專利名稱：富含紅花明苷a的紅花黃色素、其制備方法和含有它們的制劑及醫(yī)藥用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種富含紅花明苷A的紅花黃色素及其制備方法，本發(fā)明還涉及該紅花黃色素作為有效成分制備治療心腦缺血疾病藥物的用途，此外，本發(fā)明還涉及了含有該紅花黃色素的藥物制劑及它們的制法。
背景技術：
紅花為菊科植物紅花(Carthamus tinctorius L.)的干燥花，是常用的活血化瘀類中藥，紅花黃色素是紅花中具有活血化瘀作用的水溶性黃酮類化合物。有關紅花黃色素的制備及化學組成報道不一，最早的文獻報道采用纖維素柱層析將紅花的水提物層析，分為棕黑色粉末的紅花黃色素I、棕色粉末的紅花黃色素II、黃棕色粉末的紅花黃色素III以及棕色糖漿狀物的紅花黃色素IV四個柱層析段(見《山西醫(yī)藥雜志》1980年第9卷第1期第2-8頁)。陸正武等報道了含有75％的紅花明苷A和15％紅花黃色素III，余量為紅花黃色素II和IV組成的紅花黃色素，并提出紅花明苷A的化學結構與Onodera等1981年報道的safflomin A一致，但對其制備方法未公開報道(見《中國藥理學報》1991年第12卷第6期第537-542頁)。對紅花總黃色素的藥理作用也有許多報道，如陸正武等報道的紅花總黃色素對免疫功能的抑制作用(見《中國藥理學報》1991年第12卷第6期第537-542頁)；黃正良等報道了紅花總黃色素的降壓作用(見《中成藥研究》1986年第7期第27-29頁)和較強而持久的鎮(zhèn)痛效應(見《中草藥》1984年第15卷第8期第12-14頁)，此外還有抗血栓形成和抗缺氧等作用。高其銘報道了紅花對大鼠頸動脈結扎后造成急性缺血缺氧性腦損害有明顯保護作用(見《中西醫(yī)結合雜志》1984年第4卷第12期第758-760頁)。文獻報道的紅花總黃色素的提取和分離方法是水提醇沉后，通過SephadeLH-20柱層析，水為洗脫劑，反復處理純化得到的紅花總黃色素(見《中草藥》1990年第21卷第4期第44-45頁)。盡管CN1272500A中也公開了一種紅花黃色素及其提取方法和用于治療或預防多種心腦血管疾病的用途，但是經(jīng)我們進行測定發(fā)現(xiàn)該發(fā)明中所述提取方法制備的紅花黃色素中紅花明苷A的含量較低。本發(fā)明人在研究中驚奇地發(fā)現(xiàn)，紅花明苷A在紅花黃色素中的含量對其在保護和治療心腦缺血疾病的作用上有直接影響，因而研制成一種對預防和治療心腦缺血疾病有更好療效的富含紅花明苷A的紅花黃色素從而完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種富含紅花明苷A的紅花黃色素及其制備方法和其在制備治療和預防心腦缺血藥物方面的用途。
本發(fā)明的紅花黃色素中紅花明苷A的含量大于等于80％而小于100％(重量)，優(yōu)選為紅花黃色素中紅花明苷A的含量大于等于90％而小于100％，其中本發(fā)明紅花黃色素中的其余成分為其它色素。
本發(fā)明的紅花黃色素是可以通過下列方法得到的1)將紅花用水冷浸24小時或煎煮回流提取50-90分鐘，然后過濾，把濾液濃縮至相對密度為1.10-1.25；2)將濃縮液中加入乙醇至含醇量80％，并不斷攪拌，在4℃沉淀24小時，過濾除去沉淀，取上清液，揮凈乙醇并濃縮至相對密度為1.15-1.203)向濃縮液中加入5-10倍的水，在4℃沉淀12-24小時，離心除去沉淀；4)將上述離心液經(jīng)大孔吸附樹脂柱層析，先用去離子水洗脫至Molish反應和茚三酮反應呈陰性，然后繼續(xù)用去離子水洗脫4-6個柱體積并收集洗脫液；5)將上述洗脫液經(jīng)聚酰胺吸附，極性溶劑洗脫，收集洗脫液，在60℃減壓濃縮除去洗脫溶劑，把剩余水溶液冷凍干燥或噴霧干燥，得到桔黃色無定形粉末，即紅花黃色素。
本方法優(yōu)選為取紅花生藥加入其重量10-15倍的水，煮沸50分鐘，過濾，將濾液濃縮至相對密度為1.25，加乙醇至含醇量80％，在4℃沉淀24小時，過濾，濾液濃縮至相對密度1.20，加10倍量的水，在4℃沉淀24小時，離心，取上清液，用重量為其40％(生藥量)的大孔吸附樹脂吸附，用去離子水洗脫3個柱體積，然后繼續(xù)用去離子水洗脫5個柱體積，收集洗脫液，用重量為其10％(生藥量)的聚酰胺吸附，先用去離子水洗至無色，然后用95％乙醇洗8個柱體積，收集洗脫液，旋轉蒸發(fā)器上濃縮除去乙醇，冷凍干燥得到紅花黃色素。
由于上述方法中用水作提取溶劑，無毒，吸附劑吸附，乙醇洗脫，其中所用溶媒為水和乙醇，都屬于常規(guī)易得的溶媒，設備也是常用設備，所以該方法的優(yōu)點為成本低、步驟簡單、能耗少、生產(chǎn)安全而無污染，所以有較強的工業(yè)使用性；且本發(fā)明能夠使紅花黃色素中紅花明苷的含量達到80％以上，這也是以前技術尚未報道的，由于紅花明苷A含量的增加，從而提高了藥物療效，滿足了人們用藥的需求。
當然上述方法并不是唯一的，只是一種非限定性的舉例，本發(fā)明也包括了其他任何使紅花明苷A在紅花黃色素中的比例大于或等于80％而小于100％的任何提取方法。
本發(fā)明所述的紅花黃色素在治療和預防心腦缺血疾病的功效明顯優(yōu)于現(xiàn)有技術中所述的紅花注射液的療效(見試驗例2)。經(jīng)試驗證實，本發(fā)明的紅花黃色素的半數(shù)致死量為5g/kg，在治療心腦缺血方面，對大鼠的有效劑量為5-8mg/kg，對人的有效劑量為0.5-2mg/kg。本發(fā)明所述的紅花黃色素在制備治療和預防心腦缺血的藥物具有新用途。
本發(fā)明所述的紅花黃色素作為有效成分可以與藥學上可接受的輔料制成各種劑型的藥物，如注射液、大輸液、注射用無菌凍干粉針劑、片劑、膠囊或口服液等。
本發(fā)明所述的紅花黃色素的注射液的制備，就是將有效量的紅花黃色素用注射用水溶解，經(jīng)截留分子量為10000道爾頓的中空纖維膜超濾以除菌及除去熱原，灌裝封口即得。
本發(fā)明紅花黃色素的無菌凍干粉針劑的制備是選用注射用水溶液支持劑如甘露醇、低分子右旋糖苷、蔗糖等藥用輔料以確保本制劑的速溶性。將有效量的紅花黃色素和支持劑經(jīng)用注射用水溶解，經(jīng)截留分子量為10000道爾頓的中空纖維膜超濾以除菌及除去熱原，灌裝，然后先預凍至-55-35℃，保溫1-4小時，開始抽真空，在15-30小時內(nèi)，將溫度升至10-30℃，繼續(xù)抽真空3-10小時即制成。
本發(fā)明紅花黃色素的片劑和膠囊劑各組份總量配比為紅花紅色素10-15份，糊精30-40份、淀粉50-60份、乳糖5份、磷酸氫鈣2-4份、硬脂酸鎂1.5-3份，采用常規(guī)的壓片法制成片劑或者將上述組分裝入膠囊制成膠囊劑。其中優(yōu)選為把紅花黃色素10份、糊精30份、淀粉30份、乳糖5份、碳酸氫鈣2份和硬脂酸鎂1.5份混合均勻，加入水沸騰制粒，過篩整粒，把小于14目的顆粒裝入膠囊中制成膠囊，大于14目的加入硬脂酸鎂制成片劑；再優(yōu)選為把紅花黃色素15份、糊精40份、淀粉60份、乳糖5份、碳酸氫鈣4份和硬脂酸鎂3份混合均勻，加入水沸騰制粒，過篩整粒，把小于14目的顆粒裝入膠囊中制成膠囊，大于14目的加入硬脂酸鎂制成片劑。
以下通過實施例和試驗例對本發(fā)明作進一步的說明，但本發(fā)明并不受限于該實施例，在這些實施例中除另有說明，其所有份數(shù)和配比均按重量計。
實施例1取紅花生藥，加入其重量10-15倍水，煮沸90分鐘，過濾，濾液減壓濃縮至相對密度為1.12，加乙醇至含醇量為80％，4℃沉淀24小時，過濾，濾液濾液濃縮至相對密度為1.15，加10倍量的水，4℃沉淀12小時，離心，取上清液，用重量為其30％的D101大孔吸附樹脂吸附，用去離子水洗脫2個柱體積，然后繼續(xù)用去離子水洗脫4個柱體積，收集洗脫液，用重量為其5％的聚酰胺吸附，先用去離子水洗至無色，然后用95％乙醇洗8個柱體積，收集洗脫液，旋轉蒸發(fā)器上濃縮除去乙醇，冷凍干燥得到紅花黃色素，測其中紅花明苷A的含量85％。
實施例2取紅花生藥，加入其重量10-15倍水，煮沸70分鐘，過濾，濾液減壓濃縮至相對密度為1.20，加乙醇至含醇量為80％，4℃沉淀24小時，過濾，濾液濾液濃縮至相對密度為1.10，加10倍量的水，4℃沉淀24小時，離心，取上清液，用重量為其40％的D101大孔吸附樹脂吸附，用去離子水洗脫3個柱體積，然后繼續(xù)用去離子水洗脫5個柱體積，收集洗脫液，用重量為其10％的聚酰胺吸附，先用去離子水洗至無色，然后用95％乙醇洗8個柱體積，收集洗脫液，旋轉蒸發(fā)器上濃縮除去乙醇，冷凍干燥得到紅花黃色素，測紅花明苷A的含量為90％。
實施例3取紅花生藥，加入其重量10-15倍水，煮沸50分鐘，過濾，濾液減壓濃縮至相對密度為1.25，加乙醇至含醇量為80％，4℃沉淀24小時，過濾，濾液濾液濃縮至相對密度為1.20，加10倍量的水，4℃沉淀24小時，離心，取上清液，用重量為其40％的D101大孔吸附樹脂吸附，用去離子水洗脫3個柱體積，然后繼續(xù)用去離子水洗脫5個柱體積，收集洗脫液，用重量為其10％的聚酰胺吸附，先用去離子水洗至無色，然后用95％乙醇洗8個柱體積，收集洗脫液，旋轉蒸發(fā)器上濃縮除去乙醇，冷凍干燥得到紅花黃色素，測紅花明苷A的含量為98％。
實施例4無菌凍干粉針劑的制備取上述實施例1所得到的紅花紅色素10g，藥用甘露醇40g，溶于2000ml的注射用蒸餾水，經(jīng)截留分子量為10000道爾頓的中空纖維膜超濾以除菌除熱原，灌裝1000支，無菌凍干即得。
實施例5取上述實施例2所得到的紅花黃色素10g，藥用右旋糖苷20g，溶于2000ml的注射用蒸餾水，經(jīng)截留分子量為10000道爾頓的中空纖維膜超濾以除菌除熱原，灌裝1000支，無菌凍干即得。
實施例6取上述實施例3所得到的紅花紅色素10g，藥用乳糖40g，溶于2000ml的注射用蒸餾水，經(jīng)截留分子量為10000道爾頓的中空纖維膜超濾以除菌除熱原，灌裝1000支，無菌凍干即得。
實施例7取上述實施例1所得到的紅花紅色素10g，溶于2000ml的注射用蒸餾水，經(jīng)截留分子量為10000道爾頓的中空纖維膜超濾以除菌除熱原，灌裝1000支即得。
實施例8取上述實施例3所得到的紅花紅色素30g，溶于250L的生理鹽水中，經(jīng)截留分子量為10000道爾頓的中空纖維膜超濾以除菌除熱原，灌裝1000瓶即得。
實施例9取上述實施例2所得到的紅花紅色素10份，糊精30份、淀粉50份，乳糖5份，碳酸氫鈣1.5份，混合，加入水沸騰制粒，過篩整粒，把小于14目的顆粒裝入膠囊殼中制成膠囊，大于14目的加入硬脂酸鎂制成片劑。
實施例10取上述實施例3所得到的紅花紅色素15份，糊精40份，淀粉60份，乳糖5份，碳酸氫鈣4份，硬脂酸鎂3份，混合，加入水沸騰制粒，過篩整粒，把小于14目的顆粒裝入膠囊殼中制成膠囊，大于14目的加入硬脂酸鎂制成片劑。
試驗例1.本發(fā)明實施例1的制備方法與現(xiàn)有技術的比較試驗材料和條件聚酰胺層析法制備的紅花黃色素按照CN 1272500A中實施例2所述的聚酰胺層析法制備的紅花黃色素，其中選用的聚酰胺為常州永慶化工廠生產(chǎn)，規(guī)格60目。
硅膠吸附法制備的紅花黃色素按照CN 1272500A中實施例5所述的硅膠吸附法制備的紅花黃色素。
大孔樹脂吸附法制備的紅花黃色素按照CN 1272500A中實施例8所述的大孔樹脂吸附法制備的紅花黃色素，其中選用的大孔樹脂為D-101，南開大學化工廠生產(chǎn)。
薄層鑒別聚酰胺薄層板浙江臺州市路橋四甲生化塑料廠展開劑30％醋酸Rf＝0.7高效液相檢測對照品的來源紅花明苷A對照品由山東省天然藥物工程技術研究中心從紅花中分離得到，采用紫外、紅外、質譜、核磁等方法確證了結構，其高效液相純度大于98％。
色譜條件儀器SpectraSYSTEM1000色譜泵；Spectra100紫外檢測器(TSP公司；U.S.A)；CHROMTEK分析之星工作站；色譜柱DiscoveryC18(25cm×4.6mm；5 micron)；甲醇-乙腈-0.2％磷酸(345∶25∶630)為流動相；檢測波長為400nm。
線性關系及線性范圍考察經(jīng)實驗考察，紅花明苷A在0.058～1.74μg濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關系，r＝0.9997。
測定方法和結果測定法對照品溶液的制備精密稱取紅花明苷A對照品，加水制成每1ml含0.04mg的溶液，即得。
供試品溶液的制備取所得樣品各約4mg，精密稱定，分別置100ml量瓶中，加水適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。
分別精密吸取上述對照品溶液和供試品溶液各20μl，注入液相色譜儀，測定，即得。測定結果見表1，薄層色譜層析圖見

圖1。
表1不同提取方法制備的紅花黃色素中紅花明苷A的含量測定

不同提取方法制備的紅花黃色素在聚酰胺薄層板展開后的顯色圖情況見附圖(1)。
附圖(1)中，1表示按照CN 1272500A中實施例2所述的聚酰胺層析法制備的紅花黃色素；2表示按照CN 1272500A中實施例8所述的大孔樹脂吸附法制備的紅花黃色素；3表示按照CN 1272500A中實施例5所述的硅膠吸附法制備的紅花黃色素；4表示本發(fā)明方法所分離的黃色素；5表示紅花明苷A的對照品。
結論通過上述實驗結果可以看出本發(fā)明所得到的紅花黃色素中紅花明苷A的含量明顯高于使用其它方法所得到的紅花黃色素中紅花明苷A的含量。
試驗例2對大鼠血栓形成的影響動物Westar大鼠雌雄各半。
藥物空白對照組(注射用生理鹽水)，紅花注射液(參照中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準WS3-B-3825-98的方法制備)，實施例7所述的注射液(含80％紅花明苷A)、實施例8所述的注射液(含98％紅花明苷A)。
方法大鼠32只，分成靜脈注射NS組、紅花注射液組、本發(fā)明藥物兩組，每組8只。參照Umetsu法，大鼠腹腔注射戊巴比妥(30mg/kg)分離叉頸總動脈和左頸外靜脈，用50μ/ml肝素生理鹽水充滿三段連接的聚乙烯管，管中放入長7cm的4號手術絲線，管兩端先后插入左頸外靜脈和叉頸總動脈，靜脈給藥或NS后，立即放開動脈夾，使血液流通。15分鐘后中斷血流，取出絲線稱血栓濕重。按下列公司計算血栓的抑制率

結果見表2。
表2

從表2中可以看出，本發(fā)明的紅花黃色素在抑制體內(nèi)、體外血栓的形成優(yōu)于現(xiàn)有的紅花注射液，并且隨著紅花明苷A的含量的增加，功效也提高。
同時，我們通過對大鼠腦缺血后，動物行為進行觀察發(fā)現(xiàn)缺血組(對照組)神經(jīng)癥狀分數(shù)顯著高于假手術組，紅花明苷A可明顯改善其神經(jīng)癥狀，與已有技術藥物注射液相比，有顯著性差異，且呈含量依賴性。
我們也通過對大鼠腦缺血24小時后，腦組織出現(xiàn)的明顯缺血區(qū)面積進行觀察，其缺血區(qū)面積達全腦的15％，腦缺血后給予含有不同濃度紅花明苷A的紅花黃色素藥物治療，24小時后進行觀察，本發(fā)明實施例7所述的注射液(含80％紅花明苷A)以3mg/kg的劑量給藥可減少壞死面積50％以上，比已有紅花注射液的治愈率高20％，且呈劑量依賴性。
權利要求
1.一種紅花黃色素，其特征在于紅花明苷A在紅花黃色素中的含量大于等于80％而小于100％(重量)。
2.根據(jù)權利要求1所述的紅花黃色素，其中紅花明苷A在紅花黃色素中的含量大于等于90％而小于100％(重量)。
3.一種制備權利要求1所述的紅花黃色素的方法，它包括下列步驟1)將紅花用水冷浸24小時或煎煮回流提取50-90分鐘，然后過濾，把濾液濃縮至相對密度為1.10-1.25；2)將濃縮液中加入乙醇至含醇量80％，并不斷攪拌，在4℃沉淀24小時，過濾除去沉淀，取上清液，揮凈乙醇并濃縮至相對密度為1.15-1.203)向濃縮液中加入5-10倍的水，在4℃沉淀12-24小時，離心除去沉淀；4)將上述離心液經(jīng)大孔吸附樹脂柱層析，先用去離子水洗脫至Molish反應和茚三酮反應呈陰性，然后繼續(xù)用去離子水洗脫4-6個柱體積并收集洗脫液；5)將上述洗脫液經(jīng)聚酰胺吸附，極性溶劑洗脫，收集洗脫液，在60℃減壓濃縮除去洗脫溶劑，把剩余水溶液冷凍干燥或噴霧干燥，得到桔黃色無定形粉末，即紅花黃色素。
4.根據(jù)權利要求3所述的紅花黃色素的制備方法，它包括取紅花生藥加入其重量10-15倍的水，煮沸50分鐘，過濾，將濾液濃縮至相對密度為1.25，加乙醇至含醇量80％，在4℃沉淀24小時，過濾，濾液濃縮至相對密度1.20，加10倍量的水，在4℃沉淀24小時，離心，取上清液，用重量為其40％(生藥量)的大孔吸附樹脂吸附，用去離子水洗脫3個柱體積，然后繼續(xù)用去離子水洗脫5個柱體積，收集洗脫液，用重量為其10％(生藥量)的聚酰胺吸附，先用去離子水洗至無色，然后用95％乙醇洗8個柱體積，收集洗脫液，旋轉蒸發(fā)器上濃縮除去乙醇，冷凍干燥得到紅花黃色素。
5.一種含有權利要求1或2所述的紅花黃色素的藥物。
6.根據(jù)權利要求5所述的藥物，其中藥物的劑型為注射液。
7.根據(jù)權利要求6所述的藥物，其中注射液可由下列方法制得將有效量的紅花黃色素用注射用水溶解，經(jīng)截留分子量為10000道爾頓的中空纖維膜超濾以除菌除熱原，灌裝封口即得。
8.根據(jù)權利要求5所述的藥物，其中該藥物的劑型為無菌凍干粉針劑。
9.根據(jù)權利要求8所述的藥物，其無菌凍干粉針劑可由下列方法制得將有效量的紅花黃色素和支持劑用注射用水溶解，經(jīng)截留分子量為10000道爾頓的中空纖維膜超濾以除菌除熱原，灌裝，放入凍干機后先預凍至-55℃～-35℃，保溫1-4小時，開始抽真空，在15-30小時內(nèi)，將溫度升至10℃～30℃，繼續(xù)抽真空3-10小時即制成。
10.根據(jù)權利要求9所述的藥物，其中支持劑為甘露醇、低分子右旋糖苷或蔗糖。
11.根據(jù)權利要求5所述的藥物，其中該藥物的劑型為片劑或膠囊劑。
12.根據(jù)權利要求11所述的藥物，其片劑或膠囊劑可由下列方法制得紅花黃色素10-15份，糊精30-40份，淀粉50-60份，乳糖5份，磷酸氫鈣2-4份，硬脂酸鎂1.5-3份；采用常規(guī)的壓片法制成片劑或者將上述組份裝入膠囊制成膠囊劑。
13.根據(jù)權利要求12所述的藥物，其片劑或膠囊可由下列方法制得把紅花黃色素10份、糊精30份、淀粉30份、乳糖5份、碳酸氫鈣2份和硬脂酸鎂1.5份混合均勻，加入水沸騰制粒，過篩整粒，把小于14目的顆粒裝入膠囊中制成膠囊，大于14目的加入硬脂酸鎂制成片劑。
14.根據(jù)權利要求12所述的藥物，其片劑或膠囊可由下列方法制得把紅花黃色素15份、糊精40份、淀粉60份、乳糖5份、碳酸氫鈣4份和硬脂酸鎂3份混合均勻，加入水沸騰制粒，過篩整粒，把小于14目的顆粒裝入膠囊中制成膠囊，大于14目的加入硬脂酸鎂制成片劑。
15.根據(jù)權利要求5所述的藥物，其中該藥物劑型為大輸液。
16.根據(jù)權利要求16所述的藥物，其大輸液可由下列方法制得將有效量的紅花黃色素用生理鹽水溶解，經(jīng)截留分子量為10000道爾頓的中空纖維膜超濾以除熱原除菌，灌裝即得。
17.根據(jù)權利要求1或2所述的紅花黃色素在制備治療或預防心腦缺血藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種富含紅花明苷A的紅花黃色素,其中紅花明苷A的含量大于等于80%而小于100%;本發(fā)明還公開了富含紅花明苷A的紅花黃色素的制備方法及其在制備治療或預防心腦血管缺血疾病的藥物用途;此外本發(fā)明又公開了含有這種紅花黃色素的各種藥物制劑及其制法。
文檔編號C07H1/00GK1368503SQ01131268
公開日2002年9月11日 申請日期2001年9月5日 優(yōu)先權日2000年10月30日
發(fā)明者劉珂, 傅風華, 馬成俊, 徐本明, 張達磊, 劉培利, 李桂生, 劉志峰, 朱海波 申請人:山東綠葉制藥股份有限公司