser(2)Ser(2) Ser(2)Ser(2)Glu(1)Glu(1) Glu(1)Glu(1)Gly(1)Gly(1) β-Ala(1) Gly(1)leu(1)leu(1) leu(1)leu(1)Trp(1)Trp(1) Trp(1)Trp(1)Orn(2)Orn(2) Orn(2)Orn(2)β-OH-Asp(1) β-OH-Asp(1) β-OH-Asp(1) β-OH-Asp(1)Val(1)N-MeVal(1) N-MeVal(1)N-MeVal(1)N-MePhe(1)Phe(1) N-MePhe(1)N-MePhe(1)脂肪酸3H-7M-OA 3H-7M-OA 3H-7M-OA 3H-7M-OA(1)(1)(1) (1)注3H-7M-OA表示3-羥基-7-甲基辛酸本發(fā)明人根據(jù)有關(guān)該抗菌素WAP-8294A，A1，A2，A4，AX，AX-8，AX-9和AX-13的酸完全水解產(chǎn)物，以及構(gòu)成這些抗生素的氨基酸和脂肪酸的上述物理化學(xué)性質(zhì)和知識(shí)查找已知的化合物，結(jié)果得到一明顯的事實(shí)，即它們均為文獻(xiàn)中沒(méi)有報(bào)導(dǎo)過(guò)的新型物質(zhì)。
本發(fā)明的抗生素WAP-8294A，A1，A2，A4，AX，AX-8，AX-9和AX-13可以通過(guò)下述方法制備，該方法包括這些步驟在一種培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種產(chǎn)生抗生素WAP-8294A的、屬于溶菌性細(xì)菌(lysobactor)屬的細(xì)菌并分離和收集抗生素WAP-8294A，另外如果需要再將其分離和純化。一個(gè)屬于溶菌性細(xì)菌屬的產(chǎn)生抗生素WAP-8294A細(xì)菌的例子是本發(fā)明人從取自日本靜岡縣Shimodo市的泥土中分離出的溶菌(Lysobacter)sp.WAP-8294菌株，該菌株的分類細(xì)菌學(xué)性質(zhì)如下1.形態(tài)在一種肉湯-瓊脂平皿上25℃培養(yǎng)該菌株3天，在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)了一種直徑范圍為0.4-0.6μm，長(zhǎng)度范圍為3.2-4.2μm的棒狀細(xì)胞。該菌株是格蘭氏陰性細(xì)菌，無(wú)鞭毛，但表現(xiàn)出滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)，不形成芽胞，并且無(wú)耐酸性。2.在各種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)特征該菌株在各種培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)并觀察3-14天。
(1)肉湯瓊脂平板培養(yǎng)基形成的菌落具有透明的淡黃色圓環(huán)形狀，凸形圓環(huán)表面和完整的波狀周邊。該菌株不形成可擴(kuò)散的色素。
(2)肉湯-瓊脂-斜面培養(yǎng)基菌株以鋪展開(kāi)的布狀形成生長(zhǎng)，并具有透明的淡黃色。
(3)肉湯液體培養(yǎng)基培養(yǎng)基變得略微混濁，菌株形成一精巧的環(huán)并且在培養(yǎng)容器的底部邊緣上觀察到細(xì)菌細(xì)胞的沉淀。
(4)肉湯-明膠穿刺培養(yǎng)菌株從培養(yǎng)基的表面向中間擴(kuò)展的區(qū)域內(nèi)生長(zhǎng)，同時(shí)液化明膠。
(5)石蕊-牛奶培養(yǎng)基菌株沒(méi)有顯示出還原石蕊的能力且無(wú)凝結(jié)，但具有胨化能力。
(6)脫脂乳-乙酸鹽瓊脂培養(yǎng)基菌株顯示出很強(qiáng)的蛋白分解活性并且生長(zhǎng)，同時(shí)在瓊脂平皿上形成高粘稠膠狀塊。3.生理特征WAP-8294菌株的生理特征如下(1)硝酸鹽還原-(2)脫氮反應(yīng) -(3)MR試驗(yàn)-(4)VP試驗(yàn)-(5)吲哚的生成-(6)硫化氫的生成 -(7)淀粉的水解-(8)檸檬酸的利用①Koser培養(yǎng)基-②Simmonds培養(yǎng)基 -③Christensen培養(yǎng)基 +(9)無(wú)機(jī)氮源的利用①硝酸鈉 +②硫酸銨 +
③谷氨酸鈉 +(10)色素的形成①King A綠膿桿菌產(chǎn)色試驗(yàn)培養(yǎng)基 -②King B綠膿桿菌產(chǎn)色試驗(yàn)培養(yǎng)基 -(11)脲酶 -(12)氧化酶 +(13)過(guò)氧化氫酶 +(14)生長(zhǎng)溫度 15-37℃(15)生長(zhǎng)PH 5-8(16)抗氧行為 需氧的(17)O-F試驗(yàn) 非分解型(18)脫氧核糖核酸酶 +(19)磷酸酶 +(20)溶血 β(21)纖維素的降解 -(22)吐溫的降解①吐溫20 +②吐溫40 +③吐溫60 +④吐溫80 +(23)膠體幾丁質(zhì)的降解 +(24)多糖的降解①CMC+②藻酸 -
③果膠酸 -(25)溶菌活性①釀酒酵母 +②枯草芽孢桿菌 +③大腸桿菌 +(26)GC含量 68.3％(HPLC法)(27)由糖生成酸和氣糖 形成酸(胨水)形成氣(肉湯-瓊脂)使用糖(Davis培養(yǎng)基)L-阿拉伯糖 - - -D-木糖 - - -D-葡萄糖 + - -D-甘露糖 + - -D-果糖 + - -D-半乳糖 + - -麥芽糖 + - +蔗糖 + - -乳糖 + - -海藻糖 + - -D-山梨醇 - - -D-甘露糖醇 - - -肌醇 - - -甘油 - - -淀粉 + - +纖維素二糖 + - +
當(dāng)上述關(guān)于WAP-8294菌株的結(jié)果與伯杰的《系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》第3卷(1989年)中公開(kāi)的細(xì)菌種類的詳細(xì)內(nèi)容相比較時(shí)，可以得出結(jié)論，該菌株是格蘭氏陰性的需氧的棒狀物，無(wú)鞭毛，并且具有因滑動(dòng)而致的游動(dòng)現(xiàn)象，因此，該菌株屬于滑動(dòng)細(xì)菌。
滑動(dòng)細(xì)菌被分成不形成子實(shí)體的非子實(shí)滑動(dòng)細(xì)菌和形成子實(shí)體的子實(shí)滑動(dòng)細(xì)菌。該菌株不形成子實(shí)體，所以屬于非子實(shí)滑動(dòng)細(xì)菌，此滑動(dòng)細(xì)菌又被進(jìn)一步分成三個(gè)類型，即噬纖維菌目(Cytophagales)，貝氏菌目和溶菌目，根據(jù)各自DNA的GC含量(這是一個(gè)重要的關(guān)鍵特性)可以清楚地將它們彼此區(qū)分開(kāi)來(lái)。由于這一原因，將該菌株的DNA通過(guò)常用的方法被萃取出來(lái)，用FEMSMicrobiol.Letters，1984，25，P.125中描述的HPLC方法測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其GC含量是高含量的為68.3％。所以，結(jié)論是該菌株屬于具有65-71％高GC含量的溶菌目的溶菌屬。
當(dāng)將此菌株的特征與屬于同一屬的種進(jìn)行比較時(shí)，其特征類似于Lysobactor enzymogenes，但與后者在微小細(xì)節(jié)上，例如同化檸檬的能力上，不一致。因此，此菌株被命名為溶菌屬SP.WAP-2894(Lysobacter sp.WAP-8294)。
此WAP-8294菌株于1994年1月31日寄存于日本工業(yè)科學(xué)的技術(shù)社(ageney)國(guó)家生物科學(xué)和人類技術(shù)研究所，登記號(hào)為FERM BP-4990(FERM P-14093)。包括了溶菌屬作為其通性細(xì)菌均相當(dāng)容易改變它們的分類學(xué)性質(zhì)，WAP-2894菌株也不例外?？墒牵芯哂挟a(chǎn)生抗生素WAP-2894能力的微生物，包括天然突變體或那些通過(guò)用種種誘變劑導(dǎo)致的人突變的變異體，均可以在本發(fā)明的方法中使用。(培養(yǎng)和生產(chǎn))
本發(fā)明的抗生素WAP-8294A是通過(guò)將上述產(chǎn)生WAP-8294A的細(xì)菌接種到含有營(yíng)養(yǎng)源的培養(yǎng)基并在有氧條件下培養(yǎng)此細(xì)菌制備的。當(dāng)培養(yǎng)該產(chǎn)生抗生素WAP-8294A的細(xì)菌時(shí)，該細(xì)菌使用，例如含有能同化的有機(jī)碳化合物，例如葡萄糖，果糖，淀粉，糊精，甘油，糖蜜，淀粉糖漿，脂肪和油以及有機(jī)酸作為碳源；并使用含有機(jī)和無(wú)機(jī)氮的化合物，例如大豆粉，棉子粉，玉米浸漬液，酪朊，胨，酵母萃取液肉湯，胚芽，尿素，氨基酚和銨鹽作為氮源。此外，這樣的鹽的例子是無(wú)機(jī)鹽，例如鈉，鉀，鈣和鎂鹽及磷酸鹽，它們可以單獨(dú)使用或以任一種結(jié)合方式使用。還可以任選地向培養(yǎng)基中加入例如鐵鹽，銅鹽，鋅鹽和鈷鹽的重金屬鹽；微生物生長(zhǎng)所需要的維生素，例如維生素H和維生素B1；以及其他的能有促進(jìn)產(chǎn)生抗生素WAP-8294A細(xì)菌的生長(zhǎng)和改進(jìn)WAP-8294A產(chǎn)率的有機(jī)和/或無(wú)機(jī)物質(zhì)。培養(yǎng)基也可以含有抗泡沫劑，例如硅油或聚亞烷基二醇醚和表面活性劑。
此菌株用生產(chǎn)抗生素的一般常用方法培養(yǎng)，但為了維持有氧的條件，優(yōu)選使用水底鼓氣攪拌培養(yǎng)技術(shù)，而在燒瓶中搖動(dòng)培養(yǎng)適用于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。一般來(lái)說(shuō)培養(yǎng)可以在20-40℃的溫度范圍進(jìn)行，優(yōu)選為25-30℃。在PH約6-8的范圍進(jìn)行培養(yǎng)，優(yōu)選是大約7。約2-6天的培養(yǎng)時(shí)間足以確保在培養(yǎng)基中富集的WAP-8294A有一個(gè)理想的產(chǎn)率。(分離和純化)如以下將要詳敘的，通過(guò)利用本發(fā)明抗生素物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)可以有效地進(jìn)行上述在培養(yǎng)基中的富集抗生素WAP-8294A的回收。更具體地說(shuō)，抗生素WAP-8294A存在于培養(yǎng)基的濾液中，因此，通過(guò)先加入助濾劑，例如硅藻土或鈉沸石收集培養(yǎng)基濾液，然后通過(guò)減壓過(guò)濾或離心分離分離出細(xì)菌細(xì)胞。
從其下面詳敘的物理化學(xué)性質(zhì)來(lái)看，抗生素WAP-8294A被認(rèn)為是水溶性的多肽抗生素并且是由相對(duì)大的化合物(每個(gè)化合物分子量范圍1,400-1,700)組成的。當(dāng)從培養(yǎng)基濾液中收集WAP-8294A時(shí)，應(yīng)將這些性質(zhì)考慮進(jìn)去，吸附劑樹(shù)脂，例如Diaion HP-20 SepabeadsSP207，CHP-20(可從Mitsubishi Chemical Industries Ltd購(gòu)買到)，Amberlite XAD-2(可從Rohn & Haas Co.購(gòu)買到)，Duolite S-30(可從Diamond Shamrock Chemical Co.購(gòu)買到)，以及，尤其是用活性碳柱色譜該抗生素能有效地被純化。
例如，將PH為6.9的培養(yǎng)基濾液通過(guò)一個(gè)用Amberlite IR-120B(H+型)裝填的柱子，然后把得到的酸性液體通過(guò)一個(gè)用未經(jīng)過(guò)任何處理的活性碳裝填的柱以吸附濾液，接著用水洗，然后用80％的丙酮-水混合物或堿性80％丙酮-水混合物作為提洗劑洗脫從而回收抗生素WAP-8294A。減壓下從洗脫液中蒸餾出丙酮之后，得到的殘存物用乙酸乙酯在酸性條件下萃取除去油溶性雜質(zhì)，然后水相再用高極性有機(jī)溶劑，例如正丁醇萃取以回收WAP-8294A。低溫下從萃取液中將正丁醇蒸餾出來(lái)后，將剩余物本身濃縮至干，或加入一種不溶性溶劑到剩余物濃縮物中沉淀WAP-8294A，接著離心或減壓過(guò)濾得到粗(產(chǎn)物)物質(zhì)。
由于WAP-8294A在酸性條件下能夠用極性有機(jī)溶劑，例如正丁醇萃取，所以上述回收的粗(產(chǎn)物)物質(zhì)可以通過(guò)下面的方法進(jìn)一步純化，得到高純的物質(zhì)，這些方法是由離心液-液分配色譜代表的逆流分配法，吸附色譜法，例如硅膠柱色譜，和分配色譜法，例如纖維素柱色譜，它們可以單獨(dú)使用或聯(lián)合使用。
另一方面，用下面的方法純化粗產(chǎn)物物質(zhì)也是可能的，即利用Sephadex G-10，G-15，LH-20(可從Pharmacia Company購(gòu)買到)或Biogel P-4 Gel(可從Bio-Rad Laboratries購(gòu)買到)的分子篩作用，然后用水，含水的低級(jí)醇，例如含水甲醇，稀釋的堿性或酸性水溶液和含有適當(dāng)鹽的水溶液液展開(kāi)和洗脫，上述液體可以單獨(dú)或混合使用。
例如通過(guò)上述的逆流分配技術(shù)和/或高性能液相色譜技術(shù)進(jìn)一步提純和分離WAP-8294A可以得到單獨(dú)的7種組分AX、A1、A2、A3、A4、A5和A6。通過(guò)使用類似于上面所用的那些方法提純和分離AX組分，同樣可以得到13種組分AX-1、AX-2、AX-3、AX-4、AX-5、AX-6、AX-7、AX-8、AX-9、AX-10、AX-11、AX-12和AX-13。
在高效液相色譜中用的填充物可以是硅膠，其是市場(chǎng)上可以買到的優(yōu)良的載體，其中的烷基例如十八烷基和辛基被化學(xué)鍵合到硅膠的硅烷醇基上，或者可以是通用的載體例如聚苯乙烯型多孔聚合物凝膠。通過(guò)使用這些填充物可以高效的把WAP-8294A和AX組分分離成單獨(dú)的組分。可用于高效液相色譜的流動(dòng)相的可以是酸化的例如通過(guò)三氟乙酸酸化的含水乙腈，含水低碳醇例如含水甲醇，和緩沖溶液。(物化性能)通過(guò)由上述的各種色譜技術(shù)得到的WAP-8294A、A1、A2、A4、AX、AX-8、AX-9和AX-13，通過(guò)其完全的酸水解得到的以及在茚三酮反應(yīng)中呈陽(yáng)性的物質(zhì)和酸水解產(chǎn)物醚萃取物的物化性能在下面詳細(xì)描述?？股豔AP-8294A
(1)外觀白色粉末；(2)熔點(diǎn)213-220℃(分解)；(3)溶解性溶于水、甲醇、正丁醇、二甲基甲酰胺和二甲亞砜，不溶于丙酮、乙酸乙酯和氯仿；(4)顯色反應(yīng)在茚三酮、Ehrlich、Rydon-Smith、高錳酸鉀水溶液、硫酸和碘蒸氣反應(yīng)中呈陽(yáng)性，通過(guò)用紫外燈發(fā)射的254nm光線進(jìn)行照射顯示出驟熄；在Molishch、硝酸銀、氯化鐵和Dragendorff反應(yīng)中呈陰性；(5)高效液相色譜中的保留時(shí)間(圖1)4.0-6.1分鐘，8.0分鐘，11.1分鐘，12.5分鐘，16.5分鐘，17.9分鐘和18.8分鐘；(6)紫外線吸收譜(在水中)λmax275nm、280nm、287nm；(7)紅外吸收譜(FT-IR，KBr)特征吸收譜3300cm-1、1720-1715cm-1、1636cm-1、1541cm-1、1404cm-1、1207cm-1、1137cm-1；(8)分子量1400-1700；(9)有機(jī)化合物的定性試驗(yàn)(熔鈉法)該抗生素是含有碳、氫、氧和氮元素的化合物；(10)作為茚三酮陽(yáng)性物質(zhì)酸完全水解提供Asp、Glu、Gly、Leu、Ser、Trp、Orn、N-甲基纈氨酸、β-羥基天冬氨酸和N-甲基苯基丙氨酸；(11)旋光率[α]20D＝+42℃(C＝0.5，H2O)；(12)堿性、酸性和中性分類兩性?？股豔AP-8294A1
(1)外觀白色粉末；(2)熔點(diǎn)215-225℃(分解)；(3)溶解性溶于水、甲醇、正丁醇、二甲基甲酰胺和二甲亞砜，不溶于丙酮、乙酸乙酯和氯仿；(4)顏色反應(yīng)在茚三酮、艾氏菌素、Rydon-Smith、高錳酸鉀水溶液、硫酸和碘蒸氣反應(yīng)中呈陽(yáng)性，用紫外燈發(fā)射的254nm光線照射顯示出驟熄斑；在Molishch、硝酸銀、氯化鐵和Dragendorff反應(yīng)中呈陰性；(5)高效液相色譜的保留時(shí)間8.0分鐘；(6)紫外線吸收譜(在水中)λmax275nm、280nm、287nm；(7)紅外吸收譜(FT-IR，KBr)特征吸收譜3300cm-1、1720-1715cm-1、1636cm-1、1541cm-1、1404cm-1、1207cm-1、1133cm-1；(8)分子量1547.9[FAB-MS m/z 1548.9(M+H)+，m/z1546.7(M-H)-]；(9)分子式C72H109O21N17[高分辨率FAB-Mass測(cè)定的(M+H)+離子的m/z的測(cè)定值1548，8088；m/z的計(jì)算值1548，8063]；(10)酸完全水解提供Asp(1mole)、Glu(1mole)、Gly(1mole)、Leu(1mole)、Ser(2mole)、Trp(1mole)、Orn(2mole)、N-甲基纈氨酸(1mole)、β-羥基天冬氨酸(1mole)、N-甲基苯基丙氨酸(1mole)和3-羥基辛酸(1mole)；(11)旋光率[α]20D＝+41°(C＝0.5，H2O)；(12)堿性、酸性和中性分類兩性?？股豔AP-8294A2(1)外觀白色粉末；(2)熔點(diǎn)215-225℃(分解)；(3)溶解性溶于水、甲醇、正丁醇、二甲基甲酰胺和二甲亞砜，不溶于丙酮、乙酸乙酯和氯仿；(4)顏色反應(yīng)在茚三酮、艾氏菌素、Rydon-Smith、高錳酸鉀水溶液、硫酸和碘蒸氣反應(yīng)中呈陽(yáng)性，用紫外燈發(fā)射的254nm光線照射顯示出驟熄斑；在Molishch、硝酸銀、氯化鐵和Dragendorff反應(yīng)中呈陰性；(5)高效液相色譜的保留時(shí)間11.1分鐘；(6)紫外線吸收譜(在水中)(圖2)λmax275nm(E1cm1％31.8)、280nm(E1cm1％33.4)、287nm(E1cm1％29.2)；(7)紅外吸收譜(FT-IR，KBr)(圖3)特征吸收譜3300cm-1、1720-1715cm-1、1636cm-1、1541cm-1、1404cm-1、1207cm-1、1137cm-1；(8)1H-NMR譜(270MHz，D2O)(圖4)觀察到源于甲基、亞甲基、次甲在和雜環(huán)或芳環(huán)的復(fù)雜的質(zhì)子信號(hào)；(9)分子量1561.9[FAB-質(zhì)譜m/z 1562.9(M+H)+，m/z 1561.2(M-H)-]；(10)分子式C73H111O21N17[由高分辨率FAB-Mass測(cè)定的(M+H)+離子的m/z的測(cè)定值1562，822；m/z的計(jì)算值1562，8219]；(11)作為水解產(chǎn)物酸完全水解提供Asp(1mole)、Glu(1mole)、Gly(1mole)、Leu(1mole)、Ser(2mole)、Trp(1mole)、Orn(2mole)、N-甲基纈氨酸(1mole)、β-羥基天冬氨酸(1mole)、N-甲基苯基丙氨酸(1mole)和3-羥基-7-甲基辛酸(1mole)；(12)旋光率[α]20D＝+42°(C＝0.5，H2O)；(12)堿性、酸性和中性分類兩性?？股豔AP-8294A4(1)外觀白色粉末；(2)熔點(diǎn)215-225℃(分解)；(3)溶解性溶于水、甲醇、正丁醇、二甲基甲酰胺和二甲亞砜，不溶于丙酮、乙酸乙酯和氯仿；(4)顏色反應(yīng)在茚三酮、艾氏菌素、Rydon-Smith、高錳酸鉀水溶液、硫酸和碘蒸氣反應(yīng)中呈陽(yáng)性，用紫外燈發(fā)射的254nm光線照射顯示出驟熄斑；在Molishch、硝酸銀、氯化鐵和Dragendorff反應(yīng)中呈陰性；(5)高效液相色譜的保留時(shí)間16.5分鐘；(6)紫外線吸收譜(在水中)λmax275nm、280nm、287nm；(7)紅外吸收譜(FT-IR，KBr)特征吸收譜3300cm-1、1720-1715cm-1、1636cm-1、1541cm-1、1404cm-1、1207cm-1、1137cm-1；(8)分子量1575.9[FAB-質(zhì)譜m/z 1576.9(M+H)+，m/z1575.4(M-H)-]；(9)分子式C74H113O21N17[由高分辨率FAB-Mass測(cè)定的(M+H)+離子的m/z的測(cè)定值1576，8363；m/z的計(jì)算值1576，8375]；(10)作為水解產(chǎn)物，酸完全水解提供Asp(1mole)、Glu(1mole)、Gly(1mole)、Leu(1mole)、Ser(2mole)、Trp(1mole)、Orn(2mole)、N-甲基纈氨酸(1mole)、β-羥基天冬氨酸(1mole)、N-甲基苯基丙氨酸(1mole)和3-羥基-8-甲基壬酸(1mole)；(11)旋光率[α]20D＝+43°(C＝0.5，H2O)；(12)堿性、酸性和中性分類兩性。
抗生素WAP-8294A、A1、A2和A4的C18反相硅凝膠高性能液相色譜的洗脫條件如下柱YMC A-312(6×150mm)流動(dòng)相含0.05％三氟乙酸的乙腈∶水(45∶55)檢測(cè)波長(zhǎng)UV 214nm流速1ml/min抗生素WAP-8294AX(1)外觀白色粉末；(2)熔點(diǎn)196-200℃(分解)；(3)溶解性溶于水、甲醇、正丁醇、二甲基甲酰胺和二甲亞砜，不溶于丙酮、乙酸乙酯和氯仿；(4)顏色反應(yīng)在茚三酮、艾氏菌素、Rydon-Smith、高錳酸鉀水溶液、硫酸和碘蒸氣反應(yīng)中呈陽(yáng)性，用紫外燈發(fā)射的254nm光線照射顯示出驟熄斑；在Molishch、硝酸銀、氯化鐵和Dragendorff反應(yīng)中呈陰性；(5)高效液相色譜的保留時(shí)間(圖6)5.3分鐘、5.9分鐘，6.2分鐘、6.5分鐘，6.9分鐘，7.3分鐘，8.1分鐘，9.3分鐘、9.8分鐘、11.3分鐘、12.1分鐘、13.7分鐘和15.0分鐘。
(6)紫外線吸收譜(在水中)
λmax273nm、280nm、289nm；(7)紅外吸收譜(FT-IR，KBr)特征吸收譜3300cm-1、1720-1715cm-1、1636cm-1、1541cm-1、1404cm-1、1207cm-1、1137cm-1；(8)分子量1400-1700；(9)有機(jī)化合物定性試驗(yàn)(鈉熔融法)該抗生素是含有碳、氫、氧和氮元素的化合物；(10)作為茚三酮陽(yáng)性的物質(zhì)和脂肪酸，酸完全水解提供Asp、Glu、Gly、β-Ala、Leu、Ser、Trp、Orn、Val、N-甲基纈氨酸、β-羥基天冬氨酸、Phe、N-甲基苯基丙氨酸和3-羥基-7-甲基辛酸；(11)旋光率[α]20D＝+24°(C＝0.5，H2O)；(12)堿性、酸性和中性分類兩性?？股豔AP-8294AX-8(1)外觀白色粉末；(2)熔點(diǎn)196-200℃(分解)；(3)溶解性溶于水、甲醇、正丁醇、二甲基甲酰胺和二甲亞砜，不溶于丙酮、乙酸乙酯和氯仿；(4)顏色反應(yīng)在茚三酮、艾氏菌素、Rydon-Smith、高錳酸鉀水溶液、硫酸和碘蒸氣反應(yīng)中呈陽(yáng)性，用紫外燈發(fā)射的254nm光線照射顯示出驟熄斑；在Molishch、硝酸銀、氯化鐵和Dragendorff反應(yīng)中呈陰性；(5)高效液相色譜的保留時(shí)間9.3分鐘；(6)紫外線吸收譜(在水中)(圖7)λmax273nm、280nm、289nm；
(7)紅外吸收譜(FT-IR，KBr)(圖8)特征吸收譜3300cm-1、1720-1715cm-1、1636cm-1、1541cm-1、1404cm-1、1207cm-1、1133cm-1；(8)1H-NMR譜(270MHz，DMSO-D6)(圖9)觀察到甲基、亞甲基、次甲基和雜環(huán)或芳環(huán)產(chǎn)生的復(fù)雜的質(zhì)子信號(hào)；(9)分子量1548[FAB-質(zhì)譜m/z 1549(M+H)+]；(10)分子式C72H109O21N17[由高分辨率FAB-Mass測(cè)定的(M+H)+離子的m/z的測(cè)定值1548，8079；m/z的計(jì)算值1548，8063]；(11)作為水解產(chǎn)物酸完全水解提供Asp(1mole)、Glu(1mole)、Gly(1mole)、Leu(1mole)、Ser(2mole)、Trp(1mole)、Orn(2mole)、Val(1mole)、β-羥基天冬氨酸(1mole)、N-甲基苯基丙氨酸(1mole)和3-羥基-7-甲基辛酸(1mole)；(11)旋光率[α]20D＝+25°(C＝0.5，H2O)；(12)堿性、酸性和中性分類兩性。抗生素WAP-8294AX-9(1)外觀白色粉末；(2)熔點(diǎn)216-220℃(分解)；(3)溶解性溶于水、甲醇、正丁醇、二甲基甲酰胺和二甲亞砜，不溶于丙酮、乙酸乙酯和氯仿；(4)顏色反應(yīng)在茚三酮、Ehrlich、Rydon-Smith、高錳酸鉀水溶液、硫酸和碘蒸氣反應(yīng)中呈陽(yáng)性，用紫外燈發(fā)射的254nm光線照射顯示出驟熄斑；在Molishch、硝酸銀、氯化鐵和Dragendorff反應(yīng)中呈陰性；(5)高效液相色譜的保留時(shí)間9.8分鐘；
(6)紫外線吸收譜(在水中)λmax273nm、280nm、289nm；(7)紅外吸收譜(FT-IR，KBr)特征吸收譜3300cm-1、1720-1715cm-1、1636cm-1、1541cm-1、1404cm-1、1207cm-1、1137cm-1；(8)分子量1548[FAB-質(zhì)譜m/z 1549(M+H)+，m/z1547(M-H)-]；(9)分子式C72H109O21N17[由高分辨率FAB-Mass測(cè)定的(M+H)+離子的m/z的測(cè)定值1548，8065；m/z的計(jì)算值1548，8063]；(10)作為水解產(chǎn)物，酸完全水解提供Asp(1mole)、Glu(1mole)、Gly(1mole)、Leu(1mole)、Ser(2mole)、Trp(1mole)、Orn(2mole)、N-甲基纈氨酸(1mole)、β-羥基天冬氨酸(1mole)、Phe(1mole)、和3-羥基-7-甲基辛酸(1mole)；(11)旋光率[α]20D＝+28°(C＝0.5，H2O)；(12)堿性、酸性和中性分類兩性?？股豔AP-8294AX-13(1)外觀白色粉末；(2)熔點(diǎn)205-210℃(分解)；(3)溶解性溶于水、甲醇、正丁醇、二甲基甲酰胺和二甲亞砜，不溶于丙酮、乙酸乙酯和氯仿；(4)顏色反應(yīng)在茚三酮、艾氏菌素、Rydon-Smith、高錳酸鉀水溶液、硫酸和碘蒸氣反應(yīng)中呈陽(yáng)性，用紫外燈發(fā)射的254nm光線照射顯示出驟熄斑；在Molishch、硝酸銀、氯化鐵和Dragendorff反應(yīng)中呈陰性；(5)高效液相色譜的保留時(shí)間15.0分鐘；
(6)紫外線吸收譜(在水中)λmax273nm、280nm、289nm；(7)紅外吸收譜(FT-IR，KBr)特征吸收譜3300cm-1、1720-1715cm-1、1636cm-1、1541cm-1、1404cm-1、1207cm-1、1137cm-1；(8)分子量1576[FAB-MS m/z l577(M+H)+；(9)分子式C74H113O21N17[由高分辨率FAB-Mass測(cè)定的(M+H)+離子的m/z的測(cè)定值1576，8324；m/z的計(jì)算值1576，8375]；(10)作為水解產(chǎn)物，酸完全水解提供Asp(1mole)、Glu(1mole)、β-Ala(1mole)、Leu(1mole)、Ser(2mole)、Trp(1mole)、Orn(2mole)、N-甲基纈氨酸(1mole)、β-羥基天冬氨酸(1mole)、N-甲基苯基丙氨酸(1mole)和3-羥基-7-甲基辛酸(1mole)；(11)旋光率[α]20D＝+27°(C＝0.5，H2O)；(12)堿性、酸性和中性分類兩性。
抗生素WAP-8294AX、AX-8、AX-9和AX-13的C18反相硅凝膠高性能液相色譜的洗脫條件如下柱子YMC A-312(6×150mm)流動(dòng)相含0.05％三氟乙酸的乙腈∶水(37∶63)檢測(cè)波長(zhǎng)UV 214nm流速1ml/min(生物特性)(1)抗菌活性WAP-8294A、A1、A2和A4的抗菌活性的檢驗(yàn)結(jié)果列于表4。用肉湯稀釋法來(lái)測(cè)定最小抑制濃度(MIC)，該方法是利用敏感的肉湯培養(yǎng)基(可以從Eiken Chemical Co.，Ltd.買到)進(jìn)行的。
列于表4的數(shù)據(jù)明顯地表明WAP-8294A、A1、A2和A4對(duì)包括MRSA(抗甲氧苯青霉素的金黃色釀膿葡萄球菌)在內(nèi)的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌呈現(xiàn)很強(qiáng)的抗菌活性，該活性的特征在于當(dāng)把10％牛血清加到該培養(yǎng)基中時(shí)，在上述培養(yǎng)基中觀察到增加到不小于8倍的活性。
另一方面，它們對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌、真菌和酵母菌沒(méi)有表現(xiàn)出任何的活性。
表4-1MIC(μg/ml)A A1加血清試驗(yàn)的細(xì)菌 無(wú) 10％ 無(wú) 10％金黃色釀膿葡萄球菌1號(hào)(MRSA 0.78＜0.100.39 ＜0.10臨床分離的菌株)金黃色釀膿葡萄球菌11號(hào)(MRSA 0.78＜0.100.39 ＜0.10臨床分離的菌株)金黃色釀膿葡萄球菌371號(hào)R(MRSA 0.78＜0.100.39 ＜0.10臨床分離的菌株)金黃色釀膿葡萄球菌(ATCC 25923) 0.78＜0.100.39 ＜0.10表皮葡萄球菌0.78＜0.100.39 ＜0.10(ATCC 12228)釀膿鏈球菌 6.25256.25 25(ATCC 19615)枯草桿菌(ATCC 6633) 0.78＜0.100.39 ＜0.10大腸桿菌(ATCC 25922)＞100 ＞100 ＞100 ＞100綠膿桿菌＞100 ＞100 ＞100 ＞100(ATCC 9027)白色念球菌(TIMM 0239) ＞100 ＞100 ＞100 ＞100煙曲霉(IAM 2004)＞100 ＞100 ＞100 ＞100
表4-2MIC(μg/ml)A2A4加血清試驗(yàn)的細(xì)菌 無(wú) 10％ 無(wú) 10％金黃色釀膿葡萄球菌1號(hào)(MRSA 0.78＜0.100.78 ＜0.10臨床分離的菌株)金黃色釀膿葡萄球菌11號(hào)(MRSA 0.78＜0.100.78 ＜0.10臨床分離的菌株)金黃色釀膿葡萄球菌371號(hào)R(MRSA 0.78＜0.100.78 ＜0.10臨床分離的菌株)金黃色釀膿葡萄球菌(ATCC 25923) 0.78＜0.100.78 ＜0.10表皮葡萄球菌0.78＜0.100.78 ＜0.10(ATCC 12228)釀膿鏈球菌 6.25256.25 25(ATCC 19615)枯草桿菌(ATCC 6633) 0.78＜0.100.78 ＜0.10大腸桿菌(ATCC 25922)＞100 ＞100 ＞100 ＞100綠膿桿菌＞100 ＞100 ＞100 ＞100(ATCC 9027)白色念球菌(TIMM 0239) ＞100 ＞100 ＞100 ＞100煙曲霉(IAM 2004)＞100 ＞100 ＞100 ＞100以同樣的方式來(lái)測(cè)定抗生素WAP-8294AX、AX-8、AX-9和AX-13的抗菌活性將結(jié)果列于表5中。的抗菌活性將結(jié)果列于表5中。使用Muller-Hinton肉湯(可以從DIFCO公司買到)并用2％氯化鈉增補(bǔ)的MRSA測(cè)定它們的最小抑制濃度(MIC)，(而其他細(xì)菌則用Muller Hinton肉湯本身)。
表5中的數(shù)據(jù)表明，抗菌素WAP-8294AX、AX-8、AX-9和AX-13對(duì)包括抗甲氧苯青霉素的金黃色釀膿葡萄球菌在內(nèi)的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌呈現(xiàn)很強(qiáng)的抗菌活性，并發(fā)現(xiàn)當(dāng)把10％牛血清加到該培養(yǎng)基時(shí)其活性增加到約2倍于在上述培養(yǎng)基中觀察到的活性。
另一方面，它們對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌、真菌和酵母菌沒(méi)有表現(xiàn)出任何的活性。
表5-1MIC(μg/ml)AXAX-8加血清試驗(yàn)的細(xì)菌 無(wú) 10％無(wú) 10％金黃色釀膿葡萄球菌1號(hào)(MRSA 1.560.783.133.13臨床分離的菌株)金黃色釀膿葡萄球菌 1.560.783.131.56(ATCC 25923)表皮葡萄球菌 1.560.781.560.78(ATCC 12228)釀膿鏈球菌 ＞100 ＞100 ＞100 ＞100(ATCC 19615)枯草桿菌(ATCC 6633) 1.560.781.560.78大腸桿菌(ATCC 25922) ＞100 ＞100 ＞100 ＞100綠膿桿菌 ＞100 ＞100 ＞100 ＞100(ATCC 9027)白色念球菌 (TIMM 0239) ＞100 ＞100 ＞100 ＞100煙曲霉(IAM 2004) ＞100 ＞100 ＞100 ＞100
表5-2MIC(μg/ml)AX-9 AX-13加血清試驗(yàn)的細(xì)菌無(wú) 10％無(wú) 10％金黃色釀膿葡萄球菌1號(hào)(MRSA3.131.563.13 3.13臨床分離的菌株)金黃色釀膿葡萄球菌3.131.563.13 3.13(ATCC 25923)表皮葡萄球菌 1.560.781.56 0.78(ATCC 12228)釀膿鏈球菌＞100 ＞100 ＞100 ＞100(ATCC 19615)枯草桿菌(ATCC 6633) 3.131.563.13 1.56大腸桿菌(ATCC 25922) ＞100 ＞100 ＞100 ＞100綠膿桿菌 ＞100 ＞100 ＞100 ＞100(ATCC 9027)白色念球菌(TIMM 0239) ＞100 ＞100 ＞100 ＞100煙曲霉(IAM 2004) ＞100 ＞100 ＞100 ＞100
(2)在鼠中，WAP-8294A時(shí)抗實(shí)驗(yàn)MRSA于感染的保護(hù)作用。
正如在體外所看到的它的抗菌活性(如表4所示)那樣，由于抗生素WAP-8294A對(duì)包括MRSA在內(nèi)的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌顯示很強(qiáng)的抗菌活性，因而進(jìn)行了保護(hù)鼠不受金黃色釀膿葡萄球菌1號(hào)(臨床分離的MRSA的菌株)感染的試驗(yàn)。
試驗(yàn)按如下方法進(jìn)行將ICR-MCH鼠[4周令雄鼠(可以從Nippon CLEA有限公司買到)，每組8只]在用細(xì)菌感染前三天腹膜內(nèi)給藥環(huán)磷酰胺0.5mg/0.5ml/鼠，然后腹膜內(nèi)給每只鼠0.5ml含有2×106/ml的金黃色釀膿葡萄球菌1號(hào)菌株(用5％粘蛋白增補(bǔ))的液體來(lái)感染這些動(dòng)物。感染后1小時(shí)，每只鼠給予一次皮下注射，10mg/kg鹽酸萬(wàn)古霉素(可以從Shionogi有限公司購(gòu)買)和0.2ml/小鼠的抗生素WAP-8294A(含10mg/kg、5mg/kg、2.5mg/kg、1.0mg/kg、0.5mg/kg、0.25mg/kg、0.1mg/kg或0.05mg/kg的抗生素)。而對(duì)照組，每只皮下給于0.2ml生理鹽水。
從下面給出的表6中這些試驗(yàn)的結(jié)果可以看出，在感染之后3天內(nèi)，所有沒(méi)有任何治療的對(duì)照動(dòng)物全部死亡。另一方面，關(guān)于抗生素給藥的組，給藥萬(wàn)古霉素10mg/kg的8只動(dòng)物中的5只甚至在感染后5天還存活。與此相反，由表6所列的結(jié)果可以看出，在低劑量水平，WAP-8294A顯示出優(yōu)異的治療效果。由概率法測(cè)定的其ED50值是0.155mg/kg。
表6在鼠感染實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的MRSA時(shí)WAP-8294A的治療結(jié)果試驗(yàn)組 劑量(mg/kg) 試驗(yàn)動(dòng)物的存活數(shù)/動(dòng)物數(shù)對(duì)照(生理鹽水) 0/8萬(wàn)古霉素10 5/8抗生素WAP-8294A 10 8/858/82.5 8/81.0 8/80.5 7/80.25 5/80.10 3/80.05 1/8正如表5所示其體外抗菌活性，由于抗生素WAP-8294AX對(duì)包括MRSA在內(nèi)的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌顯示很強(qiáng)的抗菌活性，因而進(jìn)行了保護(hù)鼠不受金黃色釀膿葡萄球菌JCM8702(臨床分離的MRSA的菌株)感染的試驗(yàn)。
試驗(yàn)按如下方法進(jìn)行在用細(xì)菌感染前3天給予ICR-MCH鼠[4周令雄鼠(可以從Nippon CLEA有限公司買到)，每組8只]腹膜內(nèi)注射0.5mg/0.5ml/鼠的環(huán)磷酰胺，然后通過(guò)腹膜內(nèi)給予每只鼠0.5ml含有2×104/ml的金黃色釀膿葡萄球菌JCM8702菌株(用5％粘蛋白增補(bǔ))的液體。感染后1小時(shí)，用10mg/kg的萬(wàn)古霉素HCl(可從Shionogi有限公司購(gòu)買)和0.2ml/鼠的抗生素WAP-8294AX(含有10mg/kg、2.5mg/kg、1.0mg/kg或0.5mg/kg的抗菌素)給鼠皮下注射一次。而對(duì)照組，每只皮下給藥0.2ml生理鹽水。
從下面給出的表7所示的這些試驗(yàn)的結(jié)果看出，沒(méi)有給以任何治療的8只對(duì)照動(dòng)物中的6只在感染后3天內(nèi)死亡，對(duì)于抗生素給藥的組，給藥10mg/kg萬(wàn)古霉素的8只動(dòng)物中的5只甚至在感染后5天仍存活。與此相反，從表7列出的結(jié)果看出，WAP-8294AX在低劑量水平上顯示出優(yōu)異的治療效果。由概率法測(cè)定的其ED50值是1.25mg/kg。
表7在鼠中實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的MRSA感染時(shí)WAP-8294AX的治療結(jié)果試臉組劑量(mg/kg)試驗(yàn)動(dòng)物的存活數(shù)/動(dòng)物數(shù)對(duì)照(生理鹽水) 2/8萬(wàn)古霉素 10 5/8抗生素WAP-8294A 10 7/82.55/81.04/80.52/8(3)對(duì)鼠的急性毒性試驗(yàn)以25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg或250mg/kg的劑量，把抗生素WAP-8294A給鼠靜脈內(nèi)給藥(4周令I(lǐng)CR-MCH雄鼠，每組5只)，但是沒(méi)有觀察到任何的急性毒性。
以25mg/kg或100mg/kg的劑量，把抗生素WAP-8294AX給鼠腹膜內(nèi)給藥(4周令I(lǐng)CR-MCH雄鼠，每組5只)，但是未觀察到任何的急性毒性。
由上述可以看出，抗生素WAP-8294A、A1、A2、A3、A4、A5、A6、AX、AX-1、AX-2、AX-3、AX-4、AX-5、AX-6、AX-7、AX-8、AX-9、AX-10、AX-11、AX-12和AX-13是給人和動(dòng)物治療細(xì)菌感染性疾病，特別是由抗甲氧苯青霉素的金黃色釀膿葡萄球菌感染導(dǎo)致的感染性疾病的有效治療劑。
(應(yīng)用)如果把本發(fā)明的新穎的抗生素作為藥品給藥，可以按照通常的方式以各種劑型施用。例如，它們可以以口服給藥的形式例如粉劑、顆粒劑、片劑、膠囊和糖漿劑施用，可以以非經(jīng)腸道的藥藥形式例如(靜脈的、肌內(nèi)的、皮下的)注射液、滴劑、栓劑、涂布劑和軟膏來(lái)使用，均很安全。另外，本發(fā)明的新穎的抗菌素同樣可以用做眼科領(lǐng)域以非經(jīng)腸道給藥劑型例如眼藥水和眼膏安全地使用。同時(shí)注意到它們的殺菌速度比萬(wàn)古霉素的快，以及在低濃度下的有效性。
可以用通常的方法制備這些各種各樣的藥物制劑，例如通過(guò)混合的方法，加到主成分、藥用的和已知的通用的輔劑例如賦形劑、粘結(jié)劑、崩解劑、包衣劑、潤(rùn)滑劑、穩(wěn)定劑、矯味劑或香料、助溶劑、懸浮劑和稀釋劑中，然后使混合物形成所要求的劑型。
其劑量可以根據(jù)例如要治療的疾病、給藥的途徑和給藥時(shí)間而變化，但優(yōu)選的給藥劑量范圍對(duì)成人來(lái)說(shuō)是每天5mg-2000mg，可以一次給藥或分次給藥。
在下文要參考下面的實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明，但是本發(fā)明并不限制到這些特例的范圍。
當(dāng)把它與β-羥基天冬氨酸鹽酸化物可靠的樣品(可以從Sigma公司買到)比較時(shí)其1H-NMR譜(化學(xué)位移)，和在纖維素TLC[溶劑正丁醇∶吡啶∶乙酸∶水(15∶10∶3∶12)]觀察到未知氨基酸-1鹽酸化物的Rf值(0.20)完全與用可靠的樣品觀察到的結(jié)果相同，因此，未知氨基酸-1被鑒別為β-羥基天冬氨酸。
另外，濃縮從Sepabeads SP207柱的30ml至45ml之間洗脫的并含有未知氨基酸-2的組分并裝到填有10ml活性炭的柱子上。收集24和34ml之間洗脫的組分，裝到Dowex 50wx-8柱(1ml)上，用0.5NNH4OH溶液洗脫，接著濃縮至干，得到2.1mg未知氨基酸-2白色粉末。發(fā)現(xiàn)該氨基酸的分子量是131[FAB-MS m/z132(M+H)+]，1H-NMR譜[D2O，270MHz；化學(xué)位移δ(ppm)]在1.18(6H，dd，J＝7.0Hz)，2.38(1H，dq，J＝4.8，7.0Hz)，2.87(3H，S)和3.55(1H，d，J＝4.8Hz)，因而假定它是N-甲基纈氨酸。然后，把這種氨基酸與N-甲基-DL-纈氨酸(可從Sigma公司買到)的可靠樣品比較，發(fā)現(xiàn)其1H-NMR譜(化學(xué)位移)和在纖維素TLC[溶劑正丁醇∶吡啶∶乙酸∶水(15∶10∶3∶12)]上觀察到的未知氨基酸-2 Rf值(0.71)完全與用可靠樣品得到的結(jié)果相同，因此，未知氨基酸被鑒別為N-甲基纈氨酸。
此外，把用80％丙酮從Sepabead，SP207柱洗脫的并含有未知氨基酸-3的組分濃縮，并裝到Dowex 50wx-8柱上(H+型，1ml)。用1N鹽酸溶液將其洗脫后，將得到的洗脫液濃縮至干，得到3.5mg未知氨基酸-3鹽酸化物白色粉末。發(fā)現(xiàn)該氨基酸的分子量是179[FAB-MSm/z180(M+H)+]和1H-NMR譜[D2O，270MHz；化學(xué)位移δ(ppm)]在2.78(1H，S)，3.32(2H，d，J＝6.2Hz)，3.95(1H，t，J＝6.2Hz)，7.4-7.5(5H，m)，因而假定它是N-甲基苯基丙氨酸。把該氨基酸與N-甲基-L-苯基丙氨酸的可靠樣品(可從Sigams公司買到)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其1H-NMR譜(化學(xué)位移)和在纖維素TLC[溶劑正丁醇∶吡啶∶乙酸∶水(15∶10∶3∶12)]觀察到的未知氨基酸-3的Rf值(0.82)完全與用可靠樣品觀察到的結(jié)果相同，因此，該未知氨基酸-3被鑒定為N-甲基苯基丙氨酸。實(shí)施例7WAP-8294A1、A2和A4的氨基酸分析把在實(shí)施例4得到的約30μg WAP-8294A1、A2或A4在110℃用6N HCl溶液完全水解24小時(shí)，然后濃縮并進(jìn)行氨基酸分析，結(jié)果，發(fā)現(xiàn)它們各自都含有Asp(1mole)、GIu(1mole)、Gly(1mole)、Ser(2mole)、Leu(1mole)、Orn(2mole)、Trp(1mole)、β-羥基天冬氨酸(1mole)、N-甲基纈氨酸(1mole)和N-甲基苯基丙氨酸(1mole)。實(shí)施例8構(gòu)成WAP-8294A1、A2和A4的脂肪酸的分離和它們的結(jié)構(gòu)把實(shí)施例4得到的WAP-8294A1(10mg)在110℃用6N HCl水解2小時(shí)，用乙醚萃取得到的水解產(chǎn)物，接著濃縮該醚相至干，得0.8mg白色粉末。發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)的分子量是160[FAB-MS m/z161(M+H)+]和1H-NMR譜[CDCl3，270MHz；化學(xué)位移δ(ppm)]在0.89(3H，t，J＝7.0Hz)，1.3-1.55(8H，m)，2.46(1H，dd，J＝16.5，8.8Hz)，2.58(1H，dd，J＝16.5，3.3Hz)和4.03(1H，m)，因此證實(shí)是3-羥基辛酸。把該物質(zhì)(100μg)溶于0.1ml的苯∶甲醇(8∶2)中，并通過(guò)加入一滴三甲基甲硅烷基重氮甲烷(可從Tokyo Chemical Industry Co.，Ltd購(gòu)買)在室溫10分鐘將其轉(zhuǎn)化成其甲酯。當(dāng)把該甲酯衍生物進(jìn)行EI-MS測(cè)定時(shí)，觀察到在m/z 173(M+-1)有一個(gè)離子峰、碎片離子峰在156(M+-18)，143(M+-31)和125(M+-31-18)以及由3-羥基脂肪酸甲酯的C3-C4的斷裂產(chǎn)生的特征基本碎片離子峰在m/z103，因此，鑒定該物質(zhì)是3-羥基辛酸。
用上述相同的方法，把WAP-8294A2(10mg)用酸水解，接著用乙醚萃取，濃縮該醚相至干，得到0.9mg白色粉末。發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)的分子量是174[FAB-MS m/z175(M+H)+]及1H-NMR譜[CDCl3，270MHz；化學(xué)位移δ(ppm)]在0.87(6H，d，J＝6.6Hz)，1.15-1.56(7H，m)，2.50(1H，dd，J＝16.5，8.8Hz)，2.60(1H，dd，J＝16.5，3.3Hz)和4.03(1H，m)和其甲酯衍生物顯示的EI-MS峰在m/z187(M+-1)，170(M+-18)，157(M+-31)，139(M+-31-18)和103(由C3-C4斷裂產(chǎn)生的基本碎片離子峰)。因此，鑒定該物質(zhì)是3-羥基-7-甲基辛酸。
用上述所用的相同方法，把WAP-8294A4(10mg)用酸水解，接著用乙醚萃取，濃縮醚相至干，得到0.8mg白色粉末。發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)的分子量為188[FAB-Ms m/z189(M+H)+及1H-NMR譜[CDCl3，270MHz；化學(xué)位移δ(ppm)]在0.80(6H，d，J＝6.8Hz)，1.15-1.6(9H，m)，2.43(1H，dd，J＝16.5，8.8Hz)，2.50(1H，dd，J＝16.5，3.3Hz)和3.95(1H，m)和其甲酯衍生物顯示的EI-MS峰在m/z 201(M+-1)，184(M+-18)，171(M+-31)，153(M+-31-18)和103(由C3-C4的斷裂產(chǎn)生的基本碎片離子峰)。因此，鑒定該物質(zhì)是3-羥基-8-甲基壬酸。
另外，以上述所用的相同方法，分別取5mg WAP-8294AX-9和AX-13進(jìn)行酸完全水解，然后把得到的水解產(chǎn)物進(jìn)行氨基酸分析。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)WAP-8294AX-9含有ASP(1mole)、Glu(1mole)、Gly(1mole)、Ser(2mole)、Leu(1mole)、Trp(1mole)、Orn(2mole)、Phe(1mole)，N-甲基纈氨酸(1mole)和β-羥基天冬氨酸(1mole)；WAP-8294AX-13含有ASP(1mole)、Glu(1mole)、β-Ala(1mole)、Ser(2mole)、Leu(1mole)、Trp(1mole)、Orn(2mole)，N-甲基苯基丙氨酸(1mole)，N-甲基纈氨酸(1mole)和β-羥基天冬氨酸(1mole)。實(shí)施例12WAP-8294AX-8、AX-9、AX-13的脂肪酸分析將實(shí)施例10得到的WAP-8294AX-8、AX-9和AX-13(各1mg)在110℃用6N HCl水解2小時(shí)。用乙醚萃取每一水解產(chǎn)物，接著濃縮醚相至干，把殘余物溶于0.1ml的苯∶甲醇(8∶2)中，并通過(guò)加入一滴三甲基甲硅烷基重氮甲烷(可從Tokyo Chemical Industry Co.，Ltd.買到)在室溫下10分鐘轉(zhuǎn)化成其甲酯。把每一甲酯衍生物進(jìn)行GC-Ms分析[柱子DB-5(內(nèi)徑0.25mm；長(zhǎng)度30m；膜厚度0.25μm；可從J&W Company買到)；溫度100-240℃(加熱速度10℃/分鐘)；氣相氦；流速0.993ml/分鐘]?？傊贕C分析中的保留時(shí)間(9.7分鐘)和由EI-MS測(cè)定的m/z 187(M+-1)、170(M+-18)、157(M+-31)、139(M+-31-18)和103(源于C3-C4的斷裂產(chǎn)生的；特征基本碎片離子峰)都與對(duì)3-羥基-7-甲基辛酸(構(gòu)成WAP-8294A2的脂肪酸)的甲酯衍生物觀察到的結(jié)果一致。這表明，所有的WAP-8294AX-8、AX-9和AX-13都含有3-羥基-7-甲基辛酸作為它們的脂肪酸組分。實(shí)施例13WAP-8294A的藥物制劑WAP-8294A的藥物制劑的典型例子描述如下注射液根據(jù)第12版日本藥典中的制劑“注射液”的通則規(guī)定的規(guī)則，把40mg WAP-8294A鹽酸化物溶于3ml滅菌的生理鹽水(日本藥典)中，無(wú)菌地引入到3ml體積的安瓿中，熔封得到注射液。片劑按照制備“片劑”的通則規(guī)定的規(guī)則，在100mg WAP-8294A2鹽酸化物中加入65mg乳糖(日本藥典)和14.2mg淀粉(日本藥典)作為賦形劑；20mg聚乙烯吡咯烷酮K25(日本藥典)作為粘結(jié)劑；和0.8mg硬酯酸鎂(日本藥典)作為潤(rùn)滑劑，接著均勻混合，用壓片機(jī)模壓，得到未包衣的片劑，每片重200mg。軟膏按照制劑“軟膏”的通則規(guī)定的規(guī)則，在40mg WAP-8294A2鹽酸化物中加入1.2g聚乙二醇4000(日本藥典)、600mg聚乙二醇400(日本藥典)、156mg親水的凡士林(日本藥典)、0.8mg對(duì)羥苯甲酸丙酯(日本藥典)和3.2mg對(duì)羥苯甲酸乙酯(日本藥典)作為殺真菌劑，接著加熱熔化并均勻混合，得到一種軟膏(4g/可擠的膠管)。滴眼劑按照制劑“滴眼劑”的通則規(guī)定的規(guī)則，把25mg WAP-8294A2鹽酸化物溶于5ml 0.9％滅菌氯化鈉溶液中，然后把0.5mg氯化苯甲烴銨(日本藥典)作為防腐劑加入其中，得到一種均勻的溶液，接著滅菌過(guò)濾并滅菌包裝到5ml體積的點(diǎn)眼瓶中，得到一種滴眼劑。
如上所述，通過(guò)使用小的動(dòng)物感染模式，說(shuō)明本發(fā)明的新穎的抗生素WAP-8294A對(duì)由革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，特別是MRSA(抗甲氧苯青霉素的金黃色釀膿葡萄球菌)感染引起的感染性疾病有很好的治療效果，這種感染疾病目前在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域變成一個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題。因此，對(duì)于治療包括由感染性細(xì)菌革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的傳染引起的MRSA感染性疾病在內(nèi)的疾病，該抗生素會(huì)是很有效的。
權(quán)利要求
1.一種具有下列物理化學(xué)性質(zhì)的抗生素WAP-8294A或其藥用鹽(1)外觀白色粉末；(2)熔點(diǎn)213-220℃(分解)；(3)溶解性溶于水，甲醇，正丁醇，二甲基甲酰胺和二甲亞砜，不溶于丙酮，乙酸乙酯和氯仿；(4)顏色反應(yīng)在茚三酮，艾氏菌素，Rydon-Smith，高錳酸鉀水溶液，硫酸和碘蒸汽反應(yīng)中呈陽(yáng)性，并且用紫外燈發(fā)出的254nm的光線進(jìn)行照射顯示出驟熄斑；在Molisch反應(yīng)，硝酸銀反應(yīng)，氯化鐵反應(yīng)和Dragendorff氏反應(yīng)中呈陰性；(5)高效液相色譜的保留時(shí)間4.0至6.1分鐘，8.0分鐘，11.1分鐘，12.5分鐘，16.5分鐘，17.9分鐘和18.8分鐘；(6)紫外吸收光譜(在水中)λmax275nm，280nm，287nm；(7)紅外吸收光譜(FT-IR，KBr)特征吸收譜3300cm-1，1720-1715cm-1，1636cm-1，1541cm-1，1404cm-1，1207cm-1，1137cm-1；(8)1H-NMR譜(270MHz，D2O)觀察到復(fù)雜的、源于甲基、亞甲基、次甲基、和雜環(huán)或芳環(huán)的質(zhì)子信號(hào)；(9)分子量1,400-1,700；(10)有機(jī)化合物的定性試驗(yàn)(鈉熔融法)該抗菌素是含有碳、氫、氧和氮元素的化合物；(11)作為茚三酮陽(yáng)性物質(zhì)酸完全水解提供，Asp，Glu，Gly，Leu，Ser，Trp，Orn，N-甲基α-氨基異戊酸，β-羥基天冬氨酸和N-甲基苯基丙氨酸；(12)旋光率[α]D20＝+42°(C＝0.5，H2O)；(13)堿性、酸性和中性分類兩性。
2.一種具有下列物理化學(xué)性質(zhì)的抗生素WAP-8294AX或其藥用鹽(1)外觀白色粉末(2)熔點(diǎn)196-200℃(分解)；(3)溶解性溶于水，甲醇，正丁醇，二甲基甲酰胺和二甲亞砜，不溶于丙酮，乙酸乙酯和氯仿；(4)顏色反應(yīng)在茚三酮，艾氏菌素，Rydon-Smith，高錳酸鉀水溶液，硫酸和碘蒸汽反應(yīng)中呈陽(yáng)性，用從紫外燈發(fā)出的254nm的光線照射顯示出驟熄斑；在Molisch，硝酸銀，氯化鐵和Dragendorff氏反應(yīng)中呈陰性；(5)高效液相色譜的保留時(shí)間5.3分鐘，5.9分鐘，6.2分鐘，6.5分鐘，6.9分鐘，7.3分鐘，8.1分鐘，9.3分鐘，9.8分鐘，11.3分鐘，12.1分鐘，13.7分鐘和15分鐘；(6)紫外吸收光譜(在水中)λmax273nm，280nm，289nm；(7)紅外吸收光譜(FT-IR，KBr)特征吸收譜3300cm-1，1720-1715cm-1，1636cm-1，1541cm-1，1404cm-1，1207cm-1，1137cm-1；(8)1H-NMN核磁共振譜(270MHz，DMSO-D6)觀察到復(fù)雜的、源于甲基、亞甲基、次甲基和雜環(huán)或芳環(huán)的質(zhì)子信號(hào)；(9)分子量1,400-1,700；(10)有機(jī)化合物定性試驗(yàn)(鈉熔融法)該抗菌素是含有碳、氫、氧和氮元素的化合物；(11)作為茚三酮陽(yáng)性物質(zhì)和脂肪酸酸完全水解提供Asp，Glu，Gly，β-ALa，Leu，Ser，Trp；Orn，Val，N-甲基纈氨酸，β-羥基天冬氨酸，Phe，N-甲基苯基丙氨酸和3-羥基-7-甲基辛酸；(12)旋光率[α]D20＝+24°(C＝0.5，H2O)；(13)堿性、酸性和中性分類兩性。
3.一種制備權(quán)利要求1或2的抗生素WAP-8294A的方法，該方法包括在一培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種屬于溶菌(Lysobactor)屬并具有產(chǎn)生如權(quán)利要求1或2的抗生素WAP-8294A的微生物以生產(chǎn)該抗生素和在該培養(yǎng)基中富集該抗生素；然后回收該抗生素。
4.一種屬于溶菌(lysobactor)屬并具有生產(chǎn)抗生素WAP-8294A能力的微生物。
5.權(quán)利要求4的微生物，其中該微生物是溶菌SP.WAP-8294(Lysobacter SP.WAP-8294)。
6.一種抗菌組合物，該組合物包括至少一個(gè)選自由 1或2所述的抗生素WAP-9284A組成的一組抗生素和其藥用鹽。
全文摘要
本文公開(kāi)了用一種屬于溶菌(Lysobacter)屬的菌株產(chǎn)生的抗生素WAP－8294A和AX或其藥用鹽;一種生產(chǎn)上述抗生素WAP－8294A的方法,該方法包括在一培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種屬于溶菌屬并具有生產(chǎn)抗生素WAP－8294A的微生物來(lái)生產(chǎn)該抗生素及在該培養(yǎng)基中富集該抗生素;然后回收該抗生素等步驟;以及一種包括該抗生素或其藥用鹽的抗菌組合物。這種新型的抗生素WAP－8294A對(duì)于由格蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌,尤其是MRSA感染引發(fā)的感染疾病有極好的效果,因此,該抗生素對(duì)于治療包括MRSA在內(nèi)的由格蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌感染而引發(fā)的疾病是非常有效的。
文檔編號(hào)C07K14/195GK1357631SQ0111962
公開(kāi)日2002年7月10日 申請(qǐng)日期2001年5月15日 優(yōu)先權(quán)日1995年2月2日
發(fā)明者大橋良民, 平田晴久, 中谷清吾, 加藤阿斯莎, 相場(chǎng)勇志, 小久保直美, 鈴木信之, 前田孚 申請(qǐng)人:日本醫(yī)學(xué)研究公司