專利名稱：識(shí)別血小板膜糖蛋白的單克隆抗體及其在抗血栓治療中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)免疫領(lǐng)域。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及可識(shí)別血小板表面抗原的單克隆抗體，產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤，含有該單克隆抗體的抗血小板藥物及其在抗血栓治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1.血栓栓塞所引起或并發(fā)的病變，約為癌瘤的3倍之多，而且是最常見(jiàn)的死亡病因之一，是當(dāng)前嚴(yán)重危害人類健康的疾病。因此防止血栓形成，是當(dāng)代醫(yī)學(xué)研究的一個(gè)重點(diǎn)和熱點(diǎn)。作為血栓的主要組成成份，血小板在血栓的形成中起著關(guān)鍵作用。血小板在正常循環(huán)血液中處于靜息狀態(tài)。當(dāng)血管破損暴露出血管內(nèi)皮下膠原等結(jié)構(gòu)，血小板就會(huì)通過(guò)其表面膜糖蛋白直接與血漿蛋白如von Willebrand因子(vWF)結(jié)合而粘附于血管破損處內(nèi)皮下組織。粘附的血小板或當(dāng)血小板受到在凝血過(guò)程或組織損傷過(guò)程中產(chǎn)生的血小板活化劑作用時(shí)發(fā)生變形，伸出偽足，進(jìn)而釋放細(xì)胞內(nèi)顆粒內(nèi)容物。同時(shí)血小板膜糖蛋白(GP)IIb-IIIa復(fù)合物被激活形成粘附分子受體，該受體與纖維蛋白原(纖原)的結(jié)合便能促使血小板之間相互粘附、聚集成團(tuán)，最終導(dǎo)致在血管破損處形成血小板血栓(Plow EF，Ginsberg MH.Cellular adhesionGPIIb/IIIa as a prototypic adhesion receptor.Progress in Haemostasis and Thrombosis.1989；9117-124)。血小板血栓的形成在動(dòng)脈血栓栓塞性疾病，包括急性心肌梗死等冠狀動(dòng)脈血栓形成的發(fā)病過(guò)程中起重要作用，因此一類抗血小板藥物已成為包括冠心病在內(nèi)的動(dòng)脈血栓栓塞性疾病的重要治療手段(Becker RC.Thrombinantagonists and antiplatelet agents.Am J Cardiol 1992；6939E；阮長(zhǎng)耿。單克隆抗體與血栓性疾病的診斷與治療。中國(guó)科學(xué)技術(shù)前沿(中國(guó)工程院版)2001；第四卷131-145頁(yè).)。目前臨床上常用的抗血小板藥物有阿斯匹林、雙嘧達(dá)莫、噻氯匹啶等，但是這些藥物只能作用于血小板活化的某一環(huán)節(jié)，它們的療效都不如血小板受體GPIIb-IIIa拮抗劑。血小板受體GPIIb-IIIa拮抗劑直接抑制血小板聚集的最終共同途徑，阻斷纖原與血小板GPIIb-IIIa的結(jié)合就能抑制血小板聚集，使血小板血栓不能形成，從而成為臨床上強(qiáng)力、高效和特異的抗血小板藥物，顯示出良好的應(yīng)用前景。血小板受體GPIIb-IIIa拮抗劑有三類單克隆抗體，如c7E3，人工合成肽，如Eptifibatide及非肽類小分子物質(zhì)，如Tirofiban(阮長(zhǎng)耿.單克隆抗體與血栓性疾病的診斷與治療。中國(guó)科學(xué)技術(shù)前沿(中國(guó)工程院版)2001；第四卷131-145頁(yè)；Verstraete M.Synthetic inhibitors ofplatelet GPIIb/IIIa in clinical development.Circulation.2000；101(6)76-80)。
單克隆抗體(McAb，單抗)技術(shù)始創(chuàng)于1975年，在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的基礎(chǔ)研究以及疾病的診斷和治療中發(fā)揮了很大作用。但隨著單抗在臨床上的廣泛應(yīng)用，人們發(fā)現(xiàn)鼠源性單抗藥物存在一些問(wèn)題鼠源性抗體用于人體后產(chǎn)生的人抗鼠抗體(HAMA)反應(yīng)；抗體分子量較大，抗體分子到達(dá)靶部位的量不足；抗體本身效應(yīng)功能不強(qiáng)等，使抗體治療效果不理想。針對(duì)這些問(wèn)題，人們對(duì)抗體進(jìn)行人源化改造，如常見(jiàn)的人鼠嵌合抗體，制備單鏈抗體等小分子量抗體片段以及制備雙功能抗體等研究。7E3是1983年美國(guó)研究人員制備的一株鼠源性抗膜糖蛋白IIb-IIIa單克隆抗體(Coller BS，Peerschke EI，Scudder LE etal.A murine monoclonal antibody thatcompletely blocks the binging of fibrinogen to platelet producesa thrombas thenic-like state in normal platelet and bind toglycoprotein IIb/IIIa.Journal of Clinical Investigation.1983；72(1)325-328)。1992年改造為人鼠嵌合抗體片段c7E3(Knight DM，Wagner C，Jordan R，etal.The immunogenicity of the 7E3 murine Fabmonoclonal-antibody fragment variable region in dramaticallyreduced in humans by substitution of human for murine constantregions.M0lecular Immunology.1995；32(16)1271-1281)。大規(guī)模臨床觀察表明它具有良好的抗栓功能，已通過(guò)FDA批準(zhǔn)，在國(guó)外廣泛用于缺血性心臟病的治療，顯示了這類藥物良好的應(yīng)用前景。
然而，單克隆抗體c7E3的不足在于它僅作用于血小板表面的一個(gè)抗原決定簇，它僅從一個(gè)角度去封閉受體，因而它難以達(dá)到完全抑制血小板聚集的作用。因此，臨床上，人們一直在尋找新的、能夠更有效的抑制血小板聚集的單克隆抗體。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供了新的、抗血小板表面糖蛋白特定抗原決定簇的單克隆抗體。
本發(fā)明的第二個(gè)方面是提供了新的、能夠產(chǎn)生抗血小板表面糖蛋白特定抗原決定簇的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。
本發(fā)明的第三個(gè)方面是提供了新的、抗血小板表面糖蛋白特定抗原決定簇的單克隆抗體的制備方法。
本發(fā)明的第四個(gè)方面是提供了新的、抗血小板表面糖蛋白特定抗原決定簇的單克隆抗體片段。
本發(fā)明的第五個(gè)方面是提供了新的、能夠有效抑制血小板聚集的藥物組合物。


圖1顯示研制產(chǎn)生單抗R813和Y262的雜交瘤細(xì)胞的流程圖。
圖2顯示純化單抗R813和Y262 IgG的電泳分析。
圖3顯示W(wǎng)estern印跡轉(zhuǎn)移電泳圖譜，(R813和Y262結(jié)果)。
圖4顯示單抗R813和Y262親和層析產(chǎn)物電泳分析，其中A為蛋白質(zhì)標(biāo)記物，B為R813非還原性產(chǎn)物，C為蛋白質(zhì)Marker，D為Y262非還原性產(chǎn)物。
圖5顯示單克隆抗體R813和Y262與血小板結(jié)合活性，1為陰性對(duì)照，2為陽(yáng)性對(duì)照SZ-22，3為單克隆抗體R813，4為單抗Y262。
圖6顯示125I標(biāo)記單克隆抗體R813和Y262的放射免疫競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)結(jié)果。
圖7顯示制備單克隆抗體R813和Y262 F(ab′)2的電泳分析。
發(fā)明詳述按照本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了新的、抗血小板表面糖蛋白特定抗原決定簇的單克隆抗體。
我們運(yùn)用人血小板免疫Balb/c小鼠，研制成功了一批抗血小板GPIIIa或抗血小板GPIIb-IIIa的單克隆抗體(約20個(gè)克隆)，經(jīng)過(guò)反復(fù)篩選、檢測(cè)，證明Y262，Y321，Y474和R813能良好地抑制血小板聚集的功能。運(yùn)用125I標(biāo)記單克隆抗體的放射免疫競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)平均熒光強(qiáng)度疊加法發(fā)現(xiàn)本發(fā)明單抗所識(shí)別血小板表面糖蛋白的不同抗原決定簇，其中第一組單克隆抗體選自R813、Y88、Y128、Y474，它們特異性地識(shí)別血小板GPIIIa，而第二組單抗選自Y8、Y262、Y291、Y295、Y321、Y342、Y458、Y585、Y700，它們特異性地識(shí)別血小板受體GPIIb-IIIa復(fù)合物。優(yōu)選的本發(fā)明第一組單抗是單抗R813，優(yōu)選的本發(fā)明第二組單抗是單抗Y262。
按照本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供了新的、能夠產(chǎn)生抗血小板表面糖蛋白特定抗原決定簇的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。具體地說(shuō)，本發(fā)明提供了分別能夠產(chǎn)生上述第一組單抗和第二組單抗的雜交瘤細(xì)胞系，它選自產(chǎn)生識(shí)別血小板GPIIIa單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞R813、Y88、Y128、Y474和產(chǎn)生識(shí)別血小板GPIIb-IIIa復(fù)合物單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞Y8、Y262、Y291、Y295、Y321、Y342、Y458、Y585、Y700。其中優(yōu)選的是雜交瘤R813和Y262，這兩株雜交瘤細(xì)胞已按照布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，于2002年4月30日保藏于國(guó)際保藏單位—中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，其保藏編號(hào)分別為CGMCC No.0740和CGMCC No.0741。
按照本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供了新的、抗血小板表面糖蛋白特定抗原決定簇的單克隆抗體的制備方法。該方法包括利用人血小板作免疫原免疫Balb/c小鼠，取脾細(xì)胞與SP2/0-Ag14骨髓瘤細(xì)胞融合，研制產(chǎn)生識(shí)別血小板GPIIIa或IIb-IIIa復(fù)合物單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，運(yùn)用ELISA，F(xiàn)CM，Western印跡，親和層析等方法鑒定單克隆抗體的抗原決定簇和觀察單抗與血小板結(jié)合活性，并制備腹水與純化單克隆抗體。
按照本發(fā)明的第四個(gè)方面，提供了新的、抗血小板表面糖蛋白特定抗原決定簇的單克隆抗體片段。運(yùn)用木瓜酶消化法制備單克隆抗體R81 3和Y262 F(ab′)2片段并經(jīng)過(guò)SDS-PAGE鑒定，觀察單抗R813和Y262 F(ab′)2片段及其“雞尾酒”的血小板聚集功能抑制活性。
按照本發(fā)明的第五個(gè)方面，提供了新的、能夠有效抑制血小板聚集的藥物組合物，該藥物組合物含有一種或多種本發(fā)明的單克隆抗體，并根據(jù)需要含有藥學(xué)上可接受的載體或輔助劑。
在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方案中，運(yùn)用125I標(biāo)記單克隆抗體放射免疫競(jìng)爭(zhēng)抑制法和流式細(xì)胞術(shù)平均熒光強(qiáng)光疊加法篩選出針對(duì)不同抗原決定簇的抗體R813和Y262。將Y262和R813聯(lián)合作用于血小板發(fā)現(xiàn)此二個(gè)單抗聯(lián)合作用能完全抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集反應(yīng)，且抗體用量少(總量6～7μg/ml)。試驗(yàn)結(jié)果表明，單抗R813和Y262作用于血小板受體GPIIb-IIIa的不同位點(diǎn)，二者組成的單克隆抗體“雞尾酒”完全阻斷了纖原與血小板受體GPIIb-IIIa的結(jié)合，徹底抑制血小板聚集活性。且其F(ab′)2片段仍能達(dá)完全抑制血小板聚集活性，生物活性超過(guò)c7E3(商品名為Reopro)。使用兩株單抗組成單抗的“雞尾酒”，100％封閉了血小板膜糖蛋白IIb-IIIa的受體功能，這在國(guó)際上尚屬首創(chuàng)，其生物活性超過(guò)了Reopro(c7E3)。Reopro只是作用在血小板受體GPIIb-IIIa的一個(gè)位點(diǎn)，從一個(gè)角度去封閉受體，達(dá)到50％血小板聚集抑制率所需抗體量為5.5ug/ml。我們研制成功的“雞尾酒”作用于血小板受體GPIIb-IIIa上兩個(gè)不同位點(diǎn)，在空間構(gòu)型上全面封閉纖維蛋白原和受體的結(jié)合，達(dá)到50％抑制率所需的抗體量?jī)H為3.3ug/ml，不僅明顯降低了單克隆抗體用量，而且血小板聚集功能抑制作用也大大增強(qiáng)，超過(guò)了Reopro(c7E3)。為降低單抗作用時(shí)的HAMA反應(yīng)，同時(shí)減小分子量，增加靶部位抗體濃度，我們將單抗R813和Y262用酶解法改造為F(ab’)2片段(有研究表明單純鼠源性抗體F(ab’)2片段的HAMA反應(yīng)并不比嵌合抗體大，且其親和力高，可直接用于治療)。體外試驗(yàn)表明此二株抗體的F(ab’)2片段聯(lián)合作用仍能完全阻斷血小板受體GPIIb-IIIa功能，完全抑制血小板聚集。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明研制了作用于血小板受體GPIIb-IIIa不同位點(diǎn)的單抗R813和Y262，它們均能良好抑制血小板聚集功能，將這二株抗體聯(lián)合在一起組成“雞尾酒”可以完全阻斷血小板受體GPIIb-IIIa的功能，徹底抑制血小板聚集功能。我們發(fā)明的單抗“雞尾酒”生物活性超過(guò)了國(guó)際著名的抗血小板藥物Reopro且用量少。將抗體用酶解法制備成F(ab’)2片段，保存生物活性的同時(shí)也降低了抗體分子量，使到達(dá)作用靶部位的抗體量增加。去除Fc端還降低了HAMA反應(yīng)和減少了因與網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)結(jié)合而導(dǎo)致的血小板破壞。此外，酶解法操作簡(jiǎn)單，成本低廉。因此，強(qiáng)力高效的生物活性，低廉的成本，簡(jiǎn)單的操作使得本發(fā)明具有巨大的抗栓治療潛力和市場(chǎng)前景。
以下借助非限制性實(shí)施例舉例詳細(xì)描述本發(fā)明。
實(shí)施例1產(chǎn)生單抗R813和Y262雜交瘤細(xì)胞的制備1.1材料Balb/c小鼠購(gòu)自Charles River Laboratories Inc.Canada，SP2/0-Ag14小鼠骨髓瘤細(xì)胞，慢性骨髓瘤性白血病細(xì)胞(K562)，急性淋巴母細(xì)胞白血病細(xì)胞(MOLF-4)，人急性T細(xì)胞白血病細(xì)胞(Jurkat E6-1)均購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，D-MEM/F12，RPMI1640，L-G lutamine，MEMnon-Es sential，HT Supplement，HAT Suplement，Antibiotic-Antimycotic均為GIBCO公司產(chǎn)品，8-Azaguanie為Sigma公司產(chǎn)品，50％PEG1500Solution為ROCH產(chǎn)品，鼠抗體亞類分型試劑盒為Biorad公司產(chǎn)品，其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。
1.2方法正常成人抗凝全血分離出血小板，TEN洗滌3次，PBS懸浮并調(diào)血小板數(shù)為1×108細(xì)胞/毫升，取0.2ml注入8周齡雌性Balb/C小鼠腹腔，4周后重復(fù)，再過(guò)4周0.2ml血小板懸液注入小鼠尾靜脈，3日后處死小鼠，取出脾臟制成脾細(xì)胞懸液。將108脾細(xì)胞與1×107處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SP2/0-Ag14細(xì)胞用常規(guī)方法融合，依次用HAT培養(yǎng)基，HT培養(yǎng)基各培養(yǎng)2周，接著換用普通完全培養(yǎng)基。其間對(duì)出現(xiàn)細(xì)胞克隆者用血小板包被的酶標(biāo)板做ELISA檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有20多個(gè)雜交瘤細(xì)胞克隆與血小板有顯著的結(jié)合反應(yīng)。對(duì)與血小板反應(yīng)陽(yáng)性的并經(jīng)過(guò)篩選的雜交瘤細(xì)胞克隆用有限稀釋法進(jìn)行3次亞克隆，爾后逐步轉(zhuǎn)入24孔板、培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，并制備腹水(見(jiàn)圖1)。由此獲得12株能穩(wěn)定分泌抗血小板單抗的細(xì)胞株，它們是R813、Y8、Y88、Y128、Y262、Y291、Y295、Y321、Y458、Y474、Y585和Y700。采用流式細(xì)胞術(shù)觀察這些抗體與人紅細(xì)胞，白細(xì)胞，慢性骨髓瘤白血病細(xì)胞(K562)，急性淋巴母細(xì)胞白血病細(xì)胞(MOLF-4)和人急性T細(xì)胞白血病細(xì)胞(Jurkat E6-1)反應(yīng)，結(jié)果顯示這12株抗體與這些細(xì)胞均無(wú)交叉反應(yīng)。同時(shí)對(duì)產(chǎn)生這些抗體的細(xì)胞進(jìn)行核型分析表明它們確為雜交瘤細(xì)胞。應(yīng)用單抗亞類分型試劑盒(Biorad)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示單抗R813、Y128、Y321、Y458、Y474、Y585和Y700為IgG1，Kappa；單抗Y8和Y295為IgG2a，Kappa；單抗Y88、Y262和Y291為IgG2b，Kappa。連續(xù)幾年對(duì)其中兩個(gè)優(yōu)選單抗R813和Y262的雜交瘤細(xì)胞株動(dòng)態(tài)觀察，證明這兩株雜交瘤細(xì)胞株能長(zhǎng)期穩(wěn)定分泌高效價(jià)的單抗?，F(xiàn)兩株細(xì)胞已建成生產(chǎn)細(xì)胞庫(kù)。
實(shí)施例2抗體R813和Y262 IgG的制備和純化2.1材料Pristane為Sigma公司產(chǎn)品，Balb/C小鼠購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，Protein G 1ml預(yù)裝柱為Pharmacia公司產(chǎn)品，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
2.2方法以1ml Pristane注入雄性10周齡Balb/c小鼠腹腔致敏，一周至二周后分別將R813和Y262雜交瘤細(xì)胞1～10×106注入致敏后的小鼠腹腔，一周左右開始觀察并收集腹水。小鼠腹水以0.02M PB(pH7.0)4℃透析過(guò)夜，隨后4℃離心10000轉(zhuǎn)/分×15分去除沉淀，0.2μm濾器過(guò)濾。濾過(guò)液1ml/次加入Protein G柱，0.02M PB(pH7.0)平衡及洗去雜蛋白，0.1MGly-HCl(pH2.7)洗脫IgG并收集之。收集產(chǎn)物經(jīng)PBS透析后濃縮定量，并經(jīng)10％SDS-PAGE鑒定。結(jié)果表明腹水中抗體含量約8mg/ml，純化后抗體純度在90％以上(見(jiàn)圖2)。
實(shí)施例3抗體R813和Y262的血小板結(jié)合活性研究3.1材料
血小板來(lái)自正常成年志愿者全血，GAM-FITC為上海華美公司產(chǎn)品，GAM-HRP為Sigma公司產(chǎn)品，CNBr-Sepharose 4B為Pharmacia產(chǎn)品，蛋白質(zhì)標(biāo)記物為上海生化所西巴斯公司產(chǎn)品，蛋白質(zhì)組成為43KD、66KD、97KD、130KD和200KD，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?br> 3.2方法(1)ELISA法測(cè)定抗體R813和Y262與血小板結(jié)合活性健康人抗凝全血，分離出富含血小板血漿(PRP)，TEN溶液洗3次，以5×105血小板/孔包板，4℃過(guò)夜，2％BSA-PBS 37℃封閉2小時(shí)，0.5％戊二醛固定，0.01％Tween20-PBS洗滌，GAM-HRP為二抗，OPD顯色，常規(guī)ELISA測(cè)定492nm處的戲光A492值。同時(shí)以鼠IgG為陰性對(duì)照，以SZ-22(抗血小板GPIIbα)為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果表明R813和Y262具有良好的血小板結(jié)合活性。
(2)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定抗體R813和Y262與血小板結(jié)合活性5ul PRP(血小板濃度為5×108/ml)加入50ul 1∶100稀釋的抗體R813和Y262小鼠腹水，室溫放置30分鐘，洗滌后加入GAM-FITC，流式細(xì)胞儀(CoulterEPICSR，XL)檢測(cè)。同時(shí)以鼠IgG為陰性對(duì)照，同樣稀釋度之SZ-22為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果表明R813和Y262具有血小板結(jié)合能力(見(jiàn)圖5)。
(3)Western印跡測(cè)定抗體R813和Y262與血小板膜蛋白結(jié)合位點(diǎn)EDTA抗凝全血分離PRP，TEN溶液洗3次，調(diào)整血小板數(shù)至2×108/ml，加入1mmol/L PMSF，1％Triton X-100裂解血小板后，離心取上清，按60ul/孔加樣，進(jìn)行非還原5％-15％對(duì)數(shù)梯度SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維薄膜，2％BSA-PBS封閉后，裁剪成不同條帶，加R813和Y262抗體37℃溫育2小時(shí)，GAM-HRP為二抗，最后加氯萘酚顯色。同時(shí)以鼠IgG為陰性對(duì)照，SZ-22抗體為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果表明，R813作用于血小板GPIIIa，而Y262未見(jiàn)反應(yīng)(見(jiàn)圖3)。
(4)親和層析測(cè)定R813和Y262抗體與血小板膜蛋白作用位點(diǎn)將CNBr-Sepharose 4B凝膠用1mmol/L鹽酸溶脹4小時(shí)，偶聯(lián)緩沖液洗滌3次，將純化之R813，Y262經(jīng)充分透析后加入凝膠，4℃振蕩16小時(shí)。在砂芯漏斗內(nèi)經(jīng)偶聯(lián)緩沖液洗滌，1mmol/L乙醇胺浸泡2次，每次1小時(shí)，依次用偶聯(lián)緩沖液，25mmol/L Tris-HCl，TBS抽濾，最后將偶聯(lián)后的凝膠裝柱。同方法(3)中制備血小板破碎液，將2×109血小板的破碎液循環(huán)上樣，然后用0.05mol/L二乙胺-5mmol/L EDTA緩沖液洗脫。洗脫物經(jīng)PBS透析后濃縮用10％SDS-PAGE鑒定。結(jié)果表明R813作用抗原為GPIIIa，而Y262作用抗原為GPIIb-IIIa復(fù)合物(見(jiàn)圖4)。
實(shí)施例4抗體R813與Y262分別與血小板受體GPIIb-IIIa復(fù)合物的不同位點(diǎn)作用4.1材料125I購(gòu)自中國(guó)原子能總公司，Sephadex G-25凝膠為phamacia公司產(chǎn)品，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?br> 4.2方法125I標(biāo)記R813放射免疫競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)30ug R813(1mg/ml)加入10ul0.1mol/LPB pH 7.5；1mGi125I及5mg/ml ChT 10ul，室溫靜置1分鐘，后加入20mg/ml Na2S2O820ul室溫靜置1分鐘，之后加入100ul 0.5％BSA-PBS。該反應(yīng)物加入0.5％BSA-PBS預(yù)平衡的Sephadex G-25凝膠柱，同樣溶液洗脫，每管收集10滴。γ計(jì)數(shù)儀(國(guó)營(yíng)262廠，F(xiàn)J2008)測(cè)定放射性計(jì)數(shù)，收集第一個(gè)放射性峰。同前血小板包板，以不同濃度鼠IgG，R813，Y262與固定濃度125I-R813混合后加入包被板，37℃溫育2小時(shí)后，洗滌3次，γ計(jì)數(shù)儀檢測(cè)放射性計(jì)數(shù)。結(jié)果表明隨R813濃度增加，包被每孔放射性計(jì)數(shù)下降，而放射性計(jì)數(shù)不隨Y262和鼠IgG濃度改變而變化，說(shuō)明Y262與R813作用抗原位點(diǎn)不同(見(jiàn)圖6)。
實(shí)施例5抗體R813與Y262協(xié)同封閉血小板GPIIb-IIIa復(fù)合物，充分抑制血小板聚集功能5.1材料ADP為上海麗珠東風(fēng)生物制品公司產(chǎn)品，GAM-FITC為上海華美公司產(chǎn)品，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?br> 5.2方法(1)流式細(xì)胞術(shù)平均熒光強(qiáng)度疊加實(shí)驗(yàn)5ul PRP分別與抗體R813，Y262及二者混合物作用室溫30分鐘，洗滌后加入GAM-FITC，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。鼠IgG作為陰性對(duì)照。結(jié)果表明R813與Y262共同作用對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度是兩個(gè)抗體單獨(dú)作用時(shí)之和，說(shuō)明R813和Y262可以分別作用于血小板GPIIb-IIIa復(fù)合物上各自抗原決定簇，從而能對(duì)復(fù)合物分子產(chǎn)生協(xié)同封閉作用(見(jiàn)表1)。
表1單抗R813和Y262流式細(xì)胞術(shù)平均熒光強(qiáng)度疊加法實(shí)驗(yàn)結(jié)果抗體 陽(yáng)性細(xì)胞百分率(％) 平均熒光強(qiáng)度PBS3.222.61鼠-IgG 6.483.26SZ-22 90.283.1R813 87.7185.7Y262 73.6130.9R813+鼠-IgG86.4174.8R813+SZ-22 92.3255.4R813+R813 87.6180.1R813+Y262 88.1338.5(2)R813，Y262及二者協(xié)同抑制ADP誘導(dǎo)血小板聚集實(shí)驗(yàn)枸橡酸抗凝健康成人全血，分離PRP，加入不同濃度的抗體R813，Y262及二者混合物，37℃溫育5分鐘，然后加入ADP(終濃度5umol/L)，檢測(cè)聚集結(jié)果。鼠IgG為陰性對(duì)照，Reopro為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果表明R813與Y262均可良好抑制血小板聚集功能，二者聯(lián)合作用時(shí)相同抗體濃度下對(duì)血小板聚集抑制作用增強(qiáng)，可完全阻斷血小板聚集功能，其抗栓活性超過(guò)Reopro。通過(guò)計(jì)算還可知50％抑制率用量低于Reopro(見(jiàn)表2、3、4)。
表2.不同濃度單抗對(duì)血小板聚集的影響第一次試驗(yàn)試驗(yàn)次數(shù)對(duì)照 單抗PBS R813 Y262 7E3濃度(ug/ml) 0 2.5 5.02.55.0 2.5 5.0血小板聚集百分率(％)1 82％63％74％69％75％69％37％2 86％75％46％81％65％53％22％平均值 84％69％60％75％70％61％29.5％第二次試驗(yàn)試驗(yàn)次數(shù)對(duì)照 單抗PBSR813 Y262 7E3濃度(ug/ml) 0 5.010.0 5.010.0 5.0 10.0血小板聚集百分率(％)平均值 59％53％ 22％ 64％ 28％ 47％ 43％
第三次試驗(yàn)試驗(yàn)次數(shù)對(duì)照 單抗PBSR813 Y262濃度(ug/m l) 0 5.0 10.05.0 10.0血小板聚集百分率(％)1 61％ 60％23％67％54％2 72％ 68％40％58％52％平均值 66.5％ 64％31.5％ 62.5％ 53.5％表3.單抗R813、Y262及其“雞尾酒”(DiMab)對(duì)血小板聚集的影響第一次試驗(yàn)試驗(yàn)次數(shù) 對(duì)照 單抗PBS Dimab R813 Y262濃度(ug/m l) 0 10 10 10血小板聚集百分率(％)1 73％0％42％ 62％2 77％0％51％ 54％平均值75％0％46.5％ 58％
第二次試驗(yàn)試驗(yàn)次數(shù) 對(duì)照單抗PBS Dimab濃度(ug/ml) 0 0.625 1.25 2.505.0 10.0血小板聚集百分率(％)1 62％ 67％55％ 61％30％4％2 74％ 70％63％ 61％17％5％3 67％ 88％66％ 58％25％7％平均值67.7％75％61.3％60％24％5.3％第三次試驗(yàn)試驗(yàn)次數(shù) 對(duì)照 單抗PBS Dimab 7E3濃度(ug/ml) 0 1.25 2.505.0 10.0 1.252.50 5.0 10.0血小板聚集百分率(％)1 44％30％ 19％14％0％54％35％ 23％5％2 49％38％ 38％8％ 0％53％31％ 28％6％平均值 46.5％ 34％ 28.5％ 11％0％5 3.5％ 33％2 5.5％ 5.5％
表4.單抗“雞尾酒”(DiMab)與7E3的50％血小板聚集抑制率用量DiMab 7E3ug/ml3.135.26實(shí)施例6抗體R813與Y262 F(ab′)2片段制備與鑒定6.1材料木瓜酶為上海麗珠東風(fēng)生物公司產(chǎn)品，DEAE-52凝膠購(gòu)自中科院上海生化所西巴斯公司，DTT為Fluka公司產(chǎn)品，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?br> 6.2方法(1)R813和Y262F(ab′)2片段的制備和鑒定R813與木瓜酶質(zhì)量比5∶1混勻4℃作用24h，碘乙酰胺(終濃度80mmol/L)終止反應(yīng)，0.01mol/LTris-HCl pH 8.0透析后，上DEAE-52離子交換柱，0～0.3mol/L NaCl0.01mol/L Tris-HCl pH 8.0洗脫，收集第一峰。Y262與木瓜酶質(zhì)量比為80∶1混勻4℃作用35分鐘，再加入木瓜酶與Y262質(zhì)量比為1∶160，混勻4℃作用35分鐘，接下同R813終止反應(yīng)并純化，不同的是收集第2個(gè)洗脫峰。將收集物作還原及非還原10％SDS-PAGE。結(jié)果表明，經(jīng)木瓜酶消化后并純化得到兩種抗體之F(ab′)2片段。(見(jiàn)圖7)(2)R813和Y262 F(ab′)2片段抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集試驗(yàn)方法同前，結(jié)果表明R813和Y262 F(ab′)2片段仍可以協(xié)同作用，完全抑制血小板聚集功能。(見(jiàn)表5)
表5.抗體F(ab’)2片段對(duì)血小板聚集功能抑制作用1.252.505.0010.00 ug/ml血小板聚集抑制率(％)R813 16.211.876.582.4Y262 35.142.961.055.8DiMab 17.517.581.3100雖然上面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了具體描述，但是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員均了解，在不背離本發(fā)明的原則和精神的情況下，根據(jù)本說(shuō)明書及所附權(quán)利要求書中公開的內(nèi)容，可對(duì)本發(fā)明做出各種變動(dòng)和改進(jìn)。因此，所有這些變動(dòng)和改進(jìn)均應(yīng)包括在所附權(quán)利要求書中所要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種抗血小板受體GP IIIa的單克隆抗體，它是由雜交瘤細(xì)胞系R813、Y88、Y128和Y474產(chǎn)生的。
2.一種抗血小板受體GPIIb-IIIa復(fù)合物的單克隆抗體，它是由雜交瘤細(xì)胞系Y8、Y262、Y291、Y295、Y321、Y458、Y585和Y700產(chǎn)生的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體，它包括所述單克隆抗體的IgG片段Fab、F(ab’)2，單鏈抗體，嵌合抗體，人源化抗體或基因工程抗體。
4.產(chǎn)生特異性抗血小板受體單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，它選自Y262，Y321，Y474和R813。
5.權(quán)利要求4所述的雜交瘤細(xì)胞系，它是R813，CGMCC No.0740。
6.權(quán)利要求4所述的雜交瘤細(xì)胞系，它是Y262，CGMCC No.0741。
7.一種有效抑制抗血小板聚集的藥物組合物，其特征在于它含有以下兩組單克隆抗體中的一種或多種(1)抗血小板受體GP IIIa的單克隆抗體，和/或(2)抗血小板受體GPIIb-IIIa復(fù)合物的單克隆抗體。以及可作藥用的載體或賦形劑。
8.權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其中抗血小板受體GP IIIa的單克隆抗體選自R813、Y88、Y128和Y474。
9.權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其中抗血小板受體GPIIb-IIIa復(fù)合物的單克隆抗體選自Y8、Y262、Y291、Y295、Y321、Y458、Y585和Y700。
10.權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征在于它含有單克隆抗體R813和Y262。
11.權(quán)利要求10所述的藥物組合物，其中單克隆抗體R813和Y262的比例為1∶1。
12.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體的制備方法，它包括以下步驟(1)利用人血小板免疫Balb/c小鼠，制備產(chǎn)生抗血小板的抗體的雜交瘤細(xì)胞系；(2)培養(yǎng)獲得的雜交瘤細(xì)胞系以產(chǎn)生單克隆抗體；(3)純化獲得的單克隆抗體并鑒定其抗原決定簇，并任選地(4)用木瓜蛋白酶消化并純化，獲得該單克隆抗體的片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及由分別作用于血小板GPIIb－IIIa不同位點(diǎn)的抗體組合而成的雙抗體。本發(fā)明的雙抗體能夠完全封閉GPIIb－IIIa的受體活性，完全抑制血小板的聚集活性，從而抑制血小板血栓的形成。因此，本發(fā)明的雙抗體作為一種新的血小板受體GPIIb－IIIa阻斷劑，具有常規(guī)抗血小板藥物不可比擬的優(yōu)點(diǎn)和潛在應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C07K16/18GK1495199SQ0212522
公開日2004年5月12日 申請(qǐng)日期2002年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月17日
發(fā)明者阮長(zhǎng)耿, 葉慶煒 申請(qǐng)人:阮長(zhǎng)耿, 葉慶煒