專利名稱：腫瘤壞死因子受體的親和肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤壞死因子抑制劑及其應(yīng)用，具體涉及能夠與腫瘤壞死因子受體特異結(jié)合并抑制腫瘤壞死因子活性的親和肽及其應(yīng)用。
腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是一種有多種生物學(xué)活性的免疫和炎癥介質(zhì)，其在體內(nèi)的過量表達(dá)可造成嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致血栓、低血壓、休克、組織損傷甚至死亡。腫瘤壞死因子-α的非正常表達(dá)還與一些常見的自身免疫性疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、多發(fā)性硬化癥、節(jié)段性回腸炎(Crohn’s)等有關(guān)。因此以抑制腫瘤壞死因子-α為目的的治療藥物，受到人們的廣泛關(guān)注(Andreas等，Immunology Today 18487(1997))。
通過抑制TNF-α與受體的結(jié)合是一種比較好的抑制TNF-α活性的方法。目前抑制TNF-α與受體的結(jié)合主要采用TNF-α抗體、可溶性TNF受體或TNF-α受體模擬肽，這些藥物都是通過封閉TNF上的受體結(jié)合位點(diǎn)來阻斷TNF與受體的結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)抑制TNF活性的目的。
在開發(fā)TNF-α抗體藥物的努力中，一些藥物已經(jīng)獲得成功。Centorcor公司生產(chǎn)的抗TNF-α抗體REMICADE(infliximab)于1998年8月獲FDA批準(zhǔn)用于Crohn’s的治療(van Deventer等，Aliment Pharmacl Ther 13 Suppl 43(1999)；Scand J Immunol 5118(2000))，該藥于1999年11月再次獲FDA批準(zhǔn)用于RA的治療。這是第一種用于RA治療的抗體類藥物。另外，英國BASF公司在成功實(shí)驗(yàn)了人-鼠雜合抗TNF-α抗體cA2對RA的治療之后，目前正在開展新抗體D2E7治療RA的三期臨床實(shí)驗(yàn)(Baert等，Int J Colorectal Dis 1447(1999))。
可溶性TNF-α受體對TNF的抑制作用，也同樣顯示出較好的效果。美國的Immunex公司于1993年就開始研究使用人TNFR2胞外區(qū)與IgG1Fc段融合的重組蛋白(商品名ENBREL)治療RA，并于1998年5月獲得FDA批準(zhǔn)，用于RA的臨床治療(Moreland等，Rheum Dis Clin North Am 24579(1998))。1999年5月再次獲準(zhǔn)用于青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(JRA)的治療。目前該公司正在實(shí)驗(yàn)用ENBREL治療充血性心力衰竭。
小分子的TNF結(jié)合肽也可作為拮抗劑，用于抑制TNF的活性(Lie等，Biochemical and Biophysical Research Communication 1992，188503-509；Takasaki等，Nature Biotech1997，15；1266；Chirinos-Rojas等，Journal of Immuology161；5621(1998)；Immunology 96；109(1999))。目前這類小分子肽類藥物還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。
通過與TNF結(jié)合來抑制TNF活性雖然取得一定的效果，但由于TNF在炎癥反應(yīng)中濃度較高，難以完全被抑制物結(jié)合，仍然存在殘留TNF對靶細(xì)胞的激活作用，使治療效果受到影響。TNF濃度的不確定性，也使抗TNF藥物的用量難以控制。
本發(fā)明的目的是提供一類能夠與腫瘤壞死因子受體專一結(jié)合，并能抑制腫瘤壞死因子活性的腫瘤壞死因子受體親和肽。
本發(fā)明的腫瘤壞死因子受體親和肽，它的氨基酸殘基具有以下通式；A-B-C-E-F-G-H-I-J-K-L其中，A、C均代表芳香族氨基酸；B代表組氨酸；E代表色氨酸；F代表芳香族氨基酸或含羥基氨基酸；G、H、I、J、K、L代表任意氨基酸。
在所述氨基酸殘基序列的C與E之間還可以設(shè)有氨基酸殘基D，D代表含羥基氨基酸，即絲氨酸或蘇氨酸。
A、C代表芳香族氨基酸中的一種，即色氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸，其中優(yōu)選的是色氨酸。
G代表任意氨基酸殘基，但優(yōu)選的是含羥基氨基酸，即絲氨酸或蘇氨酸。
H代表任意氨基酸殘基，但優(yōu)選的是脯氨酸。
I、J、K、L代表任意氨基酸殘基，但優(yōu)選的是含羥基氨基酸、酪氨酸、精氨酸或脯氨酸中的一種。
本發(fā)明有代表性的腫瘤壞死因子受體親和肽可以是下述多肽之一；FHWWLSPPSRVFHWSWYTPSRPSWHYSWFSPYRTSWHWTWLSEYPPPWHWSWIQNAAPNWHWSLWRPPYTL本發(fā)明的腫瘤壞死因子受體親和肽即可以多肽形式單獨(dú)存在，也可與其它蛋白或多肽融合，或插入蛋白質(zhì)表面的特定部位，如凸環(huán)區(qū)，或與其它物質(zhì)連接。
本發(fā)明的腫瘤壞死因子受體親和肽可以用多種途徑獲得，例如，按已知的多肽合成方法制備，用基因工程方法生產(chǎn)重組蛋白，以及通過其他化學(xué)改造方法進(jìn)行生產(chǎn)。下面著重說明本發(fā)明肽的融合表達(dá)和純化方法；將合成的編碼TNF受體親和肽的DNA片段與pGEX-KG載體在EcoRI/HindIII酶切位點(diǎn)處連接，并轉(zhuǎn)化E.coli RRI感受態(tài)細(xì)胞。各挑取數(shù)個單菌落進(jìn)行PCR鑒定，并測序。
將經(jīng)鑒定正確的重組菌菌液按1∶100接種于含有氨卞青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6-1.0，加入終濃度為0.1-0.5mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)3h，離心去上清，菌體可進(jìn)行純化或凍存于-20℃。將誘導(dǎo)表達(dá)的菌體按原菌液1/10的體積重懸于PBS超聲緩沖液中，在超聲破碎儀上冰浴超聲裂解；將超聲處理后的菌液于4℃，12,000r/m離心15min；其間將GlutathioneSepharose 4B親和純化樹脂用10倍柱體積的PBS平衡。將離心上清上柱，使GST-結(jié)合肽融合蛋白與樹脂結(jié)合；用10倍柱體積PBS洗去非特異結(jié)合的雜蛋白。用10mmol/L還原型谷胱甘肽洗脫目的蛋白并通過SDS-PAGE鑒定純度。
本發(fā)明的另一個目的是提供腫瘤壞死因子受體親和肽在制造抗腫瘤壞死因子藥物中的應(yīng)用。
以本發(fā)明腫瘤壞死因子受體親和肽為活性成分的藥物，含有治療有效量的本發(fā)明多肽。研究結(jié)果表明，本發(fā)明的多肽不僅能夠與TNF受體結(jié)合，還可競爭性地抑制TNF與受體的結(jié)合，并能抑制TNF對細(xì)胞的細(xì)胞毒性，為各種炎癥或相關(guān)免疫性疾病的治療提供了一條新的途徑。
需要的時候，在上述藥物中還可以含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等，必要時還可以加入香味劑、甜味劑等。
本發(fā)明的藥物可以制成片劑、粉劑、粒劑、膠囊、口服液及注射液等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
本發(fā)明的再一個目的是提供腫瘤壞死因子受體親和肽在其它領(lǐng)域的應(yīng)用。
本發(fā)明的腫瘤壞死因子受體親和肽可以作為配體，與瓊脂糖偶聯(lián)后用于TNF受體的親和純化；與指示標(biāo)簽偶聯(lián)后作為探針用于TNF受體的檢測；通過合成或基因重組的方式，將含本發(fā)明序列模式的肽段與其他蛋白或肽融合，用于以抑制TNF活性為目的的各種感染性疾病、自免疫疾病以及其他相關(guān)疾病的治療。
本發(fā)明利用噬菌體多肽展示技術(shù)，以TNF受體為靶標(biāo)，巧妙地設(shè)計出腫瘤壞死因子受體親和肽，這種親和肽通過競爭抑制TNF與受體的結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)抑制TNF活性的目的。腫瘤壞死因子受體親和肽可與TNF受體專一結(jié)合，阻斷TNF與受體的結(jié)合，抑制TNF的生物學(xué)活性，包括抑制TNF的細(xì)胞毒性以及TNF誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性。
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。


圖1-A為噬菌體展示肽與TNF受體1結(jié)合的ELISA分析圖1-B為噬菌體展示肽與TNF受體2結(jié)合的ELISA分析圖2為GST融合肽對TNF-TNFR1的競爭抑制作用圖3為噬菌體克隆抑制TNF-α對MCF-7細(xì)胞殺傷作用實(shí)施例1、具有代表性的TNF受體結(jié)合肽本發(fā)明選用以下6個具有代表性的肽，并用普通的固相合成方法進(jìn)行合成。
1號肽 FHW-WLSPPSRV2號肽 FHWSWYTPSRPS3號肽 WHYSWFSPYRTS4號肽 WHWTWLSEYPPP5號肽 WHWSWIQNAAPN6號肽 WHWSLWRPPYTL實(shí)施例2、六個具有代表性肽在噬菌體表面的展示本發(fā)明的肽通過基因重組的方法展示在M13噬菌體表面。所用克隆化的噬菌體展示肽系從New England Biolabs公司的噬菌體11、12肽庫，以TNF受體1為靶，用標(biāo)準(zhǔn)生物淘洗的方法篩選得到。
實(shí)施例3、ELISA方法檢測腫瘤壞死因子受體親和肽與TNF受體的結(jié)合用PBS將純化的可溶性腫瘤壞死因子受體1(sTNFR1)或腫瘤壞死因子受體2(sTNFR2)稀釋至5μg/ml，100μl/孔包被96孔酶聯(lián)板，4℃孵育過夜；200μl/孔加入1％的明膠或BSA，室溫孵育1h；分別在不包被孔、包被sTNFR1的孔或sTNFR2孔中加入滴度為109pfu/ml的噬菌體克隆，使其結(jié)合，并以無關(guān)噬菌體作為陰性對照，室溫結(jié)合1h，每個樣品設(shè)三個平行；用PBST(0.05-0.1％Tween)洗滌三次；加入一抗(抗pVIII多抗兔血清1∶5000-1∶8000稀釋)，100μl/孔，室溫孵育30-60min；用PBST洗滌六次；加入酶標(biāo)羊抗兔IgG(按產(chǎn)品說明書要求進(jìn)行稀釋)，100μl/孔，室溫孵育30-60min；用PBST洗滌六次；加入底物顯色系統(tǒng)A+B(現(xiàn)用現(xiàn)配)等比例混合，100μl/孔，反應(yīng)10-15min(避光)；加入終止液(1mol/L H2SO4)50或100μl/孔，測定OD450。
結(jié)果如圖1-A，1-B所示，0表示無關(guān)噬菌體，1、2、3、4、5、6分別表示1、2、3、4、5、6號肽所對應(yīng)的噬菌體克隆，用最后測得的包被孔OD450減去相應(yīng)不包被孔的OD450作圖。從圖1-A可以看出，噬菌體克隆能夠與sTNFR1特異性結(jié)合；從圖1-B可以看出，噬菌體克隆與sTNFR2結(jié)合能力較弱。ELISA結(jié)果說明本發(fā)明篩選得到TNFR1特異性的結(jié)合肽配基。
實(shí)施例4、融合肽的競爭性受體結(jié)合抑制實(shí)驗(yàn)用PBS將純化的sTNFR1稀釋至終濃度為5μg/ml，100μl/孔包被96孔酶聯(lián)板，4℃孵育過夜；200μl/孔加入1％的明膠或BSA，室溫封閉1h；分別用終濃度為20μg/ml和1mg/ml的TNF-α，與20μg/ml的實(shí)施例1中2、3、4、6號肽與谷光甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合肽混合，100μl/孔與包被在板上的sTNFR1競爭結(jié)合，以GST為陰性對照，室溫結(jié)合1h；用PBST(0.05-0.1％Tween)洗滌三次；100μl/孔加入一抗(抗GST單抗1∶2000稀釋)，室溫30-60min，用PBST洗滌六次；100μl/孔加入酶標(biāo)二抗(按說明書要求進(jìn)行稀釋)，室溫30-60min，用PBST洗滌六次；100μl/孔加入底物顯色系統(tǒng)A+B等比例混合，10-15min(避光)加入終止液(1mol/L H2SO4)50或10μl/孔；測定OD450。結(jié)果如表1所示表1 GST融合肽與不同濃度TNF-α競爭結(jié)合sTNFR1的ELISA結(jié)果，樣 品樣 品 樣 品+20μg/ml TNF-α+1mg/ml TNF-α2號肽 0.3397±0.00600.2793±0.0186 0.1920±0.00693號肽 0.9960±0.01850.8036±0.0142 0.7006±0.02774號肽 1.1640±0.01741.0370±0.0165 0.6657±0.01756號肽 0.8197±0.05200.7180±0.0170 0.5247±0.0255GST0.2140±0.00520.2477±0.0216 0.1587±0.0170從表1中可以看出，與GST對照相比，四種GST融合肽均能與sTNFR1特異性結(jié)合，不同濃度的TNF-α可以競爭它們的結(jié)合，并且呈一定的濃度梯度關(guān)系。說明通過生物淘選和富集，從噬菌體隨機(jī)十二肽庫中篩選得到了與TNFR1特異結(jié)合的結(jié)合肽，并能競爭TNF-α與TNFR1的結(jié)合。
實(shí)施例5、GST融合肽的放射性受體結(jié)合分析在可拆卸酶聯(lián)板中加入60μl封閉液(含有1％BSA的PBS)對實(shí)施例1中2、3、4、6號四種GST融合肽和GST對照進(jìn)行系列倍比稀釋，然后加入60μl/孔125I-TNF，混勻后取25μl/孔加入到包被受體的平板上，室溫反應(yīng)2.5h。用封閉液充分洗滌后，在γ計數(shù)器中測定放射強(qiáng)度，每個樣品做三個平行孔，以BSA作為對照。抑制百分?jǐn)?shù)＝[(cpmBSA-cpm樣品)/cpmBSA]×100％如圖2所示，GST融合肽都可以特異性地抑制TNF-α與sTNFR1的結(jié)合，IC50值約為70-200μmol/L。證明所篩選的親和肽能夠特異性地與TNF受體的配體結(jié)合部位結(jié)合，從而抑制TNF-α與sTNFR1的作用。
實(shí)施例6、融合肽對TNF細(xì)胞毒活性的抑制實(shí)驗(yàn)將實(shí)施例1中2、3、4、6號肽的四種噬菌體單克隆擴(kuò)增和純化，用PBS溶解，除菌后稀釋成不同濃度梯度；將MCF-7細(xì)胞5×104cells/孔，50μl/孔傳于96孔板，37℃，5％CO2貼壁生長3h；每孔中加入50μl含放線菌素D(終濃度為1μg/ml)的DMEM/5％FBS；加入50μl濃度對MCF-7細(xì)胞有不同殺傷效率的TNF-α(選用殺傷率為30％的濃度)，和50μl經(jīng)DMEM/5％FBS稀釋的不同濃度的噬菌體單克隆，每個樣品設(shè)三個平行點(diǎn)，37℃，5％CO2孵育18-24h；輕輕去掉培養(yǎng)基，用PBS洗2至3次；作為調(diào)零的孔用0.2mol/L NaOH裂解細(xì)胞，并用PBS洗2次；每孔加入100μl含0.5％結(jié)晶紫的20％乙醇溶液，37℃孵育15分鐘；倒掉染料，用自來水沖洗，盡量去除多余的結(jié)晶紫，測定OD595或每孔加入100μl 30％HAC溶解結(jié)晶紫后，測定OD595。以加TNF-和加含放線菌素D的孔作為陰性和空白對照，以野生型噬菌體M13KE作為對照，計算抑制百分?jǐn)?shù)，抑制百分?jǐn)?shù)＝[(OD樣品-ODTNF-)/(OD空白-ODTNF-)]×100。如圖3所示的結(jié)果表明，噬菌體克隆對TNF-α的活性有比較顯著的抑制作用。
權(quán)利要求
1.腫瘤壞死因子受體親和肽，它的氨基酸殘基具有以下通式A-B-C-E-F-G-H-I-J-K-L其中，A、C均代表芳香族氨基酸；B代表組氨酸；E代表色氨酸；F代表芳香族氨基酸或含羥基氨基酸；G、H、I、J、K、L代表任意氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫瘤壞死因子受體親和肽，其特征在于在所述氨基酸殘基序列的C與E之間設(shè)有氨基酸殘基D，D代表含羥基氨基酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的腫瘤壞死因子受體親和肽，其特征在于所述芳香族氨基酸A、C為色氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸中的一種，其中優(yōu)選的是色氨酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的腫瘤壞死因子受體親和肽，其特征在于所述氨基酸殘基G代表含羥基氨基酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的腫瘤壞死因子受體親和肽，其特征在于所述氨基酸殘基H代表脯氨酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的腫瘤壞死因子受體親和肽，其特征在于所述氨基酸殘基I、J、K、L代表含羥基氨基酸、酪氨酸、精氨酸或脯氨酸中的一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的腫瘤壞死因子受體親和肽，其特征在于所述親和肽為下述多肽之一FHWWLSPPSRVFHWSWYTPSRPSWHYSWFSPYRTSWHWTWLSEYPPPWHWSWIQNAAPNWHWSLWRPPYTL
8.以權(quán)利要求1所述的腫瘤壞死因子受體親和肽為活性成分的藥物。
9.以權(quán)利要求1所述的腫瘤壞死因子受體親和肽為活性成分的藥物。
10.權(quán)利要求1或2所述的腫瘤壞死因子受體親和肽在純化和檢測TNF受體中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種腫瘤壞死因子受體親和肽，它的氨基酸殘基具有以下通式A－B－C－E－F－G－H－I－J－K－L，其中，A、C均代表芳香族氨基酸；B代表組氨酸；E代表色氨酸；F代表芳香族氨基酸或含羥基氨基酸；G、H、I、J、K、L代表任意氨基酸。在所述氨基酸殘基序列的C與E之間設(shè)有氨基酸殘基D，D代表含羥基氨基酸。本發(fā)明的親和肽可以在制藥、純化和檢測TNF受體中得到廣泛應(yīng)用。
文檔編號C07K14/525GK1393474SQ0112959
公開日2003年1月29日 申請日期2001年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月28日
發(fā)明者薛沿寧, 高波, 張 杰, 鄭莉, 趙安, 王會信 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所