專利名稱：應(yīng)用糖皮質(zhì)激素在哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)糖蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞的新過程，所述哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)產(chǎn)物、優(yōu)選糖基化蛋白質(zhì)產(chǎn)物。細(xì)胞培養(yǎng)過程的執(zhí)行導(dǎo)致高細(xì)胞活力，并且也可以導(dǎo)致高產(chǎn)物品質(zhì)和生產(chǎn)率、延長生長期和在死亡期中降低死亡率。
背景技術(shù)：
優(yōu)選使用動物細(xì)胞培養(yǎng)，尤其是哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)用于表達(dá)用于治療性和/或預(yù)防性應(yīng)用的重組產(chǎn)生的糖基化蛋白質(zhì)。重組糖蛋白的糖基化模式具有重要意義，因?yàn)樘堑鞍椎墓烟莻?cè)鏈影響蛋白質(zhì)功能，以及在蛋白質(zhì)的不同區(qū)域之間的分子內(nèi)相互作用。此類分子內(nèi)相互作用涉及糖蛋白的蛋白質(zhì)構(gòu)象和三級結(jié)構(gòu)。(參見例如，A. Wittwer等人，1990, Biochemistry,29:4175-4180 ；Hart,1992, Curr. Op. Cell Biol.，4:1017-1023 ;Goochee等人，1991，Bio/Technol. ,9:1347-1355 ;和 R. B. Parekh,1991, Curr. Op. Struct.Biol. ,1:750-754)。此外，寡糖可以作用于使特定多肽靶向基于特異性細(xì)胞碳水化合物受體的某些結(jié)構(gòu)。(M.P. Bevilacqua 等人，1993，J. Clin. Invest. ,91:379-387 ；R. M.Nelson 等人，1993, J. Clin. Invest. ,91:1157-1166 ；K. E. Norgard 等人，1993, Proc.Natl. Acad. Sci. USA，90:1068-1072 和 Y. Imai 等人，1993，Nature，361-555-557)。已知糖蛋白寡糖側(cè)鏈的末端唾液酸組分對糖蛋白的多個方面和特性有作用，包括吸收、溶解度、熱穩(wěn)定性、血清半衰期、從血清中的清除、以及其物理和化學(xué)結(jié)構(gòu)/行為及其免疫原性。(A. Varki, 1993, Glycobiology, 3:97-100 ；R. B. Parekh,同前，Goochee 等人，同前，J. Paulson 等人，1989，TIBS，14:272-276 ;和 A. Kobata, 1992, Eur. J. Biochem.，209:483-501 ；E. Q. Lawson 等人，1983, Arch. Biochem. Biophys. , 220:572-575 ;和 E.Tsuda 等人，1990, Eur. J. Biochem. , 188:405-411)。唾液酸在糖蛋白中的量受兩個相反過程影響唾液酸通過唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的細(xì)胞內(nèi)添加和唾液酸通過唾液酸酶切割的細(xì)胞外去除。唾液酸的細(xì)胞內(nèi)添加是在反面高爾基中發(fā)生的糖基化過程的最后階段。這涉及將唾液酸從核苷酸糖前體(CMP-唾液酸)酶促轉(zhuǎn)移到附著至新合成蛋白的新出現(xiàn)聚糖結(jié)構(gòu)上的可用半乳糖。對該過程的可能引起不完全唾液酸化的可能限制包括CMP-唾液酸的可用性、唾液酸轉(zhuǎn)移酶的活性、半乳糖在新出現(xiàn)聚糖結(jié)構(gòu)上的量和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的活性。大量研究已集中于經(jīng)由唾液酸轉(zhuǎn)移酶和糖基轉(zhuǎn)移酶的基因過表達(dá)和酶活性增強(qiáng)來使唾液酸化達(dá)到最大。Zhang 等人(Biochim Biophys Acta 1425 (3) : 1998,441-52)報道,人a 2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶在具有組織纖溶酶原激活物(tPA)產(chǎn)生的CHO細(xì)胞中的表達(dá)增強(qiáng)tPA 的 a 2，6-唾液酸化。Weikert 等人(Nat Biotechnol 17 (11) : 1999，1116-21)報道，a 2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶和P I, 4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的共表達(dá)導(dǎo)致TNK-tPA和TNFR-IgG的唾液酸化大于90%。此外，補(bǔ)充適當(dāng)量的錳(Mn2+)(關(guān)于￠1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的輔因子)極大減少較低唾液酸化級分中rHuEPO的量，增加碳水化合物位點(diǎn)占有，并且使這些較低唾液酸化種類中的碳水化合物分支(Zhang等人,1998)縮小至二觸角(bi_antennary)結(jié)構(gòu)(Crowell 等人，Biotechnol Bioeng 96 (3) : 538-49, 2007)。唾液酸在糖蛋白中的量也受通過唾液酸酶切割的唾液酸細(xì)胞外去除影響。Gramer和 Goochee (Biotechnol Prog 9 (4) : 366-73，1993)已證實(shí)，在 CHO 灌注培養(yǎng)中，乳酸脫氫酶(LDH)的增加(其表示細(xì)胞裂解的增加)與細(xì)胞外唾液酸酶的活性的增加有關(guān)。Gu等人(Biotechnol Bioeng 55 (2) :390-8，1997)也舉例說明，在整個長期分批培養(yǎng)中，干擾素-Y (IFN-y)的末端唾液酸的顯著損失連同CHO細(xì)胞活力中的降低和死細(xì)胞的伴隨增加。因此，必需延遲細(xì)胞死亡的開始且改善細(xì)胞活力，以降低或避免這種降解效應(yīng)。—般而言,在基于哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著低于微生物表達(dá)系統(tǒng)(例如細(xì)菌或酵母表達(dá)系統(tǒng))。然而，細(xì)菌和酵母細(xì)胞的以下能力有限最佳表達(dá)高分子量蛋白質(zhì)產(chǎn)物、正確折疊具有復(fù)雜立體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)、和/或提供所需翻譯后修飾以使所表達(dá)糖蛋白成熟，由此影響產(chǎn)物的免疫原性和清除率。
由于培養(yǎng)動物或哺乳動物細(xì)胞，特別是產(chǎn)生重組產(chǎn)物的動物或哺乳動物細(xì)胞的限制，已研究了多種參數(shù)的操縱，包括采用大規(guī)模培養(yǎng)容器；改變基本培養(yǎng)條件，例如溫育溫度、溶解氧濃度、PH等；使用不同類型的培養(yǎng)基和對于培養(yǎng)基的添加劑；和增加所培養(yǎng)細(xì)胞的密度。此外，用于哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的過程開發(fā)會受益于延長運(yùn)行時間的能力的進(jìn)步，以增加終產(chǎn)物濃度，同時維持高產(chǎn)物品質(zhì)。重要產(chǎn)物品質(zhì)參數(shù)是多肽產(chǎn)物中糖基化結(jié)構(gòu)的程度和完全性，其中唾液酸含量通常用作糖蛋白品質(zhì)的量度。細(xì)胞培養(yǎng)過程，特別是非連續(xù)性過程的運(yùn)行時間通常受限于細(xì)胞的剩余活力，這通常隨著運(yùn)行過程而下降。因此期望高細(xì)胞活力的最大可能延長。產(chǎn)物品質(zhì)問題也為活細(xì)胞密度的減少降到最低和維持高細(xì)胞活力提供了動力，因?yàn)榧?xì)胞死亡可以將唾液酸酶釋放至培養(yǎng)物上清液中，這可以降低所表達(dá)蛋白中的唾液酸含量。蛋白質(zhì)純化問題為活細(xì)胞密度的減少降到最低和維持高細(xì)胞活力提供了另一個動力。培養(yǎng)物中細(xì)胞碎片和死細(xì)胞內(nèi)含物的存在可以對在培養(yǎng)運(yùn)行結(jié)束時分離和/或純化蛋白質(zhì)產(chǎn)物的能力造成負(fù)面影響。通過使細(xì)胞在培養(yǎng)中維持活力較長時間段，由此存在通過細(xì)胞蛋白和酶(例如細(xì)胞蛋白酶和唾液酸酶)的培養(yǎng)基污染的伴隨減少，所述污染可以引起通過細(xì)胞產(chǎn)生的期望糖蛋白的品質(zhì)的降解和最終減少。已研究多種參數(shù)以在細(xì)胞培養(yǎng)中達(dá)到高細(xì)胞活力。一種參數(shù)涉及在37°C開始培養(yǎng)后單獨(dú)降低培養(yǎng)溫度(例如，Roessler 等人，1996, Enzyme and Microbial Technology,18:423-427 ; 1998 年頒給T. Etcheverry 等人的美國專利號 5，705，364和 5，721，121 ；1999年頒給K. Furukawa等人的美國專利號5，976，833 ;頒給L. Adamson等人的美國專利號5，851，800 ;頒給 Genentech 公司的 WO 99/61650 和 WO 00/65070 ;頒給 Biogen 公司的 W00/36092 ;和頒給Girard等人的美國專利號4，357，422)。所研究的其他參數(shù)涉及向培養(yǎng)物中添加組分。已顯示生長因子抑制劑舒拉明在CHO Kl :CycE細(xì)胞的指數(shù)生長過程中防止細(xì)胞凋亡(Zhangi等人，Biotechnol. Prog.2000，16，319-325)。然而，舒拉明不在死亡期過程中防止細(xì)胞凋亡。因此，舒拉明能夠在生長期過程中維持高活力，但不允許延長培養(yǎng)壽命。相同作者報道，對于CHO 111-10PF細(xì)胞系，類似于舒拉明，相對于對照培養(yǎng)，硫酸葡聚糖和聚乙烯硫酸鹽可以增加第3天的活細(xì)胞密度和活力。然而，未報道硫酸葡聚糖或聚乙烯硫酸鹽在死亡期過程中的效應(yīng)。還報道舒拉明、硫酸葡聚糖和聚乙烯硫酸鹽在防止細(xì)胞聚集方面是有效的。用地塞米松或N-乙酰甘露糖胺補(bǔ)充昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基對經(jīng)由桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)(BEVS)制備的蛋白質(zhì)的復(fù)雜糖基化(包括末端唾液酸殘基對N聯(lián)寡糖的添加)的效應(yīng)公開于 2002 年頒給 Boyce Thompson Institute For Plant Research 公司(Ithaca, NY)的美國專利號6，472，175中。由于其大小、結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和生物生產(chǎn)的性質(zhì)，蛋白質(zhì)治療藥物是固有異質(zhì)的(Chirino 和 Mire-Sluis，Nat Biotechnol. 2004;22:1383-1391)。甚至在“純”蛋白質(zhì)溶液中，也存在一定百分比的低分子量片段、高分子量種類和不同程度的化學(xué)修飾。高分子量種類的形成通常是由于蛋白質(zhì)聚集，其是在制造生物制品過程中遇到的常見問題。通常，認(rèn)為聚集體的存在是不期望的，因?yàn)閾?dān)心聚集體可以導(dǎo)致免疫原性反應(yīng)或可以在施用后引起不良事件(Cromwell等人，AAPS J. 2006 ;8:E572_579)。盡管某些類型的生物制品聚集體可以正常發(fā)揮功能，但維持產(chǎn)物品質(zhì)的一致性仍然重要，因?yàn)楫a(chǎn)品一致性是行政審批的先決條件。
蛋白質(zhì)聚集體可以起于若干種機(jī)制，且可以在制造過程期間的每一階段發(fā)生。在細(xì)胞培養(yǎng)中，分泌蛋白可以暴露于不利于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的條件；但更經(jīng)常地，由于未折疊蛋白質(zhì)分子的相互作用或通過負(fù)責(zé)正確折疊的分子伴侶對新生肽鏈的無效識別，大量蛋白質(zhì)的積累可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)聚集(Cromwell等人，AAPS J. 2006 ;8:E572_579)。在細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中，新合成蛋白的二硫鍵在氧化環(huán)境中形成。在正常條件下，蛋白質(zhì)巰基可逆地氧化為蛋白質(zhì)二硫化物和次磺酸，但更高氧化態(tài)例如蛋白質(zhì)半胱氨酸的亞磺酸和磺酸形式是不可逆的(Thomas 和 Mallis, Exp Gerontol. 2001;36:1519-1526)。過氧化蛋白質(zhì)可以含有不正確的二硫鍵或具有與其他內(nèi)腔ER蛋白的混合二硫鍵；在任一情況下，導(dǎo)致蛋白質(zhì)不正確的折疊和聚集。因此在ER中維持適當(dāng)受控的氧化環(huán)境是至關(guān)重要的。在這點(diǎn)上，Cuozzo和Kaiser (Nat Cell Biol. 1999 ; 1:130-135)首先證實(shí)，在酵母中谷胱甘肽可以針對ER過氧化進(jìn)行緩沖，且后來由Chakravarthi和Bulleid (J Biol Chem. 2004 ；279:39872-39879)確認(rèn)，在哺乳動物細(xì)胞中，也需要谷胱甘肽來調(diào)節(jié)進(jìn)入分泌途徑的蛋白質(zhì)內(nèi)天然二硫鍵的形成。隨著培養(yǎng)物中產(chǎn)物濃度的增加，如通過測量寡糖糖結(jié)構(gòu)的唾液酸含量測定的，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中可以觀察到產(chǎn)物品質(zhì)降低。通常，如通過藥物清除研究測定的，存在關(guān)于可接受的唾液酸含量的下限。在培養(yǎng)中通過細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的高豐度最佳地伴隨蛋白質(zhì)的高品質(zhì)，所述蛋白質(zhì)最終回收用于預(yù)期用途。正確糖基化的重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)產(chǎn)物對于用作治療性藥物、治療和預(yù)防性藥物在醫(yī)學(xué)和臨床上變得越來越重要。因此，可靠細(xì)胞培養(yǎng)過程的開發(fā)滿足本領(lǐng)域中的期望和所需的目標(biāo)，所述細(xì)胞培養(yǎng)過程經(jīng)濟(jì)有效地達(dá)到與高水平的產(chǎn)物品質(zhì)(例如通過唾液酸含量測定的)結(jié)合的最終蛋白質(zhì)產(chǎn)物濃度增加。發(fā)明概述
本發(fā)明提供通過動物或哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的新過程，所述蛋白質(zhì)優(yōu)選重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物、更優(yōu)選糖蛋白產(chǎn)物。這些新過程達(dá)到在后期增加的活細(xì)胞密度、細(xì)胞活力、生產(chǎn)率和唾液酸含量以及降低的蛋白質(zhì)聚集。本發(fā)明的一個方面涉及向培養(yǎng)基中添加糖皮質(zhì)激素。在這個方面，本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)過程可以有利地達(dá)到增強(qiáng)的比生產(chǎn)率(例如糖蛋白)，以及通過培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生的糖蛋白的唾液酸含量增強(qiáng)。更具體而言，根據(jù)本發(fā)明，在細(xì)胞培養(yǎng)期過程中添加糖皮質(zhì)激素維持培養(yǎng)物中細(xì)胞的高細(xì)胞活力，且可以在整個培養(yǎng)運(yùn)行中提供高數(shù)量和品質(zhì)的所產(chǎn)生產(chǎn)物。同樣，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，對培養(yǎng)過程添加糖皮質(zhì)激素可以有利地允許延長培養(yǎng)的生產(chǎn)期。在延長的生產(chǎn)期過程中，期望產(chǎn)物的滴度增加；如通過唾液酸含量表征的產(chǎn)物品質(zhì)維持在高水平；蛋白質(zhì)聚集水平維持在較低水平且細(xì)胞活力也維持在高水平。此外，與本發(fā)明的培養(yǎng)過程有關(guān)的延長的生產(chǎn)期允許產(chǎn)物生產(chǎn)超過在標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)期過程中產(chǎn)生的那種。在一個具體方面，本發(fā)明提供這樣的過程(或方法)，其中通過添加糖皮質(zhì)激素來增強(qiáng)比生產(chǎn)率，降低蛋白質(zhì)聚集水平且所產(chǎn)生糖蛋白的唾液酸含量更高。糖皮質(zhì)激素化合物優(yōu)選是地塞米松。根據(jù)這個具體方面，添加糖皮質(zhì)激素維持培養(yǎng)物的高細(xì)胞活力，由此使得延長的生產(chǎn)期成為可能，在此過程中產(chǎn)物優(yōu)選重組產(chǎn)物的滴度增加，并且如通過唾液酸含量表征的產(chǎn)物品質(zhì)維持在高水平。在細(xì)胞培養(yǎng)過程期間，添加糖皮質(zhì)激素可以使在產(chǎn)物產(chǎn)生中的蛋白質(zhì)滴度和唾液酸含量之間流行的折衷降到最低。因此，添加糖皮質(zhì)激素對增強(qiáng)培養(yǎng)過程的重要性能參數(shù)提供正面作用，即“終點(diǎn)(即最終)滴度” X “終點(diǎn)(即最終)唾液酸”X “單體含量”的數(shù)學(xué)乘積(“終點(diǎn)滴度X終點(diǎn)唾液酸” X “終點(diǎn)單體含量”)。 在本發(fā)明的一個方面，在接種時或在接種后初始死亡期開始前、或在初始生長期過程中、或在初始生長期的后半部分過程中、或在初始生長期結(jié)束時或大約結(jié)束時，將糖皮質(zhì)激素化合物添加至培養(yǎng)物中。根據(jù)本發(fā)明的這個方面，生長期延長一段時間和/或死亡期的開始延遲一段時間，例如若干天。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選方面且如本文進(jìn)一步描述的，涉及添加糖皮質(zhì)激素化合物的新近開發(fā)的細(xì)胞培養(yǎng)過程，尤其適合于通過經(jīng)遺傳改造為表達(dá)且產(chǎn)生這些蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞來產(chǎn)生可溶性CTLA4分子和可溶性CTLA4突變分子，例如CTLA4Ig和L104EA29Hg。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案涵蓋培養(yǎng)產(chǎn)生CTLA4Ig和L104EA29Hg的細(xì)胞，其涉及在培養(yǎng)運(yùn)行過程中添加糖皮質(zhì)激素化合物，以達(dá)到大量高品質(zhì)CTLA4Ig和L104EA29Hg產(chǎn)物，如通過最終產(chǎn)物的唾液酸測量和/或低蛋白質(zhì)聚集測定的。在閱讀本發(fā)明的詳述和考慮附圖/圖表后應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的進(jìn)一步方面、特征和優(yōu)點(diǎn)。附圖/圖表描述
圖I顯示如實(shí)施例I中所述，P 1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(IA)和a 2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(1B)的表達(dá)一般隨著經(jīng)DEX處理的CHO細(xì)胞中的地塞米松(DEX)濃度增加。DEX在接種后第2天時以0.1剛至10剛的濃度加入培養(yǎng)物中。在接種后第5天時，收集細(xì)胞樣品并制備全細(xì)胞裂解物，在4-15%梯度凝膠上分離并用針對各糖基轉(zhuǎn)移酶的抗體進(jìn)行探測。然后用￠-肌動蛋白抗體再次探測印跡，以評價相等負(fù)荷。圖2顯示如實(shí)施例I中所述，DEX導(dǎo)致培養(yǎng)物上清液中的唾液酸酶活性降低的細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)。在經(jīng)DEX處理和未經(jīng)處理的培養(yǎng)物之間沿著培養(yǎng)期的細(xì)胞活力(2A)和上清液唾液酸酶活性測定的吸光度(2B)概況分析。以I剛濃度的DEX處理在第2天時開始。值反映來自5次實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。圖3顯示如實(shí)施例I中所述，用糖皮質(zhì)激素類似物(氫化可的松(HYC)和潑尼松龍(PRD))處理的培養(yǎng)物中糖蛋白唾液酸化的改良。分別用DEX、HYC和PRD處理的培養(yǎng)物的標(biāo)準(zhǔn)化總唾液酸含量(3A)和標(biāo)準(zhǔn)化N聯(lián)唾液酸化種類比例(fraction) (3B)。處理在接種后第二天時對于各化合物以0. 1、1和10 m的濃度在培養(yǎng)基中開始。各參數(shù)的值作為平均值土差值/2 (n=2)報告。圖4顯示如實(shí)施例I中所述，通過DEX的唾液酸化增強(qiáng)被糖皮質(zhì)激素拮抗劑RU-486阻斷。在RU-486的存在和不存在下，標(biāo)準(zhǔn)化總唾液酸含量(4A)和標(biāo)準(zhǔn)化N聯(lián)唾液酸化種類比例(4B)。在接種后48小時，將RU-486以0或I剛引入細(xì)胞培養(yǎng)懸浮液中。24小時后，隨后將0. I、I和10 m DEX加入培養(yǎng)物中。各參數(shù)的值作為平均值土差值/2(n=2)手艮告。圖5顯示如實(shí)施例I中所述，在5 L生物反應(yīng)器中經(jīng)DEX處理的CHO細(xì)胞的分批補(bǔ)料式培養(yǎng)導(dǎo)致增加的唾液酸含量和唾液酸化種類比例。在培養(yǎng)自始至終未經(jīng)處理和經(jīng)處理的培養(yǎng)物的標(biāo)準(zhǔn)化總唾液酸含量(5A)和標(biāo)準(zhǔn)化N聯(lián)唾液酸化種類比例(5B)。各參數(shù)的值作為平均值土標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)報告。標(biāo)準(zhǔn)化值是實(shí)際值除以任意值。
圖6顯示如實(shí)施例I中所述，DEX在7、10和20 L規(guī)模的生物反應(yīng)器中改良糖蛋白唾液酸化的能力。概括了來自不同運(yùn)行的經(jīng)DEX處理和未經(jīng)處理的培養(yǎng)物的與標(biāo)準(zhǔn)化唾液酸化比例比較的標(biāo)準(zhǔn)化最終總唾液酸摩爾比。標(biāo)準(zhǔn)化值是實(shí)際值除以任意值。圖I顯示如實(shí)施例2中所述，在經(jīng)地塞米松(DEX)處理的CHO細(xì)胞產(chǎn)生的IgG-融合蛋白中高分子量(HMW)種類的減少百分比。7兒首先使所有細(xì)胞在相同搖瓶中一起培養(yǎng)兩天，且隨后分為兩組，其中一半在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中接受I剛終濃度的單一劑量DEX。在第10天時收集上清液，并且在測定HMW種類百分比的SEC-HPLC分析前進(jìn)行純化。數(shù)據(jù)點(diǎn)是來自單一實(shí)驗(yàn)中的5個搖瓶的結(jié)果的平均值(±S.D.)。林與對照(CON)相比，/X0. 01。7凡在第2天時將DEX以不同濃度加入CHO細(xì)胞培養(yǎng)物中，并且在第10天時收集上清液。數(shù)據(jù)點(diǎn)是得自一式兩份燒瓶的結(jié)果的平均值。所有培養(yǎng)在相同時間開始，但在不同天數(shù)時添加
IUM DEX，在第10天時的相同時間收獲細(xì)胞時給出如所示的不同溫育時間。數(shù)據(jù)點(diǎn)是來自一式兩份燒瓶的結(jié)果的平均值。圖8顯示如實(shí)施例2中所述，在用地塞米松(DEX)處理的CHO細(xì)胞中谷胱甘肽還原酶的表達(dá)增加。在接種當(dāng)天時，將DEX以不同濃度加入細(xì)胞培養(yǎng)物中，且在第5天時收集細(xì)胞樣品。在4-15%梯度凝膠上分離全細(xì)胞裂解物。在檢測谷胱甘肽還原酶后，使用相同印跡來檢測￠-肌動蛋白用于樣品負(fù)荷比較。圖9顯示如實(shí)施例2中所述，在體外與GSH—起溫育的IgG-融合蛋白中HMW種類的減少百分比。將0、1 mM和3 mM終濃度的減少谷胱甘肽(GSH)加入經(jīng)純化IgG-融合蛋白的Tris-乙酸鹽緩沖(pH 7. 5)溶液中，且在SEC-HPLC分析前，將GSH和蛋白質(zhì)的混合物在37°C溫育I小時。數(shù)據(jù)點(diǎn)是來自2個實(shí)驗(yàn)的4次測定的平均值(土 S. D. )。*與對照(0mM GSH)相比，/X0. 05。

圖10顯示如實(shí)施例2中所述，在糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑RU-486存在下，地塞米松(DEX)的效應(yīng)減弱。IOA，由未經(jīng)處理的H印G-2和CHO細(xì)胞制備全細(xì)胞裂解物且在4-15%梯度凝膠上分離。使用IfepG-2樣品作為用于初次抗體驗(yàn)證目的的人起源對照。2似，在接種后一天(第I天)，將RU-486以I PM引入培養(yǎng)物中，且在第2天時分開經(jīng)RU-486預(yù)處理的CHO細(xì)胞，其中一半在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中接受0. I剛終濃度的單一劑量DEX。在第10天時收集細(xì)胞樣品；所有其他程序都與圖2中的那些相同。肌在第I天時將RU-486以I ii M引入培養(yǎng)物中，并且隨后在第2天時將DEX以0. I ii M或I ii M的終濃度加入經(jīng)RU-486預(yù)處理的培養(yǎng)物中。在第10天時收集上清液。數(shù)據(jù)點(diǎn)是來自一式兩份燒瓶的結(jié)果的平均值。圖11顯示如實(shí)施例3中所述，在無血清培養(yǎng)基中CHO細(xì)胞的培養(yǎng)物中細(xì)胞死亡被DEX抑制。對于在第2天開始的處理，DEX對活細(xì)胞密度(IlA)和活力(IlB)的作用的劑量反應(yīng)曲線。對于I剛處理濃度，DEX對活細(xì)胞密度(IlC)和活力(IlD)的作用的時間過程曲線。各值是得自一式兩份完成的實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)的平均值。圖12顯示如實(shí)施例3中所述，通過DEX，CHO細(xì)胞比生長速率減少，同時細(xì)胞比生產(chǎn)率增加。DEX對CHO細(xì)胞比生長速率(12A)、標(biāo)準(zhǔn)化體積生產(chǎn)率(12B)和標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞比生產(chǎn)率(12B)的作用。DEX處理在第2天時開始。值反映來自5個實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。標(biāo)準(zhǔn)化值是實(shí)際值除以任意值。圖13顯示如實(shí)施例3中所述，通過qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡分析證實(shí)抗細(xì)胞凋亡基因GILZ在經(jīng)DEX處理CHO細(xì)胞中的上調(diào)。(13A)在接種后第2天時，將DEX分別以0和I 剛的終濃度加入一式三份培養(yǎng)物中。在接種后第5天和第8天時提取mRNA樣品。各參數(shù)的值作為平均值土標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)報告。(13B)在接種后第2天時，將DEX分別以0和I剛的終濃度加入一式三份培養(yǎng)物中。收集細(xì)胞樣品且在接種后第5天和第8天時制備全細(xì)胞裂解物。圖14顯示如實(shí)施例3中所述，地塞米松的死亡抑制作用涉及GILZ和糖皮質(zhì)激素受體。在RU-486的存在和不存在下，由DEX誘導(dǎo)的最終活力的百分比增加(與不含DEX處理相比)(14A)、GILZ基因表達(dá)(14B)和GILZ蛋白表達(dá)(14C)的倍數(shù)變化。在接種后48小時，將RU-486以0或I剛引入細(xì)胞培養(yǎng)懸浮液中，24小時后，隨后將0、0. I剛和I剛的DEX加入培養(yǎng)物中。收集細(xì)胞用于活力、qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡分析。小圖J中報告的各值是得自一式兩份實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)的平均值。小圖A中報告的各值是得自一式三份實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。圖15顯示如實(shí)施例3中所述，在10 L生物反應(yīng)器中經(jīng)DEX處理的CHO細(xì)胞的分批補(bǔ)料式培養(yǎng)導(dǎo)致改良的V⑶、活力、滴度和唾液酸摩爾比。未經(jīng)處理培養(yǎng)物和經(jīng)處理培養(yǎng)物的活細(xì)胞密度(15A)、活力(15B)和標(biāo)準(zhǔn)化滴度(15C)概況，其中DEX處理在第2天和第7天時開始。標(biāo)準(zhǔn)化值是實(shí)際值除以任意值。圖16展示DEX對具有CTLA4Ig分泌的CHO細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞生長的作用。DEX對用DEX分別以0、0. 001,0. 01,0. I、I和10 m的終濃度處理的活細(xì)胞密度(16A)和活力(16B)的作用的劑量反應(yīng)曲線。處理在接種后第二天時開始，且各值是得自一式兩份完成的實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)的平均值。圖17顯示DEX對CTLA4Ig的唾液酸摩爾比和HMW水平的作用。該圖顯示用DEX分別以0、0. 001、0. 01、0. I、I和10 m的終濃度處理的培養(yǎng)物的最終總唾液酸摩爾比(17A)和HMW種類(17B)。處理在接種后第二天時開始，且各值是得自一式兩份完成的實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)的平均值。小圖^中報告的值是標(biāo)準(zhǔn)化值，其是實(shí)際值除以任意值。圖18顯示如實(shí)施例5中所述，在大規(guī)模重組糖蛋白生產(chǎn)中包括DEX的可行性。該圖顯示分別以7 L (n=16)和500 L (n=6)和5000 L (n=3)規(guī)模產(chǎn)生的重組糖蛋白的活細(xì)胞密度(18A)、活力(18B)、標(biāo)準(zhǔn)化滴度(18C)和標(biāo)準(zhǔn)化唾液酸含量(18D)。值反映在各規(guī)模來自多個實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。標(biāo)準(zhǔn)化值是實(shí)際值除以任意值。在所有規(guī)模中使用相同除數(shù)用于標(biāo)準(zhǔn)化。圖19描繪CTLA4Ig的核苷酸序列(SEQ ID NO: I)和所編碼的氨基酸序列(SEQ IDNO: 2)，其具有信號肽、CTLA4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的野生型氨基酸序列(始于+1位置的甲硫氨酸到+124位置的天冬氨酸，或始于-I位置的丙氨酸到+124位置的天冬氨酸)、和Ig區(qū)域。圖20描繪CTLA4突變分子(L104EA29Hg)的核苷酸序列(SEQ ID NO: 3)和所編碼的氨基酸序列(SEQ ID N0:4)，其具有信號肽、CTLA4的突變細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(始于+1位置的甲硫氨酸且止于+124位置的天冬氨酸，或始于-I位置的丙氨酸且止于+124位置的天冬氨酸)、和Ig區(qū)域。圖21描繪與制瘤素M信號肽(在-26位置至在_2位置)融合的人CTLA4受體(在本文中稱為“野生型” CTLA4)的核酸序列(SEQ ID NO: 5)和所編碼的完整氨基酸序列(SEQID N0:6)。(美國專利號 5，434，131 和 5，844，095)。發(fā)明詳述
本發(fā)明描述用于在哺乳動物或動物細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生蛋白質(zhì)的新過程，所述蛋白質(zhì)優(yōu)選重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物、更優(yōu)選糖蛋白產(chǎn)物。此類方法達(dá)到增加的活細(xì)胞密度、細(xì)胞活力、生產(chǎn)率和唾液酸含量以及降低的蛋白質(zhì)聚集。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)過程，其包含培養(yǎng)表達(dá)目的蛋白的宿主細(xì)胞；和將糖皮質(zhì)激素化合物加入細(xì)胞培養(yǎng)物中。糖皮質(zhì)激素化合物包括但不限于氫化可的松(可從Sigma-Aldrich, St. Louis,MO獲得)、潑尼松(可從Sigma-Aldrich獲得)、潑尼松龍(可從Sigma-Aldrich獲得)、甲潑尼龍(可從Sigma-Aldrich獲得)、地塞米松(可從Sigma-Aldrich獲得)、倍他米松(可從Sigma-Aldrich獲得)、曲安西龍(可從Sigma-Aldrich獲得)、乙酸氟氫可的松(可從Sigma-Aldrich獲得)。所述化合物從所列出的來源可容易獲得,或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式可容易獲得。優(yōu)選糖皮質(zhì)激素化合物包括但不限于氫化可的松、潑尼松龍、倍他米松和地塞米松。最優(yōu)選的是地塞米松。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，糖皮質(zhì)激素化合物在接種時添加或可以為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組分。接種在第0天時發(fā)生。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，糖皮質(zhì)激素化合物在接種后某一時間點(diǎn)添加，即其在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不存在且在接種時不存在。優(yōu)選地，糖皮質(zhì)激素化合物在培養(yǎng)第I天時或以后添加。根據(jù)本發(fā)明，糖皮質(zhì)激素化合物可以在指定時間段過程中一次、兩次、三次或任何次數(shù)加入細(xì)胞培養(yǎng)物中?？梢月?lián)合使用一或多種糖皮質(zhì)激素化合物。即，糖皮質(zhì)激素化合物的任何給定單次添加可以包括一或多種其他糖皮質(zhì)激素化合物的添加。類似地，如果存在糖皮質(zhì)激素化合物的超過一次添加，則可以在不同添加時添加不同糖皮質(zhì)激素化合物?？梢栽谔瞧べ|(zhì)激素化合物添加前、同時或后，在指定時間段過程中或不在指定時間段過程中，將額外化合物和物質(zhì)(包括糖皮質(zhì)激素化合物)加入培養(yǎng)物中。在優(yōu)選實(shí)施方案中，存在糖皮質(zhì)激素化合物的單次即一次添加。在優(yōu)選實(shí)施方案中，添加一種糖皮質(zhì)激素化合物。根據(jù)本發(fā)明，可以通過任何方式將糖皮質(zhì)激素化合物加入細(xì)胞培養(yǎng)物中。添加糖皮質(zhì)激素化合物的方式包括但不限于以其所獲得的形式溶于DMSO中、溶于有機(jī)溶劑中、溶于水中、溶于培養(yǎng)基中、溶于補(bǔ)料培養(yǎng)基中、溶于合適培養(yǎng)基中、或其任何組合。優(yōu)選地，DEX作為其中DEX溶于乙醇中的溶液添加，所述溶液隨后用水稀釋用于進(jìn)一步使用(即例如將DEX加入補(bǔ)料培養(yǎng)基中)。根據(jù)本發(fā)明，添加糖皮質(zhì)激素化合物以使培養(yǎng)物中的濃度達(dá)到合適水平。作為非限制性例子，添加糖皮質(zhì)激素化合物至I nM-1 mM的濃度。優(yōu)選地，添加糖皮質(zhì)激素化合物至 I nM-0. I iiM 或 0.1 uM-10 y M ;更優(yōu)選約 5 nM_15 nM 或 0. 5 u M-5 U M 的濃度；更優(yōu)選約10 nM或I PM靶量。根據(jù)本發(fā)明，培養(yǎng)可以在添 加糖皮質(zhì)激素化合物后運(yùn)行任何時間長度。培養(yǎng)運(yùn)行時間可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員基于下述相關(guān)因素進(jìn)行測定例如可回收蛋白的數(shù)量和品質(zhì)、和上清液中起因于細(xì)胞裂解的污染性細(xì)胞種類(例如蛋白質(zhì)和DNA)的水平，所述種類使目的蛋白的回收復(fù)雜。在本發(fā)明增加細(xì)胞活力的細(xì)胞培養(yǎng)過程和方法的特定實(shí)施方案中，糖皮質(zhì)激素化合物在接種后初始死亡期開始前某一時間點(diǎn)添加。優(yōu)選地，糖皮質(zhì)激素化合物在接種后初始生長期過程中某一時間點(diǎn)添加。更優(yōu)選地，糖皮質(zhì)激素化合物在初始生長期的后半部分過程中添加。更優(yōu)選地，糖皮質(zhì)激素化合物在初始生長期結(jié)束時或大約結(jié)束時添加。初始生長期指在不存在指定添加糖皮質(zhì)激素化合物的情況下觀察到的生長期。初始死亡期指在不存在指定添加糖皮質(zhì)激素化合物的情況下觀察到的死亡期。初始生長期可以在初始死亡期開始時結(jié)束，或在初始生長期與初始死亡期之間可以存在任何時間長度的靜止期。例如，在其中初始生長期是第0天至第6天且初始死亡期始于第7天時的細(xì)胞培養(yǎng)中，在特定實(shí)施方案中，糖皮質(zhì)激素化合物在接種后且在第7天前某一時間點(diǎn)添加。在具體實(shí)施方案中，糖皮質(zhì)激素化合物在接種后且不遲于第6天添加。在具體實(shí)施方案中，糖皮質(zhì)激素化合物在第I天和第6天之間添加。在另一具體實(shí)施方案中，糖皮質(zhì)激素化合物在第3-6天時與補(bǔ)料培養(yǎng)基一起添加。在其他具體實(shí)施方案中，糖皮質(zhì)激素化合物在大約第2天時或在第2天時添加。已發(fā)現(xiàn)(參見實(shí)施例3)在實(shí)施本發(fā)明時，細(xì)胞培養(yǎng)物的活力延長。如果在培養(yǎng)中的細(xì)胞活力對于在條件的存在下高于在不存在條件的情況下一段時間，那么例如添加糖皮質(zhì)激素化合物的條件引起延長的細(xì)胞活力。因此，在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及(I)細(xì)胞培養(yǎng)過程，和(2)延長培養(yǎng)物中的細(xì)胞活力的方法，其包含培養(yǎng)表達(dá)目的蛋白的宿主細(xì)胞；和將糖皮質(zhì)激素化合物加入細(xì)胞培養(yǎng)物中；其中細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞活力是延長的。已發(fā)現(xiàn)(參見實(shí)施例3)當(dāng)糖皮質(zhì)激素化合物在接種后且在初始死亡期開始前某一時間點(diǎn)添加時，死亡期的死亡率可以是減少的，低于在不存在添加糖皮質(zhì)激素化合物的情況下觀察到的死亡期的那種。因此，在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及(I)細(xì)胞培養(yǎng)過程，和(2)用于減少細(xì)胞培養(yǎng)的死亡期的死亡率的過程，其包含培養(yǎng)表達(dá)目的蛋白的宿主細(xì)胞；和在接種后初始死亡期開始前某一時間點(diǎn)，將糖皮質(zhì)激素化合物加入細(xì)胞培養(yǎng)物中；其中死亡期的死亡率是減少的。在更特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及(I)細(xì)胞培養(yǎng)過程，和(2)用于減少細(xì)胞培養(yǎng)的死亡期的死亡率的過程，其包含培養(yǎng)表達(dá)目的蛋白的宿主細(xì)胞；和在接種后在初始生長期過程中某一時間點(diǎn)，將糖皮質(zhì)激素化合物加入細(xì)胞培養(yǎng)物中；其中死亡期的死亡率是延遲的。在更特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及(I)細(xì)胞培養(yǎng)過程，和(2)用于減少細(xì)胞培養(yǎng)的死亡期的死亡率的過程，其包含培養(yǎng)表達(dá)目的蛋白的宿主細(xì)胞；和在初始生長期的后半部分過程中，將糖皮質(zhì)激素化合物加入細(xì)胞培養(yǎng)物中；其中死亡期的死亡率是減少的。在其他特定實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于減少細(xì)胞培養(yǎng)的死亡期的死亡率的過程，其包含培養(yǎng)表達(dá)目的蛋白的宿主細(xì)胞；和在初始生長期結(jié)束時或大約結(jié)束時，將糖皮質(zhì)激素化合物加入細(xì)胞培養(yǎng)物中；其中死亡期的死 亡率是延遲的。實(shí)施例3也證實(shí)，當(dāng)與未經(jīng)處理的細(xì)胞培養(yǎng)物相比時，氫化可的松(HYC)、潑尼松龍(PRD)和地塞米松(DEX)在經(jīng)處理的細(xì)胞培養(yǎng)物中都顯示劑量依賴性細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)。然而，需要較高濃度的HYC和PRD，以達(dá)到相同水平的細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)，這與其效力差異一致(SPHYC和PRD僅與DEX 5%和20% —樣有效)。細(xì)胞培養(yǎng)過程，尤其是非連續(xù)性過程的運(yùn)行時間通常受剩余活細(xì)胞密度限制，所述活細(xì)胞密度在死亡期過程中降低。較長運(yùn)行時間可以允許達(dá)到較高產(chǎn)物滴度。產(chǎn)物品質(zhì)問題也為減少死亡率提供了動力，因?yàn)榧?xì)胞死亡可以將唾液酸酶釋放至培養(yǎng)物上清液中，這可以降低所表達(dá)蛋白質(zhì)中的唾液酸含量。蛋白質(zhì)純化問題為延遲或阻止死亡期提供了另一個動力。培養(yǎng)物中細(xì)胞碎片和死細(xì)胞內(nèi)含物的存在可以對在培養(yǎng)運(yùn)行結(jié)束時分離和/或純化蛋白質(zhì)產(chǎn)物的能力造成負(fù)面影響。已發(fā)現(xiàn)(參見實(shí)施例2)，將糖皮質(zhì)激素化合物加入細(xì)胞培養(yǎng)物中減少目的蛋白質(zhì)的聚集。因此，在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及(I)細(xì)胞培養(yǎng)過程，和(2)用于減少蛋白質(zhì)聚集百分比的過程，其包含培養(yǎng)表達(dá)目的蛋白的宿主細(xì)胞；和將糖皮質(zhì)激素化合物加入細(xì)胞培養(yǎng)物中；其中高分子量種類的百分比是降低的。已發(fā)現(xiàn)(參見實(shí)施例1)，將糖皮質(zhì)激素化合物加入細(xì)胞培養(yǎng)物中通過增強(qiáng)總唾液酸含量和增加唾液酸化種類的百分比來改良目的蛋白的唾液酸化。實(shí)施例I也證實(shí)，當(dāng)與未經(jīng)處理的細(xì)胞培養(yǎng)物相比時，氫化可的松(HYC)、潑尼松龍(PRD)和地塞米松(DEX)在經(jīng)處理的細(xì)胞培養(yǎng)物中都顯示劑量依賴性唾液酸化改良。然而，需要較高濃度的HYC和PRD，以達(dá)到相同程度的改良，這與其效力差異一致。因此，在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及(I)細(xì)胞培養(yǎng)過程，和(2)用于增加唾液酸化種類的百分比的過程，其包含培養(yǎng)表達(dá)目的蛋白的宿主細(xì)胞；和將糖皮質(zhì)激素化合物加入細(xì)胞培養(yǎng)物中；其中唾液酸化種類的百分比是增加的。因此，在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及(I)細(xì)胞培養(yǎng)過程，和(2)用于增加總唾液酸含量的過程，其包含培養(yǎng)表達(dá)目的糖蛋白的宿主細(xì)胞；和將糖皮質(zhì)激素化合物加入細(xì)胞培養(yǎng)物中；其中總唾液酸含量是增加的。因此，在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及(I)細(xì)胞培養(yǎng)過程，和(2)用于減少細(xì)胞培養(yǎng)物中糖蛋白的去唾液酸化比率的過程，其包含培養(yǎng)表達(dá)目的糖蛋白的宿主細(xì)胞；和將糖皮質(zhì)激素化合物加入細(xì)胞培養(yǎng)物中；其中去唾液酸化比率是減少的。關(guān)于糖蛋白純化和分析的技術(shù)與程序
在本發(fā)明所涵蓋的培養(yǎng)方法中，根據(jù)需要使用本領(lǐng)域已知并實(shí)踐的分離和純化方法，通常在總細(xì)胞培養(yǎng)期結(jié)束時收集、回收、分離和/或純化、或基本上純化由細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白。優(yōu)選地，從培養(yǎng)基或上清液中分離由培養(yǎng)細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)；然而，使用本領(lǐng)域已知并實(shí)踐的方法且如下文進(jìn)一步描述的，也可以從宿主細(xì)胞例如細(xì)胞裂解物中回收蛋白質(zhì)。需要時，通過碳水化合物分析的常規(guī)技術(shù)可以照常規(guī)分析通過本發(fā)明的過程產(chǎn)生的包含糖蛋白的復(fù)合碳水化合物。例如，本領(lǐng)域眾所周知的例如凝集素印跡技術(shù)揭示末端甘露糖或其他糖例如半乳糖的比例。通過使用無水肼或酶促方法從蛋白質(zhì)中釋放糖，且通過離子交換層析、尺寸排阻層析或本領(lǐng)域眾所周知的其他方法分級寡糖，可以證實(shí)單_、二 _、三-或四-觸角寡糖通過唾液酸的終止。在用神經(jīng)氨酸酶處理以去除唾液酸前和后，也可以測量糖蛋白的pi。在神經(jīng)氨酸酶處理后Pl的增加指示唾液酸存在于糖蛋白上。碳水化合物結(jié)構(gòu)通常作為N聯(lián)或0聯(lián)碳水化合物存于所表達(dá)蛋白質(zhì)上。N聯(lián)和0聯(lián)碳水化合物主要在其核心結(jié)構(gòu)方面不同。N聯(lián)糖基化指碳水化合物部分經(jīng)由GIcNAc附著至肽鏈中的天冬酰胺殘基。N聯(lián)碳水化合物都含有共同的Manl-6 (Manl_3)ManP 1_4G1cNAcP l_4GlcNAc P-R核心結(jié)構(gòu)，其中在這種核心結(jié)構(gòu)中的R代表天冬酰胺殘基。所產(chǎn)生蛋白質(zhì)的肽序列含有天冬酰胺-X-絲氨酸、天冬酰胺-X-蘇氨酸、和天冬酰胺-X-半胱氨酸，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸。相比之下，0聯(lián)碳水化合物的特征在于共同的核心結(jié)構(gòu)，其是附著至蘇氨酸或絲氨酸的羥基上的GalNAc。在N聯(lián)和0聯(lián)碳水化合物中，最重要的是復(fù)合N-和0聯(lián)碳水化合物。此類復(fù)合碳水化合物含有若干觸角結(jié)構(gòu)。單-、二-、三-、和四-外部結(jié)構(gòu)對于末端唾液酸的添加具有重要意義。此類外部鏈結(jié)構(gòu)為包含蛋白質(zhì)產(chǎn)物的碳水化合物的特異性糖和連接提供額外位點(diǎn)。所得到的碳水化合物可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法來分析。本領(lǐng)域已知用于糖基化分析的若干種方法且其可以用于本發(fā)明的背景中。這些方法提供關(guān)于附著至所產(chǎn)生肽的寡糖的身份和組成的信息。與本發(fā)明結(jié)合有用的用于碳水化合物分析的方法包括但不限于凝集素層析法；HPAEC-PAD，其使用高pH陰離子交換層析，以基于電荷分離寡糖；NMR ;質(zhì)譜法；HPLC ；GPC ;單糖組成分析；和序貫酶促消化。此外，用于釋放寡糖的方法是本領(lǐng)域已知且實(shí)踐的。這些方法包括I)酶促方法，其通常使用肽-N-糖苷酶F/內(nèi)-￠-半乳糖苷酶執(zhí)行；2) ^消除方法，使用強(qiáng)堿性環(huán)境以主要釋放0聯(lián)結(jié)構(gòu)；和3)化學(xué)方法，使用無水肼以釋放N聯(lián)和0聯(lián)寡糖。分析可以使用以下步驟來執(zhí)行1.針對去離子水透析樣品以去除所有緩沖鹽，隨后為凍干。2.用無水肼釋放完整寡糖鏈。3.用無水甲醇HCl處理完整寡糖鏈，以釋放作為0-甲基衍生物的個別單糖。
4.任何伯氨基的N-乙酰化。5.衍生化以獲得全0-三甲基甲硅烷基甲基糖苷。6.通過在CP-SIL8柱上的毛細(xì)氣液層析(GLC)分離這些衍生物。7.與已知標(biāo)準(zhǔn)比較，通過來自GLC的保留時間和質(zhì)譜法鑒定個別糖苷衍生物。8.通過FID使用內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)(13-0-甲基-D-葡萄糖)定量個別衍生物。中性糖和氨基糖可以通過與脈沖安培檢測組合的高效陰離子交換層析(HPAE-PAD碳水化合物系統(tǒng)；Dionex公司)進(jìn)行測定。例如,可以通過在100°C在20% (v/v)三氟乙酸中水解6小時來釋放糖。然后通過凍干或用Speed-Vac (Savant Instruments)來干燥水解產(chǎn)物。然后將殘?jiān)苡?%三水合乙酸鈉溶液中，并且在HPLC-AS6柱上進(jìn)行分析(如Anumula 等人，1991, Anal. Biochem.，195:269-280 所述)?？商娲?，可以執(zhí)行免疫印跡碳水化合物分析。在這個程序中，使用市售聚糖檢測、系統(tǒng)(Boehringer)來檢測結(jié)合蛋白質(zhì)的碳水化合物，該系統(tǒng)基于由Haselbeck等人(1993，Glycoconjugate J. , 7:63)所述的氧化性免疫印跡程序。遵循由制造商推薦的染色方案，除將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上而不是硝酸纖維素膜上，且封閉緩沖液含有溶于10 mMTris緩沖液(pH 7. 4)中的5%牛血清白蛋白連同0. 9%氯化鈉。用與堿性磷酸鹽綴合物(Boehringer)相連的抗地高辛配基抗體溶于Tris緩沖鹽水中的1:1000稀釋液來執(zhí)行檢測，使用溶于100 mM Tris緩沖液(pH 9. 5)中的磷酸酶底物4-氯化硝基四氮唑藍(lán)(0. 03%(w/v))和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽(0.03% (w/v))，所述緩沖液含有100 mM氯化鈉和50 mM氯化鎂。含有碳水化合物的蛋白質(zhì)條帶通常在約10至15分鐘內(nèi)顯影。也可以通過用肽-N-糖苷酶F消化來分析與蛋白質(zhì)結(jié)合的碳水化合物。根據(jù)這個程序，使殘?jiān)鼞腋∮?4 UL緩沖液中，所述緩沖液含有0. 18%SDS、18 mM ￠-巰基乙醇、90mM磷酸鹽、3. 6 mM EDTA, pH 8. 6，且在100°C加熱3分鐘。在冷卻至室溫后，將樣品分為兩個等份。不再進(jìn)一步處理的一份用作對照。將另一份調(diào)整至約l%NP-40去污劑，隨后添加0. 2單位的肽-N-糖苷酶F (Boehringer)。兩個樣品都在37°C加熱2小時，且隨后通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳來分析。
此外，通過常規(guī)方法來評價糖蛋白產(chǎn)物的唾液酸含量。例如,可以通過直接比色法來分開測定唾液酸(Yao等人，1989，Anal. Biochem.，179:332-335)，優(yōu)選使用一式三份樣品。另一種唾液酸測定方法涉及使用硫代巴比妥酸(TBA),如由Warren等人(1959, J.Biol. Chem. , 234:1971-1975)所述的。另外一種方法涉及高效層析,例如由H. K. Ogawa等人(1993, J. Chromatography, 612:145-149)所述的。舉例說明地，對于糖蛋白回收、分離和/或純化，使細(xì)胞培養(yǎng)基或細(xì)胞裂解物離心，以去除細(xì)胞微粒和細(xì)胞碎片。通過合適純化技術(shù)從污染性可溶蛋白和多肽中分離或純化出期望多肽產(chǎn)物。以下程序提供示例性但非限制性用于蛋白質(zhì)的純化方法在免疫親和或離子交換柱上的分離或分級；乙醇沉淀；反相HPLC ;在樹脂(例如二氧化硅)或陽離子交換樹脂(例如DEAE)上的層析；層析聚焦；SDS-PAGE ;硫酸銨沉淀；使用例如S^hadex G-75、Sepharose的凝膠過濾；蛋白A瓊脂糖層析用于去除免疫球蛋白污染物；等?？梢允褂闷渌砑觿├绲鞍酌敢种苿?例如PMSF或蛋白酶K)來抑制純化過程中的蛋白降解。熟練從業(yè)者應(yīng)理解，用于給定目的多肽的純化方法可能需要修改，所述修改允許在細(xì)胞培養(yǎng)中重組表達(dá)的多肽中的變化。可以選擇碳水化合物且富集唾液酸的那些純化程序是特別優(yōu)選的，例如離子交換軟凝膠層析或使用陽離子或陰離子交換樹脂的HPLC，在其中收集一種或多種更酸性的級分。細(xì)胞、蛋白質(zhì)和細(xì)胞培養(yǎng)
在本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)過程或方法中，可以將細(xì)胞維持在如本領(lǐng)域常規(guī)已知的多種細(xì)胞培養(yǎng)基，即基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。例如，所述方法適用于與維持在細(xì)胞培養(yǎng)基中的大量細(xì)胞一起使用，所述培養(yǎng)基可以補(bǔ)充有營養(yǎng)素等。通常，“細(xì)胞培養(yǎng)基”(也稱為“培養(yǎng)基”)是本領(lǐng)域從業(yè)者所理解且已知指營養(yǎng)液的術(shù)語，在所述營養(yǎng)液中生長細(xì)胞優(yōu)選動物或哺乳動物細(xì)胞，且一般提供來自以下的至少一種或多種組分能源(通常以碳水化合物例如葡萄糖的形式);所有必需氨基酸，且一般是二十種基礎(chǔ)氨基酸加上半胱氨酸；維生素和/或通常以低濃度需要的其他有機(jī)化合物；脂質(zhì)或游離脂肪酸，例如亞油酸；和微量元素，例如通常以極低濃度(通常在微摩爾范圍中)需要的無機(jī)化合物或天然存在的元素。細(xì)胞培養(yǎng)基也可以經(jīng)補(bǔ)充而含有多種任選組分，例如激素及其他生長因子，例如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、表皮生長因子、血清等；鹽，例如鈣、鎂和磷酸鹽，以及緩沖液(例如HEPES);核苷和堿，例如腺苷、胸苷、次黃嘌呤；以及蛋白質(zhì)和組織水解產(chǎn)物，例如水解動物蛋白(蛋白胨或蛋白胨混合物，其可以得自動物副產(chǎn)物、純化明膠或植物材料)；抗生素，例如慶大霉素；和細(xì)胞保護(hù)劑，例如普流尼克多元醇(普流尼克F68)。優(yōu)選的是無血清且不含動物起源產(chǎn)物或成分的細(xì)胞營養(yǎng)培養(yǎng)基。如從業(yè)者所了解的，動物或哺乳動物細(xì)胞在這樣的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基適合于待培養(yǎng)的特定細(xì)胞，并且可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員無需過度實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確定?？梢岳蒙藤徔傻玫呐囵B(yǎng)基，且包括例如最小必需培養(yǎng)基(MEM，Sigma, St. Louis, MO)；Ham’s FlO培養(yǎng)基(Sigma);達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco’s Modified EaglesMedium) (DMEM, Sigma) ；RPMI-1640 培養(yǎng)基(Sigma) ;HyClone 細(xì)胞培養(yǎng)基(HyClone, Logan,UT);和化學(xué)成分確定的(CD)培養(yǎng)基，其經(jīng)配制用于特定細(xì)胞類型，例如CD-CHO培養(yǎng)基(Invitrogen, Carlsbad, CA)。根據(jù)需要或期望且如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知且使用常規(guī)技術(shù)實(shí)踐的，可以向上述示例性培養(yǎng)基中以合適濃度或量添加上述補(bǔ)充性組分或成分，包括任選組分。
此外，適合于本發(fā)明方法的細(xì)胞培養(yǎng)條件是通常采用且已知用于分批、分批補(bǔ)料式、或連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞的那些，除溫度外還應(yīng)注意PH，例如約6. 5至約7. 5 ;溶解氧(02)，例如在約5 -9 0 %之間的空氣飽和度和二氧化碳(CO2 )，攪動和濕度。作為舉例說明性但非限制性例子，用于本發(fā)明的分批補(bǔ)料式過程的合適細(xì)胞培養(yǎng)基包含經(jīng)修改的CD-CHO培養(yǎng)基(Invitrogen, Carlsbad, CA)。也可以采用補(bǔ)料培養(yǎng)基,例如經(jīng)修改的eRDF培養(yǎng)基(Invitrogen, Carlsbad, CA)。優(yōu)選的是還含有糖皮質(zhì)激素例如地塞米松的補(bǔ)料培養(yǎng)基。動物細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞、動物或哺乳動物宿主細(xì)胞、宿主細(xì)胞、重組細(xì)胞、重組宿主細(xì)胞等是關(guān)于可以根據(jù)本發(fā)明的過程培養(yǎng)的細(xì)胞的所有術(shù)語。此類細(xì)胞通常是得自或衍生自哺乳動物的細(xì)胞系，并且當(dāng)置于含有合適營養(yǎng)素和/或生長因子的培養(yǎng)基中的單層培養(yǎng)物或懸浮培養(yǎng)中時能夠生長且存活。具有相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)者能夠憑經(jīng)驗(yàn)容易地確定生長和維持特定細(xì)胞培養(yǎng)物所需的生長因子和營養(yǎng)素，例如以下文獻(xiàn)中所述=Barnes和 Sato( 1980，Cell, 22:649);Mammalian Cell Culture, J. P. Mather 編輯,Plenum Press,NY, 1984 ;和美國專利號5，721，121。根據(jù)本發(fā)明方法可以培養(yǎng)多種類型的細(xì)胞。所述細(xì)胞通常是動物或哺乳動物細(xì)胞，其可以向培養(yǎng)基中表達(dá)并分泌、或可以經(jīng)分子改造而表達(dá)并分泌大量特定蛋白、更特別地目的糖蛋白。應(yīng)當(dāng)理解由宿主細(xì)胞產(chǎn)生的糖蛋白對于宿主細(xì)胞可以是內(nèi)源或同源的?？商娲覂?yōu)選地，糖蛋白對于宿主細(xì)胞是異源即外源的，例如由中國倉鼠卵巢(CHO)宿主細(xì)胞產(chǎn)生并分泌的人糖蛋白。同樣優(yōu)選地，哺乳動物糖蛋白即最初得自或衍生自哺乳動物生物的那些通過本發(fā)明的方法來獲得，且優(yōu)選通過細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基內(nèi)?？梢杂欣赝ㄟ^本發(fā)明的方法產(chǎn)生的哺乳動物糖蛋白的例子包括但不限于細(xì)胞因子、細(xì)胞因子受體、生長因子(例如EGF、HER-2、FGF-a、FGF-^、TGF-a、TGF-^、PDGF,IGF-U IGF-2、NGF, NGF-^ );生長因子受體，包括融合或嵌合蛋白。其他非限制性例子包括生長激素(例如人生長激素、牛生長激素)；胰島素(例如胰島素A鏈和胰島素B鏈)、胰島素原；紅細(xì)胞生成素(EPO);集落刺激因子(例如G-CSF、GM-CSF, M-CSF);白細(xì)胞介素(例如IL-I到IL-12);血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及其受體(VEGF-R);干擾素(例如IFN-a、^或Y );腫瘤壞死因子(例如TNF-a和TNF-P )及其受體TNFR-I和TNFR-2 ;血小板生成素(TPO);凝血酶；腦利鈉肽(BNP);凝血因子(例如因子VIII、因子IX、血管性血友病因子(vonWillebrands factor)等)；抗凝血因子；組織纖溶酶原激活物(TPA),例如尿激酶或人尿或組織型TPA ;卵泡刺激激素(FSH);促黃體激素(LH);降鈣素AD蛋白(例如⑶3、⑶4、⑶8、⑶28、⑶19等);CTLA蛋白(例如CTLA4);T細(xì)胞和B細(xì)胞受體蛋白；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BNP，例如BMP-I、BMP-2、BMP-3等)；神經(jīng)營養(yǎng)因子，例如骨源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF);神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，例如3-6 ;腎素；類風(fēng)濕因子；RANTES ;白蛋白；松弛素；巨噬細(xì)胞抑制蛋白(例如MIP-I、MIP-2);病毒蛋白或抗原；表面膜蛋白；離子通道蛋白；酶；調(diào)節(jié)蛋白；抗體；免疫調(diào)節(jié)蛋白(例如HLA、MHC、B7家族)；歸巢受體；轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；超氧化物歧化酶(SOD) ；G蛋白偶聯(lián)受體蛋白(GPCR);神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白；阿爾茨海默氏病相關(guān)蛋白和肽(例如A-P )、和如本領(lǐng)域已知的其他。融合蛋白和多肽，嵌合蛋白和多肽，以及上述蛋白和多肽任何的片段或部分、或突變體、變體、或類似物也包括在可以通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的合適蛋白、多肽和肽中。適合具有、表達(dá)和產(chǎn)生蛋白質(zhì)用于后續(xù)分離和/或純化的動物或哺乳動物宿主細(xì)胞的非限制性例子包括中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CH0)，例如CHO-Kl (ATCC CCL-61)、DG44 (Chasin 等人，1986, Som. Cell Molec. Genet. , 12:555-556 ；和 Kolkekar 等人， 1997，Biochemistry, 36:10901-10909), CHO-Kl Tet-On 細(xì)胞系(Clontech)、命名為 ECACC85050302 的 CHO (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK)、CHO 克隆 13 (GEIMG, Genova, IT)、CHO 克隆 B (GEMG，Genova，IT)、命名為 ECACC 93061607 的 CH0-K1/SF (CAMR, Salisbury,Wiltshire，UK)、命名為 ECACC 92052129 的 RR-CHOKI (CAMR ,Salisbury,Wiltshire, UK),^氫葉酸還原酶陰性 CHO細(xì)胞(CH0/-DHFR，Urlaub 和 Chasin，1980，Proc. Natl. Acad. Sci.USA，77:4216)、和dp 12. CHO細(xì)胞(美國專利號5，721，121);通過SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CVl細(xì)胞(C0S細(xì)胞，C0S-7, ATCC CRL-1651);人胚腎細(xì)胞(例如293細(xì)胞、或亞克隆用于在懸浮培養(yǎng)中生長的 293 細(xì)胞，Graham 等人，1977，J. Gen. Virol.，36:59);幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK，ATCCCCL-10);猴腎細(xì)胞(CV1，ATCC CCL-70);非洲綠猴腎細(xì)胞(VER0-76，ATCC CRL-1587 ；VER0,ATCC CCL-81);小鼠睪丸支持細(xì)胞(TM4，Mather，1980，Biol. R印rod.，23:243-251);人宮頸癌細(xì)胞(HELA，ATCC CCL-2);犬腎細(xì)胞(MDCK，ATCC CCL-34);人肺細(xì)胞(W138，ATCC CCL-75)；人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞(J1EP-G2，HB 8065);小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞(MMT 060562，ATCC CCL-51);水牛鼠肝細(xì)胞(BRL 3A, ATCC CRL-1442) ；TRI 細(xì)胞(Mather，1982，Annals NY Acad. Sci.，383:44-68) ；MCR 5細(xì)胞；FS4細(xì)胞。優(yōu)選的是CHO細(xì)胞，特別是CH0/-DHFR細(xì)胞。適合于在本發(fā)明的方法和過程中培養(yǎng)的細(xì)胞可以含有例如經(jīng)由轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、感染或注射引入的表達(dá)載體(構(gòu)建體)例如質(zhì)粒等，所述載體具有編碼用于在培養(yǎng)過程中表達(dá)并產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的編碼序列或其部分。此類表達(dá)載體含有轉(zhuǎn)錄和翻譯所插入編碼序列的必需元件?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知并實(shí)踐的方法來構(gòu)建表達(dá)載體，其含有編碼所產(chǎn)生蛋白和多肽的序列，以及合適轉(zhuǎn)錄和翻譯控制元件。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)、和體內(nèi)遺傳重組。此類技術(shù)描述于以下文獻(xiàn)中J. Sambrook等人，1989,MolecularCloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y.;和 F. M.Ausubel 等人，1989,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,NewYork, N. Y0控制元件或調(diào)節(jié)序列是載體的非翻譯區(qū)，例如增強(qiáng)子、啟動子、5’和3’非翻譯區(qū)，其與宿主細(xì)胞蛋白相互作用以執(zhí)行轉(zhuǎn)錄和翻譯。此類元件可以在其強(qiáng)度和特異性方面不同。取決于所用載體系統(tǒng)和宿主細(xì)胞，可以使用任何數(shù)量的合適轉(zhuǎn)錄和翻譯元件，包括組成型和誘導(dǎo)型啟動子。在哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)中，來自哺乳動物基因或來自哺乳動物病毒的啟動子是優(yōu)選的。用于在蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)中使用的構(gòu)建體經(jīng)設(shè)計為含有至少一個啟動子、增強(qiáng)子序列(對于哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)是任選的)、和基因表達(dá)的正確轉(zhuǎn)錄和調(diào)節(jié)所需或所要求的其他序列(例如轉(zhuǎn)錄起始和終止序列、復(fù)制起始點(diǎn)、多腺苷酸化序列例如牛生長激素(BGH)多腺苷酸序列)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的，用于正確轉(zhuǎn)錄、表達(dá)和分離真核(例如哺乳動物)表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的合適載體例如質(zhì)粒組分的選擇是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知且照常規(guī)確定和實(shí)踐的?？梢詫⑼ㄟ^根據(jù)本發(fā)明方法培養(yǎng)的細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)置于啟動子的控制下，所述啟動子例如病毒啟動子，例如巨細(xì)胞病毒(CMV)、Rous肉瘤病毒(RSV)、磷酸甘油激酶(PGK)、胸苷激酶(TK)、或a-肌動蛋白啟動子。此外，經(jīng)調(diào)節(jié)啟動子賦予通過特定化合物或分子的誘導(dǎo)性，例如小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)的糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件(GRE)由糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)(V. Chandler等人，1983，Cell，33:489-499)。同樣，如果需要或期望的話，可以使 用組織特異性啟動子或調(diào)節(jié)元件(G. Swift等人，1984，Cell，38:639-646)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種基因轉(zhuǎn)移方法將表達(dá)構(gòu)建體引入細(xì)胞中，所述方法例如常規(guī)基因轉(zhuǎn)染方法，例如磷酸鈣共沉淀、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、顯微注射、電穿孔、和感染或病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。方法的選擇在本領(lǐng)域熟練從業(yè)者的能力內(nèi)。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可以將攜帶用于在細(xì)胞中表達(dá)的DNA序列的一種或多種構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)，從而使得隨后在細(xì)胞中產(chǎn)生和/或從細(xì)胞中獲得表達(dá)產(chǎn)物。在特定方面，含有合適對照和調(diào)節(jié)序列的哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)選用于在本發(fā)明的蛋白質(zhì)表達(dá)哺乳動物細(xì)胞中使用。用于哺乳動物表達(dá)載體中使用的常用真核控制序列包括與哺乳動物細(xì)胞相容的啟動子和控制序列，例如巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子(CDM8載體)和禽肉瘤病毒(ASV)、( jiLN)。其他常用啟動子包括來自猿猴病毒40 (SV40)的早期和晚期啟動子(Fiers等人，1973，Nature，273:113)，或其他病毒啟動子，例如衍生自多瘤病毒、腺病毒2和牛乳頭瘤病毒的那些。也可以使用誘導(dǎo)型啟動子，例如hMTII (Karin等人，1982，Nature,299:797-802)。適合于真核宿主細(xì)胞的表達(dá)載體的例子包括但不限于用于哺乳動物宿主細(xì)胞的載體(例如 BPV-I、pHyg、pRSV、pSV2、pTK2 (Maniatis) ；pIRES (Clontech) ;pRc/CMV2、pRc/RSV> pSFVl (Life Technologies) ；pVPakc 載體、pCMV 載體、pSG5 載體(Stratagene)、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(例如pFB載體(Stratagene))、pcDNA_3 (Invitrogen)、腺病毒載體；腺病毒相關(guān)病毒載體、桿狀病毒載體、酵母載體(例如pESC載體(Stratagene))、或上述任何的經(jīng)修飾形式。載體也可以含有在啟動子區(qū)序列上游或下游的增強(qiáng)子序列用于最佳化基因表達(dá)。在重組載體(例如質(zhì)粒)中也可以使用選擇標(biāo)記，以對具有(優(yōu)選已穩(wěn)定整合)該載體的細(xì)胞賦予抗性，以允許其在合適選擇培養(yǎng)基中的選擇。可以使用多種選擇系統(tǒng)，包括但不限于單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV TK) (Wigler等人，1977，Cell，11:223)、次黃嘌呤鳥嘌呤憐酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)(Szybalska和Szybalski, 1992,Proc. Natl. Acad. Sci. USA，48:202)和腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Lowy等人，1980，Cell,22:817)基因，所述基因分別可以用于 tk-、hgprt_ 或 aprt-細(xì)胞(APRT)中。
也可以使用抗代謝物抗性作為選擇標(biāo)記基因的以下非限制性例子的基礎(chǔ)dhfr，其賦予對氨甲蝶呤的抗性(Wigler 等人，1980，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:357 ；和 0’Hare 等人，1981，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，78:1527) ;gpt，其賦予對霉酚酸的抗性(Mulligan 和 Berg，1981，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，78:2072) ;neo，其賦予對氨基葡糖苷 G418 的抗性(Clinical Pharmacy, 12:488-505 ;Wi^PWu,1991, Biotherapy,3:87-95 ；Tolstoshev,1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. ，32:573-596 ;Mulligan,1993,Science,260:926-932 ；Anderson,1993,Ann. Rev. Biochem. ,62:191-21 ；May,1993,TIB TECH, 11 (5) :155-215);和 hygro，其賦予對潮霉素的抗性(Santerre 等人，1984，Gene,30:147).重組DNA技術(shù)領(lǐng)域中通常已知的方法可以照常規(guī)應(yīng)用，以選擇期望重組細(xì)胞克隆，且此類方法描述于例如以下文獻(xiàn)中Ausubel等人(編輯)，Current Protocolsin Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993) ;Kriegler, 1990, Gene Transferand Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY ;第 12 和 13 章，Dracopoli等人(編輯)，Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994)；Colberre-Garapin等人，1981. J. Mol. Biol.，150:1，所述文獻(xiàn)整體引入本文作為參考。
此外，可以通過載體擴(kuò)增來增加所表達(dá)蛋白質(zhì)分子的表達(dá)水平(關(guān)于綜述參見Bebbington和Hentschel,“The use of vectors based on gene amplification for theexpression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning”,第 3 卷，AcademicPress, New York,1987)。當(dāng)表達(dá)蛋白質(zhì)的載體系統(tǒng)中的標(biāo)記是可擴(kuò)增的時,存在于宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中的抑制劑水平的增加將增加標(biāo)記基因的拷貝數(shù)。因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)域與蛋白質(zhì)編碼基因結(jié)合，所以蛋白質(zhì)的產(chǎn)生將伴隨地增加(Crouse等人，1983，Mol. Cell. Biol.，3:257)。具有谷氨酰胺合酶(GS)或二氫葉酸還原酶(DHFR)編碼核酸作為選擇標(biāo)記的載體可以分別在藥物甲硫氨酸砜亞胺或氨甲蝶呤的存在下進(jìn)行擴(kuò)增。基于谷氨酰胺合酶的載體的優(yōu)點(diǎn)是其為谷氨酰胺合酶陰性的細(xì)胞系(例如鼠骨髓瘤細(xì)胞系，NS0)的可用性。通過提供額外抑制劑來防止內(nèi)源性基因發(fā)揮作用，谷氨酰胺合酶表達(dá)系統(tǒng)也可以在谷氨酰胺合酶表達(dá)細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)中發(fā)揮作用。表達(dá)DHFR作為選擇標(biāo)記的載體包括但不限于pSV2_dhfr質(zhì)粒(Subramani等人，Mol. Cell. Biol. 1:854 (1981))。表達(dá)谷氨酰胺合酶作為選擇標(biāo)記的載體包括但不限于 Stephens 和 Cockett, 1989, Nucl. Acids. Res. , 17:7110 中所述的 pEE6 表達(dá)載體。谷氨酰胺合酶表達(dá)系統(tǒng)及其組分詳細(xì)描述于以下PCT公開中W0 87/04462、WO 86/05807、WO 89/01036、W 0 89/10404、和WO 91/06657，所述公開整體引入本文作為參考。此外，可以根據(jù)本發(fā)明使用的谷氨酰胺合酶表達(dá)載體是從供應(yīng)商商購可得的，所述供應(yīng)商包括例如Lonza Biologies Inc. (Portsmouth, NH)。在特定實(shí)施方案中，可以將編碼可溶性CTLA4分子或可溶性CTLA4突變分子的核酸序列插入設(shè)計用于在真核宿主中表達(dá)外源序列的載體。載體的調(diào)節(jié)元件可以根據(jù)具體真核宿主而改變。在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)可溶性CTLA4或可溶性CTLA4突變體的載體可以包括最佳化蛋白質(zhì)表達(dá)的增強(qiáng)子序列。細(xì)胞培養(yǎng)類型
為了理解但非限制性的目的，熟練從業(yè)者應(yīng)當(dāng)理解，用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)和培養(yǎng)運(yùn)行可以包括三種一般類型；即，連續(xù)培養(yǎng)、分批培養(yǎng)和分批補(bǔ)料式培養(yǎng)。例如，在連續(xù)培養(yǎng)中，在培養(yǎng)期過程中向細(xì)胞提供新鮮培養(yǎng)基補(bǔ)充物(即補(bǔ)料培養(yǎng)基)，同時每天去除舊培養(yǎng)基且例如每天或連續(xù)收獲產(chǎn)物。在連續(xù)培養(yǎng)中，補(bǔ)料培養(yǎng)基可以每天添加且可以連續(xù)添力口，即作為滴或輸注。對于連續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞可以與期望一樣久地保留在培養(yǎng)中，只要細(xì)胞保持為活的且維持環(huán)境和培養(yǎng)條件。在分批培養(yǎng)中，最初在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，且在培養(yǎng)運(yùn)行過程中或結(jié)束前既不去除、更換也不補(bǔ)充這種培養(yǎng)基，即不用新培養(yǎng) 基“補(bǔ)給”細(xì)胞。在培養(yǎng)運(yùn)行結(jié)束時收獲期望產(chǎn)物。對于分批補(bǔ)料式培養(yǎng)，在運(yùn)行過程中通過每天一或多次(或連續(xù)地)用新鮮培養(yǎng)基補(bǔ)充培養(yǎng)基來增加培養(yǎng)運(yùn)行時間，即在培養(yǎng)期過程中用新培養(yǎng)基(“補(bǔ)料培養(yǎng)基”)“補(bǔ)給”細(xì)胞。分批補(bǔ)料式培養(yǎng)可以包括多種補(bǔ)料方案和時間，例如每天、每隔一天、每兩天等、每天超過一次、或少于每天一次等等。此外，分批補(bǔ)料式培養(yǎng)可以用補(bǔ)料培養(yǎng)基連續(xù)補(bǔ)料。然后在培養(yǎng)/生產(chǎn)運(yùn)行結(jié)束時收獲期望產(chǎn)物。本發(fā)明優(yōu)選涵蓋分批補(bǔ)料式細(xì)胞培養(yǎng)，其中在接種后某一時間點(diǎn)添加糖皮質(zhì)激素化合物。根據(jù)本發(fā)明，在用于大規(guī)?；蛐∫?guī)模蛋白質(zhì)生產(chǎn)的條件下，使用照常規(guī)用于動物或哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)容器和/或培養(yǎng)裝置，可以執(zhí)行細(xì)胞培養(yǎng)，且可以由細(xì)胞產(chǎn)生糖蛋白。如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的，組織培養(yǎng)皿、T形瓶和旋轉(zhuǎn)瓶通常使用實(shí)驗(yàn)室規(guī)模上。對于在更大規(guī)模上的培養(yǎng)(例如500 L、5000 L等，例如如共同受讓的美國專利號7，541，164、美國專利號7，332，303、和2006年12月19日提交的美國申請系列號12/086786中所述，所述專利的內(nèi)容整體引入本文作為參考)，可以使用包括但不限于流化床生物反應(yīng)器、中空纖維生物反應(yīng)器、滾瓶培養(yǎng)或攪拌罐生物反應(yīng)器系統(tǒng)的程序。在滾瓶或攪拌罐生物反應(yīng)器系統(tǒng)中可以使用或可以不使用微載體。此類系統(tǒng)可以分批、連續(xù)或分批補(bǔ)料式模式操作。此外，培養(yǎng)裝置或系統(tǒng)可以配備有或不配備有使用濾器、重力、離心力等的細(xì)胞分離器。細(xì)胞培養(yǎng)期和相關(guān)參數(shù)
術(shù)語“接種”指向啟動培養(yǎng)基中添加細(xì)胞以開始培養(yǎng)。培養(yǎng)的“生長期”是在任何時間點(diǎn)的活細(xì)胞密度高于任何先前時間點(diǎn)的時期。培養(yǎng)的“靜止期”是在其過程中經(jīng)過任何長度的時間段活細(xì)胞密度都大致恒定(SP在測量誤差內(nèi))的時期。培養(yǎng)的“死亡期”是跟在生長期或生長期和靜止期后面的時期，且在此過程中任何時間點(diǎn)的活細(xì)胞密度都低于在該時期過程中的任何先前時間點(diǎn)。在“生長相關(guān)”培養(yǎng)過程中，例如在其中糖皮質(zhì)激素化合物引起延長的生長期的情況下，生產(chǎn)期可以在延長的生長期過程中起始。在“非生長”相關(guān)培養(yǎng)過程中，細(xì)胞培養(yǎng)的生產(chǎn)期可以是靜止期。優(yōu)選地，在生產(chǎn)期過程中特別是在延長的生產(chǎn)期中補(bǔ)充(“補(bǔ)給”)培養(yǎng)基，以支持連續(xù)蛋白質(zhì)產(chǎn)生，且獲得大量高品質(zhì)糖蛋白產(chǎn)物(如在蛋白質(zhì)回收后通過高水平的最終唾液酸含量例示和/或測定的)。補(bǔ)料可以在每天基礎(chǔ)上或根據(jù)其他時間表發(fā)生，以支持細(xì)胞活力和蛋白質(zhì)生產(chǎn)。根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)過程可以導(dǎo)致更多活細(xì)胞存活直到培養(yǎng)期結(jié)束時。相應(yīng)地，在一些實(shí)施方案中，存活細(xì)胞越多，產(chǎn)生期望產(chǎn)物的細(xì)胞越多。這進(jìn)而導(dǎo)致在培養(yǎng)過程結(jié)束時更大積累量的產(chǎn)物，其中通過個別細(xì)胞的蛋白質(zhì)生產(chǎn)速率(即細(xì)胞比生產(chǎn)率)保持不變。如本領(lǐng)域已知的細(xì)胞比生產(chǎn)率或細(xì)胞比速率通常指每個細(xì)胞或每細(xì)胞質(zhì)量或體積的量度所產(chǎn)生產(chǎn)物的比表達(dá)速率。細(xì)胞比生產(chǎn)率以例如每天每個細(xì)胞所產(chǎn)生蛋白質(zhì)的克數(shù)來測量，且可以根據(jù)涉及下式的積分方法來測量dP/dt=qp X,或P=qp / Qt Xdt
其中qp是細(xì)胞比生產(chǎn)率常數(shù)；X是細(xì)胞數(shù)目或細(xì)胞體積或細(xì)胞質(zhì)量當(dāng)量；且dP/dt是蛋白質(zhì)生產(chǎn)速率。因此，1可以得自與活細(xì)胞的時間積分(/ Ot Xdt “活細(xì)胞天數(shù)”)比較的產(chǎn)物濃度曲線。根據(jù)此式，當(dāng) 針對活細(xì)胞天數(shù)繪制所產(chǎn)生糖蛋白產(chǎn)物的量時，斜率等于細(xì)胞比速率?；罴?xì)胞可以通過若干種量度來測定,例如生物量、O2攝取速率、乳酸脫氫酶(LDH)、細(xì)胞壓積或池度(例如頒給T. Etcheverry等人的美國專利號5，705，364)。通過本發(fā)明的培養(yǎng)方法產(chǎn)生可溶性CTLA4分子和可溶性CTLA4突變分子 在由本發(fā)明涵蓋的其他實(shí)施方案中，采用本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)方法來產(chǎn)生可溶性CTLA4
分子或可溶性CTLA4突變分子，如下文所述?？扇苄訡TLA4分子優(yōu)選是CTLA4融合蛋白，優(yōu)選CTLA4Ig。更優(yōu)選的是如圖19中所示，包含氨基酸-I至357或+1至357的CTLA4Ig?？扇苄訡TLA4突變分子優(yōu)選是如圖20中所示，包含氨基酸-I至357或+1至357的L104EA29Hg。涉及蛋白質(zhì)產(chǎn)物的延長生產(chǎn)期的細(xì)胞培養(yǎng)方法特別適合于通過其培養(yǎng)中的宿主細(xì)胞來產(chǎn)生高品質(zhì)和大量可溶性CTLA4分子和可溶性CTLA4突變分子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，CTLA4Ig通過重組改造的宿主細(xì)胞來產(chǎn)生。CTLA4Ig融合蛋白可以通過用含有編碼CTLA4Ig的DNA序列的載體轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞重組產(chǎn)生。(參見頒給P. S. Linsley等人的美國專利號5，844，095)。在根據(jù)本發(fā)明的過程培養(yǎng)時，CTLA4Ig融合蛋白以大量產(chǎn)生且是合適唾液酸化的。本發(fā)明提供高水平的可回收蛋白質(zhì)產(chǎn)物(例如唾液酸化CTLA4Ig蛋白質(zhì)產(chǎn)物)的產(chǎn)生。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，如圖20中所示包含氨基酸-I至357或+1至357的可溶性CTLA4突變分子L104EA29Hg通過本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)方法來產(chǎn)生。關(guān)于CTLA4的配體是B7分子。如本文使用的，“配體”指特異性識別并結(jié)合另一種分子的分子。分子與其配體的相互作用可以通過本發(fā)明培養(yǎng)過程的產(chǎn)物來調(diào)節(jié)。例如，CTLA4與其配體B7的相互作用可以通過施用CTLA4Ig分子來阻斷。作為其他例子，腫瘤壞死因子(TNF)與其配體TNF受體(TNFR)的相互作用可以通過施用依那西普或其他TNF/TNFR阻斷分子來阻斷。野生型CTLA4或“未突變CTLA4”具有如圖20中所示的天然存在的全長CTLA4的氨基酸序列(且也如美國專利號5，434，131,5, 844，095和5，851，795中所述，其整體引入本文作為參考)，或其識別并結(jié)合B7分子或干擾B7分子的任何部分，從而阻斷與CD28和/或CTLA4 (例如內(nèi)源性⑶28和/或CTLA4)的結(jié)合。野生型CTLA4包含特定部分，包括例如始于+1位置的甲硫氨酸且止于+124位置的天冬氨酸的野生型CTLA4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，或始于-I位置的丙氨酸且止于+124位置的天冬氨酸的野生型CTLA4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，如圖21中所示。天然存在的野生型CTLA4是細(xì)胞表面蛋白，其具有N-末端細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和C-末端細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合IE分子,例如B7分子。在細(xì)胞中,天然存在的野生型CTLA4蛋白被翻譯為未成熟的多肽，其包括在氨基末端或N-末端的信號肽。未成熟的多肽經(jīng)歷翻譯后加工，其包括切割并去除信號肽以生成CTLA4切割產(chǎn)物，其具有與未成熟形式中的N-末端不同的新近生成N-末端。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可能發(fā)生額外翻譯后處理，其從CTLA4切割產(chǎn)物的新近生成N-末端去除一個或多個氨基酸。成熟CTLA4蛋白可以始于+1位置的甲硫氨酸或-I位置的丙氨酸。CTLA4分子的成熟形式包括結(jié)合B7的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或其任何部分。如本文使用的，CTLA4突變分子指包含如圖21中所示的野生型CTLA4或其任何部分或衍生物的分子，所述部分或衍生物具有在野生型CTLA4序列優(yōu)選野生型CTLA4中的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中的一個突變或多個突變，且結(jié)合B7。CTLA4突變分子具有與野生型CTLA4分子的序列類似但不等同，但仍可以結(jié)合B7的序列。所述突變可以包括由具有保守性(例如亮氨酸取代異亮氨酸)或非保守性(例如甘氨酸由色氨酸取代)結(jié)構(gòu)或化學(xué)特性的氨基酸取代一個或多個氨基酸殘基，氨基酸缺失、添加、移碼或截短。CTLA4突變分子可以包括在其中或與其附著的非CTLA4分子，即CTLA4突變體融合蛋白。突變分子可以是可溶的(即循環(huán)的)，或它們可以結(jié)合至細(xì)胞表面(膜結(jié)合的)。CTLA4 突變分子包括L104EA29Hg和描述于以下文獻(xiàn)中的那些美國申請系列號60/214，065和 60/287，576 ;W0 01/92337 A2 ;美國專利號 6，090，914、5，844，095、7，094，874 和
5,773, 253 ;和如 R. J. Peach 等人，1994，J Exp Med，180:2049-2058 中所述。CTLA4 突變分子可以合成或重組產(chǎn)生。CTLA4Ig是可溶性融合蛋白，其包含與免疫球蛋白(Ig)分子或其部分連接的，野生型CTLA4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或其結(jié)合B7的部分。CTLA4或其部分的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與Ig部分連接，所述Ig部分包含全部或一部分免疫球蛋白分子，優(yōu)選全部或一部分免疫球蛋白恒定區(qū)，例如全部或一部分 IgC Y I (IgCgammal)>IgC y 2 (IgCgamma2)>IgC y 3 (IgCgamma3)、IgC y 4 (IgCgamma4)> IgC U (IgCmu)、IgC a I (IgCalphal )、IgC a 2 (IgCalpha2)> IgC 6(IgCdelta)或IgC e (IgCepsilon),致使融合分子可溶。Ig部分可以包括上述恒定區(qū)或其他恒定區(qū)的鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域，或CHl、鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，Ig部分是人或猴且包含鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。最優(yōu)選地，Ig部分包含人IgC Y I的鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域，或由人IgC y I的鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域組成。在CTLA4Ig的Ig部分中，Ig恒定區(qū)或其部分可以突變，由此導(dǎo)致其效應(yīng)子功能減少(參見例如，美國專利號5，637，481、5，844，095和5，434，131)。如本文使用的，術(shù)語Ig部分、Ig恒定區(qū)、Ig C (恒定)結(jié)構(gòu)域、IgC y I (IgCgammal)> IgCy 2 (IgCgamma2)> IgCy 3 (IgCgamma3)> IgCy 4 (IgCgamma4)>IgC u (IgCmu)、IgC a I (IgCalphal)、IgC a 2 (IgCalpha2)、IgC 5 (IgCdelta)或 IgCe(IgC印silon)包括天然序列和已突變的序列，例如具有在恒定區(qū)中減少效應(yīng)子功能的突變的序列。關(guān)于CTLA4的具體實(shí)施方案包含野生型CTLA4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，其始于+1位置的甲硫氨酸且止于+124位置的天冬氨酸，或始于-I位置的丙氨酸至+124位置的天冬氨酸；在+125位置的連接氨基酸殘基谷氨酰胺；和免疫球蛋白部分，其涵蓋在+126位置的谷氨酸直到在+357位置的賴氨酸，如圖19中所示。編碼這種CTLA4Ig的DNA根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款在1991年5月31日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC) (10801 UniversityBlvd.，Manassas, VA 20110-2209)，且已給予 ATCC 登記號 ATCC 68629 ；P. Linsley 等人，1994，Immunity 1:793-80。表達(dá)CTLA4Ig的CHO細(xì)胞系在1991年5月31日在識別號CRL-10762下保藏于ATCC。根據(jù)本文所述方法產(chǎn)生的可溶性CTLA4Ig分子可以包括或不包括信號(前導(dǎo))肽序列。圖19和20包括信號(前導(dǎo))肽序列的舉例說明。通常，所述分子不包括信號肽序列。L104EA29Hg是融合蛋白，其是包含與Ig尾連接的野生型CTLA4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的可溶性CTLA4突變分子，所述細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域具有氨基酸變化A29Y (酪氨酸氨基酸殘基取代在29位置的丙氨酸)和L104E (谷氨酸氨基酸殘基取代在+104位置的亮氨酸)。圖20舉例說明L104EA29Hg。如圖20中所示，L104EA29YIg的氨基酸序列包含在_1氨基酸位置的丙氨酸至在+357氨基酸位置的賴氨酸。可替代地，如圖20中所示，L104EA29Hg的氨基酸序列包含在+1氨基酸位置的甲硫氨酸至在+357氨基酸位置的賴氨酸。L104EA29Hg包含在+125位置的連接氨基酸殘基谷氨酰胺，和Ig部分，其涵蓋在+126位置的谷氨酸至在+357位置的賴氨酸。編碼L104EA29Hg的DNA根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款在2000年6月20日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，且已給予ATCC登記號PTA-2104。104EA29YIg 描述于共同未決的美國專利申請系列號09/579，927、60/287，576和60/214，065以及W0/01/923337 A2中，所述專利整體引入本文作為參考。通過本發(fā)明的培養(yǎng)方法產(chǎn)生的可溶性L104EA29Hg分子可以包括或不包括信號(前導(dǎo))肽序列。通常，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的分子不包括信號肽序列。如本文使用的，術(shù)語“可溶性”指未結(jié)合或附著至細(xì)胞的任何分子或其片段，即循環(huán)的。例如，可以通過使Ig部分附著至CTLA4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域來使CTLA4可溶?？商娲兀梢酝ㄟ^去除其跨膜結(jié)構(gòu)域來致使分子例如CTLA4可溶。通常，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的可溶性分子不包括信號(或前導(dǎo))序列?？扇苄訡TLA4分子指非細(xì)胞表面結(jié)合的(即循環(huán)的)分子，其包含野生型CTLA4或結(jié)合B7的任何部分或衍生物，包括但不限于可溶性CTLA4融合蛋白；可溶性CTLA4融合蛋白，例如CTLA4Ig融合蛋白(例如ATCC 68629)，其中CTLA4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與Ig部分融合，該Ig部分是全部或一部分Ig分子，優(yōu)選是全部或一部分Ig恒定區(qū)，例如全部或一部分IgC y I (IgCgammal)> IgCy 2 (IgCgamma2)> IgCy 3 (IgCgamma3)> IgCy 4 (IgCgamma4)>IgC u (IgCmu)、IgC a I (IgCalphal)、IgC a 2 (IgCalpha2)、IgC 5 (IgCdelta)或 IgCe(IgCepsilon),致使融合分子可溶；可溶性CTLA4融合蛋白，其中細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與生物活性或化學(xué)活性蛋白的一部分融合或連接，所述活性蛋白例如乳頭瘤病毒E7基因產(chǎn)物(CTLA4-E7)、黑色素瘤相關(guān)抗原 p97 (CTLA4_p97)或 HIV env 蛋白(CTLA4_env gpl20)，如整體引入本文作為參考的美國專利號5，844，095中所述；雜交(嵌合)融合蛋白，例如CD28/CTLA4Ig，如整體引入本文作為參考的美國專利號5，434，131中所述；去除跨膜結(jié)構(gòu)域以致使蛋白質(zhì)可溶的CTLA4分子(參見例如，M. K. Oaks等人,2000, Cellular Immunology,201:144-153,該文獻(xiàn)整體引入本文作為參考)；可溶性CTLA4突變分子L104EA29Hg。可溶性CTLA4分子還可以是可溶性CTLA4突變分子。根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的可溶性CTLA4分子可以包括或不包括信號(前導(dǎo))肽序列。信號肽可以是允許分子分泌的任何序列，包括來自制瘤素 M 的信號肽(Malik 等人，1989，Molec. Cell. Biol.，9: 2847-2853)、或 CD5(N. H. Jones等人，1986，Nature，323:346-349)、或來自任何細(xì)胞外蛋白的信號肽。通過本發(fā)明的培養(yǎng)過程產(chǎn)生的可溶性CTLA4分子可以包括在CTLA4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的N-末端連接的制瘤素M信號肽。通常，在本發(fā)明中，所述分子不包括信號肽序列。如本文使用的，“CTLA4融合蛋白”指包含與致使CTLA4分子可溶的非CTLA4部分例如Ig部分融合的，野生型CTLA4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或其結(jié)合B7的部分的分子。例如，CTLA4融合蛋白可以包括與全部或一部分Ig恒定區(qū)融合的CTLA4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域?？梢耘cCTLA4融合的Ig恒定結(jié)構(gòu)域(或其部分)的例子包括上文所列出的所有，但不限于那些。CTLA4融合蛋白也可以是CTLA4突變分子。本文所用“非CTLA4部分”指不結(jié)合⑶80和/或⑶86且不干擾CTLA4與其配體的結(jié)合的分子或其部分。例子包括但不限于作為全部或一部分Ig分子的Ig部分、生物活性或化學(xué)活性蛋白的一部分，例如乳頭瘤病毒E7基因產(chǎn)物(CTLA4-E7)、黑色素瘤相關(guān)抗原p97 (CTLA4-p97)或HIV env蛋白(CTLA4_env gpl20)(如整體引入本文作為參考的美國系列號5，844，095中所述)。Ig部分的例子包括全部或一部分免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域，例如IgC y I (IgCgammal)> IgCy 2 (IgCgamma2)> IgCy 3 (IgCgamma3)> IgCy 4 (IgCgamma4)>IgC u (IgCmu)、IgC a I (IgCalphal)、IgC a 2 (IgCalpha2)、IgC 5 (IgCdelta)或 IgCe(IgC印silon)。Ig部分可以包括上述恒定區(qū)或其他恒定區(qū)的鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域，或 CHl、鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，Ig部分是人或猴且包括鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。最優(yōu)選地，Ig部分包括人IgC y I的鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域，或是人IgC y I的鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。在Ig部分中，Ig恒定區(qū)或其部分可以突變，以便減少其效應(yīng)子功能(參見例如，美國專利號 5，637，481,5, 844，095 和 5，434，131)。CTLA4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域指野生型CTLA4中識別并結(jié)合B7的任何部分。例如，CTLA4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域包含在+1位置的甲硫氨酸至在+124位置的天冬氨酸(圖21 )。例如，CTLA4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域包含在-I位置的丙氨酸至在+124位置的天冬氨酸(圖21)。如本文使用的，術(shù)語“突變”指野生型分子的核苷酸或氨基酸序列中的變化，例如野生型CTLA4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的DNA和/或氨基酸序列中的變化。DNA中的突變可以改變密碼子，導(dǎo)致所編碼的氨基酸序列中的變化。DNA變化可以包括取代、缺失、插入、可變剪接或截短。氨基酸變化可以包括取代、缺失、插入、添加、截短、或蛋白質(zhì)的加工或切割錯誤?？商娲?，如本領(lǐng)域所充分理解的，核苷酸序列中的突變可以導(dǎo)致氨基酸序列中的沉默突變。如同樣理解的，某些核苷酸密碼子編碼相同氨基酸。例子包括核苷酸密碼子CGU、CGG、CGC和CGA，其編碼氨基酸精氨酸(R);或密碼子GAU和GAC，其編碼氨基酸天冬氨酸(D)。因此，可以通過在其特定核苷酸序列中不同但仍編碼具有等同序列的蛋白質(zhì)分子的一個或多個核酸分子來編碼蛋白質(zhì)。突變分子可以具有一處或超過一處突變。關(guān)于指導(dǎo)，氨基酸編碼序列如下
氨基酸j符號j單字母符號j密碼子
丙氨酸 Ala A_GCU、GCC、GCA、GCG_
軍瓶氨酸Cys ~UGU. UGC
芙￥氨酸 Asp FGAU. GAC
吝"氨酸 Glu ~E~ GAA. GAG—
萊丙氨酸F一 UUU. UUC
苷氨酸石廠 G一 GGU. GGC. GGA. GGG
11氨酸H一CAlkCAC
異亮氨酸 He ~AUU. AUC. AUA
麗酸 Lys IAAA. AAG
亮氨酸 keu |l|uua、UUG、cull、cue、CUA、CUG
權(quán)利要求
1.一種用于產(chǎn)生糖蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其包含a)在允許蛋白質(zhì)產(chǎn)生的條件下，培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生糖蛋白的宿主細(xì)胞；和b)添加無毒水平的糖皮質(zhì)激素。
2.權(quán)利要求I的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其中與在不含糖皮質(zhì)激素添加的培養(yǎng)物中的唾液酸化比較，所述糖蛋白的唾液酸化是增加的。
3.權(quán)利要求I的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其中與在不含糖皮質(zhì)激素添加的培養(yǎng)物中的細(xì)胞凋亡比較，細(xì)胞死亡是被抑制的。
4.權(quán)利要求I的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其中與在不含糖皮質(zhì)激素添加的培養(yǎng)物中的細(xì)胞活力比較，細(xì)胞活力是增加的。
5.權(quán)利要求I的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其中與在不含糖皮質(zhì)激素添加的培養(yǎng)物中的糖蛋白滴度比較，糖蛋白滴度是增加的。
6.權(quán)利要求I的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其中與在不含糖皮質(zhì)激素添加的培養(yǎng)物中的糖蛋白聚集體比較，糖蛋白聚集體是降低的。
7.權(quán)利要求I至6中任一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其中所述糖皮質(zhì)激素選自地塞米松、倍他米松、乙酸氟氫可的松、氫化可的松、甲潑尼龍、潑尼松龍、潑尼松和曲安西龍。
8.權(quán)利要求I至6中任一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其中所述宿主細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。
9.權(quán)利要求8的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞選自CHO、骨髓瘤和COS細(xì)胞。
10.權(quán)利要求I至6中任一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其中所述糖皮質(zhì)激素水平在所述細(xì)胞培養(yǎng)物中維持在I nM至I mM的濃度。
11.權(quán)利要求I至6中任一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其中在所述培養(yǎng)過程期間的任何時間，將所述糖皮質(zhì)激素加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基、補(bǔ)料培養(yǎng)基中或作為推注劑添加。
12.根據(jù)權(quán)利要求I至6中任一項(xiàng)的方法，其中所述糖皮質(zhì)激素在接種后在開始初始死亡期前的某個時間添加。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述糖皮質(zhì)激素在接種后初始生長期過程中某個時間添加。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述糖皮質(zhì)激素在初始生長期結(jié)束時或大約結(jié)束時添加。
15.一種用于產(chǎn)生可溶性CTLA4分子的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其包含a)在允許蛋白質(zhì)產(chǎn)生的條件下，培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生可溶性CTLA4分子的CHO細(xì)胞；和b)向所述細(xì)胞補(bǔ)給含有地塞米松的補(bǔ)料培養(yǎng)基。
16.權(quán)利要求15的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其中與未向所述細(xì)胞補(bǔ)給含有地塞米松的補(bǔ)料培養(yǎng)基的培養(yǎng)物中的唾液酸化比較，所述可溶性CTLA4分子的唾液酸化是增加的。
17.權(quán)利要求15的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其中所述可溶性CTLA4分子是可溶性CTLA4突變分子，其包含與包含鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白部分連接的，如SEQ ID NO:3中所示始于+1位置的甲硫氨酸或-I位置的丙氨酸且止于124位置的天冬氨酸的氨基酸序列，其中地塞米松在所述細(xì)胞培養(yǎng)物中保持或維持在0. I ii M至10 UM的濃度下，且其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物體積是至少500升。
18.權(quán)利要求15的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其中所述可溶性CTLA4分子是可溶性CTLA4突變分子，其包含與包含鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白部分連接的，如SEQ ID NO:3中所示始于+1位置的甲硫氨酸或-I位置的丙氨酸且止于124位置的天冬氨酸的氨基酸序列，其中向所述細(xì)胞補(bǔ)給含有地塞米松的補(bǔ)料培養(yǎng)基，且其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物體積是至少500升。
19.權(quán)利要求15的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其中所述可溶性CTLA4分子包含與包含鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白部分連接的，如SEQ ID NO: I中所示始于+1位置的甲硫氨酸或-I位置的丙氨酸且止于124位置的天冬氨酸的氨基酸序列，其中地塞米松在所述細(xì)胞培養(yǎng)物中保持或維持在I nM至0. I UM的濃度下，且其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物體積是至少500升。
20.權(quán)利要求15的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其中所述可溶性CTLA4分子包含與包含鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白部分連接的，如SEQ ID NO: I中所示始于+1位置的甲硫氨酸或-I位置的丙氨酸且止于124位置的天冬氨酸的氨基酸序列，其中向所述細(xì)胞補(bǔ)給含有地塞米松的補(bǔ)料培養(yǎng)基，且其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物體積是至少500升。
21.權(quán)利要求15、19和20中任一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其中所述可溶性CTLA4分子包含 如SEQ ID NO: I中所示始于+1位置的甲硫氨酸或-I位置的丙氨酸且止于+357位置的賴氨酸的氨基酸序列。
22.權(quán)利要求17和18中任一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其中所述可溶性CTLA4分子包含如SEQ ID NO: 3中所示始于+1位置的甲硫氨酸或-I位置的丙氨酸且止于+357位置的賴氨酸的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明描述通過動物細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)，優(yōu)選但不限于分批補(bǔ)料式細(xì)胞培養(yǎng)用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法和過程。在一個方面，該方法包含在培養(yǎng)期過程中添加糖皮質(zhì)激素化合物。添加糖皮質(zhì)激素化合物維持所培養(yǎng)細(xì)胞的高活力，且如例如通過所產(chǎn)生蛋白質(zhì)的唾液酸含量測定的，可以獲得終點(diǎn)滴度增加的蛋白質(zhì)產(chǎn)物和高品質(zhì)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
文檔編號C07K14/705GK102753572SQ201080044802
公開日2012年10月24日 申請日期2010年10月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月6日
發(fā)明者Y.京, 李正劍, 錢月明 申請人:百時美施貴寶公司