胞間通訊易化化合物的新醫(yī)學(xué)用途的制作方法

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導(dǎo)航： X技術(shù)> 最新專利>有機(jī)化學(xué)裝置的制造及其處理,應(yīng)用技術(shù)

專利名稱：胞間通訊易化化合物的新醫(yī)學(xué)用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在體外和/或體內(nèi)具有提高的穩(wěn)定性、具有線狀或環(huán)狀結(jié)構(gòu)的包括新的抗心律失常肽的新肽，涉及包含所述肽的組合物，以及所述肽在制備藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及易化胞間通訊的化合物在制備用于治療一系列以胞間間隙連接通訊損傷為特征的疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種治療疾病的方法，例如膀胱失禁、肺泡組織及支氣管組織疾病、由耳蝸疾病所致的聽力損傷、內(nèi)皮病變、糖尿病性視網(wǎng)膜病和糖尿病性神經(jīng)病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和脊髓的局部缺血、牙組織疾病包括牙周病、腎病例如腎小球旁器分泌損傷導(dǎo)致高血壓，以及一種預(yù)防骨髓移植失敗的方法。
背景技術(shù)：
間隙連接是細(xì)胞膜的特化區(qū)域，有成百上千緊密堆積的間隙連接通道簇，直接連接了兩個(gè)相鄰細(xì)胞的胞質(zhì)區(qū)室。間隙連接通道由兩相鄰細(xì)胞各自提供的兩個(gè)半通道(連接子)組成。每一個(gè)連接子由6個(gè)稱為連接蛋白(Cx)的蛋白組成。連接蛋白為一個(gè)具有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域、2個(gè)胞外環(huán)和1個(gè)胞質(zhì)環(huán)基本結(jié)構(gòu)的蛋白大家族。種間及連接蛋白同種型間胞外環(huán)及跨膜結(jié)構(gòu)域具有高度的保守性。不過，C-末端的長度變化相當(dāng)大，引起了基于分子量對連接蛋白的分類。間隙連接通道通過一種扭轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)可以在開啟或關(guān)閉狀態(tài)之間轉(zhuǎn)換。在開放狀態(tài)下離子和小分子可以通過孔道。電脈沖的傳導(dǎo)及信號(hào)分子的胞間擴(kuò)散是通過間隙連接進(jìn)行的，因而正常行使功能的間隙連接是正常胞間通訊的先決條件。正常胞間通訊對于細(xì)胞穩(wěn)恒性、增殖及分化是必需的。
連接蛋白異常和疾病之間的聯(lián)系已經(jīng)在人類中建立起來，這將在下面的部分中顯示。一個(gè)例子是由原生動(dòng)物寄生蟲克魯斯氏錐蟲所致的恰加斯病。該病是拉丁美洲心功能障礙的主要病因。在被克魯斯氏錐蟲感染的細(xì)胞中觀察到了Cx43分布的改變，而這種改變可能與該病特征化的傳導(dǎo)紊亂有關(guān)[7]。
在多細(xì)胞生物中，細(xì)胞之間的協(xié)同是至關(guān)重要的。在各種不同的細(xì)胞對話方式中，間隙連接提供最為直接的路徑。間隙連接是在鄰近細(xì)胞之間形成的一類連接復(fù)合體，由聚集的直接連接了相鄰細(xì)胞內(nèi)部(細(xì)胞質(zhì))的通道組成。在成年哺乳動(dòng)物中，在大多數(shù)細(xì)胞類型中發(fā)現(xiàn)有間隙連接，一個(gè)已知的例外是循環(huán)的血液成分。
對連接蛋白的基因結(jié)構(gòu)所知相對較少。關(guān)于小鼠Cx43的報(bào)道結(jié)果顯示Cx43含有2個(gè)外顯子和1個(gè)位于5′非翻譯區(qū)的內(nèi)含子。已經(jīng)在5′近側(cè)啟動(dòng)子中鑒定出若干推定的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。體外研究表明通透性通道可能是由不同連接蛋白對所構(gòu)成的半通道產(chǎn)生的。舉例來說，Cx43能與Cx32、Cx37、Cx40和Cx45以及卵母細(xì)胞內(nèi)源性Cx(Cx38)但不能與Cx26卵母細(xì)胞產(chǎn)生功能性通道。然而，關(guān)于這些雜通道的特性也和其通透性的調(diào)控一樣所知甚少。Cx在絕大多數(shù)的組織中都有表達(dá)，且單個(gè)細(xì)胞能夠表達(dá)數(shù)個(gè)不同的Cx。通透性間隙連接能夠在細(xì)胞之間形成，這些細(xì)胞表達(dá)不同類型的Cx。由此組織中的間隙連接胞間通訊(GJIC)似乎對于維持組織的完整性非常重要。似乎數(shù)個(gè)基因在制造等效產(chǎn)物以防止由于所述基因之一突變而喪失GJIC。
形成的間隙連接通道的孔徑據(jù)報(bào)道是在0.8-1.4nm的范圍內(nèi)。間隙連接相對來說是非選擇性的，可允許高達(dá)約1000道爾頓的分子通過。這樣的物質(zhì)特別是離子、水、糖、核苷酸、氨基酸、脂肪酸、小肽、藥物及致癌物質(zhì)等。通過通道無需ATP，似乎是被動(dòng)擴(kuò)散的結(jié)果。細(xì)胞之間通過間隙連接通道的物流已知為間隙連接胞間通訊(GJIC)，其在細(xì)胞新陳代謝、增殖及細(xì)胞-細(xì)胞信號(hào)作用的調(diào)控方面起著重要作用。GJIC最為顯著的生理意義之一就是在組織內(nèi)由間隙連接偶聯(lián)的細(xì)胞不是獨(dú)個(gè)的、分離的實(shí)體，而是與其鄰里細(xì)胞高度整合在一起的。這一特性促進(jìn)了內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，而且還允許第二信使在細(xì)胞之間迅速、直接轉(zhuǎn)移，以協(xié)同該組織內(nèi)的細(xì)胞反應(yīng)。
GJIC過程是由多種機(jī)制調(diào)控的，所述機(jī)制可以粗略分成幾大類。在一種調(diào)控類型中，細(xì)胞間隙連接數(shù)量是通過影響連接蛋白的表達(dá)、降解、連接蛋白到質(zhì)膜的細(xì)胞運(yùn)輸、或者連接蛋白裝配為功能性間隙連接得以控制的。由連接蛋白表達(dá)的減量調(diào)節(jié)所導(dǎo)致的GJIC損傷，例如在腫瘤細(xì)胞中，是這種調(diào)控模式的一個(gè)例子。另一類型的調(diào)控通常不包括間隙連接或連接蛋白的細(xì)胞水平的任何總量變化，而是誘導(dǎo)存在的間隙連接的開啟或關(guān)閉(門控作用)。胞外可溶性因子，例如促細(xì)胞分裂原(如DDT)、激素(如兒茶酚胺)、麻醉劑(如氟烷)、胞內(nèi)生物分子(如cAMP)，以及細(xì)胞應(yīng)激(如機(jī)械或代謝應(yīng)激)可導(dǎo)致這一類的調(diào)控。此外，在細(xì)胞周期及細(xì)胞遷移過程中GJIC都被調(diào)控。
對間隙連接特別是Cx43構(gòu)成的間隙連接的GJIC調(diào)控或連接門控作用模式已經(jīng)進(jìn)行了廣泛的研究。有些因子，舉例來說，通過改變脂質(zhì)環(huán)境和細(xì)胞膜的流動(dòng)性間接地對GJIC起抑制作用。而其它的GJIC抑制劑包括癌基因、生長因子和腫瘤啟動(dòng)子，則誘導(dǎo)對Cx43多種不同的修飾。對于后一組，連接通透性的破壞可能對介導(dǎo)特定的生物功能是必需的。這些因子啟動(dòng)由激酶、磷酸酶及相互作用的蛋白的激活構(gòu)成的復(fù)雜信號(hào)作用途徑。對這些GJIC調(diào)節(jié)子作用機(jī)制的理解不僅將闡釋清楚其負(fù)責(zé)連接調(diào)控的各自的信號(hào)作用途徑，而且還將為表征GJIC和連接蛋白的生物功能提供實(shí)驗(yàn)工具。
Cx43胞質(zhì)羧基末端結(jié)構(gòu)域特定位點(diǎn)磷酸化的改變似乎對間隙連接通道的開啟和關(guān)閉是關(guān)鍵的。羧基末端結(jié)構(gòu)域的磷酸化可能對將Cx43間隙連接半復(fù)合體帶到細(xì)胞膜的過程、其內(nèi)化及降解也很重要。連接蛋白的半衰期(數(shù)小時(shí))比大多數(shù)質(zhì)膜蛋白(數(shù)天)要短得多，舉例來說，Cx43在大鼠心臟中的半衰期小于1.5個(gè)小時(shí)。因此，周轉(zhuǎn)率的調(diào)控將會(huì)是調(diào)控GJIC的一個(gè)重要因素。
羧基末端結(jié)構(gòu)域含有多種蛋白激酶(PKA、PKC、PKG、MAPK、CaMkII及酪氨酸激酶)的推斷的磷酸化位點(diǎn)。羧基末端結(jié)構(gòu)域這些位點(diǎn)的磷酸化導(dǎo)致間隙連接通道的關(guān)閉，而且各種不同的Cx43間隙連接通道抑制劑利用不同的信號(hào)作用途徑來誘導(dǎo)羧基末端結(jié)構(gòu)域的磷酸化。細(xì)胞類型及特定的抑制劑決定利用何種信號(hào)作用途徑，而所涉及的蛋白激酶類型則指向所采用的胞內(nèi)信使系統(tǒng)。這樣PKA的激活需要cAMP第二信使系統(tǒng)的參與而PKC需要磷酸肌醇胞內(nèi)信號(hào)系統(tǒng)的參與。
其它調(diào)控通道門控作用的機(jī)制包括氫離子和鈣離子的胞內(nèi)水平、跨連接電壓、以及自由基。pH或pCa的下降誘導(dǎo)通道以一種細(xì)胞-和連接蛋白-特異性的方式關(guān)閉。
除了生長控制之外，還提出了GJIC的許多生理角色。體內(nèi)穩(wěn)態(tài)GJIC允許養(yǎng)分、離子及液體在細(xì)胞之間迅速平衡。這也許是這些通道最為原始、廣泛和重要的功能。電偶聯(lián)間隙連接在可電興奮細(xì)胞例如心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及神經(jīng)元中起著電突觸的作用。在這些組織中，電偶聯(lián)較之于化學(xué)突觸能允許動(dòng)作電位更迅速地進(jìn)行細(xì)胞到細(xì)胞傳遞。在心肌細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中，這使得它們同步收縮。組織對激素的應(yīng)答GJIC可以增強(qiáng)組織對外部刺激的反應(yīng)性。第二信使例如環(huán)核苷酸、鈣及肌醇磷酸的大小足以從激素激活的細(xì)胞通過連接通道進(jìn)入靜止細(xì)胞并激活后者。這樣一種作用可以增加組織對激動(dòng)劑的反應(yīng)。胚胎發(fā)育調(diào)控間隙連接可以在胚胎中作為化學(xué)和/或電發(fā)育信號(hào)的胞間通路，并界定發(fā)育區(qū)室的范圍。GJIC在胚胎細(xì)胞中以特定的方式發(fā)生，且GJIC的損傷與發(fā)育異常及許多化學(xué)物質(zhì)的致畸作用有關(guān)。
胞間通訊確保單個(gè)細(xì)胞的活動(dòng)以一種協(xié)同的方式發(fā)生，并使這些活動(dòng)并入到運(yùn)轉(zhuǎn)的組織的動(dòng)態(tài)中，以服務(wù)于其所在的生物體。因而種類繁多的病理狀況與GJIC的減弱相關(guān)是不足為奇的。已經(jīng)在體外和體內(nèi)都建立起了連接蛋白異常與一系列疾病狀態(tài)的聯(lián)系。一個(gè)例子是氣道上皮細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子對間隙連接通訊的調(diào)控，其中ChansonM、Berclaz PY、Scerri I、Dudez T、Wernke-Dollries K、Pizurki L、PaVIrani A、Fiedler MA、Suter S(Am J Pathol 2001 May；158(5)1775-84)發(fā)現(xiàn)由TNF-α誘導(dǎo)的胞間通訊減弱進(jìn)行性地導(dǎo)致炎癥。
總而言之，大量證據(jù)將間隙連接的功能失常如門控作用或關(guān)閉或甚至缺失與增加的疾病危險(xiǎn)聯(lián)系起來。沒有一種治療所述疾病的現(xiàn)有藥物通過促進(jìn)或增加間隙連接功能而作為胞間通訊易化物。不過，以前描述了能夠增加間隙連接傳導(dǎo)的一組肽(抗心律失常肽)。有關(guān)綜述在PCT/DK01/00127中提供，在此并入本文作為參考。關(guān)于本發(fā)明的概述在2001年2月22日遞交的USSN 09/792,286中公開，USSN09/792,286公開的內(nèi)容在此并入本文作為參考。
抗心律失常肽是選擇性作用于間隙連接從而減少細(xì)胞解偶聯(lián)并降低動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間的離差的一組肽。然而，天然AAP和合成的AAP10一樣具有一些不理想的特征，例如低穩(wěn)定性、高有效濃度等等，因而迄今為止阻止了其作為藥物的應(yīng)用。Grover和Dhein[21]用核磁共振光譜表征了AAP10的兩個(gè)半環(huán)狀構(gòu)象。所以，獲得穩(wěn)定抗心律失常肽的一個(gè)途徑可以是提供抗心律失常肽的環(huán)狀衍生物。DE19707854披露了表觀環(huán)狀的CF3C(OH)-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-CONH以及環(huán)狀的CO-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-CONH，其與AAP和AAP10具有相同的抗心律失常性能，但據(jù)稱在水溶液中以及經(jīng)重復(fù)凍融循環(huán)后具有改善的穩(wěn)定性。然而，DE19707854中描述的實(shí)驗(yàn)條件不足以制備所述的環(huán)狀化合物，而且該文給出的利用HPLC的化學(xué)鑒定數(shù)據(jù)也不足以鑒定所述的環(huán)狀化合物。US 4,775,743披露了HP5，一種具有N-3-(4-羥基苯基)丙酰-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH序列的肽衍生物，其具有抗血小板凝集的活性。Dhein和Tudyka[22]對屬于抗心律失常肽組的肽及其衍生物的文獻(xiàn)在活性及濃度方面進(jìn)行了綜述，參見該文表1，發(fā)現(xiàn)只有7個(gè)化合物具有活性，另有4個(gè)化合物具有微弱活性。不過，這些肽或肽衍生物里沒有一個(gè)顯示出在治療方案中足夠穩(wěn)定有效。
本文的肽在脊椎動(dòng)物組織尤其是哺乳動(dòng)物組織中增加間隙連接胞間通訊(GJIC)，并可用于治療脊椎動(dòng)物例如哺乳動(dòng)物中多種疾病和失調(diào)，這些疾病與胞間間隙連接通訊功能減弱有關(guān)或由其所致，如下文所述。
因而，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種預(yù)防或治療以下降或受損的細(xì)胞通訊為特征的疾病及醫(yī)學(xué)狀況的方法，例如因間隙連接胞間通訊的損傷或通過間隙連接的偶聯(lián)的損傷所引起的疾病。這些疾病及醫(yī)學(xué)狀況的例子有氣道上皮的炎癥、肺泡組織疾病、膀胱失禁、由耳蝸疾病所致的聽力損傷、內(nèi)皮病變、糖尿病性視網(wǎng)膜病和糖尿病性神經(jīng)病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和脊髓的局部缺血、牙組織疾病包括牙周病、腎病、及如前文所提及的骨髓移植失敗。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是通過本發(fā)明的肽包括抗心律失常肽化合物實(shí)現(xiàn)的。
在本發(fā)明中提供了預(yù)防或治療由受損的細(xì)胞通訊或受損的間隙連接功能所致的疾病的方法。例示的疾病包括那些影響呼吸、循環(huán)或神經(jīng)系統(tǒng)、視覺和聽力、牙組織、平滑肌系統(tǒng)、及細(xì)胞和組織移植的疾病。該方法可以作為唯一的療法單獨(dú)使用或與一個(gè)或多個(gè)針對特定疾病或狀況制定的其它方案結(jié)合使用。優(yōu)選的發(fā)明實(shí)踐包括治療哺乳動(dòng)物，如靈長類、嚙齒類(包括小鼠、大鼠、倉鼠及兔類動(dòng)物，例如兔)、狗、豬和山羊。優(yōu)選的靈長類是人類患者?？捎糜诒景l(fā)明方法的化合物的特征在于其作為GJIC易化物發(fā)揮功能。
更具體地，本發(fā)明涉及一種通過促進(jìn)(維持)患病細(xì)胞和組織中通過間隙連接發(fā)生的胞間通訊來預(yù)防或治療由受損的間隙連接功能所致的疾病的方法，優(yōu)選通過向患有所述疾病的患者施用治療有效量的至少一種促進(jìn)間隙連接胞間通訊的化合物。
可用于本發(fā)明的化合物都具有促進(jìn)或介導(dǎo)細(xì)胞和組織中GJIC的特征。實(shí)現(xiàn)這種GJIC介導(dǎo)的機(jī)制可能不同，因?yàn)橛性S多細(xì)胞機(jī)制影響連接蛋白功能和/或介導(dǎo)間隙連接功能。這些機(jī)制包括，如·通過增量調(diào)節(jié)或正?；B接蛋白的表達(dá)來控制間隙連接的細(xì)胞數(shù)量·抑制間隙連接和連接蛋白降解，包括通過提高半衰期調(diào)控連接蛋白的周轉(zhuǎn)率·增加連接蛋白到質(zhì)膜的細(xì)胞運(yùn)輸·介導(dǎo)連接蛋白裝配成功能性間隙連接
·誘導(dǎo)現(xiàn)存間隙連接的開啟，如在其由抑制劑關(guān)閉或門控時(shí)。這種機(jī)制可以描述為逆轉(zhuǎn)由GJIC抑制劑通過直接或間接的機(jī)制引起的間隙連接關(guān)閉，所述機(jī)制例如連接蛋白如Cx43胞質(zhì)羧基末端結(jié)構(gòu)域的過磷酸化。
羧基末端結(jié)構(gòu)域含有多種蛋白激酶(PKA、PKC、PKG、MAPK、CaMkII及酪氨酸激酶)的推斷的磷酸化位點(diǎn)。羧基末端結(jié)構(gòu)域這些位點(diǎn)的磷酸化導(dǎo)致間隙連接通道的關(guān)閉，而且各種不同的Cx43間隙連接通道抑制劑利用不同的信號(hào)作用途徑來誘導(dǎo)羧基末端結(jié)構(gòu)域的磷酸化。細(xì)胞類型及特定的抑制劑決定利用何種信號(hào)作用途徑，而所涉及的蛋白激酶類型則指向所采用的胞內(nèi)信使系統(tǒng)。這樣PKA的激活據(jù)報(bào)道需要cAMP第二信使系統(tǒng)的參與而PKC需要磷酸肌醇胞內(nèi)信號(hào)系統(tǒng)的參與。
其它調(diào)節(jié)通道門控作用的機(jī)制包括氫離子和鈣離子的胞內(nèi)水平、跨連接電壓、氧和葡萄糖的低可用性、以及自由基。pH或pCa的下降誘導(dǎo)通道以一種細(xì)胞-和連接蛋白-特異性的方式關(guān)閉。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了肽例如抗心律失常肽的用途，優(yōu)選下文詳細(xì)描述的為AAP受體激動(dòng)劑的肽(描述于PCT/DK01/00127和USSN09/792,286中，均遞交于2001年2月22日。USSN 09/792,286申請是2000年12月6日遞交的美國臨時(shí)申請60/251,659的繼續(xù)，該申請要求2000年2月23日遞交的丹麥專利申請DK PA2000 00288及2000年5月4日遞交的DK PA2000 00738的利益。USSN 09/792,286，60/251,659及丹麥申請DK PA2000 00288和DK PA2000 00738公開的內(nèi)容分別在此引用作為參考)，用于治療特定的疾病，包括氣道上皮的炎癥、肺泡組織疾病、創(chuàng)傷、勃起障礙、泌尿膀胱失禁、由耳蝸疾病所致的聽力損傷、內(nèi)皮病變、糖尿病性視網(wǎng)膜病和糖尿病性神經(jīng)病、神經(jīng)病性疼痛、中樞神經(jīng)系統(tǒng)局部缺血、脊髓損傷、牙組織疾病包括牙周病、腎病、亞慢性和慢性炎癥、癌癥及骨髓和干細(xì)胞移植失敗。這些疾病或醫(yī)學(xué)狀況特征在于GJIC損傷作為疾病或疾病進(jìn)展的主導(dǎo)原因。
PCT/DK01/00127中公開的抗心律失常肽及其功能類似物在本發(fā)明中有用。
所述抗心律失常肽包括一組選擇性作用于間隙連接從而減少細(xì)胞解偶聯(lián)并降低動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間的離差的肽，類似于前文所述的抗心律失常肽AAP10的效果?？剐穆墒Сｋ牡姆肿影谢蚴荏w目前還不知曉。不過，R.Grover和S.Dhein已經(jīng)就AAP10在一個(gè)推斷受體上的結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)提出了假設(shè)(Peptides 2001，22 1011-1021)。假定可用于本發(fā)明的肽是抗心律失常肽如AAP10受體的激動(dòng)劑，而肽與受體之間互相作用的生理效應(yīng)是通過間隙連接的細(xì)胞偶聯(lián)增加或者是增強(qiáng)或介導(dǎo)GJIC。不過，有許多更為理論上的信號(hào)作用途徑可能調(diào)控間隙連接的功能，本發(fā)明人不希望被GJIC調(diào)節(jié)生物作用之后的任何特定理論束縛。
總的來說，本發(fā)明提供了治療由活性氧和/或自由基和/或氧化氮過量所致的疾病和組織紊亂的方法。一個(gè)例子是糖尿病性神經(jīng)病以及其中因自由基導(dǎo)致谷胱甘肽耗竭從而間隙連接減少或間隙連接通訊解偶聯(lián)的傷口。低氧供應(yīng)和/或高濃度自由基在有壞死組織的傷口、糖尿病、動(dòng)脈硬化、外科手術(shù)傷口、水腫、感染、燒傷以及靜脈功能不全中很重要，會(huì)降低間隙連接通訊。自由基對于神經(jīng)末梢破壞、降低的傳導(dǎo)性、脫髓鞘、以及增加的炎癥反應(yīng)至關(guān)重要。已知噪音誘導(dǎo)的聽力喪失、老年性耳聾與自由基的產(chǎn)生相關(guān)聯(lián)并與間隙連接偶聯(lián)的抑制有關(guān)。過量的自由基還會(huì)減少內(nèi)皮修復(fù)以及血管形成過程中毛細(xì)管的萌發(fā)。
例如，在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防氣道炎癥的方法。優(yōu)選的方法包括向需要這種治療的患者施用治療有效量的至少一種易化間隙連接胞間通訊的化合物。
本發(fā)明還提供了治療或預(yù)防膀胱失禁的方法。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該方法包括向需要這種治療的患者施用治療有效量的至少一種易化間隙連接胞間通訊的化合物。
本發(fā)明還提供了治療或預(yù)防由耳蝸疾病所致的聽力損傷的方法。例如，在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該方法包括向需要這種治療的患者施用治療有效量的至少一種易化間隙連接胞間通訊的化合物。
特別地，本發(fā)明涉及易化細(xì)胞通訊例如間隙連接胞間通訊的化合物用于生產(chǎn)預(yù)防或治療疾病的藥物組合物的用途，所述疾病優(yōu)選非增殖性疾病包括例如氣道上皮的炎癥、肺泡組織疾病、傷口、勃起障礙、膀胱失禁、由耳蝸疾病所致的聽力損傷、內(nèi)皮病變、糖尿病性視網(wǎng)膜病和糖尿病性神經(jīng)病、神經(jīng)病性疼痛、中樞神經(jīng)系統(tǒng)局部缺血、脊髓損傷、牙組織疾病包括牙周病、腎病、亞慢性和慢性炎癥、癌癥及骨髓和干細(xì)胞移植失敗。
發(fā)明的詳細(xì)說明可用于本發(fā)明的肽包括具有以下通式的化合物，其中虛線表示式I任選為環(huán)狀，顯示的鍵代表共價(jià)鍵；其中A代表具有一個(gè)氨基基團(tuán)(基)和一個(gè)羧基基團(tuán)(基)的化學(xué)部分，其形成連接A與X和B的部分肽鍵；B代表具有一個(gè)氨基基團(tuán)(基)和一個(gè)羧基基團(tuán)(基)的化學(xué)部分，其形成連接B與A和Y的部分肽鍵；當(dāng)Y代表具有2-5個(gè)可獨(dú)立為L-或D-構(gòu)型的氨基酸殘基的C-末端肽序列時(shí)，X代表具有1-3個(gè)可獨(dú)立為L-或D-構(gòu)型的氨基酸殘基的肽序列；或者當(dāng)Y代表具有2-5個(gè)可獨(dú)立為L-或D-構(gòu)型的氨基酸殘基的C-末端肽序列時(shí)，X代表基團(tuán)A-B的N-末端修飾；或者當(dāng)Y代表具有1-3個(gè)可獨(dú)立為L-或D-構(gòu)型的氨基酸殘基的C-末端肽序列時(shí)，X代表具有2-5個(gè)可獨(dú)立為L-或D-構(gòu)型的氨基酸殘基的肽序列；而且當(dāng)式I代表線狀肽時(shí)，X任選在其N-末端化學(xué)修飾，而L是任選的包含0-8個(gè)骨架原子的連接基團(tuán)；以及式I的鏡像或反轉(zhuǎn)(retro)類似物、或者式I的衍生物，其為藥學(xué)上可接受的鹽，烷基、芳基或芳烷基酯，酰胺，單-或雙-取代的酰胺，其中取代基為烷基、芳基或芳烷基，酰肼或醇；條件是化合物
H-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-OH，H-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH，N-3-(4-羥基苯基)丙酰-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH，N-3-苯基丙酰-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH，N-3-苯基丙基-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH，N-3-(4-羥基苯基)丙酰-Pro-4Hyp-Gly-Ala-OH，N-3-(4-羥基苯基)丙酰-Pro-4Hyp-Gly-OH，N-3-(4-羥基苯基)丙酰-Pro-4Hyp-OH，N-3-(4-羥基苯基)丙酰-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly-OH，H-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-NH2，H-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-Oh，H-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-NH2，H-Gly-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly-OH，H-Gly-Pro-Sar-Gly-Ala-GlyOH，H-Gly-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly-OH，H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr(3-I)-NH2，H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr(3-F)-NH2H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr(3-Cl)-NH2H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr(3-Br)-NH2H-Arg-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-NH2H-Val-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-NH2H-Ala-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-NH2H-Gly-Ala-Gly-Hyp-His-Tyr-NH2H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Phe-NH2環(huán)(CF3C(OH)-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-CONH)，環(huán)(CO-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-CONH)，CF3C(OH)-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-CONH，和CO-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-CONH不被所述通式覆蓋。優(yōu)選共價(jià)鍵選自肽鍵、二硫鍵、酯鍵、還原的酰胺鍵、烷氧基鍵、氧羰基鍵和酰氧基烷氧基鍵。A和B的例子包括式Z
(Z) 其中n是數(shù)值為3、4或5的整數(shù)，R代表一個(gè)選擇性的取代基，優(yōu)選選自由鹵素、苯基、羥基、NH2及C(1-6)烷基構(gòu)成的組。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選具體實(shí)施方案中，A和B各自代表一個(gè)具有功能性氨基和羧酸基團(tuán)的氨基酸或氨基酸衍生物。A和B進(jìn)一步的例子由式Za所示其中n是數(shù)值為0、1、2和3的整數(shù)，p是數(shù)值為0、1、2和3的整數(shù)，Z代表O或S，R代表一個(gè)選擇性的取代基，優(yōu)選選自由鹵素、苯基、羥基、NH2及C(1-6)烷基構(gòu)成的組。本發(fā)明中A或B由式Za代表的例示性化合物是化合物11 H-Gly-Ala-Gly-NCG-Pro-Tyr-NH2化合物12 H-Gly-Ala-Gly-T4C-Pro-Tyr-NH2化合物13 H-Gly-Ala-Gly-A2C-Pro-Tyr-NH2化合物14 H-Gly-Ala-Gly-PC-Pro-Tyr-NH2及其鹽。
A和B的例子包括但不局限于下列化合物的N-和C(O)-基
D/L-氮雜環(huán)丁烷-3-羧酸，D/L-氮雜環(huán)丁烷-2-羧酸，D/L-二氫吲哚-2-羧酸，D/L-1，3-二氫-異吲哚-1-羧酸，D/L-噻唑烷-4-羧酸，D/L-2-哌啶酸，D/L-nipecotinic acid，isonipecotinic acidL/D-2-羧基嗎啉，L/D-1，2，3，4-四氫喹啉-3-羧酸，L/D-1，2，3，4-四氫喹啉-3-羧酸，和4-羧基-4-苯基-哌啶。
優(yōu)選地，A和B的化學(xué)部分各自代表具有包含一個(gè)或多個(gè)雜環(huán)原子例如N和S的4、5或6元飽和碳環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基。所述氨基酸殘基包括L和D構(gòu)型，天然和非天然氨基酸及其衍生物，例如在3、4或5位具有一個(gè)或多個(gè)取代的脯氨酸殘基，所述取代基優(yōu)選選自羥基、氨基或苯基；以及N-取代的氨基酸，例如肌氨酸、N-環(huán)己基甘氨酸和N-苯基甘氨酸。優(yōu)選序列A-B代表選自由Sar-Sar、Sar-Hyp、Hyp-Sar、Pro-Sar、Sar-Pro、Pro-Hyp、Pro-Pro、Hyp-Pro及Hyp-Hyp構(gòu)成的組的二肽，其中Pro和Hyp可獨(dú)立為L或D構(gòu)型，其中Pro和Hyp的環(huán)結(jié)構(gòu)任選由鹵素、硝基、甲基、氨基或苯基取代，且Hyp代表3-羥脯氨酸或4-羥脯氨酸，或者A-B氨基酸殘基之一或兩者都是Sar或N-環(huán)己基甘氨酸殘基。
上面的通式可以代表一個(gè)線狀肽，其中所述X N-末端的化學(xué)修飾是酰化作用，用任選取代的C(1-22)烷基羧酸，例如乙酸、丙酸、丁酸和其它脂肪酸，或者任選取代的C(2-22)鏈烯基羧酸或芳基羧酸，例如苯甲酸，其中取代基選自羥基、鹵素、C(1-6)烷基、硝基、或氰基，并且可位于碳鏈或芳香部分上；或者是烷化作用，用任選取代的C(1-22)烷基、C(2-22)鏈烯基、或者芳基(1-22)烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁基、苯丙基、2-羥基苯基丙基和4-羥基苯基丙基，其中取代基選自羥基、鹵素、C(1-6)烷基、硝基、或氰基，并且可位于碳鏈或芳香部分上。更優(yōu)選地，當(dāng)Y代表如前文定義的具有2-5個(gè)氨基酸殘基的C-末端肽序列時(shí)，X選自L-Tyr和D-Tyr，其任選被C(1-4)羧酸?；瑑?yōu)選乙酸。還優(yōu)選X代表基團(tuán)A-B的N-末端修飾，所述修飾優(yōu)選選自苯丙酸及其衍生物，例如4HPP和2HPP；苯乙酸及其衍生物，例如4HPA、3HPA和2HPA；苯氧基乙酸及其衍生物，例如4HPPA、2HPPA和4HMPA；苯甲酰甘氨酸及其衍生物，例如4HBG、3HBG和2HBG；以及通過酰胺鍵與A結(jié)合的苯基甘氨酸及其衍生物。
A-B更優(yōu)選選自由Pro-Hyp、Pro-Pro、Hyp-Pro及Hyp-Hyp構(gòu)成的組，其中Pro和Hyp可獨(dú)立為L或D構(gòu)型，且Hyp優(yōu)選代表4Hyp。優(yōu)選地，Y代表3-5個(gè)氨基酸殘基的肽，或者優(yōu)選3-4個(gè)氨基酸殘基，所述氨基酸殘基獨(dú)立地為L-或D-構(gòu)型，且優(yōu)選在其C-末端具有Sar或Gly，而且當(dāng)X代表單個(gè)氨基酸時(shí)，更優(yōu)選Y代表選自以下的肽序列，Gly-L-Ala-Gly-OH，Gly-L-Ala-Gly-NH2，Gly-D-Ala-Gly-OH，Gly-D-Ala-Gly-NH2，和Sar-Aib-Sar-OH/NH2。
式I線狀化合物的例子是
H-Gly-Ala-Gly-Gly-Pro-Tyr-OH/NH2，Ac-L-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-L-Ala-Gly-OH/NH2，Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH，Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2(化合物2)Ac-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH(化合物1)Ac-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2Ac-Tyr-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2Ac-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2Ac-Tyr-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2Ac-Tyr-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2Ac-Tyr-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2Ac-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2Ac-Tyr-4 Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2Ac-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2Ac-Tyr-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2Ac-D-Tyr-D-Pro-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2Ac-Tyr-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2Ac-D-Tyr-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2Ac-Tyr-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2Ac-D-Tyr-Sar-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2Tfa-L-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-L-Ala-Gly-OH，Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH，Tfa-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OHTfa-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2Tfa-Tyr-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2Tfa-Tyr-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2Tfa-Tyr-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2Tfa-Tyr-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2Tfa-Tyr-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2Tfa-Tyr-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2Tfa-D-Tyr-D-Pro-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2Tfa-Tyr-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2Tfa-D-Tyr-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2Tfa-Tyr-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2Tfa-D-Tyr-Sar-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HPP-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HPPA-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HPPA-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HMPA-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HMPA-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HPA-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HPA-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HBG-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HBG-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HPP-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HPP-D-Pro-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HPPA-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HPPA-D-Pro-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HMPA-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HMPA-D-Pro-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HPA-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HPA-D-Pro-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HBG-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HBG-D-Pro-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HPP-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HPP-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HPPA-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HPPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HMPA-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HMPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HPA-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HBG-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HBG-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HPP-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HPP-D-4Hyp-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HPPA-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HPPA-D-4Hyp-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HMPA-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HMPA-D-4Hyp-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HPA-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HPA-D-4Hyp-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HBG-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HBG-D-4Hyp-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HPP-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HPP-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HPPA-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HPPA-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HMPA-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HMPA-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HPA-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HPA-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HBG-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HBG-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HPP-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HPP-D-Pro-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HPPA-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HPPA-D-Pro-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HMPA-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HMPA-D-Pro-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HPA-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HPA-D-Pro-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HBG-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HBG-D-Pro-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HPP-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HPP-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HPPA-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HPPA-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HMPA-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HMPA-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPA-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HPA-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HBG-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HBG-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HPP-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HPP-D-4Hyp-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HPPA-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HPPA-D-4Hyp-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HMPA-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HMPA-D-4Hyp-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HPA-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HPA-D-4Hyp-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HBG-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HBG-D-4Hyp-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HPP-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HPP-Sar-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HPPA-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HPPA-Sar-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HMPA-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HMPA-Sar-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HPA-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HPA-Sar-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH24HBG-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH24HBG-Sar-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2Ac-Tyr-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2Ac-Tyr-Pro-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2Ac-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2Ac-Tyr-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2Ac-Tyr-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2Ac-Tyr-Sar-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2Ac-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2Ac-Tyr-4Hyp-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2Ac-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2Ac-Tyr-Pro-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-Pro-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2Ac-Tyr-Sar-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2Ac-D-Tyr-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2Tfa-Tyr-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2Tfa-Tyr-Pro-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2Tfa-Tyr-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2Tfa-Tyr-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2Tfa-Tyr-Sar-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2Tfa-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2Tfa-Tyr-4Hyp-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2Tfa-Tyr-Pro-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2Tfa-D-Tyr-D-Pro-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2Tfa-Tyr-Sar-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2Tfa-D-Tyr-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH24HPP-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH24HPP-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH24HPPA-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH24HPPA-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH24HMPA-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH24HMPA-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH24HPA-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH24HPA-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH24HBG-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH24HBG-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH24HPP-Pro-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH24HPP-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH24HPPA-Pro-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH24HPPA-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH24HMPA-Pro-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH24HMPA-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH24HPA-Pro-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH24HPA-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HBG-Pro-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH24HBG-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH24HPP-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH24HPP-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH24HPPA-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH24HPPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH24HMPA-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH24HMPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH24HPA-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH24HPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH24HBG-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH24HBG-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH24HPP-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH24HPP-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH24HPPA-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH24HPPA-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH24HMPA-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH24HMPA-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH24HPA-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH24HPA-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH24HBG-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH24HBG-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH24HPP-Sar-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH24HPP-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH24HPPA-Sar-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH24HPPA-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH24HMPA-Sar-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH24HMPA-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH24HPA-Sar-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH24HPA-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH24HBG-Sar-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH24HBG-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH24HPP-Pro-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH24HPP-D-Pro-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH24HPPA-Pro-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH24HPPA-D-Pro-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH24HMPA-Pro-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
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Ac-Tyr-Pro-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2Ac-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2Ac-Tyr-4Hyp-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2Ac-Tyr-4Hyp-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-Alb-Gly-OH/NH2Ac-Tyr-Sar-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2Ac-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Sar-Alb-Gly-OH/NH2Ac-Tyr-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2Ac-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2Ac-Tyr-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2Ac-D-Tyr-D-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2Ac-Tyr-Sar-Pro-Sar-Alb-Gly-OH/NH2Ac-D-Tyr-Sar-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2Ac-Tyr-Sar-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2Ac-D-Tyr-Sar-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HPP-Pro-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2Tfa-Tyr-Pro-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Sar-Alb-Gly-OH/NH2Tfa-Tyr-Pro-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Sar-Alb-Gly-OH/NH2Tfa-Tyr-4Hyp-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2Tfa-Tyr-4Hyp-4Hyp-Sar-Alb-Gly-OH/NH2Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2Tfa-Tyr-Sar-4Hyp-Sar-Alb-Gly-OH/NH2Tfa-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Sar-Alb-Gly-OH/NH2Tfa-Tyr-4Hyp-Sar-Sar-Alb-Gly-OH/NH2Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2Tfa-Tyr-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2Tfa-D-Tyr-D-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2Tfa-Tyr-Sar-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2Tfa-D-Tyr-Sar-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2Tfa-Tyr-Sar-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2Tfa-D-Tyr-Sar-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HPP-D-Pro-D-4Hyp-Sar-Alb-Gly-OH/NH24HPPA-Pro-4HyP-Sar-Alb-Gly-OH/NH2
4HPPA-D-Pro-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HMPA-Pro-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HMPA-D-Pro-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HPA-Pro-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HPA-D-Pro-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HBG-Pro-4Hyp-Sar-Alb-Gly-OH/NH24HBG-D-Pro-D-4Hyp-Sar-Alb-Gly-OH/NH24HPP-Pro-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HPP-D-Pro-D-Pro-Sar-Alb-Gly-OH/NH24HPPA-Pro-Pro-Sar-Alb-Gly-OH/NH24HPPA-D-Pro-D-Pro-Sar-Alb-Gly-OH/NH24HMPA-Pro-Pro-Sar-Alb-Gly-OH/NH24HMPA-D-Pro-D-Pro-Sar-Alb-Gly-OH/NH24HPA-Pro-Pro-Sar-Alb-Gly-OH/NH24HPA-D-Pro-D-Pro-Sar-Alb-Gly-OH/NH24HBG-Pro-Pro-Sar-Alb-Gly-OH/NH24HBG-D-Pro-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HPP-4Hyp-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HPP-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HPPA-4Hyp-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HPPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HMPA-4Hyp-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HMPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HPA-4Hyp-4Hyp-Sar-Alb-Gly-OH/NH24HPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-Alb-Gly-OH/NH24HBG-4Hyp-4Hyp-Sar-Alb-Gly-OH/NH24HBG-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HPP-4Hyp-Pro-Sar-Alb-Gly-OH/NH24HPP-D-4Hyp-D-Pro-Sar-Alb-Gly-OH/NH24HPPA-4Hyp-Pro-Sar-Alb-Gly-OH/NH24HPPA-D-4Hyp-D-Pro-Sar-Alb-Gly-OH/NH24HMPA-4Hyp-Pro-Sar-Alb-Gly-OH/NH24HMPA-D-4Hyp-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HPA-4Hyp-Pro-Sar-Alb-Gly-OH/NH24HPA-D-4Hyp-D-Pro-Sar-Alb-Gly-OH/NH24HBG-4Hyp-Pro-Sar-Alb-Gly-OH/NH24HBG-D-4Hyp-D-Pro-Sar-Alb-Gly-OH/NH2
4HPP-Sar-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HPP-Sar-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HPPA-Sar-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HPPA-Sar-D-Pro-Sar-Alb-Gly-OH/NH24HMPA-Sar-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HMPA-Sar-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HPA-Sar-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HPA-Sar-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HBG-Sar-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HBG-Sar-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HPP-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HPP-D-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HPPA-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HPPA-D-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HMPA-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HMPA-D-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HPA-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HPA-D-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HBG-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HBG-D-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HPP-Sar-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HPP-Sar-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HPPA-Sar-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HPPA-Sar-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HMPA-Sar-4Hyp-Sar-Alb-Gly-OH/NH24HMPA-Sar-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HPA-Sar-4Hyp-Sar-Alb-Gly-OH/NH24HPA-Sar-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HBG-Sar-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HBG-Sar-D-4Hyp-Sar-Alb-Gly-OH/NH24HPP-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HPP-D-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HPPA-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HPPA-D-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HMPA-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HMPA-D-4Hyp-Sar-Sar-Alb-Gly-OH/NH24HPA-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPA-D-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HBG-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HBG-D-4Hyp-Sar-Sar-Alb-Gly-OH/NH24HPP-Sar-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HPPA-Sar-Sar-Sar-Alb-Gly-OH/NH24HMPA-Sar-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HPA-Sar-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH24HBG-Sar-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2Ac-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Alb-Sar-OH/NH2Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-Alb-Sar-OH/NH2Ac-Tyr-Pro-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2Ac-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Gly-Aib-Sar-O H/NH2Ac-Tyr-4Hyp-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2Ac-Tyr-4Hyp-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-Alb-Sar-OH/NH2Ac-Tyr-Sar-4Hyp-Gly-Alb-Sar-OH/NH2Ac-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2Ac-Tyr-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2Ac-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2Ac-Tyr-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2Ac-D-Tyr-D-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2Ac-Tyr-Sar-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2Ac-D-Tyr-Sar-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2Ac-Tyr-Sar-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2Ac-D-Tyr-Sar-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPP-Pro-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2Tfa-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2Tfa-Tyr-Pro-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2Tfa-Tyr-4Hyp-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2Tfa-Tyr-4Hyp-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2Tfa-Tyr-Sar-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2Tfa-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
Tfa-Tyr-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2Tfa-Tyr-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2Tfa-D-Tyr-D-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2Tfa-Tyr-Sar-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2Tfa-D-Tyr-Sar-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2Tfa-Tyr-Sar-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2Tfa-D-Tyr-Sar-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPP-D-Pro-D-4Hyp-Gly-Alb-Sar-OH/NH24HPPA-Pro-4Hyp-Gly-Alb-Sar-OH/NH24HPPA-D-Pro-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HMPA-Pro-4Hyp-Gly-Alb-Sar-OH/NH24HMPA-D-Pro-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPA-Pro-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPA-D-Pro-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HBG-Pro-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HBG-D-Pro-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPP-Pro-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPP-D-Pro-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPPA-Pro-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPPA-D-Pro-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HMPA-Pro-Pro-Gly-Alb-Sar-OH/NH24HMPA-D-Pro-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPA-Pro-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPA-D-Pro-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HBG-Pro-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HBG-D-Pro-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPP-4Hyp-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPP-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPPA-4Hyp-4Hyp-Gly-Alb-Sar-OH/NH24HPPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HMPA-4Hyp-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HMPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPA-4Hyp-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HBG-4Hyp-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HBG-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-4Hyp-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPP-D-4Hyp-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPPA-4Hyp-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPPA-D-4Hyp-D-Pro-Gly-Alb-Sar-OH/NH24HMPA-4Hyp-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HMPA-D-4Hyp-D-Pro-Gly-Alb-Sar-OH/NH24HPA-4Hyp-Pro-Gly-Alb-Sar-OH/NH24HPA-D-4Hyp-D-Pro-Gly-Alb-Sar-OH/NH24HBG-4Hyp-Pro-Gly-Alb-Sar-OH/NH24HBG-D-4Hyp-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPP-Sar-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPP-Sar-D-Pro-Gly-Alb-Sar-OH/NH24HPPA-Sar-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPPA-Sar-D- Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HMPA-Sar-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HMPA-Sar-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPA-Sar-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPA-Sar-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HBG-Sar-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HBG-Sar-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPP-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPP-D-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPPA-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPPA-D-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HMPA-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HMPA-D-Pro-Sar-Gly-Alb-Sar-OH/NH24HPA-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPA-D-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HBG-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HBG-D-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPP-Sar-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPP-Sar-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPPA-Sar-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPPA-Sar-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HMPA-Sar-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HMPA-Sar-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPA-Sar-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-Sar-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HBG-Sar-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HBG-Sar-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPP-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPP-D-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPPA-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPPA-D-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HMPA-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HMPA-D-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPA-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPA-D-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HBG-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HBG-D-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPP-Sar-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPPA-Sar-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HMPA-Sar-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH24HPA-Sar-Sar-Gly-Alb-Sar-OH/NH24HBG-Sar-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2以及其鏡像、其反轉(zhuǎn)類似物和其衍生物，選自由藥學(xué)上可接受的鹽；烷基、芳基和芳烷基酯；單-和雙-取代的酰胺，其中取代基選自烷基、芳基和芳烷基；酰肼；和醇構(gòu)成的組。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，式I代表環(huán)狀肽，其中A-B選自由Sar-Sar、Sar-Hyp、Hyp-Sar、Pro-Sar、Sar-Pro、Pro-Hyp、Pro-Pro、Hyp-Pro和Hyp-Hyp構(gòu)成的組，其中Pro和Hyp可獨(dú)立為L或D構(gòu)型，且Hyp優(yōu)選代表4-羥脯氨酸。更優(yōu)選地，A-B代表未取代的L-Pro-L-4Hyp、L-4Hyp-L-Pro、D-Pro-D-4Hyp或D-4Hyp-D-Pro。
當(dāng)Y代表獨(dú)立為L-或D-構(gòu)型的3或4個(gè)氨基酸殘基的肽，優(yōu)選在其C-末端具有Asp或Glu時(shí)，更優(yōu)選當(dāng)Y代表選自以下的肽序列時(shí)Gly-L-Ala-L-Asn，
Gly-D-Ala-L-Asn，Gly-L-Ala-Gly-L-Asn，Gly-L-Ala-Gly-D-Asn，Gly-L-Ala-L-Gln，Gly-L-Ala-Gly-L-Gln，Gly-L-Ala-Gly-D-Gln，Gly-D-Ala-D-Asn，Gly-D-Ala-Gly-D-Asn，Gly-D-Ala-Gly-L-Asn，Gly-D-Ala-D-Gln，Gly-D-Ala-Gly-D-Gln，Gly-D-Ala-L-Gln，Gly-D-Ala-Gly-D-Gln，Gly-L-Ala-L-Asp，Gly-D-Ala-L-Asp，Gly-L-Ala-Gly-L-Asp，Gly-L-Ala-Gly-D-Asp，Gly-L-Ala-L-Glu，Gly-L-Ala-Gly-L-Glu，Gly-L-Ala-Gly-D-Glu，Gly-D-Ala-D-Asp，Gly-D-Ala-Gly-D-Asp ，Gly-D-Ala-Gly-L-Asp，Gly-D-Ala-D-Glu，Gly-D-Ala-Gly-D-Glu，Gly-D-Ala-L-Glu，Gly-D-Ala-Gly-D-Glu，X代表單個(gè)的氨基酸殘基，優(yōu)選L-Tyr或D-Tyr，任選在其芳環(huán)上進(jìn)一步被鹵素、苯基、羥基、NH2和任選被鹵素取代的C(1-6)烷基取代；或者當(dāng)Y代表單個(gè)的氨基酸殘基，優(yōu)選L-Tyr或D-Tyr，任選在其芳環(huán)進(jìn)一步被鹵素例如Cl取代時(shí)，X代表一個(gè)肽序列，優(yōu)選選自由Gly-L-Ala-L-Asp，Gly-L-Ala-Gly-L-Asp，Gly-L-Ala-L-Glu，Gly-L-Ala-Gly-L-Glu，Gly-D-Ala-D-Asp，Gly-D-Ala-Gly-D-Asp，Gly-D-Ala-D-Glu，Gly-D-Ala-Gly-D-Glu，構(gòu)成的組。
式I可以代表全部由L-構(gòu)型、全部由D-構(gòu)型組成的環(huán)狀肽序列，或者具有混合的L-構(gòu)型和D-構(gòu)型氨基酸殘基的序列。

圖1顯示了本發(fā)明范圍內(nèi)的7種不同環(huán)狀結(jié)構(gòu)的概要。
式I環(huán)狀化合物的例子是環(huán)(L-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-L-Ala-L-Asn)(化合物4)，環(huán)(L-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-D-Ala-L-Asn)，環(huán)(L-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-L-Ala-L-Asp)，環(huán)(L-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-L-Ala-Gly-L-Asn)(化合物3)，環(huán)(L-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-L-A-Gly-L-Asp)，環(huán)(D-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-L-Ala-Gly-L-Asp)，環(huán)(D-TyR-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-D-Asn)，環(huán)(D-TYr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-D-Asp)，環(huán)(D-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-D-Ala-D-Asp)，環(huán)(D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-D-Asn)，環(huán)(D-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-L-Asn)，環(huán)(D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-D-Asp)，環(huán)(L-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-L-Ala-L-Gln)，環(huán)(L-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-D-Ala-L-Gln)，環(huán)(L-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-L-Ala-L-Glu)，環(huán)(L-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-L-Ala-Gly-L-Gln)，環(huán)(L-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-L-Ala-Gly-L-Glu)，環(huán)(D-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-L-Ala-Gly-L-Glu)，環(huán)(D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-D-Gln)，環(huán)(D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-D-Glu)，環(huán)(D-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-D-Ala-D-Glu)，環(huán)(D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-D-Gln)，環(huán)(D-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-L-Gln)，環(huán)(D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-D-Glu)，環(huán)(-Tyr-Ala-Ser-Ala-Gly-Asn-)化合物44環(huán)(-Tyr-Gly-Asn-Tyr-Gly-Asn-)化合物45環(huán)(-Tyr-Gly-Asn-Tyr-Ala-Gly-Asn-)化合物46環(huán)(-Tyr-Val-Ser-Gly-Ala-Gly-Asn-)化合物47以及其鏡像、其反轉(zhuǎn)類似物和其衍生物，例如藥學(xué)上可接受的鹽和酰胺。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，式I代表環(huán)狀化合物，其中基團(tuán)X和Y通過氨基羰基鍵、烷氧基鍵、酯鍵、還原的酰胺鍵或二硫鍵相連。其中X和Y通過烷氧基鍵相連的，具有式的接頭L(其中R′和R″各自代表氫或低級烷基和/或低級芳基，優(yōu)選甲基和苯基)的化合物的實(shí)例列舉如下環(huán)(O-C(R′，R″)-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly)環(huán)(O-C(R′，R″)-Tyr-4-Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly)環(huán)(O-C(R′，R″)-Tyr-4-Hyp-4-Hyp-Gly-Ala-Gly)環(huán)(O-C(R′，R″)-Tyr-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly)環(huán)(O-C(R’，R″)-Tyr-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly)環(huán)(O-C(R′，R″)-Tyr-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly)環(huán)(O-C(R′， R″)-Tyr-4-Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly)環(huán)(O-CH2-Tyr-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly)環(huán)(O-C(甲基，苯基)-Tyr-Sar-4-Hyp-Gly-Ala-Gly)以及其鏡像、其反轉(zhuǎn)類似物和其衍生物，例如藥學(xué)上可接受的鹽和酰胺。
其中X和Y通過氨基羰基鍵相連的，具有式的接頭L的化合物實(shí)例列舉如下環(huán)(HNC(O)-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly)環(huán)(HNC(O)-Tyr-4-Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly)環(huán)(HNC(O)-Tyr-4-Hyp-4-Hyp-Gly-Ala-Gly)環(huán)(HNC(O)-Tyr-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly)環(huán)(HNC(O)-Tyr-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly)環(huán)(HNC(O)-Tyr-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly)環(huán)(HNC(O)-Tyr-4-Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly)環(huán)(HNC(O)-Tyr-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly)環(huán)(HNC(O)-Tyr-Sar-4-Hyp-Gly-Ala-Gly)
以及其鏡像、其反轉(zhuǎn)類似物和其衍生物，例如藥學(xué)上可接受的鹽和酰胺。
其中X和Y通過酯鍵相連的，具有式的接頭L(其中R′和R″各自代表氫或低級烷基和/或低級芳基，優(yōu)選甲基和苯基，優(yōu)選R′≠R″)的化合物實(shí)例列舉如下環(huán)(O-C(R′，R″)C(O)-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly)環(huán)(O-C(R′，R″)C(O)-Tyr-4-Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly)環(huán)(O-C(R′，R″)C(O)-Tyr-4-Hyp-4-Hyp-Gly-Ala-Gly)環(huán)(O-C(R′，R″)C(O)-Tyr-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly)環(huán)(O-C(R′，R″)C(O)-Tyr-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly)環(huán)(O-C(R′，R″)C(O)-Tyr-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly)環(huán)(O-C(R′，R″)C(O)-Tyr-4-Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly)環(huán)(O-C(R′，R″)C(O)-Tyr-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly)環(huán)(O-C(苯基，甲基)C(O)-Tyr-Sar-4-Hyp-Gly-Ala-Gly)以及其鏡像、其反轉(zhuǎn)類似物和其衍生物，例如藥學(xué)上可接受的鹽和酰胺。
當(dāng)酯鍵作為本發(fā)明環(huán)狀化合物的部分骨架時(shí)，L可以來自羥基-羧酸，例如羥基C(3-6)烷基碳環(huán)酸。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，L來自α-羥基-羧酸，優(yōu)選具有通式HO-C(R1)(R2)-COOH，其中R1和R2獨(dú)立為H、C(1-6)-烷基、C(2-6)-鏈烯基、芳基、芳基-C(1-4)-烷基、雜芳基或雜芳基-C(1-4)-烷基；或者R1和R2與它們所結(jié)合的碳原子一起形成環(huán)戊基、環(huán)己基或環(huán)庚基環(huán)；其中的烷基或鏈烯基基團(tuán)可以被選自以下的1-3個(gè)取代基取代氨基、氰基、鹵素、異氰基、異硫氰基、硫氰基、氨磺酰、C(1-4)-烷硫基、單-或雙-C(1-4)-烷基-氨基、羥基、C(1-4)烷氧基、芳基、雜芳基、芳氧基、羧基、C(1-4)-烷氧基羰基、C(1-4)-烷基羰基氧、氨基羰基、單-或雙-C(1-4)-烷基-氨基羰基、單-或雙-C(1-4)-烷基-氨基、單-或雙-C(1-4)-烷基-氨基-C(1-4)-烷基，C(1-4)-烷基羰基-氨基、溯砜(sulfono)和亞磺基；而其中的芳基或雜芳基基團(tuán)可以被選自以下的1-3個(gè)取代基取代C(1-4)-烷基、C(2-4)-鏈烯基、硝基、氨基、氰基、鹵素、異氰基、異硫氰基、硫氰基、氨磺酰、C(1-4)-烷硫基、單-或雙-C(1-4)-烷基-氨基、羥基、C(1-4)烷氧基、芳氧基、羧基、C(1-4)-烷氧基羰基、C(1-4)-烷基羰基氧、氨基羰基、單-或雙-C(1-4)-烷基-氨基羰基、單-或雙-C(1-4)-烷基-氨基、單-或雙-C(1-4)-烷基-氨基-C(1-4)-烷基，C(1-4)-烷基羰基氨基、溯砜和亞磺基。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，L來自羥基芳基-C(3-6)-烷基-羧酸，或L來自羥基C(2-6)鏈烯基-羧酸，或L來自羥基C(3-6)烷基羧酸。優(yōu)選的是R1和R2代表不同的基團(tuán)。
在環(huán)化作用是作為酯鍵形成的且氨基酸殘基的數(shù)目為5的本發(fā)明環(huán)狀化合物中，基團(tuán)A-B選自由Sar-Hyp、Hyp-Sar、Pro-Hyp、Pro-Pro、Hyp-Pro和Hyp-Hyp組成的組，其中Pro和Hyp獨(dú)立地可以是L或D構(gòu)型，且Hyp優(yōu)選代表4-羥脯氨酸。更優(yōu)選地，A-B代表未取代的L-Pro-L-4Hyp，L-4Hyp-L-Pro、D-Pro-D-4Hyp或D-4Hyp-D-Pro。
本發(fā)明的化合物的例子是當(dāng)L是羥基C(3-6)烷基碳環(huán)酸時(shí)，為環(huán)(O-(CH2)5C(O)-Tyr-Pro-4-Hyp-Gly-Ala-Gly)和環(huán)(O-(CH2)5C(O)-Tyr-4-Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly)；以及當(dāng)L是羥基芳基-C(1-4)烷基羧酸時(shí)，為環(huán)(O-(4-羥基甲基苯甲?；?C(O)-Tyr-Pro-4-Hyp-Gly-Ala-Gly)和環(huán)(O-(4-羥基甲基苯甲?；?C(O)-Tyr-4-Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly)，以及其鏡像、其反轉(zhuǎn)類似物和其衍生物，例如藥學(xué)上可接受的鹽和酰胺。
本發(fā)明的環(huán)狀化合物中環(huán)化作用是與絲氨酸形成的是
而與蘇氨酸形成的是本發(fā)明中具有二硫鍵的環(huán)狀化合物的例子是
化合物21，實(shí)施例21 化合物20，實(shí)施例20 包括具有L和D氨基酸的組合、Sar取代的氨基酸及其它N-取代的天然氨基酸的化合物，以及其各自的鏡像、其反轉(zhuǎn)類似物和衍生物，例如藥學(xué)上可接受的鹽和酰胺。
其中X和Y通過還原的酰胺鍵相連的，具有式的接頭L的化合物實(shí)例列舉如下
環(huán)(ψH2NH)-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly)環(huán)(ψCH2NH)-Tyr-4-Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly)環(huán)(ψCH2NH)-Tyr-4-Hyp-4-Hyp-Gly-Ala-Gly)環(huán)(ψCH2NH)-Tyr-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly)環(huán)(ψCH2NH)-Tyr-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly)環(huán)(ψCH2NH)-Tyr-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly)環(huán)(ψCH2NH)-Tyr-4-Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly)環(huán)(ψCH2NH)-Tyr-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly)環(huán)(ψCH2NH)-Tyr-Sar-4-Hyp-Gly-Ala-Gly)以及其鏡像、其反轉(zhuǎn)類似物及其衍生物，例如藥學(xué)上可接受的鹽和酰胺。
其中X和Y通過還原的酰胺鍵相連的，具有式的接頭L的化合物實(shí)例列舉如下環(huán)(ψCH(OH)NH)-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly)環(huán)(ψCH(OH)NH)-Tyr-4-Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly)環(huán)(ψCH(OH)NH)-Tyr-4-Hyp-4-Hyp-Gly-Ala-Gly)環(huán)(ψCH(OH)NH)-Tyr-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly)環(huán)(ψCH(OH)NH)-Tyr-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly)環(huán)(ψCH(OH)NH)-Tyr-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly)環(huán)(ψCH(OH)NH)-Tyr-4-Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly)環(huán)(ψCH(OH)NH)-Tyr-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly)環(huán)(ψCH(OH)NH)-Tyr-Sar-4-Hyp-Gly-Ala-Gly)以及其鏡像、其反轉(zhuǎn)類似物及其衍生物，例如藥學(xué)上可接受的鹽和酰胺。
更優(yōu)選地，本發(fā)明涉及具有通式I的肽和肽衍生物
其代表一個(gè)肽序列，其中的氨基酸殘基可以為D-和/或L-構(gòu)型，具有位于N*處的N-末端及C*處的C-末端，而且任選是環(huán)狀的，通過N*和C*之間虛線所示的或者Rd和C*之間虛線U所示的共價(jià)鍵連接；其中X代表N-末端部分，例如能夠結(jié)合到氨基末端N*的光探針，或者來自C(2-22)烷基羧酸的?；鶊F(tuán)，例如來自乙酸、丙酸、丁酸及其它脂肪酸，例如山萮酸，任選被選自羥基、鹵素、C(1-6)烷基、硝基和氰基的一個(gè)或多個(gè)取代基取代；或者X代表氫；當(dāng)N*和C*之間的鍵缺失時(shí)，R7代表OH、NH2、NHNH2或OR8，或者當(dāng)N*和C*之間有鍵時(shí)，R7不存在；R8代表H或直鏈或支鏈C(1-6)烷基基團(tuán)、芳基或芳烷基基團(tuán)。
Ra代表Hyp或Pro的氨基酸側(cè)鏈；Rb代表Hyp或Pro的氨基酸側(cè)鏈；Rc代表Gly、Sar的氨基酸側(cè)鏈，芳族氨基酸側(cè)鏈，任選在Rc芳環(huán)中被一個(gè)或多個(gè)羥基、鹵素或低級烷氧基基團(tuán)取代；Rd代表Ala、Gly、Glu、Asp、Dab、Dapa、Lys、Asn、Gln、Orn或Cys的氨基酸側(cè)鏈；Re代表Ala的氨基酸側(cè)鏈；Rf代表Ala、Sar或Gly的氨基酸側(cè)鏈；Rg代表除L-4Hyp的側(cè)鏈之外的任何氨基酸側(cè)鏈，或者式Z或Za的部分；Rh代表Ala的氨基酸側(cè)鏈，或者Rh代表式Z或Za的部分，優(yōu)選Pro；Ri代表Gly的氨基酸側(cè)鏈，或者Ri代表一個(gè)芳族氨基酸，任選在其芳環(huán)被一個(gè)或多個(gè)鹵素基團(tuán)取代，優(yōu)選Tyr、Phe、Trp或Nal；Rj代表Asn、Gln、Asp、Glu、Cys或Tyr；且j、k、l、m、n、p及q各自獨(dú)立為0或1；及式I肽序列的反轉(zhuǎn)構(gòu)型、全D構(gòu)型、或者反轉(zhuǎn)全-D構(gòu)型，以及其鹽和酰胺。
在式I優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，X優(yōu)選選自光探針例如ASAL，任選在5位碘化，例如2-羥基-4-疊氮基-5-碘代苯甲?；?，和AB，以及?；鶊F(tuán)，例如Ac。R7優(yōu)選是NH2。Ra優(yōu)選是Pro的氨基酸側(cè)鏈。Rb優(yōu)選是Hyp的氨基酸側(cè)鏈。Rc優(yōu)選是Gly或Tyr的氨基酸側(cè)鏈。Rd優(yōu)選是Gly、Asp、Glu、Dapa或Dab的氨基酸側(cè)鏈。Re優(yōu)選是Ala。Rf優(yōu)選是Gly或Ala的氨基酸側(cè)鏈。當(dāng)式I代表線狀肽時(shí)，Rg優(yōu)選是Asn、Gly、D-4Hyp或L-/D-Pro的氨基酸側(cè)鏈，或者當(dāng)式I代表在N*和C*之間環(huán)化的肽時(shí)，則Rg代表L-/D-4Hyp或L-/D-Pro的氨基酸側(cè)鏈。當(dāng)U不存在時(shí)，Rh優(yōu)選是Ala的氨基酸側(cè)鏈，或者當(dāng)U存在時(shí)，Rh是Pro或Hyp。Ri優(yōu)選是Tyr、Phe、Trp、Nal，任選在其芳環(huán)被一個(gè)或多個(gè)羥基或鹵素基團(tuán)優(yōu)選F或Cl取代。Rj優(yōu)選是Asp或Glu的氨基酸側(cè)鏈。R8代表H、芐基、叔丁基或CH3。
當(dāng)U存在時(shí)，j和k優(yōu)選為0，而當(dāng)U不存在且式I代表環(huán)狀肽時(shí)，j和k優(yōu)選為1，當(dāng)U不存在時(shí)，m優(yōu)選為0，當(dāng)U存在時(shí)，p優(yōu)選為1，且當(dāng)U存在時(shí)，q優(yōu)選為0。式I的非-環(huán)狀或線狀肽優(yōu)選為反轉(zhuǎn)全-D構(gòu)型。當(dāng)式I代表環(huán)狀肽時(shí)，則該肽優(yōu)選由3到9個(gè)氨基酸殘基組成，更優(yōu)選由3到7個(gè)氨基酸殘基組成。
對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，具有可與式I相比的結(jié)構(gòu)式、但是其中一個(gè)或多個(gè)肽鍵改變?yōu)樘貏e選自二硫鍵、酯鍵、還原的酰胺鍵、烷氧基鍵、氧羰基鍵和酰氧基烷氧基鍵等的共價(jià)鍵的肽-樣化合物，將會(huì)對于治療與本發(fā)明化合物所治療的相同的病癥和疾病有用。
在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有通式II的化合物
(II)X-(G′)a-A-G′-(Px)2-(Y′)b-R7其指明了一種肽序列，其中氨基酸殘基可以是L和/或D構(gòu)型，且其中X代表H或Ac；當(dāng)所有的氨基酸殘基均為L構(gòu)型時(shí)，則X代表Ac；G′代表甘氨酸殘基或甘氨酸類似物例如Sar，G′優(yōu)選為甘氨酸；A代表丙氨酸；Px代表式Z或Za的氨基酸殘基，例如Hyp或Pro，優(yōu)選脯氨酸；Y′代表酪氨酸或苯丙氨酸，任選在苯環(huán)上被鹵素或羥基取代；Y′優(yōu)選為酪氨酸；a和b獨(dú)立地為0或1，R7代表OH、NH2、NHNH2、Asn-NH2或Gln-NH2；及其具有式IIaX-(Y′)b-(Px)2-G′-A-(G′)a-R7的反轉(zhuǎn)形式，其中所有的氨基酸殘基優(yōu)選為D-構(gòu)型且其中所有的符號(hào)具有與上面式II所定義的相同含義；及其中至少一個(gè)Px殘基是D-氨基酸且其余均為L-氨基酸的式II肽化合物；及式II的環(huán)狀序列，其中X代表H，R7代表具有與Y′相連的共價(jià)鍵的Asn或Gln；b為1，且a為1；以及其鹽。
優(yōu)選的式I的環(huán)狀肽化合物特征在于具有通式III或IV之一
其中，X代表H或N-末端部分，例如能夠結(jié)合到N末端的光探針或由C(2-22)烷基羧酸的?；饔茫鲷人崂缫宜?、丙酸、丁酸和其它脂肪酸例如山萮酸，任選被選自羥基、鹵素、C(1-6)烷基、硝基和氰基的一個(gè)或多個(gè)取代基取代；R1代表H或CH3，優(yōu)選H；R2和R3是不同的或相同的，且代表任何可能的氨基酸側(cè)鏈，優(yōu)選H或CH3；代表一個(gè)選擇性的鍵；R5和R4代表任何可能的氨基酸側(cè)鏈，或者當(dāng)選擇性鍵存在時(shí)，R5和R4與所連的C和N原子一起代表脯氨酸環(huán)，其任選被OH取代，優(yōu)選在4-位，或R5和R4與所連的C和N原子一起代表上面式Z或Za的部分，優(yōu)選Pro或Hyp；R6代表一個(gè)芳族氨基酸側(cè)鏈，優(yōu)選芐基，任選在苯環(huán)上被選自鹵素、硝基和羥基的一個(gè)或多個(gè)取代基取代，優(yōu)選R6代表Tp為0或1；
n為1、2、3或4；優(yōu)選n為1；以及其鹽。
式III的例示性化合物為以及其鹽。
其中R8與前文定義的相同，優(yōu)選H；R6代表H或CH3，優(yōu)選H；R4和R5是不同的或相同的，并代表任何可能的氨基酸側(cè)鏈，優(yōu)選Gly或Ala；代表選擇性的鍵；R2和R3代表任何可能的氨基酸側(cè)鏈，或者當(dāng)選擇性鍵存在時(shí)，R2和R3與所連的C和N原子一起代表脯氨酸環(huán)，其任選被OH取代，優(yōu)選在4-位，或者R2和R3代表式Z或Za的部分；R1代表一個(gè)芳族氨基酸側(cè)鏈，優(yōu)選Tyr側(cè)鏈；p為0或1；n為1、2、3或4；優(yōu)選n為1；以及其鹽。
式IV的例示性化合物為
此外，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)用天冬酰胺或谷氨酰胺殘基替換AAP10中的Hyp-Pro序列產(chǎn)生了一種新的抗心律失常肽，即下文實(shí)施例21中的化合物21。從而，本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案涉及肽化合物，其中氨基酸殘基可以為D-和/或L-構(gòu)型，并且具有通式V 其中R1代表該肽N和C末端之間一個(gè)選擇性的酰胺鍵、H或Ac；Aa1代表一個(gè)肽序列，優(yōu)選0到4個(gè)氨基酸殘基，當(dāng)Aa1代表具有1到4個(gè)氨基酸殘基的肽序列時(shí)，Aa1優(yōu)選選自Ala、Gly-Ala、Gly-Asn-Tyr和Gly-Asn-Tyr-Ala；Al代表一個(gè)氨基酸殘基，選自Gly、β丙氨酸和Sar；Aa2代表一個(gè)氨基酸殘基，選自Asn、Gln、Gly、Tyr或一個(gè)化學(xué)單元，例如羥酸、氨基磺酸、磷酸基團(tuán)、或者通過4個(gè)共價(jià)鍵連接G和Ar的烴鏈；
Ar代表一個(gè)芳族氨基酸殘基，例如Tyr、Trp、Phe、His或Nal，任選被一個(gè)或多個(gè)鹵素例如F、Cl、Br、I，OH，NO2，NH2，COOH，CONH取代；R2代表OH、NH2或不存在；以及其反轉(zhuǎn)類似物、反轉(zhuǎn)全-D類似物(反轉(zhuǎn)-逆向類似物)和鹽。
式V的例示性化合物為化合物39 H-Gly-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH2化合物44 環(huán)(-Tyr-Ala-Ser-Ala-Gly-Asn-)化合物45 環(huán)(-Tyr-Ala-Ser-Ala-Gly-Asn-)化合物46 環(huán)(-Tyr-Gly-Asn-Tyr-Ala-Gly-Asn-)化合物47 環(huán)(-Tyr-Val-Ser-Gly-Ala-Gly-Asn-)化合物40 Ac-Gly-Asn-Tyr-NH2化合物41 H-Gly-Asn-Tyr-NH2化合物42 Ac-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH2化合物43 H-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH2以及如本文所定義的其鹽。
對光/熱不穩(wěn)定的肽衍生物親和標(biāo)記是一種頻繁用于研究生物活性分子相互作用的技術(shù)。這種研究采用化合物的對光或熱不穩(wěn)定的類似物。
待研究化合物的光不穩(wěn)定類似物，其在黑暗中是穩(wěn)定的，通過光照轉(zhuǎn)化成一種可參與插入反應(yīng)的活性中間體。這通過形成共價(jià)鍵穩(wěn)定了基于生物親和性的相互作用。由于光探針芳香疊氮化物和穩(wěn)定的重氮基化合物在光解時(shí)產(chǎn)生反應(yīng)性非?；顫姾头翘禺愋缘闹虚g體氮賓和卡賓，其分別能參與插入反應(yīng)。因而，利用芳基疊氮化物和穩(wěn)定的重氮基化合物作為光探針的光親和標(biāo)記可以在任何包含碳-氫鍵的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行，而無需在結(jié)合位點(diǎn)存在特定的活性功能基團(tuán)。因此標(biāo)記的特異性僅僅依賴于配體與受體的特異性結(jié)合，隨之是確保結(jié)合位點(diǎn)標(biāo)記的非特異性共價(jià)鍵形成反應(yīng)。光親和探針對于標(biāo)記活性功能基團(tuán)可能不存在但肯定含有碳-氫鍵的激素受體位點(diǎn)尤為有用。作為光活性官能團(tuán)，疊氮基、diazirino、α-重氮酮、硫雜-和硒基二唑、二苯甲酮、硝基苯基特別有用。利用芳基疊氮化物的標(biāo)記過程包括在λex＝300-320nm對含有光不穩(wěn)定肽類似物和受體的水溶液在室溫下光解大約0.5-2h。
熱不穩(wěn)定化合物含有可在熱控反應(yīng)中特異性與氨基或巰基基團(tuán)形成共價(jià)鍵的活性基團(tuán)。作為熱探針，可用脂族鹵化物特別是碘和溴、活性酯例如N-羥基琥珀酰亞胺、?；?、吡啶二硫化物、異氰酸酯、異硫氰酸酯、碳化二亞胺和馬來酰亞胺可用。
體外應(yīng)用的標(biāo)記大多常選擇為放射性同位素例如碘-125和131、C-14及氚，或熒光探針或生物素或半抗原。為保證受體親和性得到維持，需要研究標(biāo)記對配體結(jié)合活性的影響。作為放射性標(biāo)記，碘-125由于其60天的半衰期和低能量的光子發(fā)射而常被用于體外應(yīng)用。長的半衰期允許在使用或分析之前延長的時(shí)期內(nèi)制備和貯存標(biāo)記的光活性類似物和所得的標(biāo)記的蛋白產(chǎn)物。如果例如酪氨酸或組氨酸存在于肽序列中，則可以容易地實(shí)現(xiàn)將碘(I-125)摻入肽配體中。為保證生物活性的維持，需要研究肽標(biāo)記對配體生物活性的影響。Dhein等(WO96/21674)已表明Tyr殘基的苯環(huán)上帶有碘-125取代基的AAPl0衍生物具有生物活性。不過，由于其與潛在配體或受體的可逆性結(jié)合，所述AAP10變體是不可能用作親和探針的。利用芳基疊氮化物的光親和標(biāo)記通常導(dǎo)致50-60％的肽配體不可逆的結(jié)合于靶蛋白(受體)。從而，本發(fā)明的一個(gè)目的是進(jìn)一步提供一種抗心律失常肽，用光或熱探針及任選地用放射性標(biāo)記適當(dāng)修飾，用于鑒定該抗心律失常肽的可能配體或受體的實(shí)驗(yàn)分析。所述目的是通過本文式I、II或9的化合物用前文提及的光探針之一優(yōu)選4-疊氮水楊酰(ASAL)和AB(4-疊氮苯甲酰)進(jìn)行衍生而實(shí)現(xiàn)的。優(yōu)選地，所述衍生的化合物進(jìn)一步被放射性標(biāo)記取代，例如碘-125。
光探針修飾且放射性標(biāo)記的式I或9的例示性化合物為化合物31 ASAL-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2化合物32 ASAL(3-I)-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2
化合物32a ASAL(6-I)-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2化合物33 AB-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2化合物34 AB-Tyr(3，5-二-I)-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2及其鹽，參見下文合成實(shí)施例31-34。
此外，本發(fā)明涉及選自由下列通式構(gòu)成的組的肽化合物2H-GAG-(Pa)2-NH2其中Pa為任何氨基酸殘基或者式Z或Za的部分；至少一個(gè)Pa是D-氨基酸；優(yōu)選Pa是Hyp、P、G或A；3H-GAG-(Px)2-Y-NH2其中Px為式Z或Za的部分，其中一個(gè)Px是式II、IIa的部分而另外一個(gè)Px是P或Hyp；4Ac-Y′-(Px)2-GAG-OH其中Y′是Y或F，而Px是P或Hyp；5Cys(Acm)-AAP10*-Cys(Acm)或Cys(Acm)-反轉(zhuǎn)AAP10*-Cys(Acm)其中Acm是乙酰氨基甲基，而AAP10*是AAP10序列或其截短的形式；6X-D-Y-(D-Px)2-G-D-A-G-NH2或其反轉(zhuǎn)形式X-G-D-A-G-(D-Px)2-D-Y-NH2或X-G-D-A-G-(D-Px)2-D-Y-D-(Asn)-NH2其中X是H或Ac；Px為式Z或Za的部分，優(yōu)選Hyp或P；而(Asn)是選擇性的，其中兩個(gè)結(jié)構(gòu)式都任選地具有一個(gè)或多個(gè)C或N同位素；7H-(Px)n-Y(N/Q)G-AG-(Px)m-NH2其中Px是P或Hyp，n是1或2，而m是0或1，優(yōu)選當(dāng)n＝2時(shí)，m＝0，而當(dāng)n＝1時(shí)，m＝1；8H-G′-A-G′-(Px)2-Y-NH2其中G′是Sar或Gly且至少一個(gè)G′是Sar，而Px是P或Hyp；9X-(Y)p-(Px)2-GAG-NH2其中X是ASAL或AB，p是0或1，且Y的苯環(huán)任選具有一個(gè)或多個(gè)鹵素取代基，優(yōu)選I，而Px是P或Hyp；10環(huán)(-GAG-(Px)2-Y-N/Q-)，其中Px是P或Hyp；11環(huán)(-Y-(Px)2-GA-(G)q-N/Q-)，其中q是0或1，Y的苯環(huán)任選具有一個(gè)或多個(gè)鹵素取代基，優(yōu)選I，而Px是P或Hyp；12X-Zd-G(N/Q)Y-NH2，其中Zd是具有選自G或A的0、1或2個(gè)氨基酸殘基的序列，而X是H或Ac；及其鹽。
根據(jù)本發(fā)明的其它化合物具有如下的通式VI R1H、Ac、HAA、THAA(巰基乙酸)、Tfa、芳?；⒁阴；鵕2HR3G、A、N、K、C的側(cè)鏈，我認(rèn)為任何氨基酸都可以R4OH、NO2、鹵素(F、Cl、Br、I)、NH2或HR5(4-羥基苯基或4-硝基苯基或4-氟苯基或4-氯苯基或4-溴苯基或4-碘苯基或4-氨基苯基或4-烷氧基苯基或HR6OH、NO2、鹵素(F、CI、Br、I)、NH2或HR7OH、NO2、鹵素(F、CI、Br、I)、NH2或Hs0或1t0或1及其鹽。
可用于本發(fā)明方法的進(jìn)一步優(yōu)選的化合物表示為通式VII(VII)
其中R1代表H或乙酰基(Ac)R2代表氨基酸G、Y、D-Y、F和D-F之一的側(cè)鏈，R3代表O或HR4代表任何氨基酸側(cè)鏈R5代表O或HR6代表C(1-4)烷基基團(tuán)，例如CH2、(CH2)2、(CH2)3和(CH2)4R7代表O或HR8代表O或HR9代表氨基酸G、Y、D-Y、F和D-F之一的側(cè)鏈，R10代表OH或NH2，且S、T、U、V和Z為如下定義的整數(shù)S0、1或2T0、1或2U0或1V0或1Z0或1及其鹽。
更具體地，在本發(fā)明中有用的化合物具有如下的結(jié)構(gòu)式VIIIR1-X1-X2-X3-R2 (VIII)其中，X1為0，Ala，Gly，β-Ala，Tyr，D-Tyr，Asp，HAAX2為0；Ala-Gly-T4c-Pro；Ala-Sar-Hyp-Pro；Ala-6環(huán)-；Ala-Asn；D-Asn-D-Ala；D-Asn；γAbu；Gly，Ala；D-Ala；β-Ala；Pamh；Asn或HAA；
X3為Tyr；D-Tyr；Gly，Pamb或Phe；且R1為H或Ac，條件是X1和X2不都為0；及其鹽。
在一個(gè)特定的具體實(shí)施方案中，表1的下列具體化合物是由上面式VII或VIII表示的。
表1.式VII和VIII的化合物
Gly-Ala-6環(huán)-Tyr，Gly-Ala-Asn-Tyr，D-Tyr-D-Asn-D-Ala-Gly，D-Tyr-D-Asn-Gly，Gly-γAbu-Tyr，Gly-γAbu-D-Tyr，Gly-Gly-Tyr，Gly-Ala-Tyr，D-Tyr-D-Ala-Gly，Gly-D-Asn-Tyr，Gly-βAla-Tyr，βAla-βAla-Tyr，Gly-γAbu-Tyr，βAla-γAbu-Tyr，βAla-γAbu-D-Tyr，Gly-βAla-Phe，Gly-Pamh-Tyr，Gly-Pamh-D-Tyr，D-Tyr-Pamh-Gly，βAla-Pamh-Tyr，βAla-Pamh-D-Tyr，Gly-Asn-Phe，Gly-Ala-Gly-Pamb，Asn-Tyr，Ac-Gly-Tyr，Ac-Ala-Tyr，AC-HAA-Y，HAA-NY，HAA-GY，AC-HAA-GY，(還原的Gly)-Gly-Tyr(H2N-CH2-CH2-NH-CH2-C(O)-Tyr)，化合物Gly-Ala-6環(huán)-Tyr具有下面所示的結(jié)構(gòu)式
及其鹽。
鹽優(yōu)選本發(fā)明的化合物是以藥學(xué)上可接受的鹽、烷基酯、酰胺、烷基酰胺、二烷基酰胺、或酰肼的形式應(yīng)用，其是與線狀化合物的C-末端羧酸官能團(tuán)形成的或與環(huán)狀化合物中如果存在的游離羧酸官能團(tuán)所形成的。線狀化合物的酰胺和低級烷基酰胺在本發(fā)明優(yōu)選的化合物之中。鹽包括藥學(xué)上可接受的鹽，例如酸加成鹽和堿性鹽。酸加成鹽的例子為鹽酸鹽、鈉鹽、鈣鹽、鉀鹽等等。堿性鹽的例子為其中陽離子選自堿金屬例如鈉和鉀、堿土金屬例如鈣、以及銨離子+N(R3)3(R4)的鹽，其中R3和R4獨(dú)立代表任選取代的C1-6-烷基、任選取代的C2-6-鏈烯基、任選取代的芳基或任選取代的雜芳基。藥學(xué)上可接受的鹽的其它例子是例如″Remington′s Pharmaceutical Sciences″第17版，Alfonso R.Gennaro(編輯)，Mark Publishing Company，Easton，PA，美國，1985和更近版本中以及藥學(xué)技術(shù)百科全書中所描述的那些。
定義在整個(gè)說明書和權(quán)利要求中，使用天然氨基酸的三字母代碼以及通常接受的其它α-氨基酸的三字母代碼，例如肌氨酸(Sar)、α-氨基-異-丁酸(Aib)、萘丙氨酸(Nal)包括1-萘基丙氨酸(1Nal)和2-萘基丙氨酸(2Nal)、苯基甘氨酸Phg、2，4-二氨基丁酸(Dab)、2，3-二氨基丙酸(Dapa)和羥脯氨酸(Hyp)。未特別指明處Hyp代表4-羥脯氨酸。天然或必需氨基酸是蛋白的氨基酸組成成分。芳族氨基酸是Phe，Tyr，Trp，1Nal，2Nal和His。其中未指明L或D構(gòu)型的應(yīng)理解為所討論的氨基酸具有天然L構(gòu)型，參見Pure & Appl.Chem.Vol.56(5)pp595-624(1984)。未特別指明處應(yīng)理解為本發(fā)明化合物的C-末端氨基酸作為游離羧酸存在，這也可以被指明為″-OH″。本發(fā)明化合物的C-末端氨基酸可被顯示為具有末端官能團(tuán)″-OH/NH2″，意味著有兩種優(yōu)選的化合物形式游離羧酸及酰胺化了的衍生物。本發(fā)明包含序列Ala-Gly-Hyp且在C-末端具有-NH2基團(tuán)的六肽化合物不含有C-末端Phe或Tyr或其在苯環(huán)具有鹵素取代的衍生物。
抗心律失常肽的“功能性類似物”意指任何化學(xué)實(shí)體或化合物，其具有與內(nèi)源性AAP十分相似的結(jié)構(gòu)構(gòu)象和/或結(jié)合特性，足以提供內(nèi)源性AAP的一種或多種有益的抗心律失?；蚩寡ㄐ纬傻奶匦?。
術(shù)語“雜芳基”包括含有1-4個(gè)選自氮、氧和硫的雜原子的5-或6-元的芳族單環(huán)雜環(huán)基團(tuán)，例如吡咯基、呋喃基、吡唑基、咪唑基、_唑基、異_唑基、噻唑基、異噻唑基、_二唑基、噻二唑基、三唑基、吡啶基；以及含有1-6個(gè)選自氮、氧和硫的雜原子的芳族雙環(huán)雜環(huán)基團(tuán)，例如喹啉基。
術(shù)語反轉(zhuǎn)類似物”意指其序列與指定肽的序列顛倒相反的肽。
術(shù)語“鹵素”指F、Cl、Br和I，其中F和I是優(yōu)選的。
術(shù)語“烷基”指通過去除任何碳原子上的一個(gè)氫原子而由烷烴所衍生的單價(jià)基團(tuán)CnH2n+1-。通過去除無支鏈烷烴末端碳原子上的一個(gè)氫原子所衍生的基團(tuán)構(gòu)成了一個(gè)亞類的正烷基(n-烷基)基團(tuán)H[CH2]n-?；鶊F(tuán)RCH2-、R2CH-(R不等于H)和R3C-(R不等于H)分別為伯、仲和叔烷基。C(1-22)烷基指含有從1到22個(gè)碳原子的任何烷基基團(tuán)，并包括C(1-6)烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、戊基和己基以及其所有可能的異構(gòu)體?！暗图壨榛笔侵窩(1-6)烷基，優(yōu)選C(1-4)烷基，更優(yōu)選甲基和乙基。
術(shù)語“鏈烯基”指含有一個(gè)或多個(gè)碳-碳雙鍵的直鏈或支鏈或環(huán)狀烴基團(tuán)。C(2-22)鏈烯基指含有從1到22個(gè)碳原子的任何鏈烯基基團(tuán)，并包括C(2-6)鏈烯基，乙烯基、烯丙基、1-丁烯基等等。
術(shù)語“芳烷基”指芳基C(1-22)烷基，且術(shù)語“芳基”在說明書全文中自始至終表示苯基或萘基。
HPP指羥基苯基丙酰基4HPP指3-(4-羥基苯基)丙?；?br> 2HPP指3-(2-羥基苯基)丙?；鵋AA指羥基乙酸4HPPA指4-羥基苯氧基乙酸2HPPA指2-羥基苯氧基乙酸4HMPA指4-(羥甲基)苯氧基乙酸4HPA指4-羥基苯基乙酸3HPA指3-羥基苯基乙酸2HPA指2-羥基苯基乙酸4HBG指N-(4-羥基苯甲酰)甘氨酸3HBG指N-(3-羥基苯甲酰)甘氨酸2HBG指N-(2-羥基苯甲酰)甘氨酸4HPG指N-(4-羥基苯基)甘氨酸Ac指乙?；鵓c或PC指L-2-哌啶酸根Tfa指三氟乙?；鵗4c指L-噻唑烷-4-甲酸根ASAL指4-疊氮基水楊酰基AB指4-疊氮基苯甲?；鵋OBt指1-羥基苯并三唑HOAt指1-羥基-7-氮雜苯并三唑Acm指乙酰氨基甲基Pd(PPh3)4是四(三苯膦)鈀(0)DNP指二硝基苯基Pamh指4-氨基-6-甲基庚酸Pamb指4-氨基甲基苯甲酸DBF定義為2-氨基乙基-6-二苯并呋喃丙酸″6-環(huán)″用于3-氨基-1-羧甲基戊內(nèi)酰胺γAbu指γ氨基丁酸短語“氨基酸殘基”是指天然和非天然氨基酸單元，其在這里是以通常所接受的氨基酸三字母代碼表示的，例如肌氨酸(Sar)、α-氨基-異-丁酸(Aib)、萘丙氨酸(Nal)包括1-萘基丙氨酸(1Nal)和2-萘基丙氨酸(2Nal)、苯基甘氨酸Phg、2，4-二氨基丁酸(Dab)、2，3-二氨基丙酸(Dapa)和羥脯氨酸(Hyp)，以及β-Ala表示β-丙氨酸。其中無特別說明的Hyp或4Hyp代表4-羥脯氨酸。天然或必需氨基酸是蛋白的氨基酸組成成分，并可以用通常所接受的單字母代碼表示。芳族氨基酸是Phe，Tyr，Trp，1Nal，2Nal和His。其中未指定L或D構(gòu)型的應(yīng)理解為所討論的氨基酸具有天然L構(gòu)型，參見Pure & Appl.Chem.Vol.56(5)pp595-624(1984)。其中無特別說明的應(yīng)理解為本發(fā)明化合物的C-末端氨基酸作為游離羧酸存在，這也可以被指定為″-OH″。本發(fā)明化合物的C-末端氨基酸可被顯示為具有末端官能團(tuán)″-OH/NH2″，意味著有兩種優(yōu)選的化合物形式游離羧酸及酰胺化了的衍生物。應(yīng)理解氨基酸殘基的這一定義包括氨基酸樣的化合物，例如DBF、T4c、Pc、DNP和3-氨基-1-羧甲基戊內(nèi)酰胺。DNP作為半抗原用于抗體識(shí)別，含有DNP部分的本發(fā)明化合物可以優(yōu)選用作研究工具。
術(shù)語“模擬肽”指具有肽和非-肽兩種性質(zhì)的化合物。創(chuàng)建肽模擬的目的是建立可以替代肽骨架的支架。假定肽中的仲酰胺鍵是不穩(wěn)定性和可能較差的肽跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)性能的原因。氨基酸側(cè)鏈以適當(dāng)?shù)能壍勒_放置被視為是肽的肽模擬學(xué)中獲得生物活性的關(guān)鍵設(shè)計(jì)策略。骨架修飾包括還原的酰胺鍵和烷化的酰胺鍵，以及等排鍵例如硫代酰胺鍵、CH2-CH2、CH＝CH等的應(yīng)用。
術(shù)語“類肽”指可以用類肽與母肽結(jié)構(gòu)式之間的拓?fù)湎嗨菩詠肀碚鞯幕衔铩Ｒ蚨?，類肽可以是由在骨架氮原子上而不是如真正肽那樣在α碳原子上攜帶側(cè)鏈的氨基酸的肽-樣鏈組成的化合物。模擬肽和類肽可以包含具有修飾側(cè)鏈的氨基酸單元，例如Nal、Dab和Dapa，或者它們可以包含D-氨基酸。
El Tayar N等描述的肽和模擬肽結(jié)構(gòu)的各種修飾(Amino Acids(1995)8125-139)包括在本文的定義中。
術(shù)語“胞間通訊易化化合物”、“間隙連接易化物”、“易化間隙連接通訊的化合物”和“間隙連接開啟物”等都是指促進(jìn)或介導(dǎo)GJIC的化合物，而不考慮所產(chǎn)生的改善或正?；腉JIC背后的特定機(jī)制。更具體地，術(shù)語“間隙連接開啟物”可以指一旦刺激表達(dá)連接蛋白的細(xì)胞，就會(huì)使間隙連接通道的傳導(dǎo)增加的物質(zhì)，這進(jìn)而導(dǎo)致能通過間隙連接的分子在胞外和胞內(nèi)空間之間的交換增加和/或GJIC增加。
術(shù)語“激動(dòng)劑”指可以與受體相互作用并引發(fā)該受體所特征性的生理學(xué)或藥理學(xué)反應(yīng)(收縮、松弛、分泌、酶活化等)的內(nèi)源物質(zhì)或藥物。本文所用的“抗心律失常肽受體激動(dòng)劑”或“AAP-R激動(dòng)劑”可以或可以不等同于”間隙連接開啟物”，取決于該化合物作用背后的具體生物學(xué)機(jī)制。
間隙連接的一般背景在多細(xì)胞生物中，細(xì)胞之間的協(xié)同是至關(guān)重要的。在各種不同的細(xì)胞通訊方式中，間隙連接提供最為直接的路徑。間隙連接是在鄰近細(xì)胞之間形成的一類連接復(fù)合體，由聚集的直接連接相鄰細(xì)胞內(nèi)部(細(xì)胞質(zhì))的通道組成。在成年哺乳動(dòng)物中，在大多數(shù)細(xì)胞類型中發(fā)現(xiàn)有間隙連接，一個(gè)已知的例外是循環(huán)的血液成分。
間隙連接通道的結(jié)構(gòu)單元是連接子或半-通道。每個(gè)連接子由六個(gè)連接蛋白多肽(Cx)組成，其寡聚形成跨越單一質(zhì)膜的水性孔。為形成完整的間隙連接通道，來自毗鄰細(xì)胞的兩個(gè)連接子相互之間排列并靠攏以形成一個(gè)連續(xù)的通道，連接這兩個(gè)細(xì)胞的胞質(zhì)。
形成間隙連接通道的連接蛋白包括一個(gè)多基因家族，迄今已發(fā)現(xiàn)了至少十四種哺乳動(dòng)物連接蛋白。連接蛋白表達(dá)是組織和細(xì)胞特異性的，有些細(xì)胞表達(dá)多種連接蛋白同種型。實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明兩種不同的雜合構(gòu)型是可能的異型細(xì)胞-細(xì)胞通道，其中每個(gè)連接子或半通道由一種特定的連接蛋白同種型組成；或者異數(shù)通道，其中每個(gè)連接子是在特定細(xì)胞類型中表達(dá)的不同連接蛋白同種型的混合物。連接蛋白以細(xì)胞-、組織-和發(fā)育-特異性方式表達(dá)。
對連接蛋白的基因結(jié)構(gòu)所知相對較少。關(guān)于小鼠Cx43的報(bào)道結(jié)果顯示Cx43含有2個(gè)外顯子和1個(gè)位于5′非翻譯區(qū)的內(nèi)含子。進(jìn)一步的分析表明Cx43轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)在胚胎和成年組織中均存在。已經(jīng)在5′近側(cè)啟動(dòng)子中鑒定出若干推定的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。體外研究表明通透性通道可由不同Cx對所構(gòu)成的半通道產(chǎn)生。舉例來說，Cx43可與Cx32、Cx37以及卵母細(xì)胞內(nèi)源性Cx(Cx38)但不能與Cx26卵母細(xì)胞產(chǎn)生功能性通道。然而，關(guān)于這些雜通道的特性也和其通透性的調(diào)控一樣所知甚少。Cx在絕大多數(shù)的組織中都有表達(dá)，且單個(gè)細(xì)胞能夠表達(dá)數(shù)種不同的Cx。通透性間隙連接能夠在細(xì)胞之間形成，這些細(xì)胞表達(dá)不同類型的Cx。由此組織中的間隙連接胞間通訊(GJIC)似乎對于維持組織的完整性非常重要。似乎數(shù)個(gè)基因在制造其等效產(chǎn)物以防止由于所述基因之一發(fā)生突變而喪失GJIC。
形成的間隙連接通道的孔徑據(jù)報(bào)道是在0.8-1.4nm的范圍內(nèi)。間隙連接相對來說是非選擇性的，可允許高達(dá)約1000道爾頓的分子通過。這樣的物質(zhì)特別是離子、水、糖、核苷酸、氨基酸、脂肪酸、小肽、藥物及致癌物質(zhì)等。通過通道無需ATP，似乎是被動(dòng)擴(kuò)散的結(jié)果。細(xì)胞之間通過間隙連接通道的物流已知為間隙連接胞間通訊(GJIC)，其在細(xì)胞新陳代謝、增殖及細(xì)胞-細(xì)胞信號(hào)作用的調(diào)控方面起著重要作用。GJIC最為顯著的生理意義之一就是在一個(gè)組織內(nèi)由間隙連接偶聯(lián)的細(xì)胞不是單獨(dú)的、分離的實(shí)體，而是與其相鄰細(xì)胞高度整合在一起的。這一特性促進(jìn)了內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，而且還允許第二信使在細(xì)胞之間迅速、直接轉(zhuǎn)移，以協(xié)同該組織內(nèi)的細(xì)胞反應(yīng)。
GJIC過程是由多種機(jī)制調(diào)控的，其可以粗略分成兩大類。
第一類型調(diào)控通過影響連接蛋白的表達(dá)、降解、連接蛋白向質(zhì)膜的細(xì)胞運(yùn)輸、或者連接蛋白裝配成功能性間隙連接來控制細(xì)胞間隙連接的數(shù)量。腫瘤細(xì)胞中連接蛋白表達(dá)的減量調(diào)節(jié)所導(dǎo)致的GJIC損傷是這種調(diào)控模式的一個(gè)例子。第二類型的調(diào)控通常不包括間隙連接或連接蛋白的細(xì)胞水平的任何總量變化，而是誘導(dǎo)現(xiàn)有間隙連接的開啟或關(guān)閉或門控。胞外可溶性因子，例如促細(xì)胞分裂原(如DDT)、激素(如兒茶酚胺)、麻醉劑(如氟烷)，胞內(nèi)生物分子(如cAMP)，以及細(xì)胞應(yīng)激(如機(jī)械或代謝應(yīng)激)可導(dǎo)致這一類的調(diào)控。此外，在細(xì)胞周期及細(xì)胞遷移過程中GJIC都受到調(diào)控。
對間隙連接特別是連接蛋白43(Cx43)構(gòu)成的間隙連接的GJIC調(diào)控或連接門控作用模式已經(jīng)進(jìn)行了廣泛的研究，Cx43因而用作所有連接蛋白的代表。有些因子，舉例來說，通過改變脂質(zhì)環(huán)境和細(xì)胞膜流動(dòng)性間接地對GJIC發(fā)揮其抑制作用；而其它的GJIC抑制劑包括癌基因、生長因子和腫瘤啟動(dòng)子，則誘導(dǎo)對Cx43多種不同的修飾。對于后一組，連接通透性的破壞可能對介導(dǎo)特定的生物學(xué)功能是必需的。這些因子引發(fā)由激酶、磷酸酶及相互作用的蛋白的激活構(gòu)成的復(fù)雜信號(hào)作用途徑。對這些GJIC調(diào)節(jié)子作用機(jī)制的理解不僅將闡明其負(fù)責(zé)連接調(diào)控的各自的信號(hào)作用途徑，而且還將為表征GJIC和連接蛋白的生物學(xué)功能提供實(shí)驗(yàn)工具。
Cx43胞質(zhì)羧基末端結(jié)構(gòu)域特定位點(diǎn)磷酸化的改變似乎對間隙連接通道的開啟和關(guān)閉是關(guān)鍵的。羧基末端結(jié)構(gòu)域的磷酸化可能對將Cx43間隙連接半復(fù)合體帶到細(xì)胞膜的過程、其內(nèi)化及降解也很重要。連接蛋白的半衰期(數(shù)小時(shí))比大多數(shù)質(zhì)膜蛋白(數(shù)天)要短得多，舉例來說，Cx43在大鼠心臟中的半衰期小于1.5個(gè)小時(shí)。因而，周轉(zhuǎn)率的調(diào)控將會(huì)是調(diào)控GJIC的一個(gè)重要因素。
羧基末端結(jié)構(gòu)域含有多種蛋白激酶(PKA、PKC、PKG、MAPK、CaMkII及酪氨酸激酶)的推定的磷酸化位點(diǎn)。羧基末端結(jié)構(gòu)域這些位點(diǎn)的磷酸化導(dǎo)致間隙連接通道的關(guān)閉，而且各種不同的Cx43間隙連接通道抑制劑利用不同的信號(hào)作用途徑來誘導(dǎo)羧基末端結(jié)構(gòu)域的磷酸化。細(xì)胞類型及特定的抑制劑決定利用何種信號(hào)作用途徑，而所涉及的蛋白激酶類型則指向所采用的胞內(nèi)信使系統(tǒng)。由此，PKA的活化據(jù)報(bào)道需要cAMP第二信使系統(tǒng)的參與而PKC需要磷酸肌醇胞內(nèi)信號(hào)系統(tǒng)的參與。
其它調(diào)節(jié)通道門控作用的機(jī)制包括氫離子和鈣離子的胞內(nèi)水平、跨連接電壓、以及自由基。pH或pCa的下降誘導(dǎo)通道以細(xì)胞-和連接蛋白-特異性的方式關(guān)閉。
除了生長控制之外，還提出了GJIC的許多生理角色體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。GJIC允許養(yǎng)分、離子及液體在細(xì)胞之間迅速平衡。這也許是這些通道最為原始、廣泛和重要的功能。
電偶聯(lián)。間隙連接在可電興奮細(xì)胞例如心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及神經(jīng)元中起著電突觸的作用。在這些組織中，電偶聯(lián)較之于化學(xué)突觸能允許動(dòng)作電位更迅速地進(jìn)行細(xì)胞-細(xì)胞傳遞。在心肌細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中，這使得它們得以同步收縮。
組織對激素的反應(yīng)。GJIC可以增強(qiáng)組織對外部刺激的反應(yīng)性。第二信使例如環(huán)核苷酸、鈣及肌醇磷酸小得足以從激素激活的細(xì)胞通過連接通道進(jìn)入靜止細(xì)胞并激活后者。這樣一種效應(yīng)可以提高組織對激動(dòng)劑的反應(yīng)。
胚胎發(fā)育調(diào)控。間隙連接可以在胚胎中作為化學(xué)和/或電發(fā)育信號(hào)的胞間通路，并界定發(fā)育區(qū)室的邊界。GJIC在胚胎細(xì)胞中以特定的方式發(fā)生，且GJIC的損傷與發(fā)育異常及許多化學(xué)物質(zhì)的致畸作用有關(guān)。
胞間通訊確保單個(gè)細(xì)胞的活動(dòng)以一種協(xié)同的方式發(fā)生，并使這些活動(dòng)整合為運(yùn)轉(zhuǎn)的組織的動(dòng)態(tài)，以服務(wù)于其所在的生物體。因而種類繁多的病理狀況與GJIC的減弱相關(guān)是不足為奇的。
藥理學(xué)心臟適應(yīng)癥正如在說明書發(fā)明背景中略述的，有充足證據(jù)支持GJIC在心肌細(xì)胞中正常和病理狀況下的重要角色。下面討論與受損的GJIC相關(guān)的具體心臟適應(yīng)癥，并提供體外和體內(nèi)證據(jù)來證明增加心臟GJIC的化合物可用于預(yù)防和/或治療一系列的心臟病理狀況。
折返性心律失常心臟心律失常是由異常的沖動(dòng)起始或異常的沖動(dòng)傳導(dǎo)所致。在具有異常沖動(dòng)傳導(dǎo)的心律失常中，由折返機(jī)制導(dǎo)致的心律失常最為嚴(yán)重。
心室折返折返是持續(xù)性室顫和突發(fā)性心臟死亡的主要原因。當(dāng)傳播的沖動(dòng)完全激活心臟后不是逐漸消失，而是在不應(yīng)期結(jié)束后繼續(xù)再刺激心臟時(shí)發(fā)生折返。遲緩的傳導(dǎo)、復(fù)極化離差增加、不一致的各向異性和單向的傳導(dǎo)阻滯促進(jìn)誘發(fā)折返。引起大多數(shù)心室折返病例的潛在疾病是局部缺血性心臟病(如急性心肌梗塞、慢性心肌梗塞、穩(wěn)定性心絞痛及不穩(wěn)定心絞痛)。在急性缺血期間，間隙連接通道關(guān)閉導(dǎo)致鄰近細(xì)胞的解偶聯(lián)。離子通道和間隙連接功能的不均一變化導(dǎo)致動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間和有效不應(yīng)期的離差增加，特別是在將缺血區(qū)域與正常心肌分隔開的邊界地帶。動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間的離差增加可促進(jìn)室顫的誘發(fā)長期以來就為人所知[23]。正常情況下，在偶聯(lián)良好的細(xì)胞中，動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間的差別由于電偶聯(lián)而被消除?？墒牵馀悸?lián)會(huì)阻止這種消除從而造成動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間和不應(yīng)期的離差的暴露[24]。如果局部缺血延長，可以觀察到Cx43表達(dá)程度降低和分布模式改變。急性缺血期間間隙連接通道的關(guān)閉以及慢性缺血中表達(dá)和分布模式的改變可以導(dǎo)致遲緩的傳導(dǎo)、增加的離差、不一致的各向異性以及單向的傳導(dǎo)阻滯，并因此促進(jìn)誘發(fā)折返性心律失常。因此，實(shí)驗(yàn)研究表明異常連接蛋白表達(dá)和分布的部位與折返性室性心動(dòng)過速環(huán)路的位置之間的相關(guān)性[25]。
利于發(fā)生折返的條件，也就是傳導(dǎo)遲緩、復(fù)極化離差增加、不一致的各向異性和單向的傳導(dǎo)阻滯，在許多其它心臟病中以多種不同的程度存在。因此，在感染性或自主性心肌病中所發(fā)生的炎癥可能導(dǎo)致心肌中纖維組織的沉積，從而產(chǎn)生傳導(dǎo)遲緩、離差增加以及可能的單向傳導(dǎo)阻滯的病灶。肥大性心肌病(如由于高血壓、主動(dòng)脈縮窄或先天原因)可能會(huì)導(dǎo)致折返性心律失常，歸因于大量心肌組織與相對少量的傳導(dǎo)組織之間的失配，其可能會(huì)導(dǎo)致傳導(dǎo)遲緩、離差增加和單向傳導(dǎo)阻滯。先天疾病(如長-QT綜合征)和延長QT間期的藥物(如抗心律失常藥物、精神抑制藥、抗組胺藥、抗菌藥等)也增加動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間的離差，可能歸因于離子通道在心肌不同層中分布的不均勻性，并且其是較年輕患者中折返誘導(dǎo)的突然死亡的主要原因。
心房折返房顫-最常見的心律失常-也是由折返機(jī)制引起的。在這種病例中，多個(gè)小波傳播通過心房并再次興奮不再不應(yīng)的組織。房顫可以持續(xù)數(shù)年并最終導(dǎo)致心房的重塑。重塑過程中一個(gè)重要的部分是間隙連接分布的變化。這樣，Cx40分布模式變得愈加不均勻。Cx40間隙連接分布變化的時(shí)間進(jìn)程和含量與AF穩(wěn)定性和復(fù)雜性的增加相關(guān)，提示Cx40間隙連接重塑可能與持續(xù)性房顫的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[27]。此外，多方面的證據(jù)支持在心房傳導(dǎo)遲緩的條件下房顫的易感性提高的觀點(diǎn)。
復(fù)極化交替觀察到心電圖上T-波交替伴有心率增加或代謝損害已將近一個(gè)世紀(jì)。宏觀T-波交替常被詮釋為突發(fā)性心律失常死亡的先兆。近來的工作提示一種普遍機(jī)制可將失諧的復(fù)極化交替的存在與多種折返性心律失常的引發(fā)聯(lián)系起來，取決于底物的解剖學(xué)性質(zhì)[28]。在變時(shí)或代謝應(yīng)激下，心肌動(dòng)作電位的復(fù)極相在形態(tài)和持續(xù)時(shí)間上發(fā)生交替。在額外應(yīng)激或存在結(jié)構(gòu)屏障情況下，復(fù)極化交替變得在空間上失諧。失諧的交替導(dǎo)致足夠大的復(fù)極化梯度，從而產(chǎn)生單向阻滯和折返。沒有結(jié)構(gòu)屏障時(shí)，折返是功能性的并表現(xiàn)為室顫或多形性室性心動(dòng)過速。在有結(jié)構(gòu)屏障礙情況下，折返會(huì)成為解剖學(xué)固定的，導(dǎo)致單形性室性心動(dòng)過速[29]。
總之，似乎增加間隙連接傳導(dǎo)并使得各向異性更為一致的物質(zhì)如本發(fā)明的化合物可以阻止單向阻滯和折返性心律失常。這樣的一種物質(zhì)將可用于具有心房和心室這兩種起源的折返環(huán)路的患者。具有T-波交替的患者傾向于患折返性心律失常，增加間隙連接偶聯(lián)并降低各向異性的物質(zhì)可用于預(yù)防這些患者的致死性室性心律失常。
緩慢心律失常緩慢心律失?？捎蛇t緩傳導(dǎo)或者竇房結(jié)、房室結(jié)、希斯氏束或者右或左束支的傳導(dǎo)阻滯所致。負(fù)責(zé)整個(gè)傳導(dǎo)系統(tǒng)的傳導(dǎo)的主要連接蛋白是Cx40。Cx40基因敲除的小鼠純合子具有顯著減慢的心房、房室及希斯氏浦肯野傳導(dǎo)，并且發(fā)生心律失常和束支傳導(dǎo)阻滯的危險(xiǎn)增加[4-6]。因而Cx40間隙連接的正常功能是維持正常節(jié)律所必要的。
增加間隙連接傳導(dǎo)的物質(zhì)如本發(fā)明的化合物可用于預(yù)防和/或治療心臟傳導(dǎo)減緩。
收縮性降低收縮性降低是很多慢性心臟病的一個(gè)共有特征。在最壞的情況下(也就是末期心力衰竭)，收縮性減少到射血分?jǐn)?shù)低至不能再維持器官灌注的基本需求。實(shí)驗(yàn)及臨床證據(jù)已表明晚期心力衰竭患者心臟中連接蛋白的表達(dá)和分布發(fā)生了改變。因而Cx43被顯著地減量調(diào)節(jié)，并在異常組織中呈高度不規(guī)則的分布。Cx45的表達(dá)在正常條件下非常有限，在衰竭心臟中顯著增加；可是，Cx45的傳導(dǎo)性能不如Cx43的性能，因此不能補(bǔ)償Cx43的減少。近來的證據(jù)顯示一些調(diào)控型離子通道和受體在胞間連接部位聚集，所以很可能Cx43表達(dá)和分布的改變可以影響興奮-收縮偶聯(lián)并因此影響收縮性[30]。支持間隙連接功能和收縮性之間聯(lián)系的一個(gè)有力證據(jù)是由無Cx43的胚胎干細(xì)胞與野生型胚細(xì)胞形成的嵌合小鼠(從而不均一喪失Cx43)發(fā)生嚴(yán)重的收縮缺陷的事實(shí)[31]。
我們提出提高間隙連接傳導(dǎo)的物質(zhì)可改善參與興奮-收縮偶聯(lián)的介質(zhì)的胞間通訊，從而改善收縮性。
實(shí)驗(yàn)例1化合物2對心肌細(xì)胞中GJIC的影響細(xì)胞制備根據(jù)Langendorf方法通過膠原酶灌注從豚鼠心臟中分離細(xì)胞。簡而言之，經(jīng)腹膜內(nèi)注射肝素(1000IU/kg)將豚鼠肝素化。30分鐘后敲擊頸部隨之切斷頸部脊柱將動(dòng)物處死，打開胸腔，主動(dòng)脈插管。然后用縫線結(jié)扎將插管固定至主動(dòng)脈，切斷并用蒂羅德溶液灌注幾分鐘。蒂羅德溶液具有如下組成以mM表示，Na+135.33，K+4，Cl-145，PO4-0.33，Mg2+1，Ca2+2，Hepes 10，葡萄糖10，pH 7.4。所有灌注基質(zhì)都用100％氧起泡吹過。
之后心臟用不含Ca2+的蒂羅德溶液灌注兩分鐘，隨之用高K+溶液灌注兩分鐘，其含有以mM表示的Na+20，K+120，Cl-22，谷氨酸120，Mg2+1，Ca2+25μM，Hepes 10，葡萄糖10，pH 7.4。
然后心臟用含0.6mg/ml膠原酶的高K+溶液灌注，這步需要進(jìn)行10-15分鐘，根據(jù)心臟的外觀判斷。切掉心房，切碎心室，隨后將碎塊在膠原酶溶液中攪拌，用100％氧輕輕起泡。細(xì)胞隨之過篩以分離釋放的細(xì)胞，并通過離心除去膠原酶。將細(xì)胞重懸于無Ca2+的蒂羅德溶液，將Ca2+慢慢增至0.65mM。室溫下將細(xì)胞保存于這種溶液中，直到轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)容器中。
電生理學(xué)蓋片安放在倒置顯微鏡的載物臺(tái)上一個(gè)敞開的容器中，其中的細(xì)胞用Dulbecco氏磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)在37℃以1ml/min澆注。該溶液含有(以mM表示)Na+152，K+4.2，Cl-141.5，PO43-9.5，Ca2+0.9，Mg2+0.5，pH 7.2。膜片鉗吸管在Sutter Flaming-Brown P-87微電極拉制器上從1.5mm的玻璃毛細(xì)管(GC150F-15，HarvardApparatus)拉制并火琢至電阻為4-6MΩ。吸管中充滿胞內(nèi)樣溶液，含有以mM表示的K+145，Na+15，Cl-5，葡糖酸-153，丙酮酸5，EGTA 1，HEPES 5，Ca2+0.42mM，Mg2+1.6，pH7.2。向該溶液中加入取自60mg/ml貯液(溶劑DMSO)的兩性霉素B(240μg/ml)。
膜片鉗設(shè)置由兩個(gè)同步不連續(xù)的放大器組成(SEC-05LX，NPIelectronics)，且數(shù)據(jù)用INT-10界面(NPI electronics)和PC1200數(shù)據(jù)獲取板(National Instruments)數(shù)字化。電流和電壓信號(hào)都是低通的，由放大器的內(nèi)置過濾器在1kHz過濾，并在10kHz數(shù)字化。
利用PatchMan 5173顯微操作器(Eppendorf)使電極靠近每對中的一個(gè)細(xì)胞。當(dāng)實(shí)現(xiàn)與細(xì)胞接觸時(shí)(看到輸入電阻突然增大)，施加抽吸直到建立吉咖封口構(gòu)型。然后對另一個(gè)細(xì)胞重復(fù)這一過程。接著通過短暫應(yīng)用抽吸而破壞吸管下面的膜且將細(xì)胞內(nèi)部的電位鉗至-70mV，這與細(xì)胞的自發(fā)膜電位接近。每10秒鐘對每個(gè)細(xì)胞用10mV連續(xù)超極化1秒鐘，而在另一個(gè)細(xì)胞中所產(chǎn)生的電流變化可用來計(jì)算胞間電導(dǎo)，利用公式Gj=ΔIpΔUj=Ip,pulse-Ip,restUp-Ua]]>(方程式1)其中Ip，pulse和Ip，rest分別代表脈沖過程中和脈沖之前被動(dòng)細(xì)胞中的電流，而Up和Ua代表被動(dòng)和主動(dòng)細(xì)胞的電壓。由于細(xì)胞-細(xì)胞接觸的差異以及由此所致的功能性間隙連接通道數(shù)量的差別，這類實(shí)驗(yàn)不能比較絕對Gj值?？墒牵瑯?biāo)準(zhǔn)化干預(yù)例如藥物而致的Gj值改變可以通過比較Gj的相對變化加以分析。
結(jié)果九次成功實(shí)驗(yàn)的結(jié)果總結(jié)于圖2。該圖顯示了用化合物2(10-8M)刺激之前和刺激過程中相對Gj對時(shí)間的函數(shù)。在細(xì)胞用化合物2處理的所有5次實(shí)驗(yàn)中，化合物引起Gj的顯著增加，在刺激大約400秒后達(dá)到一個(gè)穩(wěn)態(tài)水平(ΔGj＝+120±46％)。在所有四份用載體處理的制備物中，電導(dǎo)始終未變(ΔGj＝-3±5％)。
這些發(fā)現(xiàn)與文獻(xiàn)中報(bào)道的利用合成的AAP類似物AAP10的實(shí)驗(yàn)很相符，表明刺激后心肌細(xì)胞之間電偶聯(lián)增加[32]。不過，在M_ller等的研究中[32]，在對照條件下間隙連接傳導(dǎo)是不穩(wěn)定的。因而，在應(yīng)用AAP10的六次實(shí)驗(yàn)中有三次未增加傳導(dǎo)性，但阻止了間隙連接傳導(dǎo)的耗盡；而在六次實(shí)驗(yàn)中的兩次，間隙連接傳導(dǎo)性實(shí)際上在對照期間增加。在本文提供的實(shí)驗(yàn)中，化合物2增加了穩(wěn)定對照條件下制備物中的間隙連接傳導(dǎo)。
實(shí)驗(yàn)例2化合物2與小鼠心臟組織制備物的結(jié)合制備從小鼠(Balb/c，20g)切除心臟，在冰冷的(0℃)0.32 M蔗糖中漂洗兩次，并在冰上于10倍體積的蔗糖中用Ultra Turrax勻漿器(1000rpm)勻漿2分鐘。勻漿物以1000g均值于4℃離心10分鐘，收集上清通過4層紗布過濾。濾液隨之以50,000g均值于4℃離心45分鐘，沉淀重懸于10倍體積器官濕重冰冷的蒸餾水中，并于0℃溫育60分鐘，以50,000g均值于4℃再離心45分鐘。將所得到的沉淀重懸于2倍體積器官濕重的PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)并貯存于-80℃?zhèn)溆谩?br> 化合物2的置換實(shí)驗(yàn)將40-250μg濾液或膜物質(zhì)溫育于總體積為100μl的D-PBS(含有1g/lMgCl26H2O & CaCl2的Dulbecco氏磷酸鹽緩沖鹽水)中，其含有0.8nM[125I]AAP10和遞增濃度的測試化合物AAP和化合物2。在10μM AAP10(CE2)測定非特異性結(jié)合。
計(jì)算置換實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)擬合以下等式f＝(Total-ns)/(1+s/IC50)+ns其中Total是標(biāo)記配體濃度為s時(shí)的總結(jié)合放射性，ns是非特異性結(jié)合，而IC50是將特異性結(jié)合(Total-ns)減少至50％最大特異性結(jié)合的測試化合物的濃度。
結(jié)果表2.小鼠心臟組織制備物中0.8nM[125I]AAP10的置換(n.t.未測試)。
上面表2中所給出的數(shù)值與Dhein[33]等用來自兔心臟的膜所給出的關(guān)于AAP10的值在同一個(gè)數(shù)量級(0.2nM)。
完整細(xì)胞原位結(jié)合的方法CHO細(xì)胞培養(yǎng)將CHO細(xì)胞以7,900細(xì)胞/cm2的密度(～15,000細(xì)胞/孔)接種于24多孔板中并在體外(DIV)在1ml/孔的補(bǔ)充有10％胎牛血清(FCS)和1000單位青霉素/1000μg鏈霉素(pen/strep)的F-12K營養(yǎng)混合物中、在5％CO2和100％濕度的空氣中、于37℃生長3天。細(xì)胞密度到那時(shí)已經(jīng)增至295,000細(xì)胞/cm2(152pgprot/細(xì)胞～85μgprot/孔)。
預(yù)處理在分析當(dāng)天從溫箱中取出細(xì)胞，取決于實(shí)驗(yàn)，每個(gè)孔用2ml預(yù)溫的(37℃)或者冰冷的(0℃)D-PBS沖洗兩次以除去血清。重要的是將細(xì)胞脫離生理溶液的時(shí)間保持到最低限度，以避免其在沖洗過程中變干。冷洗的細(xì)胞直接用于結(jié)合測定，而溫洗的細(xì)胞用于剝奪葡萄糖和氧的實(shí)驗(yàn)。
葡萄糖和氧氣剝奪將細(xì)胞在N2環(huán)境中、由N2預(yù)平衡至少10分鐘的不含葡萄糖的D-PBS(pH 7.2)中37℃下溫育10分鐘。對照細(xì)胞同樣在37℃下溫育10分鐘，只是，在正常大氣條件下并在含有葡萄糖(6mM)的D-PBS中溫育。
結(jié)合測定原位結(jié)合是通過一個(gè)基于Koenig[34]的描述的改進(jìn)方案進(jìn)行的。從細(xì)胞培養(yǎng)物中除去D-PBS，加入有或無未標(biāo)記配體或者測試化合物的0.50ml[125I]AAP10溶液。細(xì)胞4℃過夜溫育以達(dá)到平衡。每孔，每次一個(gè)，隨之用2×1ml D-PBS迅速漂洗，放置至干。
向每孔中加入0.25ml 0.5％Triton-X-100(v/v)，細(xì)胞放置至少1h以溶解。將提取物轉(zhuǎn)移到計(jì)數(shù)瓶中，孔用0.25ml水漂洗，將漂洗提取物也加到相應(yīng)的瓶中。該瓶在γ-計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)。
表3.原位結(jié)合，IC50(nM)
這些結(jié)果證明本發(fā)明的幾種不同物質(zhì)對CHO細(xì)胞的高親和性結(jié)合與現(xiàn)有技術(shù)的肽相當(dāng)。
實(shí)驗(yàn)例3化合物2對CHO細(xì)胞中cAMP形成的影響CHO細(xì)胞培養(yǎng)CHO細(xì)胞以6,000細(xì)胞/cm2的密度(～2,000細(xì)胞/孔)接種于96孔微滴板中并于體外在200μl/孔如前面部分所述的生長培養(yǎng)基中生長4天。
預(yù)處理在分析當(dāng)天從溫箱中取出細(xì)胞，用200μl預(yù)溫的(37℃)D-PBS(pH7.2)沖洗兩次以去除血清。將細(xì)胞如前面部分所描述在不含葡萄糖的D-PBS和N2環(huán)境中溫育10分鐘。
cAMP效力測定將CHO細(xì)胞于37℃在含有6mM 葡萄糖，2.0mM IBMX(磷酸二酯酶封阻劑)，10μM毛喉素(刺激cAMP形成)和遞增濃度的測試肽的D-PBS(pH7.2)中溫育。20分鐘后加入20μl 0.5M HCl終止反應(yīng)，并在室溫下放置至少20分鐘。
cAMP含量通過向含有180μl[125I]cAMP示蹤溶液的FlashPlateTM孔(NEN assay kit SMP001)中混入20μl酸細(xì)胞提取物進(jìn)行分析。FlashPlatesTM于4℃過夜溫育，在TopCount(PackardInstrument)中計(jì)數(shù)板結(jié)合的放射性。如前面部分所述計(jì)算數(shù)據(jù)。
結(jié)果APP-樣化合物在CHO細(xì)胞中對毛喉素刺激的cAMP形成的抑制作用表明AAP受體與cAMP第二信使系統(tǒng)負(fù)偶聯(lián)。此外，它還證實(shí)CHO細(xì)胞中存在功能性AAP受體。
表4.對CHO細(xì)胞中毛喉素刺激的cAMP形成的抑制作用
實(shí)驗(yàn)例4大鼠原代心肌細(xì)胞中的磷酸肌醇分析原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)用的是新生的Wistar大鼠(1-2天齡)。在細(xì)胞分離過程中用由10mM HEPES緩沖的不含鈣和鎂的Hank′s平衡鹽溶液洗滌。切除心臟、分離心室并將組織切成小塊。用0.05％的膠原酶通過分步酶促降解分離心肌細(xì)胞，如文獻(xiàn)[35]所述。重復(fù)循環(huán)的離心和洗滌之后，沉淀細(xì)胞重懸于含有Earle′s鹽、10％NCS、青霉素(75U/mL)和鏈霉素(75U/mL)的培養(yǎng)基M199中，并預(yù)鋪板于培養(yǎng)皿中90分鐘。從培養(yǎng)基中收集非貼壁細(xì)胞，并以2.5*105細(xì)胞/孔平板接種于多孔培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)物于37℃保存在水飽和的CO2溫箱中。該心肌細(xì)胞培養(yǎng)物6-7天之后用于分析。
磷酸肌醇周轉(zhuǎn)的分析心肌細(xì)胞培養(yǎng)物在含有4μCi/mL肌-[2-3H]肌醇的培養(yǎng)基中溫育48小時(shí)以標(biāo)記肌醇磷脂。在分析當(dāng)天，將培養(yǎng)基用含有鋰的緩沖溶液替換，并于37℃溫育，如Meier等所述[36]。至少5分鐘之后，該緩沖液由相同體積的含有測試化合物的緩沖液替換，并準(zhǔn)確溫育20分鐘。用冰冷的4％v/v高氯酸(PCA)迅速置換所述緩沖液以終止反應(yīng)，并在0℃溫育至少20分鐘。中和該P(yáng)CA提取物，利用含有100mgSAX季胺的AmprepTM柱通過陰離子交換層析分離[3H]肌醇磷酸。洗脫[3H]肌醇單磷酸，并通過液體閃爍計(jì)數(shù)測量該級分中的放射性。
葡萄糖和氧剝奪向培養(yǎng)物中加入測試物質(zhì)之前，通過將細(xì)胞置于不含葡萄糖的鋰緩沖液中、在N2環(huán)境中37℃下溫育10分鐘而剝奪葡萄糖和氧。對照細(xì)胞同樣溫育，只是在正常大氣條件下并在含有葡萄糖的緩沖液中。
去甲腎上腺素(NA)在心肌細(xì)胞培養(yǎng)物中以一種濃度依賴性的方式刺激磷酸肌醇周轉(zhuǎn)。然而，如圖3所示，在剝奪葡萄糖和氧10分鐘之后培養(yǎng)物中去甲腎上腺素(300nM NA)刺激磷酸肌醇周轉(zhuǎn)的能力大大下降。
在正常大氣和營養(yǎng)條件下，我們獲得的Emax值為3852±266cpm，EC50值為203nM(SDR＝1.2)，而在經(jīng)受N2環(huán)境和剝奪葡萄糖的細(xì)胞中，顯示Emax值為2248±702cpm，EC50值為303nM(SDR＝1.7)。
為研究本發(fā)明的物質(zhì)在局部缺血和葡萄糖饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)激期間對減弱了的去甲腎上腺素所誘導(dǎo)的磷酸肌醇周轉(zhuǎn)增加的影響，向心肌細(xì)胞培養(yǎng)物中加入化合物2或AAP10(CE2)。兩種物質(zhì)都非常有效地增加磷酸肌醇周轉(zhuǎn)，化合物2最為有效。如下文表5所示，在含氧量正常時(shí)，AAP10(CE2)的EC50值比化合物2的EC50值高200倍，而在缺氧和葡萄糖剝奪所誘導(dǎo)的代謝應(yīng)激期間高10倍。
表5.在缺氧和葡萄糖饑餓所誘導(dǎo)的代謝應(yīng)激期間化合物2和AAP10對磷酸肌醇周轉(zhuǎn)的增加
對照條件下，化合物2(100nM)的加入對于去甲腎上腺素(300nM)所誘導(dǎo)的新生大鼠心肌細(xì)胞中磷酸肌醇周轉(zhuǎn)的增加沒有進(jìn)一步的影響，但是在經(jīng)受缺氧和葡萄糖剝奪(代謝應(yīng)激)的細(xì)胞中，化合物2(100nM)+去甲腎上腺素(300nM)的加入使受損的磷酸肌醇周轉(zhuǎn)正常化，如圖4所示，比單獨(dú)去甲腎上腺素引起的增加高大約70％的增加。
實(shí)驗(yàn)例5鈣誘導(dǎo)的小鼠心律失常模型在根據(jù)Lynch等[37]的模型的鈣誘導(dǎo)心律失常體內(nèi)模型中測試本發(fā)明化合物的抗心律失常作用。將小鼠(25-30g)用一種安定藥麻醉劑組合(Hypnorm_(檸檬酸芬太尼0.315mg/ml和氟丁酰酮10mg/ml)+咪達(dá)唑侖(5mg/ml))麻醉。將hypnorm和咪達(dá)唑侖的市售溶液用蒸餾水1∶1稀釋，一份稀釋的Hypnorm_與一份稀釋的咪達(dá)唑侖混合。
麻醉是以0.05-0.075μl/10克小鼠的劑量通過皮下給藥誘導(dǎo)的。靜脈內(nèi)插管插入尾靜脈。通過將不銹鋼心電圖電極置于右前肢和左后肢而連續(xù)記錄II導(dǎo)聯(lián)心電圖信號(hào)。接地電極置于右后肢。信號(hào)經(jīng)由HugoSachs Electronic 689型ECG module放大(×5.000-10.000)和過濾(0.1-150Hz)。模擬信號(hào)經(jīng)由12比特的數(shù)據(jù)獲取板(數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換模型DT321)數(shù)字化，并用支持Windows NT的Notocord HEM 3.1軟件在1000Hz取樣。在10分鐘的平衡期之后，將藥物的測試樣品注射入尾靜脈。對用載體預(yù)處理的小鼠進(jìn)行測試，作為未處理動(dòng)物的對照水平的度量標(biāo)準(zhǔn)。所有實(shí)驗(yàn)中注射體積為100μl。CaCl2輸注(30mg/ml，0.1ml/min≈100mg/kg/min(二水氯化鈣，Riedel-de Haёn，Germany))灌注開始于靜脈注射施用藥物或載體之后3分鐘。
到二度房室傳導(dǎo)阻滯發(fā)作的時(shí)間間隔測定為從CaCl2輸注開始到第一個(gè)心律失常事件發(fā)生的時(shí)間。二度房室傳導(dǎo)阻滯事件定義為房室傳導(dǎo)的間歇失效，以不伴隨QRS復(fù)合體的P-波為特征。
相對于在用載體處理的小鼠中直到發(fā)生二度房室傳導(dǎo)阻滯的時(shí)間來表示反應(yīng)。每種測試物質(zhì)的最大效應(yīng)總結(jié)于下面的表6。
表6.本發(fā)明化合物的體內(nèi)抗心律失常活性。+++指至心律失常發(fā)生的時(shí)間增加＞60％；++指至心律失常發(fā)生的時(shí)間增加30-50％；+指至心律失常發(fā)生的時(shí)間增加15-29％；(+)指至心律失常發(fā)生的時(shí)間增加≤15％，而nd指“未測”。
Cpd號(hào) 化合物名稱體內(nèi)活性組1比較例CE-1 H-Gly-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-OH(AAP) ++CE-2 H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-NH2(AAP10)+++CE-3 3-(4-羥基苯基)丙?；?Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-OH(HP5) ++組2H-GAG-(Pa)2-NH2Pa是任何氨基酸殘基或者式Z或Za式2的部分；至少一個(gè)Pa為D氨基酸；優(yōu)選Pa是Hyp，P，G或A；
5H-Gly-Ala-Gly-D-Hyp-Pro-Tyr-NH2++6H-Gly-Ala-Gly-D-Pro-Pro-Tyr-NH2Nd7H-Gly-Ala-Gly-D-Pro-Ala-Tyr-NH2Nd8H-Gly-Ala-Gly-Gly-D-Pro-Tyr-NH2Nd9H-Gly-Ala-Gly-D-Hyp-Ala-Tyr-NH2+10 H-Gly-Ala-Gly-D-Hyp-D-Pro-Tyr-NH2+++組3H-GAG-(Px)2-Y-NH2Px是式Z或Za的部分，其中一個(gè)式3Px是式II、IIa的部分，而另一個(gè)Px是P或Hyp11 H-Gly-Ala-Gly-NCG-Pro-Tyr-NH2Nd12 H-Gly-Ala-Gly-T4C-Pro-Tyr-NH2++13 H-Gly-Ala-Gly-A2C-Pro-Tyr-NH2Nd14 H-Gly-Ala-Gly-Pc-Pro-Tyr-NH2+組4式4Ac-Y′-(Px)2-GAG-oHY′是Y或F；Px是P或Hyp1 Ac-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-OH +15 Ac-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2Nd組5式5Cys(Acm)-AAP10*/反轉(zhuǎn)AAP10*-Cys (Acm)16H-Cys(Acm)-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Cys(Acm)-NH2+17H-Cys(Acm)-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Cys(Acm)-NH2Nd18H-Cys(Acrn)-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-Cys(Acm)-NH2Nd19H-Cys(Acm)-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Cys(Acm)-NH2Nd組6X-D-Y-(D-Px)2-G-D-A-G-NH2或其反轉(zhuǎn)形式式6X-G-D-A-G-(D-Px)2-D-Y-NH2或X-G-D-A-G-(D-Px)2-D-Y-D-(Asn)-NH2其-中X是H或Ac；Px是式Z
或Za的部分，優(yōu)選Hyp或P；而(Asn)是選擇性的，其中兩個(gè)結(jié)構(gòu)式都任選具有一個(gè)或多個(gè)C或N同位素22H-Gly-D-Ala-Gly-D-Hyp-D-Pro-D-Tyr-NH2Nd23H-Gly-D-Ala-Gly-D-Hyp-D-Pro-D-Tyr-D-Asp-OH Nd2 Ac-D-Tyr-D-Pro-D-Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2+++24Ac-D-Tyr(3，5-di-1)-D-Pro-D-Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2NdAc-D-Tyr(苯環(huán)單-碘取代的)-D-Pro-D-25Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2NdAc-D-Tyr-D-Pro-D-Hyp-(1，213C，15N-Gly)-D-Ala-26(1，2l3C，15N-Gly)-NH2nd組7H-(Px)n-Y(N/Q)G-AG-(Px)m-NH2Px是P或Hyp，n是1式7或2；m是0或1；優(yōu)選n＝2時(shí)m＝0，而n＝1時(shí)m＝127 H-Pro-Tyr-Asn-Gly-Ala-Gly-Hyp-NH2nd28 H-Hyp-Pro-Tyr-Asn-Gly-Ala-Gly-NH2(+)組8H-G′-A-G′-(Px)2-Y-NH2式8G′是Sar或Gly且至少一個(gè)G′是Sar；Px是P或Hyp29 H-Sar-Ala-Sar-Hyp-Pro-Tyr-NH2+30 H-Gly-Ala-Sar-Hyp-Pro-Tyr-NH2++組9X-(Y)p-(Px)2-GAG-NH2X是ASAL或AB；p是0或1；Y的式9苯環(huán)任選具有一個(gè)或多個(gè)鹵素取代基，優(yōu)選I；Px是P或Hyp31ASAL-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2nd32ASAL(單-碘取代的)-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2+++33AB-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2nd34AB-Tyr(3，5-dl-I)-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2nd組10
式10 (-GAG-(Px)2-Y-N/Q-)Px是P或HyP35環(huán)(-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Gln-)++36環(huán)(-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Asn-)+++37(-Gly-Ala-Gly-Pro-Pro-Tyr-Asn-) nd組11環(huán)(-Y-(Px)2-GA-(G)q-N/Q-)q是0或1，Y的苯環(huán)任選具有式11一個(gè)或多個(gè)鹵素取代基，優(yōu)選I；Px是P或Hyp3(-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-Asn-) +++4環(huán)(-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Asn-) nd38 環(huán)(-Tyr(3-I，5-I)-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-Asn) nd組12X-Zd-G(N/Q)Y-NH2Zd為具有選自G或A的0、1或2個(gè)式12氨基酸殘基的序列；X是H，Ac39H-Gly-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH2+++40Ac-Gly-Asn-Tyr-NH2++41H-Gly-Asn-Tyr-NH2++42Ac-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH2nd43H-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH2nd正如可從表6所示結(jié)果看出的，很多本發(fā)明的新化合物表現(xiàn)出可與現(xiàn)有技術(shù)中化合物AAP、AAP10和HP5相比的抗心律失常活性。
實(shí)驗(yàn)例6化合物2對分離的灌注的心臟的影響Langendorff技術(shù)的原理Langendorff技術(shù)提供了一種方法，維持離體心臟的充足代謝需求，從而可對整個(gè)心臟進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)達(dá)數(shù)小時(shí)。在Langendorff方法中，心臟通過插入主動(dòng)脈的插管得到逆向灌注。當(dāng)灌注溶液進(jìn)入主動(dòng)脈時(shí)，在主動(dòng)脈中所產(chǎn)生的壓力關(guān)閉主動(dòng)脈瓣，從而阻止液體進(jìn)入心腔。取而代之的是，灌注溶液進(jìn)入供應(yīng)心臟的冠狀動(dòng)脈循環(huán)。因而在Langendorff技術(shù)中主動(dòng)脈的總流量等于冠狀動(dòng)脈流量。Langendorff實(shí)驗(yàn)利用GermanyHugo Sachs Elektronik公司生產(chǎn)的ISOLATEDHEART SIZE 5 Type 833儀器進(jìn)行。該設(shè)備的主要組件是主動(dòng)脈塞(block)，心臟通過插管附在其上。該主動(dòng)脈塞直接與一個(gè)旋鈕操作的人工流量調(diào)節(jié)器相連，從而可以調(diào)節(jié)后負(fù)荷并因而調(diào)節(jié)灌注壓力。灌注液從一個(gè)恒溫的貯器通過連接到滾子泵的管道輸送到主動(dòng)脈塞。泵送體積可以調(diào)整以適應(yīng)不同的需要。過量的液體從主動(dòng)脈塞流回到貯器中。主動(dòng)脈塞下面是可以升高覆蓋心臟的恒溫心腔(heart chamber)。這種結(jié)構(gòu)允許連續(xù)記錄冠狀動(dòng)脈流量、左心室壓力(LVP)、灌注壓力、12-導(dǎo)聯(lián)心電圖及8個(gè)單相動(dòng)作電位(MAP′s)。這些多種記錄的輸出利用NOTOCORD HEM 3.3軟件分析。該軟件可以計(jì)算多種的心電生理學(xué)和血液動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
灌注技術(shù)和灌注介質(zhì)實(shí)驗(yàn)在恒壓灌注模式下進(jìn)行。流量泵設(shè)置在70ml/min且后負(fù)荷設(shè)置在50mmHg，確保灌注壓大約為60mmHg。除非另外指出，心臟用預(yù)溫的(38℃)具有如下組成(mmol/l)的改進(jìn)的Krebs-Henseleit溶液灌注NaCl118，KCl4.7，CaCl2，2H2O2.52，KH2PO41.18，Mg2SO4，7H2O1.64，丙酮酸鈉2.0，NaHCO324.88，葡萄糖5.55。用之前溶液通過45μm瓶蓋濾器過濾。
溶液通過持續(xù)用碳合氣(95％O2/5％CO2)起泡通過而獲得大約7.4的pH以及充足的氧含量。使2升或更多升體積用碳合氣平衡至少20分鐘，而小于1升體積的平衡10分鐘。
麻醉、外科手術(shù)及實(shí)驗(yàn)流程采用的是獲自Hvidesten，Allerφd，丹麥的雄性Ssc∶CPH兔(2.5-4.0kg)。對它們肌肉注射施用鎮(zhèn)靜劑1.2ml Hypnorm_(檸檬酸芬太尼0.315mg/ml和氟丁酰酮10mg/ml)。10分鐘后通過緩慢靜脈內(nèi)施用0.55ml Dormicum_(咪達(dá)唑侖5mg/ml)誘導(dǎo)麻醉。此外，靜脈給予500IU肝素以防止血凝。
將兔背朝下放置，前肢固定在側(cè)面，作切口暴露氣管。進(jìn)行氣管切開手術(shù)，利用Ugo Basile嚙齒動(dòng)物通氣機(jī)(潮氣量18ml，頻率60pr.min)給兔通氧氣。就在劍突下打開腹腔，且腹肌在雙側(cè)側(cè)切。為進(jìn)入胸腔，在胸骨下打開橫膈膜，且刀口向雙側(cè)沿著肋骨曲延伸。盡可能靠近胸骨切開縱隔，肋骨在雙側(cè)沿著平行于胸骨的線切開，以使胸腔壁可以沿頭顱方向提起。將提起的胸腔壁固定在兔頭上方，以提供對胸腔的完整縱覽。打開心包暴露主動(dòng)脈。在主動(dòng)脈周圍松松結(jié)扎。就在肝顱側(cè)鉗夾尾側(cè)腔靜脈以減少向心臟的回流，并且打開顱側(cè)腔靜脈和肺動(dòng)脈以減少心臟的容量過載。打開主動(dòng)脈，并將通過充滿灌注液體的延伸管連接到主動(dòng)脈塞的插管立即插入主動(dòng)脈以進(jìn)行人工灌注。收緊結(jié)扎，切出心臟并轉(zhuǎn)移到灌注設(shè)備中。從夾住尾側(cè)腔靜脈到插入插管的時(shí)間大約為30秒。
心臟轉(zhuǎn)移到設(shè)備中后，在左心耳作切口，以在左心室中插入一個(gè)充滿液體的球囊(size 12)來測量左心室壓。調(diào)整球囊的體積以給出大約為10mmHg的舒張末期壓。測量12-導(dǎo)聯(lián)心電圖的電極環(huán)放置在心臟周圍冠狀溝水平，左心耳尖位于第5和第6心前區(qū)導(dǎo)聯(lián)之間。8個(gè)MAP電極置于心臟上直接與心外膜接觸。MAP5和MAP6置于右心室上，而其它MAP電極均勻分布在左心室上。這個(gè)方法與Zabel等[38]所用的相似。當(dāng)所有的電極都在適當(dāng)?shù)奈恢脮r(shí)，提高心腔以確保心臟一直浸在38℃ Krebs-Henseleit溶液中。
實(shí)驗(yàn)開始之前，在供給左心室大部分的回旋動(dòng)脈的一個(gè)主要分支周圍放置結(jié)扎。結(jié)扎線兩端都穿過一個(gè)小塑料管，通過向著心臟擠壓塑料管并夾緊結(jié)扎線末端能夠誘導(dǎo)局部缺血。使所有的心臟在實(shí)驗(yàn)開始之前平衡15分鐘。
該實(shí)驗(yàn)的時(shí)間安排如下1.由標(biāo)準(zhǔn)Krebs-Henseleit緩沖液灌注15分鐘(平衡期)2.由添加到標(biāo)準(zhǔn)Krebs-Henseleit緩沖液中的化合物灌注15分鐘(血鉀正常對照期；t＝0-15min)。
3.由添加到含有減少的K+濃度(2.5mM)的Krebs-Henseleit溶液中的化合物灌注15分鐘(低血鉀對照期；t＝15-30min)。
4.誘導(dǎo)局部性缺血，隨之由添加到含有減少的K+濃度(2.5mM)的Krebs-Henseleit溶液中的化合物灌注30分鐘(低血鉀缺血期；t＝30-60min)。
在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，心臟用伊文思藍(lán)染料灌注來評估處于梗塞危險(xiǎn)的區(qū)域。切去心房和右心室，而余下的左心室分成被伊文思藍(lán)著色的區(qū)域和未著色區(qū)域，即危險(xiǎn)區(qū)域。用紙巾吸干這兩部分區(qū)域并稱重，以測定處于梗塞危險(xiǎn)區(qū)域的百分比。
記錄連續(xù)記錄下列參數(shù)冠脈流量、左心室壓、灌注壓、12-導(dǎo)聯(lián)心電圖及8MAP記錄。ECG和MAP在2000Hz取樣，而壓力和流量參數(shù)在500Hz。平均動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間根據(jù)8個(gè)MAP記錄計(jì)算為從最大去極化的時(shí)間(dV/dt Max的時(shí)間)到90％復(fù)極化的時(shí)間的平均持續(xù)時(shí)間。該持續(xù)時(shí)間稱為APD90且APD90離差以這8個(gè)APD90測量值的標(biāo)準(zhǔn)偏差度量。
結(jié)果如圖5所示，研究了三組。兔心臟用單獨(dú)的Krebs-Henseleit緩沖液(載體；n＝11次實(shí)驗(yàn))、10-10mol/l的化合物2(n＝10次實(shí)驗(yàn))、或者用10-10mol/l的AAP10(CE2；n＝3次實(shí)驗(yàn))灌注。在低血鉀期間觀察到APD90離差的增加，在載體處理的兔心臟中急性心肌缺血被10-10mol/l的化合物2所防止，但不能被10-10mol/l的AAP10(CE2)防止。這些發(fā)現(xiàn)證明化合物2阻止電離差在局部缺血期間的增加，而且它表明化合物2抗心律失常的特性與這個(gè)機(jī)制有關(guān)。先前有報(bào)道在兔中AAP10(CE2)能夠減小心外膜活化-恢復(fù)間期的離差，并能減少由局部缺血誘導(dǎo)的心外膜活化模式的改變，在10-8mol/l的濃度時(shí)具有最大效應(yīng)[39]。在我們的實(shí)驗(yàn)中，化合物2在濃度為10-10mol/l時(shí)有效阻止了局部缺血期間所誘導(dǎo)的電離差的增加，而AAP10(CE2)在該濃度無效。這些區(qū)別不是由于心肌梗塞大小的差異，因?yàn)榫植咳毖陂g的冠脈流量的減少和危險(xiǎn)區(qū)域在所有組中是相似的。這些結(jié)果表明化合物2比AAP10(CE2)更為有效。
實(shí)驗(yàn)例7化合物2對狗中室性折返心律失常的影響間隙連接在心律失常中的影響已在關(guān)于連接蛋白43(Cx43)對心室傳導(dǎo)特性的影響的研究中闡明[33]。在Cx43缺陷的雜合敲除小鼠中，自發(fā)VT并伴有冠狀動(dòng)脈阻塞(CAO)的頻率為2倍[3]。在狗中局部缺血6小時(shí)之后下調(diào)Cx43的作用，表現(xiàn)出端對端CX43減少60％及側(cè)對側(cè)Cx43減少49％[40]，很可能繼發(fā)于去磷酸化作用。在狗亞急性局部缺血中，心外膜折返在Cx43減少的區(qū)域被促進(jìn)[25]。由此折返機(jī)制可能關(guān)鍵性地取決于局部缺血介導(dǎo)的CX43的下調(diào)和推測的間隙連接的阻抗，使得恢復(fù)和傳導(dǎo)性能的不均一性傾向于發(fā)生VT和VF。
在下文所述的研究中，我們檢測了化合物2對前降動(dòng)脈CAO所引起的心肌局部缺血期間折返心律失常的影響。
動(dòng)物制備研究了在麻醉、胸腔打開狀態(tài)下的3只狗，以便于電極的放置和測繪。α-氯醛糖先作為一次性推注(bolus)給藥(200mg/kg)然后以8mg/kg/hr(溶于聚乙二醇，MW＝200)行恒定輸注。股靜脈和動(dòng)脈插管分別用于給予液體和藥物和用于測量升主動(dòng)脈壓力。
電生理學(xué)方法夾住竇房結(jié)，且心耳由一個(gè)可編程的刺激器起博，其具有兩倍于舒張閾值的恒定電流輸出。起博率≥200b/min以控制心率。對于心室起博，正常區(qū)域中的多極針中的一個(gè)電極使用的是腹肌中的一個(gè)陽極(7cm2不銹鋼)。心內(nèi)膜有效不應(yīng)期(ERP)通過標(biāo)準(zhǔn)的額外刺激技術(shù)測量。晚期心室舒張閾值在每次干預(yù)期間測量；起博電流為四倍閾值。
電描記圖的記錄沿著16電極針桿選擇測試部位(J.Kassell，F(xiàn)ayetteville，NC)；每個(gè)電極完全環(huán)繞針桿以防止針定位的方向性記錄毗鄰的浦肯野束。在心房起博期間通過放大高達(dá)1000倍、濾波3-1300Hz、并介由示波器記錄沿著針桿序貫記錄下6個(gè)雙極電描記圖(1mm間距)。每一個(gè)多極針記錄4個(gè)壁內(nèi)電描記圖。心外膜電描記圖在每一個(gè)電極針都是最后活化的。如Xing和Martins[41]所詳細(xì)描述的，采用了23多極電極陣列，17個(gè)在前降冠狀動(dòng)脈梗塞危險(xiǎn)區(qū)，6個(gè)在周圍的正常區(qū)域。在重12-16kg的狗中，心外膜上測量的針間距變化范圍在6-10mm之內(nèi)。
心律失常的誘導(dǎo)心內(nèi)膜的起博位置是在基底部、尖頂隔和剛好處于危險(xiǎn)區(qū)域之外的側(cè)向游離壁。測定了ERP之后，以4毫秒＞ERP延長S1-S2間隔，并以初始S2-S3間隔等于50毫秒＞S1-S2在方案中加入S3。逐漸縮短該間隔時(shí)間直至無法捕獲。如果在任何起博點(diǎn)都沒有誘導(dǎo)室性心動(dòng)過速，再加入第三個(gè)(S4)和第四個(gè)(S5)額外刺激。在CAO之前我們進(jìn)行了一套完整的室性心動(dòng)過速誘導(dǎo)方案，以排除由于針聚集或者因?yàn)獒樜＜把鞫碌娜毖鶎?dǎo)致的人為室性心動(dòng)過速。在確認(rèn)生理性血?dú)夂妥銐虻穆樽砗螅瑢⑶敖礐AO結(jié)扎起來。60分鐘后梗塞大小幾乎為危險(xiǎn)區(qū)域的75％，而梗塞區(qū)的進(jìn)一步增大可以忽略不計(jì)。隨后，在干涉前誘導(dǎo)至少兩次室性心動(dòng)過速。每20分鐘進(jìn)行重復(fù)測試并持續(xù)直至CAO之后3小時(shí)。于每次干涉記錄正常心肌ERP。
心律失常繪圖心外膜繪圖是利用來自BARD電生理學(xué)公司的基于計(jì)算機(jī)的系統(tǒng)進(jìn)行的。該軟件以12比特的分辨率獲取64通道的數(shù)據(jù)，取樣頻率為1kHz/通道，濾波從30-300Hz。從外部觸發(fā)8-秒窗，包括直到觸發(fā)信號(hào)前8秒的數(shù)據(jù)。這個(gè)系統(tǒng)用來從外部記錄每個(gè)記錄電極上心外膜的2-3個(gè)雙極。
用戶化的計(jì)算機(jī)軟件系統(tǒng)通過以每通道3kHz取樣被用來分辨來自每個(gè)心內(nèi)膜多極電極上的內(nèi)部3個(gè)雙極的浦肯野信號(hào)。濾波器整合浦肯野頻率(3-1300Hz)。取樣率為235kHz。PC機(jī)界面配有一個(gè)放大器，由一個(gè)模似信號(hào)多路調(diào)制器和64組件的放大器電路組成。每個(gè)均有可選擇的擴(kuò)大率(高達(dá)1000)和頻帶寬度截?cái)嘀怠ｋ娚頂?shù)據(jù)的獲取、處理和顯示是由軟件進(jìn)行的。高速獲取允許我們獲取14秒數(shù)據(jù)包括直到觸發(fā)信號(hào)前8秒的數(shù)據(jù)。
繪圖分析繪圖分析是離線進(jìn)行的。計(jì)算機(jī)利用第一個(gè)最大dv/dt選擇激活時(shí)間。只有對刺激不可重復(fù)的電描記圖才被認(rèn)為是無法解釋的并從圖中排除；沒有基于電描記圖電壓的排除。當(dāng)偶聯(lián)間隔短于不應(yīng)期的復(fù)合體中發(fā)生實(shí)質(zhì)性的電壓和dv/dt損失時(shí)，認(rèn)為存在電場或遠(yuǎn)場電勢。等時(shí)線是手繪的。室性心動(dòng)過速機(jī)制定義如下折返性室性心動(dòng)過速發(fā)生之處電極記錄下最早活性，發(fā)生時(shí)間在單向阻滯定位在直接毗鄰于來自前一個(gè)復(fù)合體的最遲激活位點(diǎn)并且在復(fù)合體之間記錄下舒張活性之后。心外膜折返大多總是在急性局部缺血中記錄到，因此觀察到壁的逆行(心外膜到心內(nèi)膜)激活。
實(shí)驗(yàn)方案對心臟應(yīng)用儀器和CAO發(fā)生一小時(shí)之后，進(jìn)行誘導(dǎo)室性心動(dòng)過速的起博方案，以確定是可重復(fù)誘導(dǎo)(誘導(dǎo)兩次具有相似的表觀形態(tài)的室性心動(dòng)過速)還是誘導(dǎo)失敗(在一小時(shí)內(nèi)起博所有的三個(gè)位點(diǎn)兩次而沒有發(fā)生室性心動(dòng)過速)。在三只可重復(fù)誘導(dǎo)室性心動(dòng)過速的狗中識(shí)別了一種折返機(jī)制。在這三只狗中，化合物2作為靜脈推注(bolus)給藥，接著在兩只狗中以三種劑量水平進(jìn)行30min恒定輸注，而第三只狗用鹽水處理。隨后在整個(gè)方案中在所有位點(diǎn)重復(fù)額外刺激測試，以確定室性心動(dòng)過速存在與否。化合物2以三種劑量水平靜脈給藥，以分別產(chǎn)生10-10M(推注0.1μg/kg；輸注2ng/kg/min)、10-9M(推注1.1μg/kg；輸注21ng/kg/min)及10-8M(推注11μg/kg；輸注210ng/kg/min)的血漿濃度。
結(jié)果在持續(xù)單形態(tài)VT的誘導(dǎo)僅僅是來自于側(cè)面心室起博點(diǎn)的誘導(dǎo)(連續(xù)兩次，發(fā)生在CAO之后2小時(shí)10分，并且在2小時(shí)20分重復(fù))之后，對圖6-9所圍繞的第一只動(dòng)物進(jìn)行了研究。圖6給出了隔刺激后的活化圖，其未能引起VT。這顯示了常規(guī)直立行走的激活模式，PURK起博點(diǎn)的早期激活在刺激后6毫秒被激活，而心外膜位點(diǎn)的晚期激活在107毫秒最遲被激活。注意86毫秒時(shí)心外膜上緊靠著最遲激活的東面和南面的臨近激活時(shí)間為圖7上的E-S。VT第一復(fù)合體的心外膜激活，起始于表面QRS發(fā)作之前44毫秒，對應(yīng)于圖7中E-C所記錄的電描記圖。
在圖7中顯示由側(cè)面心外膜心室起博位點(diǎn)的刺激(導(dǎo)致一個(gè)折返環(huán)路)所誘導(dǎo)的持續(xù)的單形態(tài)室性心動(dòng)過速(VT)。激活以雙環(huán)折返進(jìn)行，首先在-17毫秒激活，然后進(jìn)行到西北環(huán)上的57毫秒。東南環(huán)首先在2毫秒、31毫秒，然后在57毫秒激活。誘導(dǎo)VT的方案為S1-S2＝150，S1-S3＝280，S1-S4＝390，S1-S5＝490毫秒。該圖例示了用表面導(dǎo)聯(lián)ECG II和V5R在第二到第五期前額外刺激期間(最佳體現(xiàn)在E-L)記錄的心外膜(E-)電描記圖，確保4個(gè)VT復(fù)合體。電描記圖從側(cè)向邊界區(qū)域(L)起博點(diǎn)以及東(E)、北(N)、中央(C)、心外膜下(SE)、E-C下方以及E-C之南(S)、西北(NW)和東南(SW)記錄。E-C顯示了逐漸解離的電描記圖，末次期前刺激表現(xiàn)出對第二組分的阻滯(垂直線)。ES臨近傳導(dǎo)延遲允許傳導(dǎo)繼續(xù)在周圍以及返回中央位點(diǎn)(EC)，伴有繼續(xù)在EC和ES之間的折返興奮(直線和箭頭線)。
圖8例示了在室性心動(dòng)過速第一復(fù)合體的心外膜激活期間的激活圖譜，起始于表面QRS發(fā)作之前-44毫秒，對應(yīng)于圖7中E-C所記錄的電描記圖。激活以雙環(huán)折返進(jìn)行，首先在-17毫秒激活，然后進(jìn)行到西北環(huán)上的57毫秒。東南環(huán)首先在2毫秒、31毫秒，然后在57毫秒激活。這個(gè)激活圖譜還例示了在折返心律失常期間心室壁的逆向激活。
化合物2以三種遞增的IV劑量給藥，其并不改變平均動(dòng)脈壓(MAP＝80mmHg)。對照的有效不應(yīng)期為150毫秒，最低劑量后為154毫秒以及最高和末次劑量時(shí)為148毫秒?？烧T導(dǎo)的VT是圖7和8所示的典型心外膜折返。在第一劑量的化合物2后(推注0.1μg/kg；輸注2ng/kg/min)，VT不再可誘導(dǎo)，盡管事實(shí)是在化合物2給藥之前誘導(dǎo)方案所誘導(dǎo)的VT是可重復(fù)實(shí)現(xiàn)的；施用藥物前誘導(dǎo)VT的方案為S1-S2＝150，S1-S3＝280，S1-S4＝390，S1-S5＝490毫秒，而在輸注化合物2期間的時(shí)間間隔分別為150、270、370和470毫秒。在輸注最低劑量的化合物2開始后直到一個(gè)半小時(shí)沒有VT誘導(dǎo)發(fā)生。
靜脈給予最低劑量的化合物2之后的心電圖記錄顯示于圖9。這些結(jié)果證明化合物2有效阻斷了這只狗的折返VT。
對第二只狗研究可誘導(dǎo)的VT，這次從兩個(gè)邊界區(qū)域，起博位點(diǎn)位于側(cè)面和中隔?；衔?再次未使MAP產(chǎn)生變化，其始于90mmHg并終于90mmHg。兩個(gè)誘導(dǎo)位點(diǎn)的有效不應(yīng)期在整個(gè)化合物2測試期間分別保持在163和144毫秒，始于CAO后85分鐘并再持續(xù)2個(gè)小時(shí)。在最低劑量的化合物2后，側(cè)壁誘導(dǎo)的VT不再可誘導(dǎo)；這種VT的機(jī)制是心外膜折返，與圖7-9所示的甚為相似。隔部位誘導(dǎo)的VT在化合物2給藥之前也是心外膜折返，但是隨著靜脈給予化合物2之后，心外膜折返被完全阻斷。這樣在這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中，心外膜折返性VT在最低劑量的化合物2誘導(dǎo)前可誘導(dǎo)發(fā)生，但是隨著該物質(zhì)的給藥之后，任何劑量都無折返可再次誘導(dǎo)發(fā)生。
最后另外一只動(dòng)物不引入化合物2而是用鹽水在上文所述的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)所用的時(shí)間框架內(nèi)經(jīng)歷電生理學(xué)測試。CAO后一小時(shí)誘導(dǎo)心外膜折返，而且CAO 1.5-2.5小時(shí)誘導(dǎo)相同的VT形態(tài)和折返機(jī)制。從而這次對照的實(shí)驗(yàn)中折返VT的可重復(fù)性與折返心律失常條件下化合物2是有效的抗心律失常化合物是一致的。
這些實(shí)驗(yàn)證明化合物2在預(yù)防和/或治療致死性折返心律失常中有效。由此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用以制備用于預(yù)防和/或治療室上起源或者心室起源的心臟折返心律失常的藥物的化合物。這個(gè)目的用本發(fā)明的肽化合物實(shí)現(xiàn)，例如式I到VIII、式2到12的化合物，以及本文表1和8的化合物，更具體地，本文合成實(shí)施例1-55的化合物。
實(shí)驗(yàn)例8間隙連接開啟物對骨細(xì)胞的影響背景成骨細(xì)胞，是形成骨的細(xì)胞，其與骨細(xì)胞連接良好。在骨切片中通過電子顯微鏡檢已發(fā)現(xiàn)有成骨細(xì)胞-成骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞-骨細(xì)胞以及骨細(xì)胞-骨細(xì)胞連接[42]。如同在心臟中，與骨有關(guān)的最另人感興趣的連接蛋白是Cx43。在骨細(xì)胞中，這些蛋白的表達(dá)與某些成骨細(xì)胞特異性蛋白的表達(dá)聯(lián)系在一起。向鈣性激素也可以調(diào)控間隙連接蛋白的表達(dá)。
人成骨細(xì)胞(HOB)和骨髓起源的基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)都顯示出表達(dá)Cx43和Cx45。如用熒光黃(LY)染料轉(zhuǎn)移技術(shù)[43]所顯示的，它們是功能性偶聯(lián)的。大鼠成骨細(xì)胞系與人原代培養(yǎng)物不同；ROS 17/2.8細(xì)胞僅表達(dá)Cx43并且偶聯(lián)良好，而UMR 106-01主要表達(dá)Cx45且與染料偶聯(lián)較差[44]。兩種大鼠成骨細(xì)胞系都是電偶聯(lián)的。Cx43轉(zhuǎn)染UMR細(xì)胞產(chǎn)生高度染料偶聯(lián)的細(xì)胞。因而，Cx43允許LY和其它較大分子的轉(zhuǎn)移，而Cx45則不允許這種通過。與之相對照的是，向表達(dá)Cx43的細(xì)胞中引入Cx45則降低染料偶聯(lián)。在成骨細(xì)胞分化過程中，Cx43表達(dá)發(fā)生變化；從而，成骨細(xì)胞越成熟，Cx43表達(dá)越高[45]。
已經(jīng)研究了不同刺激對骨細(xì)胞的影響及其與間隙連接通訊變化的關(guān)系。眾所周知對骨施加中等適度的機(jī)械壓力會(huì)增加骨密度。為模擬這種情況，將ROS 17/2.8細(xì)胞暴露于周期應(yīng)力下，這導(dǎo)致細(xì)胞染料偶聯(lián)的增加。施加于較差偶聯(lián)的UMR 106-01細(xì)胞的周期力也導(dǎo)致染料偶聯(lián)的增加，但與ROS細(xì)胞相比不那么顯著。未發(fā)現(xiàn)Cx43 mRNA的增加，但發(fā)現(xiàn)更多磷酸化形式的Cx43，標(biāo)志著施于成骨細(xì)胞的周期應(yīng)力通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)間隙連接蛋白Cx43的定位而增加細(xì)胞之間的間隙連接通訊。相同的實(shí)驗(yàn)組表明Cx43轉(zhuǎn)染較差偶聯(lián)的UMR 106-01細(xì)胞不僅增加染料偶聯(lián)[46]，而且還增加成熟成骨細(xì)胞產(chǎn)物骨鈣蛋白和骨涎蛋白(BSP)的表達(dá)。通過向細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Cx45而減少成骨細(xì)胞(ROS)之間的偶聯(lián)減少了骨鈣蛋白以及BSP、骨基質(zhì)形成和鈣化的關(guān)鍵基因的表達(dá)。近來的研究表明Cx43敲除小鼠與野生型小鼠相比具有缺陷的骨形成和發(fā)育[47]。因而，一個(gè)溝通的胞間網(wǎng)絡(luò)對于完整精細(xì)運(yùn)作的分化的成骨細(xì)胞表型和正常骨形成及周轉(zhuǎn)是必需的。所以缺陷的間隙連接通訊可能會(huì)導(dǎo)致骨丟失增加。
還已經(jīng)表明間隙連接部分地負(fù)責(zé)骨細(xì)胞中胞間鈣信號(hào)的傳播。在體外機(jī)械刺激細(xì)胞單層中的一個(gè)人成骨細(xì)胞誘導(dǎo)鈣沖動(dòng)，其被傳播到多個(gè)周圍細(xì)胞。該信號(hào)的傳播包括信使分子通過間隙連接，隨后活化鄰里細(xì)胞[48；49]。這些信號(hào)在體內(nèi)很可能是作為對機(jī)械刺激的應(yīng)答而傳遍骨中的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，而且可能是作為對骨機(jī)械負(fù)荷的應(yīng)答而負(fù)責(zé)骨形成增加。
間隙連接通訊與向鈣性激素的效果是相聯(lián)的。已表明1，25(OH)2vit.D3刺激人皮膚成纖維細(xì)胞可促進(jìn)介由間隙連接的通訊，并增加Cx43蛋白和mRNA的水平[50]，但只是在功能性維生素D受體(VDR)存在的條件下。已表明喪失Cx43的表達(dá)會(huì)降低細(xì)胞對PTH的反應(yīng)性，而PTH受體的數(shù)量或cAMP應(yīng)答沒有任何變化[51]。另一方面，PTH和PGE2經(jīng)由兩種機(jī)制增強(qiáng)成骨細(xì)胞培養(yǎng)物中的間隙連接通訊；初始的Cx43至細(xì)胞膜的迅速重分布，以及稍后的對Cx43基因表達(dá)的刺激[52]。從而，胞間通訊的調(diào)節(jié)代表了一種骨營養(yǎng)因子調(diào)控骨形成細(xì)胞活性的機(jī)制。
間隙連接胞間通訊可很好地被證明是最重要的骨細(xì)胞協(xié)調(diào)其活性以及對機(jī)械和激素刺激應(yīng)答的機(jī)制之一。因而，如果能夠從藥理學(xué)上增加骨細(xì)胞之間的間隙連接通訊，成骨細(xì)胞的活性就可以增加，從而促進(jìn)體內(nèi)骨形成。
心肌細(xì)胞也通過間隙連接連接，并且與成骨細(xì)胞中相似，主要的連接蛋白為Cx43。已發(fā)現(xiàn)某些化合物能增加心肌細(xì)胞之間的間隙連接通訊，其中對人工合成的AAP10(CE2)研究得最透徹。心肌細(xì)胞細(xì)胞偶聯(lián)減少對局部缺血的反應(yīng)為細(xì)胞偶聯(lián)減少。體外實(shí)驗(yàn)中，向暴露于局部缺血的心肌細(xì)胞中加入AAP10(CE2)，某些喪失的細(xì)胞偶聯(lián)得以恢復(fù)。如果心肌細(xì)胞可對這組化合物作出反應(yīng)，間隙連接偶聯(lián)增加，成骨細(xì)胞可能也會(huì)作出同樣的應(yīng)答。在這種情形下，顯然細(xì)胞偶聯(lián)的增加非常可能伴隨著成骨細(xì)胞成熟和活性的增加，以及隨后骨形成的增加。為研究這種假說，我們檢測了化合物2對人成骨細(xì)胞和大鼠骨肉瘤細(xì)胞中GJIC的影響。而且，我們還研究了化合物2對人成骨細(xì)胞活性和骨形成的標(biāo)記物(即堿性磷酸酶)的影響。
方法細(xì)胞培養(yǎng)人成骨細(xì)胞(hOB)細(xì)胞分離自通過穿刺健康志愿者(年齡20-36)的后髂棘而獲得的人骨髓10-15ml骨髓原料收集在含有100U/ml肝素(Sigma，Cat.No.H-3149)的15ml PBS+Ca，Mg(Life Technologies，Cat.No.14040)中。骨髓的單核的級分由Lymphoprep gradient(Nycomed Pharma，Cat.No.1001967)分離，以2200rpm離心30分鐘。獲取細(xì)胞后，將單核的級分用培養(yǎng)基洗滌一次，并以1800rpm離心10分鐘。隨后計(jì)數(shù)細(xì)胞并以8×106細(xì)胞/100mm平皿平板接種于培養(yǎng)基中。hOB培養(yǎng)基(所有試劑獲自Life Technologies)MEM w/o酚紅w/Glutamax(Cat.No.041-93013)補(bǔ)充有10％熱滅活的胎牛血清(Cat.No.10106)和0.1％青霉素/鏈霉素(Cat.No.15140)。第二天更換培養(yǎng)基，并且細(xì)胞于37℃ 5％CO2中培養(yǎng)，培養(yǎng)基每7天更換一次。培養(yǎng)3-4周后細(xì)胞達(dá)到70％匯合。然后培養(yǎng)基補(bǔ)充100nM地塞米松(Sigma，Cat.No.D-4902)7天。接著將細(xì)胞平板接種進(jìn)行視頻成像實(shí)驗(yàn)將25mm的#1玻璃蓋片置于35mm培養(yǎng)皿中(或6孔皿的各個(gè)孔中)，細(xì)胞以2.5×105細(xì)胞/蓋片平板接種并在用前培養(yǎng)2-3天。
ROS 17/2.8細(xì)胞細(xì)胞在37℃ 5％CO2中培養(yǎng)于100mm平皿中，培養(yǎng)基每2-3天更換一次。ROS培養(yǎng)基(所有試劑獲自LifeTechnologies)MEM(Cat.No.31095)補(bǔ)充有10％熱滅活的小牛血清(Cat.No.16170)、1％NEAA(Cat.No.11140)、1％丙酮酸鈉(Cat.No.11360)、1％L-谷氨酰胺(Cat.No.25030)和0.1％青霉素/鏈霉素(Cat.No.15140)。對于視頻成像實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞以2-3×105細(xì)胞/蓋片平板接種于蓋片上并在用前培養(yǎng)2-3天。
鈣波的測量在37℃對培養(yǎng)于蓋片上的細(xì)胞加載5μM fura-2-AM(MolecularProbes，Cat.No.F-1221)30分鐘，并在新鮮培養(yǎng)基中溫育20分鐘。然后將蓋片固定于PDMI-2培養(yǎng)室中(Medical Systems Corp.)ZeissAxiovert顯微鏡上，維持在37℃并傾注CO2。通過利用附于Eppendorf5171顯微操作器的硼硅酸鹽玻璃微量吸液管對單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行機(jī)械刺激來誘導(dǎo)胞間鈣波。利用MetaMorph成像系統(tǒng)(UniversalImaging)進(jìn)行成像。激發(fā)光(340和380 nm)由單色儀(T.I.L.L.Photonics GmbH)提供。用強(qiáng)化的CCD相機(jī)(Dage MTI)獲取圖像，并用Matrox MVP圖像處理板數(shù)字化。
顯微注射將培養(yǎng)于蓋片上的細(xì)胞如上文所述置于顯微鏡中。利用Eppendorf 5171顯微操作器和Eppendorf Transjector 5346系統(tǒng)進(jìn)行顯微注射。在一個(gè)微量吸液管中裝入10mM熒光黃(LY)溶液(Sigma，Cat.No.L-0259)。向單層中的一個(gè)細(xì)胞小心注入LY 30秒，從細(xì)胞移開微量吸液管，30秒后計(jì)數(shù)顯示出染料轉(zhuǎn)移的細(xì)胞數(shù)目。LY的激發(fā)光為430nm，而圖像獲取如上文所述。
堿性磷酸酶測定第1天細(xì)胞以8000細(xì)胞/孔(hOB)或3000細(xì)胞/孔(ROS)的濃度平板接種于96孔板的200μl常規(guī)培養(yǎng)基中。
第2天更換細(xì)胞的培養(yǎng)基。
第4天(ROS為第3天)細(xì)胞用200μl MEM、0.1％BSA(Sigma，Cat.No.A-9418)洗滌。向細(xì)胞中加入含有不同濃度化合物2的200μlMEM、0.1％BSA，繼續(xù)培養(yǎng)4天(ROS細(xì)胞為2天)。
第8天(ROS為第5天)堿性磷酸酶(ALP)測定為測量酶活性的一種終點(diǎn)比色法，是利用堿性磷酸酶試劑盒(Sigma，Cat.No.104-LL)進(jìn)行的細(xì)胞用200μl PBS+Ca，Mg洗滌一次。向每孔加入100μl堿性緩沖液，將板于37℃放置10分鐘。向每孔加入100μl底物溶液，將板于37℃溫育30分鐘。向每孔加入100μl 2.0N NaOH以終止反應(yīng)。用讀板機(jī)在405nm測量吸光度。
化合物2對GJIC的影響為評估間隙連接修飾物增加通過間隙連接介導(dǎo)的胞間鈣信號(hào)的通訊的能力，對玻璃蓋片上的單層人成骨細(xì)胞加載fura-2。在實(shí)時(shí)成像期間，用玻璃微量吸液管進(jìn)行機(jī)械刺激。出現(xiàn)胞內(nèi)鈣增加，隨后信號(hào)擴(kuò)展到周圍細(xì)胞。處于波中的平均細(xì)胞數(shù)目為6.5個(gè)細(xì)胞。下一步，加入100μM腺苷三磷酸(ATP)以使嘌呤受體脫敏。脫敏后，鈣波的傳播專一依賴于GJIC。在ATP刺激后，在視野內(nèi)大多數(shù)細(xì)胞中可看到胞內(nèi)鈣的增加。再次機(jī)械刺激單個(gè)細(xì)胞?，F(xiàn)在，波的傳播局限于波中平均僅4.5個(gè)細(xì)胞?；衔?以10-8mol/l的濃度加入浸泡溶液中。在視野內(nèi)大多數(shù)細(xì)胞中可看到胞內(nèi)鈣濃度增加。與化合物2溫育10分鐘后，機(jī)械刺激單個(gè)細(xì)胞。再次地，被刺激的細(xì)胞胞內(nèi)鈣濃度增加，伴有隨后的該波的傳播。現(xiàn)在波傳播到平均6.2個(gè)細(xì)胞(圖10)，與添加化合物2之前相比是顯著的增加。
為測試化合物恢復(fù)受抑制的間隙連接偶聯(lián)的能力，對成骨細(xì)胞系ROS 17/2.8(ROS)進(jìn)行了相似的實(shí)驗(yàn)，但是在將細(xì)胞在低氧條件下溫育48小時(shí)后(只有3-6％O2，公知的減少細(xì)胞偶聯(lián)的條件)。對單層中的ROS細(xì)胞加載fura-2，并在與上文相同的條件下進(jìn)行機(jī)械刺激。由于ROS細(xì)胞不表達(dá)嘌呤受體，未進(jìn)行ATP預(yù)處理。經(jīng)刺激，被刺激的細(xì)胞中胞內(nèi)鈣濃度增加，并激發(fā)波，傳播到總計(jì)平均為2.2個(gè)細(xì)胞(n＝18)。然后向浸泡溶液中加入終濃度為10-8M的化合物2。10分鐘后，重復(fù)機(jī)械刺激?，F(xiàn)在，波傳播到平均5.4個(gè)細(xì)胞(n＝18)(圖11)，與添加該化合物之前相比是一個(gè)顯著的增加。因而，化合物2有效增加間隙連接介導(dǎo)的胞間鈣波。
為評估化合物對直接細(xì)胞偶聯(lián)的影響，根據(jù)前文所述的方法進(jìn)行顯微注射實(shí)驗(yàn)。向單層中的單個(gè)人成骨細(xì)胞注射染料熒光黃(LY)。30秒后，評估含有染料的細(xì)胞數(shù)目。在生理?xiàng)l件下，染料擴(kuò)展到平均14個(gè)細(xì)胞(n＝19)。為抑制細(xì)胞偶聯(lián)，將細(xì)胞在缺氧條件下(3-6％O2)溫育48小時(shí)。然后通過顯微注射LY再評估細(xì)胞偶聯(lián)，這時(shí)染料只能通過平均7個(gè)細(xì)胞(n＝10)。向培養(yǎng)基中加入化合物2，10分鐘后，再次評估染料偶聯(lián)。與化合物2溫育10分鐘后，細(xì)胞偶聯(lián)已經(jīng)增加，染料轉(zhuǎn)移至9個(gè)細(xì)胞(n＝11)。
用ROS細(xì)胞進(jìn)行相似的實(shí)驗(yàn)。生理?xiàng)l件下ROS細(xì)胞的基礎(chǔ)偶聯(lián)為12個(gè)細(xì)胞(n＝19)。在3-6％O2溫育48小時(shí)后，看到染料轉(zhuǎn)移減少到9個(gè)細(xì)胞(n＝27)。再次向浸泡溶液中加入化合物2，細(xì)胞偶聯(lián)事實(shí)上恢復(fù)到低氧之前的水平，平均染料轉(zhuǎn)移至12個(gè)細(xì)胞(n＝27)，(圖12)。因而，化合物2能夠增加間隙連接通訊并恢復(fù)缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞偶聯(lián)的減少。
還已知由低血糖誘導(dǎo)的代謝應(yīng)激能減少間隙連接通訊。所以，我們想要評估化合物2是否能夠逆轉(zhuǎn)低血糖所誘導(dǎo)的細(xì)胞偶聯(lián)減少。將人成骨細(xì)胞單層培養(yǎng)于玻璃蓋片上并加載fura-2。如前文所述ATP脫敏之后，機(jī)械刺激單個(gè)細(xì)胞，并記錄處于波中的細(xì)胞數(shù)目。在這套實(shí)驗(yàn)中，波延伸到平均3.2個(gè)細(xì)胞(n＝19)。培養(yǎng)基換成不含葡萄糖的培養(yǎng)基，8分鐘后進(jìn)行另一次機(jī)械刺激。現(xiàn)在，波幾乎被阻滯，波傳播僅1.4個(gè)細(xì)胞(n＝20)。向培養(yǎng)基中加入終濃度為10-8M的化合物2。進(jìn)行最后一次刺激，現(xiàn)在波幾乎恢復(fù)，平均傳播到2.9個(gè)細(xì)胞(n＝18)，(圖13)。因而，化合物2能夠恢復(fù)低血糖所誘導(dǎo)的細(xì)胞解偶聯(lián)。
最后，為評估化合物2對骨形成和成骨細(xì)胞活性的影響，我們測量了該化合物對細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性的影響。用從1×10-13到1×10-6不同濃度的化合物2刺激人成骨細(xì)胞，并與未處理的對照比較。在常規(guī)培養(yǎng)條件下，化合物2在大多數(shù)測試濃度下增加ALP活性，除了最高濃度(10-6mol/l)，其可能有毒性的(圖14)。此外，還測試了缺氧條件期間該化合物對ALP的影響。人成骨細(xì)胞在5％O2中培養(yǎng)4天。培養(yǎng)基中添加不同濃度的化合物2，并與正常氧含量條件期間的反應(yīng)比較。在缺氧期間，在10-11到10-8mol/l范圍內(nèi)的所有濃度下化合物2誘導(dǎo)的對ALP活性的刺激比正常氧含量期間高大約15％(圖15)。
總而言之，這些結(jié)果證明化合物2能夠使缺氧期間人成骨細(xì)胞之間減弱的GJIC正?；?。而且，化合物2刺激堿性磷酸酶產(chǎn)生，提示化合物2能夠刺激成骨細(xì)胞的活性從而刺激骨形成。因而，化合物2可用于治療骨形成相對于骨吸收受損的骨病。缺氧期間化合物2對細(xì)胞-細(xì)胞偶聯(lián)的效果提示本發(fā)明的物質(zhì)可用于治療和/或預(yù)防與骨組織血管化差、缺氧及缺血有關(guān)的骨病。
從這些實(shí)驗(yàn)中可以得出結(jié)論，本發(fā)明增強(qiáng)GJIC的物質(zhì)可用于制備用于預(yù)防和/或治療骨質(zhì)疏松癥的藥物。在某些情況下，骨質(zhì)疏松癥為另一種疾病的表現(xiàn)，例如庫興氏綜合征或成骨不全。不過在大多數(shù)骨質(zhì)疏松癥病例中，沒有明顯的其它疾病。一種形式在兩種性別的兒童或年輕成年人中發(fā)生，患者具有正常的性腺功能，常稱之為特發(fā)性骨質(zhì)疏松癥，盡管大多數(shù)其它形式也還不知道發(fā)病機(jī)理。I型骨質(zhì)疏松癥發(fā)生在年齡為51到75歲之間的絕經(jīng)后婦女中，特征為小梁骨加速和不成比例的喪失。椎體和前臂遠(yuǎn)端骨折是常見的并發(fā)癥。甲狀旁腺功能降低可能對骨吸收增加有補(bǔ)償作用。II型骨質(zhì)疏松癥發(fā)生在70歲以上的男女中，并且與股骨頸、近端肱骨、近端脛骨以及骨盆這些包含皮質(zhì)骨和小梁骨兩者的部位的骨折有關(guān)。除骨質(zhì)疏松癥外，增加GJIC的物質(zhì)還可以在代謝性骨病例如佝僂病和骨軟化以及因長期服用糖皮質(zhì)激素或慢性腎衰竭而致的骨質(zhì)疏松癥中增加骨形成。從而，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供化合物用于制備用以預(yù)防和/或治療骨質(zhì)疏松癥的藥物。這個(gè)目的用本發(fā)明的肽化合物實(shí)現(xiàn)，例如式I到VIII、式2到12的化合物、以及本文表1和8的化合物，更具體地說，本文合成實(shí)施例1-55的化合物。
間隙連接開啟物對軟骨的影響關(guān)節(jié)軟骨是一種在關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)期間用來經(jīng)受壓縮的組織，并且其在體內(nèi)經(jīng)受多種機(jī)械負(fù)荷力。機(jī)械敏感性已被證明可影響軟骨細(xì)胞代謝和軟骨穩(wěn)態(tài)。在許多細(xì)胞類型中機(jī)械刺激誘導(dǎo)作為胞間Ca2+波從細(xì)胞傳播到細(xì)胞的胞質(zhì)Ca2+濃度的增加。通過間隙連接的細(xì)胞到細(xì)胞通訊成為組織協(xié)調(diào)代謝及對胞外刺激敏感性的基礎(chǔ)間隙連接對胞內(nèi)第二信使的透性允許信號(hào)傳導(dǎo)途徑在幾個(gè)細(xì)胞間共享，最終產(chǎn)生協(xié)同的組織應(yīng)答。已經(jīng)在軟骨細(xì)胞中研究了機(jī)械誘導(dǎo)的Ca2+信號(hào)作用，且已證明間隙連接通訊對于軟骨細(xì)胞中機(jī)械誘導(dǎo)的Ca2+信號(hào)作用是必要的[53]。此外，機(jī)械刺激激活磷脂酶C，從而導(dǎo)致胞內(nèi)肌醇1，4，5-三磷酸的增加。第二信使通過透過間隙連接，刺激鄰近細(xì)胞中的胞內(nèi)Ca2+釋放，這個(gè)系統(tǒng)被認(rèn)為對于機(jī)械張力期間軟骨細(xì)胞中協(xié)同的信號(hào)作用非常重要，而且它可提供一種在代謝應(yīng)激期間協(xié)調(diào)軟骨細(xì)胞代謝活性的機(jī)制[53；54]。軟骨中主要的連接蛋白為Cx43，并且除了其在細(xì)胞-細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)和信號(hào)作用中的角色外，Cx43對于正常軟骨形成也是必要的[47；55]另外，半月板細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分取決于間隙連接通訊。半月板的纖維軟骨部分以及腱的纖維軟骨結(jié)構(gòu)取決于胞間通訊。在損傷期間，間隙連接開啟物會(huì)提高修復(fù)速度。
因而，看起來本發(fā)明增加GJIC的物質(zhì)可用來預(yù)防和/或治療涉及細(xì)胞到細(xì)胞偶聯(lián)受損的關(guān)節(jié)病。如同我們在人成骨細(xì)胞中所證明的，我們提出增加GJIC的物質(zhì)可用來預(yù)防和/或治療涉及代謝應(yīng)激的關(guān)節(jié)病。這些可以包括任何形式的與血運(yùn)減少有關(guān)的關(guān)節(jié)炎或骨折軟骨組織愈合?；衔?和化合物40對DDT所誘導(dǎo)的人軟骨細(xì)胞間隙連接通訊的減少的影響會(huì)與下面關(guān)于成骨細(xì)胞所述相同的方式進(jìn)行測試。測試化合物將以從10-10-10-6mol/kg的濃度范圍應(yīng)用，并預(yù)期測試化合物會(huì)逆轉(zhuǎn)由腫瘤促進(jìn)劑DDT誘導(dǎo)的間隙連接通訊的減少。因而，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供化合物用于制備用以預(yù)防和/或治療關(guān)節(jié)病包括關(guān)節(jié)炎的藥物。這個(gè)目的用本發(fā)明的肽化合物實(shí)現(xiàn)，例如式I到VIII、式2到12的化合物、以及本文表1和8的化合物，更具體地，本文合成實(shí)施例1-55的化合物。
給藥可以是口服、腸胃外或關(guān)節(jié)內(nèi)施用。
間隙連接開啟物對癌癥的影響間隙連接通透性和GJIC的調(diào)節(jié)在細(xì)胞中以不同水平發(fā)生。GJIC減少或缺失可能是轉(zhuǎn)錄和翻譯期間Cx表達(dá)的改變、翻譯后加工的改變、以及連接子裝配和插入質(zhì)膜的改變的結(jié)果。與其它膜蛋白相比，Cx一個(gè)不尋常的特征是其短的半衰期。已發(fā)現(xiàn)連接蛋白的迅速周轉(zhuǎn)是在1.5和2小時(shí)之間。已表明Cx的降解依賴于磷酸化，其導(dǎo)致某些連接蛋白亞型的不穩(wěn)定?？焖俚闹苻D(zhuǎn)率提供了一種額外的機(jī)制，通過該機(jī)制，GJIC可以迅速受到影響Cx mRNA半衰期、翻譯、胞內(nèi)運(yùn)輸及Cx裝配為間隙連接的物質(zhì)的調(diào)控。調(diào)控間隙連接通透性的另外一種方式是在某些情況下通過機(jī)械扭轉(zhuǎn)連接子的六個(gè)亞基而完全或部分的關(guān)閉間隙連接通道。已知間隙連接的門控受減少GJIC的腫瘤促進(jìn)劑的影響。腫瘤促進(jìn)劑為在腫瘤開始后反復(fù)給予時(shí)可增強(qiáng)或加速致癌作用的因子。腫瘤促進(jìn)劑調(diào)節(jié)GJIC的機(jī)制不完全清楚，但有證據(jù)支持腫瘤促進(jìn)劑可能通過改變Cx的磷酸化和/或抑制Cx的表達(dá)及裝配而影響GJIC。近來的結(jié)果已表明在低GJIC能力惡性腫瘤中逆轉(zhuǎn)錄病毒所介導(dǎo)的連接蛋白43體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移顯著地減少腫瘤生成[56]。作為對正常GJIC在預(yù)防癌癥方面的重要角色的進(jìn)一步支持，已顯示Cx32缺陷小鼠具有非常高的自發(fā)肝腫瘤的發(fā)生率以及增加的患化學(xué)誘導(dǎo)的肝腫瘤的易感性[57]。而且，苯巴比妥的腫瘤促進(jìn)作用需要功能性Cx32用于腫瘤進(jìn)展[58]。這暗示GJIC的解偶聯(lián)對于苯巴比妥的致癌作用是重要的[58]。
致癌作用以生長因子、致癌基因和腫瘤抑制基因所參與的生長調(diào)控機(jī)制漸進(jìn)性損害為特征。既然GJIC的改變可導(dǎo)致生長調(diào)控的改變，生長因子和致癌基因?qū)JIC的影響可能對于腫瘤發(fā)生是至關(guān)重要的。已顯示數(shù)個(gè)致癌基因介導(dǎo)GJIC的下調(diào)[59]。已表明PP60V-SrC以一種涉及由MAP激酶導(dǎo)致的C-末端絲氨酸殘基磷酸化的鎖鏈機(jī)制來介導(dǎo)Cx43間隙連接關(guān)閉[59]。有趣的是，某些情況下致癌基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞彼此之間可以溝通，但是缺乏與鄰近正常細(xì)胞的異種通訊。
利用染料轉(zhuǎn)移測定的腫瘤細(xì)胞中間隙連接的通透性比在周圍肝組織中的GJIC低。有趣的是，許多腫瘤被包在一種胞外基質(zhì)樣結(jié)構(gòu)中并與正常組織分隔開。
正常人體組織中的腫瘤性轉(zhuǎn)化作為遺傳改變累積的結(jié)果發(fā)生。不過，癌生成和腫瘤生成的一般策略是GJIC的下調(diào)。各種不同的連接蛋白以一種組織特異性方式表達(dá)。Cx43，Cx26，Cx32已在正常乳腺組織中檢測到。對一組人乳腺癌分析了Cx43的表達(dá)水平。在原位導(dǎo)管癌、浸潤性導(dǎo)管癌及浸潤性小葉癌中觀察不到Cx43間隙連接，而且它們似乎不依賴于雌激素、孕酮及erbB2受體的狀態(tài)。相比之下，人乳腺癌細(xì)胞系和嚙齒類乳腺癌組織顯示了Cx43的下調(diào)，而且它究其源是在mRNA水平，暗示乳腺癌中Cx43蛋白減少的一種轉(zhuǎn)錄機(jī)制[60]。癌癥和GJIC之間聯(lián)系的另外一個(gè)例子是肝細(xì)胞癌，其中連接蛋白32敲除顯示出傾向于這種特定的癌類型[57]。用卵細(xì)胞的研究顯示它們可以分化為肝細(xì)胞，而且卵細(xì)胞的腫瘤性轉(zhuǎn)化衍生物既可以產(chǎn)生肝細(xì)胞腫瘤又可以產(chǎn)生膽道腫瘤。由分化中的卵細(xì)胞表達(dá)的特定連接蛋白決定了它是與肝細(xì)胞或者膽道上皮細(xì)胞溝通。這種通訊可能對進(jìn)一步分化和分化中的卵細(xì)胞的調(diào)控生長是必要的，而且GJIC損傷可能促成肝細(xì)胞及膽細(xì)胞腫瘤的形成。因而，GJIC可能是卵細(xì)胞分化中的關(guān)鍵因素，而阻斷的GJIC可能促進(jìn)其腫瘤性轉(zhuǎn)化。此外，體外分析用馬洛替酯處理過的大鼠肺內(nèi)皮細(xì)胞中的腫瘤入侵顯示，馬洛替酯促進(jìn)細(xì)胞到細(xì)胞通過間隙連接形成粘附，導(dǎo)致抑制腫瘤細(xì)胞入侵[61]。綜合考慮，這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)烈支持GJIC的改變是癌生成中的關(guān)鍵事件而本發(fā)明增加GJIC的物質(zhì)可有益于癌癥治療的假說。所以，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供增加GJIC的新化合物。我們提出式I到VIII、式2到12的肽化合物、以及本文表1和8的化合物作為用于治療癌癥的藥物可能特別有利，因?yàn)槠溆行舛鹊蛷亩拘缘汀?br> 本文的肽的具體用途包括治療下列癌癥相關(guān)的醫(yī)學(xué)狀況腫瘤進(jìn)展在腫瘤生成期間，正常細(xì)胞與其鄰近細(xì)胞間生理學(xué)相互作用的中斷以及喪失分化特征是腫瘤進(jìn)展中常見的共同特征。間隙連接通訊的改變被認(rèn)為是細(xì)胞腫瘤生成期間最早的變化之一(WolburgH，Rohlmann A.Int Rev Cytol.1995；157315-73)，Klaunig JE，RuchRJ.1990；135-46))。Kyung-Sun Kang，Jun-Won Yun，ByoungSu Yoon，Yoon-Kyu Lim和Yong-Soon Lee(Cancer Letters 166(2001)147-153)已經(jīng)表明預(yù)先與GeO2溫育以及與之共同溫育在經(jīng)TPA處理的大鼠肝上皮細(xì)胞中消除了TPA對GJIC的下調(diào)，暗示恢復(fù)GJIC抑制的物質(zhì)可以用于預(yù)防或抑制腫瘤促進(jìn)作用。Suzuki J，Na H-K，Upham BL，Chang C C和Trosko JE(Nutrition and Cancer，vol 36 No.1 p.122-8)已經(jīng)表明食品添加劑λ-角叉藻聚糖抑制大鼠肝上皮細(xì)胞中的GJIC，類似于文獻(xiàn)充分記載的腫瘤促進(jìn)物佛波酯(TPA)，因此可在癌發(fā)生中作為腫瘤促進(jìn)因子的角色。因而，本發(fā)明的化合物可用以預(yù)防或治療由腫瘤促進(jìn)因子例如TPA和λ-角叉藻聚糖所致的癌癥。
藥物敏感抗性增加的間隙連接通訊改善腫瘤中的微環(huán)境，參見Carystinos GD，Alaouijamati MA，Phipps J，Yen L，Batist G。
轉(zhuǎn)移在所有具有轉(zhuǎn)移潛力的癌癥中，胞間間隙連接通訊的喪失與高度轉(zhuǎn)移潛力有關(guān)。(Saunders MM，Seraj MJ，Li Z，Zhou Z，WinterCR，Welch DR Donahue HJ.(Cancer Res.2001；611765-1767)，Nicolson GI，Dulski KM，Trosko J E，Porc Natl Acad Sci USA.1988；85473-6))。通過用保持腫瘤中間隙連接通訊的間隙連接開啟物治療可預(yù)防轉(zhuǎn)移。
治療是對常規(guī)化療的補(bǔ)充。
實(shí)驗(yàn)例9化合物2對DDT誘導(dǎo)的人成骨細(xì)胞間隙連接通訊減少的影響方案和結(jié)果化合物1，1-雙(對氯苯基)-2，2，2-三氯乙烷，也公知為殺蟲劑DDT，是間隙連接通訊的抑制劑，并具有促進(jìn)腫瘤的能力。它通過減少間隙連接數(shù)量和大小和減少磷酸化(有活性)形式的間隙連接蛋白Cx43的細(xì)胞水平而抑制細(xì)胞到細(xì)胞通訊，這些作用被認(rèn)為對于化合物的致癌性能是關(guān)鍵的[62-64]。因而，具有阻止腫瘤促進(jìn)物誘導(dǎo)的GJIC減少的能力的化合物可能是用于防止腫瘤促進(jìn)作用和癌癥治療的潛在候選物[65]。為檢測本發(fā)明的物質(zhì)是否能阻止腫瘤促進(jìn)物誘導(dǎo)的GJIC減少，我們檢測了化合物2對DDT誘導(dǎo)的人成骨細(xì)胞解偶聯(lián)的影響。
方法細(xì)胞培養(yǎng)人成骨細(xì)胞細(xì)胞分離自通過穿刺健康志愿者(年齡20-36)的后髂棘而獲得的人骨髓10-15ml骨髓原料收集在含有100U/ml肝素(Sigma，Cat.No.H-3149)的15ml PBS+Ca，Mg(Life Technologies，Cat.No.14040)中。骨髓的單核的級分由Lymphoprep gradient(NycomedPharma，Cat.No.1001967)分離，以2200rpm離心30分鐘。獲取細(xì)胞后，將單核的級分用培養(yǎng)基洗滌一次，并以1800rpm離心10分鐘。隨后計(jì)數(shù)細(xì)胞并以8×106細(xì)胞/100mm皿平板接種于培養(yǎng)基中。hOB培養(yǎng)基(所有試劑獲自Life Technologies)MEM w/o酚紅w/Glutamax(Cat.No.041-93013)補(bǔ)充有10％熱滅活的胎牛血清(Cat.No.10106)和0.1％青霉素/鏈霉素(Cat.No.15140)。第二天更換培養(yǎng)基，并且細(xì)胞培養(yǎng)于37℃ 5％CO2中，培養(yǎng)基每7天更換一次。培養(yǎng)3-4周后細(xì)胞達(dá)到70％匯合。然后培養(yǎng)基補(bǔ)充100nM地塞米松(Sigma，Cat.No.D-4902)7天。接著細(xì)胞平板接種進(jìn)行視頻成像實(shí)驗(yàn)將一個(gè)25mm的#1玻璃蓋片置于35mm皿中(或一個(gè)6孔皿的各個(gè)孔中)，細(xì)胞以2.5×105細(xì)胞/蓋片平板接種并在用前培養(yǎng)2-3天。
顯微注射細(xì)胞培養(yǎng)于蓋片上，并固定于PDMI-2培養(yǎng)室中(Medical SystemsCorp.)Zeiss Axiovert顯微鏡上，維持在37℃并傾注CO2。利用Eppendorf 5171顯微操作器和Eppendorf Transjector 5346系統(tǒng)進(jìn)行顯微注射。在一個(gè)微量吸液管中裝入10mM熒光黃(LY)溶液(Sigma，Cat.No.L-0259)。向單層中的一個(gè)細(xì)胞小心注入LY 30秒，從細(xì)胞移開微量吸液管，30秒后計(jì)數(shù)顯示出染料轉(zhuǎn)移的細(xì)胞數(shù)目。激發(fā)光(430nm)由單色儀(T.I.L.L.Photonics GmbH)提供。圖像用強(qiáng)化的CCD相機(jī)(Dage MTI)獲取，并利用MetaMorph成像軟件(UniversalImaging)由Matrox MVP圖像處理板數(shù)字化。
結(jié)果為評估間隙連接修飾物防止腫瘤促進(jìn)作用的能力，我們想測試間隙連接修飾物是否可以逆轉(zhuǎn)由熟知的腫瘤促進(jìn)因子DDT誘導(dǎo)的間隙連接通訊的減少。因此，單層人成骨細(xì)胞在玻璃蓋片上于37℃含有5％CO2的潮濕空氣中溫育。將DDT以13μM的終濃度加入培養(yǎng)基中，并留置60分鐘。
為評估化合物2對在DDT處理后直接細(xì)胞偶聯(lián)的影響，根據(jù)前文描述的方法進(jìn)行顯微注射實(shí)驗(yàn)。向單層中的單個(gè)人成骨細(xì)胞注射染料熒光黃(LY)。30秒后，估算含有染料的細(xì)胞數(shù)目。在對照條件下(無DDT處理)，染料擴(kuò)散到中值為14.5個(gè)細(xì)胞(n＝12)。用暴露于DDT的細(xì)胞進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)。這些細(xì)胞顯示出減少的細(xì)胞偶聯(lián)，中值為7(n＝13)。向浸泡溶液中加入終濃度為10-8mol/l的化合物2，并于10分鐘后進(jìn)行另外一次顯微注射?；衔?在所有制備物中增加細(xì)胞到細(xì)胞染料轉(zhuǎn)移，中值為8.3個(gè)細(xì)胞(圖15)。運(yùn)用Wilcoxon非參數(shù)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，這種增加非常顯著，p＜0.01。因而，間隙連接開啟物能夠逆轉(zhuǎn)與腫瘤促進(jìn)作用相關(guān)的胞間偶聯(lián)的減少，這暗示本發(fā)明的物質(zhì)可用于化學(xué)預(yù)防和/或治療癌癥。本發(fā)明的化合物可用于制備化學(xué)預(yù)防和/或治療癌癥的藥物。本發(fā)明的化合物還可與其它抗癌劑一起用于聯(lián)合治療。從而，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供化合物用于制備用以預(yù)防和/或治療癌癥的藥物。這個(gè)目的用本發(fā)明的肽化合物實(shí)現(xiàn)，例如式I到VIII、式2到12的化合物、以及本文表1和8的化合物，更具體地，本文合成實(shí)施例1-55的化合物。
其它藥理學(xué)方法本文所述肽在治療性治療方法中的有用性將顯示于下文另外的例子中。
間隙連接開啟物對傷口愈合的影響傷口為包括皮膚的正常解剖結(jié)構(gòu)的中止，可以是外科手術(shù)傷口或外傷，或者它可以繼發(fā)于數(shù)種疾病例如糖尿病、動(dòng)脈硬化癥、營養(yǎng)不良等。正常傷口愈合是一個(gè)系統(tǒng)的過程，它逐步發(fā)生并且包括止血和炎癥。重塑緊隨著這些過程，可能持續(xù)數(shù)年并引起疤痕組織的形成。血纖維蛋白的止血提供一個(gè)表面，在其之下發(fā)生著傷口邊緣的遷移和移動(dòng)。立即開始的是上皮化、纖維組織形成及毛細(xì)血管增生進(jìn)入愈合的傷口。血管生成性毛細(xì)血管萌芽侵入纖維蛋白傷口凝塊，且?guī)滋熘畠?nèi)構(gòu)成一個(gè)貫穿肉芽組織的微血管網(wǎng)絡(luò)，所述肉芽組織還包括白細(xì)胞和吞噬單核細(xì)胞。參與傷口愈合過程的各種不同組織成分之間發(fā)生非常動(dòng)態(tài)的相互作用。血管形成過程對于成功的傷口愈合是必需的。胞間通訊、間隙連接對于成纖維細(xì)胞合胞體的創(chuàng)建和毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)的增殖是必需的。連接蛋白43的正常分布對于不同組織成分的這種生長是必要的。
在病理?xiàng)l件如水腫、缺血、低氧壓力和感染期間?？吹降臄?shù)個(gè)局部因子可能延緩傷口愈合過程。傷口愈合包括許多細(xì)胞類型的相互作用，而由間隙連接介導(dǎo)的胞間通訊被認(rèn)為在組織和器官的生長與發(fā)育過程中在細(xì)胞代謝協(xié)同中起著重要作用[66-68]。
我們提出本發(fā)明增加GJIC的物質(zhì)可用于治療傷口，特別是加速傷口愈合。鑒于對心臟和骨組織的實(shí)驗(yàn)暗示這些物質(zhì)在代謝應(yīng)激期間(如低血糖、缺氧、局部缺血)具有增強(qiáng)的功效，可以推斷這些物質(zhì)可能特別有益于治療缺血性潰瘍。從而，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供化合物用于制備用以治療傷口特別是缺血性潰瘍的藥物。這個(gè)目的用本發(fā)明的肽化合物實(shí)現(xiàn)，例如式I到VIII、式2到12的化合物、以及本文表1和8的化合物，更具體地，本文合成實(shí)施例1-55的化合物。
傷口愈合過程愈合過程是起始于止血(凝血)的一系列相互重疊的階段。愈合過程的第二階段是一連串的炎癥反應(yīng)，其間小吞噬細(xì)胞在傷口部位聚集，并且肉芽組織開始形成，包括成纖維細(xì)胞和淋巴細(xì)胞及其它成分。上皮細(xì)胞隨之開始從傷口邊界遷移以覆蓋該區(qū)域。還包括毛細(xì)血管從正常組織萌發(fā)進(jìn)入傷口，以確保供給營養(yǎng)、氧和不同細(xì)胞。所有細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有活躍的經(jīng)由間隙連接的胞間通訊(AbdullahKM，Luthra G，Bilski JJ，Abdullah SA，Ryenolds LP，Grazul-BilskaAT.(Endocrine.1999；1035-41)。在有壞死組織的傷口、糖尿病、動(dòng)脈硬化、外科手術(shù)傷口、水腫、感染、燒傷和靜脈功能不全中常見的具有低氧供給和/或高濃度自由基的區(qū)域會(huì)減弱間隙連接通訊(NagyJI，Hossain MZ，Lynn BD，Cupern GE，Yang S，Turley EA.CellGrowth Diff.1996；7745-51))。
在體外成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物中測試間隙連接開啟物的效果。成纖維細(xì)胞從人齒齦獲取，如Arora KK，Lee W，McCullock C.Am JPhysiol Cell Physio.2000；279C147-57)所述。細(xì)胞培養(yǎng)物暴露于10-10-10-8nM的間隙連接開啟物，將會(huì)看到明顯加快的細(xì)胞生長。這種生長通過常規(guī)方法進(jìn)行測試，測量細(xì)胞核隨著時(shí)間對胸苷的吸收。
在暴露于化合物前后研究了間隙連接開啟物刺激內(nèi)皮細(xì)胞生長和內(nèi)皮管形成，如Ashton AW，Yokota R，John G，Zhao S，Suadicani SO.Spray DC，Ware JA.(J Biol Chem.1999；27435562-70)所述。
間隙連接開啟物刺激口腔粘膜的傷口愈合過程。Hara A等(JGastroenterol 1999 Feb 341-6)在人口腔粘膜中鑒定了連接蛋白26和32，表明該組織中存在間隙連接?？墒?，免疫熒光研究未發(fā)現(xiàn)口瘡性口炎患者與對照之間在連接蛋白表達(dá)方面有顯著差異。伊索格拉定馬來酸鹽可在體外增強(qiáng)間隙連接胞間通訊，能夠有效治療暫時(shí)性和復(fù)發(fā)性口瘡性口炎，以及癥狀性和藥物誘導(dǎo)的口瘡性口炎。它同樣可用于預(yù)防復(fù)發(fā)性口瘡性口炎的發(fā)作，每天服用可預(yù)防口炎再發(fā)。本發(fā)明的肽通過加強(qiáng)口腔粘膜細(xì)胞間的隙連接胞間通訊可以相同的方式用來加速口腔粘膜傷口愈合過程；并且本發(fā)明的肽同樣可用于治療和預(yù)防口瘡性口炎。
為考察體內(nèi)的傷口愈合，將化合物2和化合物40每天2-4次向小鼠局部 (濃度范圍為含水凝膠中10-9-10-6mol/l)和腸胃外給藥(10-10-10-6mol/kg)。用6-mm活檢打孔機(jī)在每只小鼠背部皮膚上形成兩個(gè)深達(dá)肉膜的圓形切割傷口。用化合物2和化合物40處理5天后，通過顯微鏡觀察活檢組織從組織學(xué)上評估對皮膚的作用，而傷口愈合通過每天測量傷口直徑來度量。我們預(yù)測化合物2和化合物40不會(huì)單獨(dú)影響皮膚結(jié)構(gòu)，但是兩個(gè)化合物都會(huì)加速活檢后傷口的愈合。
用間隙連接開啟物處理將會(huì)確保不同細(xì)胞之間最大程度的間隙連接通訊，這些細(xì)胞被認(rèn)為在復(fù)雜的修復(fù)過程中扮演著重要的角色，從而促進(jìn)傷口修復(fù)。化合物的給藥可以是腸胃外、局部、全身或口服。
間隙連接開啟物對胃和十二指腸潰瘍愈合的影響間隙連接在胃粘膜細(xì)胞的胞間通訊、增殖和分化中同樣起著重要作用。間隙連接開啟物會(huì)刺激碘誘導(dǎo)的損傷后的再生過程(Endo K，Watanabe S，Nagahara A，Hirose M，Sato N.(J Gastroenterol Hepatol.1995；10589-94))。
Mine等證明正常人胃粘膜含有連接蛋白32和連接蛋白43兩者[69；70]。相反，處于慢性胃潰瘍病損周圍的胃粘膜含有較少量的連接蛋白32和連接蛋白43。在Mine等的研究中，調(diào)查了連接蛋白的出現(xiàn)與潰瘍愈合之間的關(guān)系。當(dāng)觀察到潰瘍愈合時(shí)，在活動(dòng)潰瘍階段減少的連接蛋白32和43，幾乎恢復(fù)到在正常胃粘膜中所觀察到的水平。這些資料顯示連接蛋白32和連接蛋白43兩者的消失是與慢性胃潰瘍損害的階段密切相關(guān)的。此外，利用乙酸誘導(dǎo)的慢性胃潰瘍大鼠模型，同一組研究者證明抗?jié)兯幬镂髅滋娑〉呐R床效果與連接蛋白32的再現(xiàn)密切相關(guān)[69]。
間隙連接對于胃粘膜防御系統(tǒng)及酸誘導(dǎo)損傷的恢復(fù)很重要。Takahashi N，Joh T，Yokoyama Y，Seno K，Nomura T，Ohara H，UedaF，Itoh M.(J Lab Clin Med 2000 Aug；136(2)93-9)。間隙連接胞間通訊(GJIC)決定了GJIC是否介導(dǎo)胃粘膜的恢復(fù)過程的證據(jù)正逐漸累積。雄性Sprague-Dawley大鼠被禁食并麻醉。胃損傷由0.2N HCl腔內(nèi)灌注10分鐘來誘導(dǎo)。通過測量鉻51標(biāo)記的乙二胺四乙酸的清除連續(xù)監(jiān)測粘膜的完整性，其用于分析損傷后的恢復(fù)。酸損傷后開始用0.25％辛醇(OCT；GJIC抑制物)灌注以評估其對恢復(fù)的影響。同樣測試伊索格拉定(IG；GJIC激活物)的效應(yīng)。用間隙連接蛋白(連接蛋白32)單克隆抗體對胃粘膜GJIC進(jìn)行免疫組化分析。當(dāng)停止酸灌注時(shí)，酸誘導(dǎo)粘膜損傷的恢復(fù)迅速發(fā)生(在大約60分鐘之內(nèi))。OCT對正常胃粘膜不產(chǎn)生任何損傷，其顯著抑制這種恢復(fù)。IG以一種劑量依賴性的方式逆轉(zhuǎn)這種抑制作用。在免疫組化研究中，證明了OCT誘導(dǎo)的對間隙連接的破壞，但并非在IG預(yù)處理之后。這些發(fā)現(xiàn)暗示GJIC可能在大鼠胃粘膜的恢復(fù)中起著關(guān)鍵性作用，而本發(fā)明的肽可用于治療潰瘍，例如胃和十二指腸潰瘍。為證實(shí)這一陳述，可以利用前文Takahashi N等2000年的大體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行大鼠實(shí)驗(yàn)，在酸性溶液中穩(wěn)定的化合物2和化合物40以10-11-10-7M范圍的濃度向大鼠給藥。這些實(shí)驗(yàn)預(yù)期可以顯示化合物2和化合物40對間隙連接偶聯(lián)的促進(jìn)作用以及抵消蛙皮縮膽囊肽的效應(yīng)從而導(dǎo)致胃潰瘍的愈合。
肽的給藥可以是口服或腸胃外，如靜脈內(nèi)。
所以，本發(fā)明增加GJIC的物質(zhì)可促進(jìn)胃和十二指腸潰瘍的愈合。從而，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供化合物用于制備用以治療胃和十二指腸潰瘍的藥物。這個(gè)目的用本發(fā)明的肽化合物實(shí)現(xiàn)，例如式I到VIII、式2到12的化合物、以及本文表1和8的化合物，更具體地，本文合成實(shí)施例1-55的化合物。
間隙連接在血管生物學(xué)中的角色在血液和其下的組織之間的內(nèi)皮界面處細(xì)胞反應(yīng)的協(xié)調(diào)通過多信號(hào)作用機(jī)制介導(dǎo)，包括經(jīng)由間隙連接的直接胞間通訊。內(nèi)皮間隙連接胞間通訊牽涉到的功能有損傷后內(nèi)皮細(xì)胞的遷移行為、血管生成、內(nèi)皮生長和衰老、以及血管舒縮反應(yīng)的協(xié)調(diào)[71]。
血流在廣泛的動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)的調(diào)節(jié)需要阻力和供應(yīng)動(dòng)脈的協(xié)調(diào)反應(yīng)。血管間的這種協(xié)同作用可通過流動(dòng)的血液所施加的剪切應(yīng)力的血管效應(yīng)或者通過血管舒縮信號(hào)沿著血管壁細(xì)胞的傳導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)。事實(shí)上，局部應(yīng)用某些血管活性化合物，例如乙酰膽堿(ACh)或去甲腎上腺素(NE)不僅誘導(dǎo)局部擴(kuò)張或收縮，而且誘導(dǎo)在上下游數(shù)毫米處的血管舒縮反應(yīng)。血管舒縮反應(yīng)也可以從毛細(xì)血管傳導(dǎo)到細(xì)動(dòng)脈，并可能有助于組織需要與血液供給的匹配。這由下列方法證明當(dāng)刺激單條肌纖維收縮時(shí)，觀察到供給這些纖維的毛細(xì)血管上游的細(xì)動(dòng)脈擴(kuò)張[72]。
這種高的傳導(dǎo)速度與信號(hào)沿著血管壁的電緊張傳輸是一致的。事實(shí)上，局部誘導(dǎo)的超極化和去極化已證明在內(nèi)皮和血管平滑肌細(xì)胞中傳導(dǎo)到上游數(shù)毫米處。電信號(hào)的傳導(dǎo)需要血管細(xì)胞通過可提供細(xì)胞間低電阻通道的間隙連接的偶聯(lián)。在血管組織中，至少表達(dá)三種不同的連接蛋白(Cx)(Cx37，Cx40，和Cx43)形成間隙連接。Cx40似乎是主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中主要的連接蛋白同種型，而在平滑肌中，Cx43大量表達(dá)。
對Cx40缺失小鼠(Cx40-/-)的研究證明在Cx40-/-動(dòng)物中通過局部施用乙酰膽堿或緩激肽誘導(dǎo)的血管舒張的傳播與正常野生型(Cx+/+)動(dòng)物相比嚴(yán)重減弱[73]。而且，與正常野生型(Cx+/+)小鼠相比，Cx40-/-動(dòng)物中動(dòng)脈血壓顯著升高。這些結(jié)果支持Cx40在血管胞間通訊中的重要作用，并且它們顯示血管壁中受損的間隙連接通訊與內(nèi)皮細(xì)胞依賴性血管擴(kuò)張反應(yīng)的傳輸減少有關(guān)，其隨即增大血管阻力并導(dǎo)致高血壓。最近體內(nèi)研究表明腎臟中正常的壓力波動(dòng)對于調(diào)節(jié)血壓極為重要[74]。因而，由細(xì)胞到細(xì)胞偶聯(lián)差所致的血管舒縮反應(yīng)受損可能促成Cx40缺失動(dòng)物中高血壓的發(fā)生。
老化內(nèi)皮細(xì)胞中Cx43 mRNA和蛋白水平的下調(diào)表明受損的間隙連接胞間通訊可能在血管老化過程中起作用[75]。
基于得到的有關(guān)間隙連接在血管反應(yīng)中的作用的信息，很可能增加血管壁間隙連接偶聯(lián)的藥理學(xué)化合物能夠促進(jìn)傳導(dǎo)的血管反應(yīng)并在代謝需求增加的條件下(如體育運(yùn)動(dòng)、心動(dòng)過速)以及局部缺血期間改善血液供給。此外，這樣一種物質(zhì)有可能預(yù)防和/或治療高血壓。所以本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供增加血管壁間隙連接偶聯(lián)和/或GJIC從而可用于預(yù)防或治療高血壓的化合物。這個(gè)目的用本發(fā)明的肽化合物實(shí)現(xiàn)，例如式I到VIII、式2到12的化合物、以及本文表1和8的化合物，更具體地，本文合成實(shí)施例1-55的化合物。
實(shí)驗(yàn)步驟所有的實(shí)驗(yàn)利用的都是來自大鼠腸系膜的分離的阻力動(dòng)脈(內(nèi)徑大約200mm)。該動(dòng)脈為腸系膜動(dòng)脈的第3個(gè)級分支，并從14-18周齡的雄性Wistar大鼠的腸系膜解剖出來。動(dòng)脈安放在肌動(dòng)描記器中測量等長收縮力并且被動(dòng)伸展以獲得最大力。將組織浴一分為二，每一半中安放一條動(dòng)脈。動(dòng)脈浸泡在生理的碳酸氫鹽緩沖的鹽溶液中，并且除非另外聲明，通氣含5％CO2的21％O2。
為評價(jià)血管舒縮，將動(dòng)脈用去甲腎上腺素以極限下濃度激活。這是在除去內(nèi)皮后進(jìn)行的，并且使用逐漸增加濃度的cGMP，我們知道其可以增加血管舒縮的程度和胞間通訊。
為評價(jià)內(nèi)皮功能，動(dòng)脈用接近最高的去甲腎上腺素濃度激活，并在去甲腎上腺素的存在下用逐漸增加濃度的乙酰膽堿松弛，我們知道乙酰膽堿可在這些動(dòng)脈中內(nèi)皮細(xì)胞依賴性地松弛動(dòng)脈，通過部分NO-依賴性和部分EDHF-依賴性途徑。
評估了10-8M和10-6M的化合物2和化合物40對于血管舒縮和對乙酰膽堿的反應(yīng)的影響。當(dāng)藥物存在時(shí)，采用至少5分鐘的預(yù)溫育。
為評價(jià)血管舒縮，組織浴中的一條動(dòng)脈作為對照，而另一條動(dòng)脈由化合物2和化合物40之一進(jìn)行處理。
在缺氧實(shí)驗(yàn)中，在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前將組織暴露于含5％CO2的N2中至少5分鐘。這個(gè)步驟使得浴中PO2下降至大約5mmHg。
我們預(yù)期本發(fā)明的化合物將會(huì)增加乙酰膽堿誘導(dǎo)的血管舒張和血管舒縮。從而這些物質(zhì)可用于治療高血壓和與血管收縮有關(guān)的血管疾病。給藥模式可以是口服或腸胃外。
間隙連接開啟物在神經(jīng)組織中的作用在CNS中表達(dá)八種不同的連接蛋白(Cx26，30，32，37，40，43，45，46)。此外，Cx36似乎在神經(jīng)元中優(yōu)先表達(dá)。不同的連接蛋白允許多種不同細(xì)胞群體之間的通訊或者根據(jù)其連接蛋白表達(dá)模式將細(xì)胞隔離成獨(dú)立的區(qū)室。異型偶聯(lián)可能具有功能相關(guān)性的區(qū)室界面位于少突膠質(zhì)細(xì)胞(Cx32，Cx45)和星形膠質(zhì)細(xì)胞(Cx43，Cx45，Cx40，Cx30)或神經(jīng)元(Cx26，Cx32，Cx43)之間[76]。
特定組的連接蛋白在特定的腦區(qū)室中提供功能上的優(yōu)勢是可行的；也就是說，較高或較低的單元傳導(dǎo)可能在功能上促進(jìn)或限制神經(jīng)輸入的同步或傳導(dǎo)的速度。
在未成熟的成神經(jīng)細(xì)胞和出生后的神經(jīng)元中，間隙連接介導(dǎo)的胞間偶聯(lián)已得到證實(shí)[76；77]。出生后神經(jīng)元間隙連接的增加及其皮層構(gòu)成提示這些連接在皮層發(fā)生的關(guān)鍵時(shí)期潛在的形態(tài)發(fā)生事件中的重要作用。神經(jīng)遞質(zhì)能夠修飾間隙連接偶聯(lián)的事實(shí)支持間隙連接參與神經(jīng)元運(yùn)輸。
所以，我們提出本發(fā)明的物質(zhì)，已知其能增加GJIC，可加速在神經(jīng)損傷后或在未成熟細(xì)胞(祖細(xì)胞)移植到腦組織期間的修復(fù)。目前正在經(jīng)受實(shí)驗(yàn)評估的用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞修復(fù)的技術(shù)有移植祖細(xì)胞、胎組織、以及用于治療疾病例如帕金森病、亨廷頓舞蹈病和其它神經(jīng)變性腦病的病毒載體。
軸突損傷迅速激活接近軸突化神經(jīng)元的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。在運(yùn)動(dòng)軸突損傷后，星形膠質(zhì)細(xì)胞在數(shù)小時(shí)內(nèi)上調(diào)間隙連接蛋白連接蛋白-43，并在一天內(nèi)上調(diào)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)。同時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞增殖并朝軸突化神經(jīng)元核周質(zhì)遷移。軸突損傷后神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活的一個(gè)假說暗示，受損的神經(jīng)元最初與鄰近的星形膠質(zhì)細(xì)胞通過GJIC相互作用。隨后，附近靜止的膠質(zhì)細(xì)胞被激活。這些神經(jīng)膠質(zhì)反應(yīng)通過旁分泌和自分泌機(jī)制擴(kuò)大，其中細(xì)胞因子似乎是重要的介導(dǎo)物。激活的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的這種特定的功能特性將決定它們對神經(jīng)元存活、軸突再生和突觸可塑性的影響。因而對這些反應(yīng)的誘導(dǎo)和進(jìn)展的控制很可能對例如神經(jīng)外傷、腦局部缺血及慢性神經(jīng)變性疾病的結(jié)果是關(guān)鍵性的[78]。
間隙連接據(jù)信提供了神經(jīng)膠質(zhì)區(qū)室個(gè)別成員間協(xié)調(diào)長距離信號(hào)作用的分子聯(lián)接。同樣的，星形膠質(zhì)細(xì)胞理想地適于神經(jīng)元的代謝支持，因?yàn)樗鼈兪枪δ苄詷O化的，一端接觸血管床而另一極接近神經(jīng)元實(shí)質(zhì)[76]。因而，這種支持機(jī)制的障礙可能引起整合的神經(jīng)元路徑的障礙從而發(fā)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。所以，我們提出本發(fā)明的物質(zhì)，已表明其可增加GJIC，可以通過增加神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元之間的代謝支持而預(yù)防腦的局部缺血傷害。此外，本發(fā)明的物質(zhì)對于患有器質(zhì)性精神病可能呈現(xiàn)出諸如抑郁、焦慮、學(xué)習(xí)和記憶缺陷、恐怖癥和幻覺征象的患者意義重大。如此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供化合物用以制備用于預(yù)防腦局部缺血損傷和治療器質(zhì)性精神病包括抑郁、焦慮、學(xué)習(xí)和記憶缺陷、恐怖癥和幻覺的藥物。這個(gè)目的通過選擇或配制本發(fā)明的肽化合物以便能夠?yàn)橹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)所利用而實(shí)現(xiàn)。
神經(jīng)組織眾所周知小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的主要免疫效應(yīng)物，并且它們被激活以應(yīng)答觸發(fā)大腦炎癥反應(yīng)的多種損傷，包括頭部損傷和局部缺血、神經(jīng)變性疾病、自身免疫病、感染性疾病、朊病毒疾病及腦腫瘤。激活的小膠質(zhì)細(xì)胞遷移到受損的CNS區(qū)域，在那里它們增殖并逐步去除細(xì)胞碎片。Eugenin等表明小膠質(zhì)細(xì)胞可以通過被炎癥細(xì)胞因子誘導(dǎo)的間隙連接彼此之間進(jìn)行通訊(Eugen n，EA，Eckardt，D，Theis，M，Willecke，K，Bennett，M V L and Saez，J CMicroglia at brain stab wounds express connexin 43 and in VItro formfunctional gap junctions after treatment with interferon-gamma andtumor necrosis factor-alpha.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.98，4190-4195，2001)。這在下面的實(shí)驗(yàn)中證實(shí)。在大腦刺傷傷口處，小膠質(zhì)細(xì)胞在幾天內(nèi)日益增多地聚集并在細(xì)胞間界面處形成頻繁顯示Cx43免疫反應(yīng)性的聚集物。在原代培養(yǎng)中，小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出通過蛋白質(zhì)印跡測定的低水平的Cx43、彌漫性胞內(nèi)Cx43免疫反應(yīng)性、以及低發(fā)生率的染料偶聯(lián)。用免疫刺激劑細(xì)菌脂多糖(LPS)或細(xì)胞因子干擾素-γ(INF-γ)或腫瘤壞死因子-α(TNF-α)一次一種進(jìn)行處理不增加染料偶聯(lián)的發(fā)生率。然而，用INF-γ加上LPS處理的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出可被抗-TNF-α抗體的同時(shí)應(yīng)用所阻止的染料偶聯(lián)顯著增加，暗示著TNF-α的釋放和自分泌作用。用INF-γ加上TNF-α處理同樣大大增加染料偶聯(lián)的發(fā)生率和Cx43的水平，伴有Cx43易位至細(xì)胞細(xì)胞接觸。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的染料偶聯(lián)由一種間隙連接阻滯劑18-甘草次酸可逆地抑制。培養(yǎng)的小鼠小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞也表達(dá)Cx43并在細(xì)胞因子的處理下產(chǎn)生染料偶聯(lián)，但是來自純合型Cx43缺失小鼠的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在用INF-γ加LPS或NF-y加TNF-α處理后并不形成顯著的染料偶聯(lián)。
由于化合物2和化合物40對間隙連接通訊的激活作用，預(yù)期這些化合物會(huì)促進(jìn)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的胞間通訊從而增加或加速前述疾病中的“愈合”過程(大腦炎癥反應(yīng)，包括頭部損傷和局部缺血、神經(jīng)變性疾病、自身免疫病、感染性疾病、朊病毒疾病及腦腫瘤)。
為證實(shí)這一陳述，可以利用前文Eugenin等2001年的大體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物實(shí)驗(yàn)，化合物2和化合物40以10-11-10-8M范圍的濃度給予受影響的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。這些實(shí)驗(yàn)預(yù)期會(huì)顯示化合物2和化合物40對間隙連接偶聯(lián)的促進(jìn)作用以及抵消18α-甘草次酸的效果。本發(fā)明的化合物還可用于Nagy JI和Li WE描述的體外模型(Eur J Neurosci 2000 Dec；12(12)4567-72)用來特別研究局部缺血對星形膠質(zhì)細(xì)胞間隙連接調(diào)控的作用。
肺組織-肺泡細(xì)胞肺泡細(xì)胞之間經(jīng)由間隙連接的肺泡胞間通訊對于離子運(yùn)輸?shù)膫鞑ァC(jī)械化學(xué)信號(hào)的傳導(dǎo)、細(xì)胞生長的調(diào)控及表面活性因子的分泌很重要(Ashino Y，Ying X，Dobbs LG，Bhattacharya J.(Am J PhysiolLung Mol Physiol 2000；279L5-L13))。肺的肺泡區(qū)域急性和慢性炎癥損傷后的體內(nèi)修復(fù)包括形成纖連蛋白作為部分胞外基質(zhì)(Charash WE，VIncent PA，Saba TM，Minnear FL，Mc Keown-Longo PJ，MigliozziJA，Lewis MA，Lewis E，Giunta C.(Am Rev Respir Dis 1993；148467-476)和Torikata C，VIlliger B，Charles Kuhn I，McDonald JA.(Lab Invest 1985；52399-408))。肺泡上皮細(xì)胞培養(yǎng)研究證明了間隙連接數(shù)目增加平行于胞外纖連蛋白濃度增加(Alford AI，Rannels DE.(Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2001；280L680-L688))。體內(nèi)動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)在肺泡組織、末端細(xì)支氣管壁、肺泡管及支氣管周肺泡中二氧化氮誘導(dǎo)嚴(yán)重的肺部炎癥后間隙連接數(shù)目減少。這些結(jié)果是劑量依賴性的。不過，如果用?；撬犷A(yù)處理，這種間隙連接喪失被阻止，與炎癥反應(yīng)顯著性降低相平行。對大鼠肺照射后及用化療化合物博來霉素處理后發(fā)現(xiàn)相似的結(jié)果。
因而，維持肺組織的間隙連接通訊看來對于預(yù)防肺纖維化很重要，而且連接蛋白數(shù)目的減少被看作是對炎癥過程、對各種毒性刺激物例如氣體吸入、空氣攜帶的破壞性物質(zhì)及放射的反應(yīng)。在肺所要接觸的治療性照射之前將會(huì)建議用促進(jìn)間隙連接開啟或間隙連接通訊的化合物預(yù)處理，舉例來說在肺癌、乳腺癌、甲狀腺及食道癌的治療中。
根據(jù)本發(fā)明的治療方法可以使用一種或多種本文公開的化合物作為唯一的活性劑。優(yōu)選將使用一種化合物。如果需要，這樣的化合物可以預(yù)防性應(yīng)用，也就是預(yù)防或減少特定適應(yīng)癥或病癥的嚴(yán)重程度?；蛘撸衔锟膳c認(rèn)可的治療方法聯(lián)合應(yīng)用。作為一個(gè)例證在放射處理的具體實(shí)施方案中，通常優(yōu)選治療方法是“另外加上的”，也就是，與已認(rèn)可的治療該病癥的療法相聯(lián)合。本發(fā)明的這種“另外加上的”治療方法視需要可以與認(rèn)可的治療同時(shí)或者在不同的時(shí)間進(jìn)行。對多種疾病和醫(yī)學(xué)狀況已確立的治療方法已有描述。通常參見如Harrison′s Principles of Internal Medicine(1991)12版，McGraw-Hill，Inc.以及The Pharmacological Basis of Therapeutics(1996)Goodman，Louis S.第9版Pergammon Press；其公開內(nèi)容并入本文作為參考。
用促進(jìn)或介導(dǎo)間隙連接開啟的化合物治療可防止肺氣腫、石棉肺、硅肺、肺纖維化、肺炎、藥物誘導(dǎo)的肺纖維化以及暴露于肺毒性氣體例如二氧化氮的患者中肺功能的進(jìn)一步惡化。治療優(yōu)選附加于對這些病癥的常規(guī)治療。
可在體外肺泡上皮細(xì)胞培養(yǎng)物中測試化合物，用分離自大鼠肺的細(xì)胞(Rannels SR，Rannels DE.(在Cell Biology。A LaboratoryHandbook，由Celis JE編輯。San Diego，CAAcademic 1994，p116-123)，Abraham V，Chou ML，DeBolt KM，Koval M(Am J Physio)Lung Cell Mol Physiol 1999；276L825-L834))或商購的人細(xì)胞系。細(xì)胞可在含抗生素和胎牛血清的Earle′s基本必需培養(yǎng)基中培養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)膠原包被的塑料平皿中。細(xì)胞生長直至匯合成層。間隙連接通訊直接用介由顯微注射入細(xì)胞中的溶于150mM LiCl中的4％熒光黃溶液進(jìn)行測定。通過簡單擴(kuò)散3分鐘使該熒光示蹤物填充細(xì)胞。注射階段過后，移走吸液管并計(jì)數(shù)發(fā)熒光細(xì)胞的數(shù)目。發(fā)熒光細(xì)胞的數(shù)目在間隙連接抑制物與或者不與不同劑量的在10-10-10-7M(肽)范圍內(nèi)的所述間隙連接易化物的期間計(jì)數(shù)。
這里優(yōu)選的間隙連接開啟物，例如化合物2，還將在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物藥物誘導(dǎo)的肺纖維化及放射誘導(dǎo)的肺纖維化期間進(jìn)行體內(nèi)測試。動(dòng)物暴露于誘導(dǎo)物，評估結(jié)果，并和用化合物2預(yù)處理的動(dòng)物的結(jié)果比較。劑量在10-10到10-7mol/kg范圍內(nèi)，取決于該化合物的生物動(dòng)力學(xué)，舉例來說，如在前文所述氯化鈣誘導(dǎo)的心律失常中所測定的?；衔锟梢钥诜?、腸胃外、經(jīng)鼻或者經(jīng)由肺吸入給予。
平滑肌血管系統(tǒng)。經(jīng)由間隙連接通道的胞間通訊在調(diào)節(jié)和調(diào)制整個(gè)血管樹中血管肌細(xì)胞張力方面起著基礎(chǔ)性的作用(Christ GJ，Spray DC，Moore LK，EI-Sabban ME，Brink PR.(Circ Res.1996；79631-646))。間隙連接通訊的另一個(gè)重要角色是在血管松弛反應(yīng)所涉及的平滑肌細(xì)胞間傳播超極化(Benny JL，Paicca C.Am J Physiol Heart CircPhysiol 1994；266H1465-72))。內(nèi)皮的這種特化功能需要單層內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞之間以及內(nèi)皮細(xì)胞與其它存在于血管壁中的細(xì)胞之間的間隙連接胞間通訊。冠狀毛細(xì)血管中和所有其它血管中這些不同細(xì)胞類型之間經(jīng)由間隙連接的通訊已經(jīng)在數(shù)項(xiàng)研究中得到證實(shí)。參與適應(yīng)性動(dòng)脈生成的證據(jù)也已經(jīng)被證實(shí)(Cai W-J，Koltai S，Kocsis E，Scholz D，Shaper W，Schaper J(J Mol Cell Cardiol 2001；33957-67)，WangH-Z，Day N，Valcic M，Hsieh K，Serels S，Brink PR，Christ GJ.(Am JPhysiol Cell Physio.2001；281C75-88)，Schuster A，Oishi H，BennyJ-L，Stergiopulos N，Meisater J-J.(Am J Physiol Heart Circ Physio.2001；280H1088-96))。
在如飲食所誘導(dǎo)的高膽固醇血癥損害中內(nèi)皮單層被破壞的不同血管病理生理情況下，血管平滑肌中間隙連接通訊減少(Polacek D，BechF，McKinsey JF，Davies PF.(J Vasc Res 1997；3419-30)。在靜脈停滯期間和血栓性靜脈炎發(fā)生時(shí)可看到內(nèi)皮細(xì)胞層損傷。Kwak BR，Pepper MS，Gros DB，Meda P(Molec Biol Cell 2001；12831-845)清楚證明了間隙連接通訊在內(nèi)皮修復(fù)期間起著協(xié)調(diào)細(xì)胞遷移的作用，并且對于血管生成期間毛細(xì)血管萌發(fā)同樣重要。
用促進(jìn)間隙連接通訊的化合物治療可以改善受影響的血管區(qū)域中受損的胞間通訊，而且在器官局部缺血期間尤其有用，舉例來說間歇性跛行和心肌梗塞。
可是在大鼠頸動(dòng)脈球囊導(dǎo)管損傷后，血管愈合過程表現(xiàn)出的特征是增加的間隙連接通訊(Yeh HI，Lupu F，Dupont E，Severs NJ，(Arterioscle Thromb Vasc Biol 1997；173174-84)?；衔飳⒃谇蚰腋深A(yù)之前給予，優(yōu)選附加于對這種病癥的常規(guī)醫(yī)學(xué)治療。化合物的給藥將為腸胃外給予。
其效果將會(huì)在球囊導(dǎo)管損傷之前及之后的不同時(shí)間取樣的組織中檢測。內(nèi)皮表面的加速愈合利用普通顯微鏡可看到。還會(huì)發(fā)現(xiàn)間隙連接通訊的改善。
(Arterioscle Thromb Vasc Biol 1997；173174-84)。用間隙連接開啟物處理可加速愈合過程。
用間隙連接開啟物例如化合物2和化合物40治療的預(yù)防效果可以在如Yeh HI，Lupu F，Dupont E，Severs NJ(Arterioscle Thromb VascBiol 1997；173174-84)所述的實(shí)驗(yàn)設(shè)置中檢測?；衔?或化合物40在球整干預(yù)前以10-11到10-8范圍的劑量給藥，取決于化合物的生物動(dòng)力學(xué)，舉例來說，如上文所述在氯化鈣誘導(dǎo)的心律失常模型中所確定的。組織在球囊導(dǎo)管損傷前以及損傷后的不同時(shí)間取樣。內(nèi)皮表面的加速愈合利用普通顯微鏡可看到。還會(huì)發(fā)現(xiàn)間隙連接通訊的改善。
該化合物可以例如腸胃外給藥。
在其它疾病中平滑肌細(xì)胞之間的間隙連接通訊被擾亂。在海綿體中經(jīng)由間隙連接建立一種合胞體細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，其對勃起功能很重要并且確保陰莖的海綿體和動(dòng)脈的平滑肌細(xì)胞以一種協(xié)調(diào)一致的方式發(fā)生反應(yīng)(Christ GJ.(Int J Impot Res.2000；12 suppl.4S15-25)，Melman A，Christ JC.(Urolog Clin North America.2001；28217-31))。擾亂的勃起功能見于糖尿病、動(dòng)脈硬化、不同的神經(jīng)病和許多慢性疾病中。從糖尿病的研究中，神經(jīng)支配和胞間偶聯(lián)之間的逆相關(guān)性指向海綿體環(huán)境的潛在功能可塑性，盡管未建立經(jīng)由間隙連接的功能性胞間通訊。
用促進(jìn)間隙連接開啟的化合物處理將改善經(jīng)由間隙連接的通訊，從而正?；＞d體和血管中平滑肌細(xì)胞間的復(fù)雜綜合協(xié)調(diào)。
海綿體平滑細(xì)胞分離自大鼠并如Christ GJ，Moreno AP，MelmanA，Spray DC.(Am J Physiol 1992；263C373-83)所述建立。間隙連接通訊用熒光黃或另一種熒光染料利用如上所述的顯微注射技術(shù)或利用FACS方法測量，例如Juul MH等Cell Adhes Commun 2000；7(6)501-12所描述的。發(fā)熒光細(xì)胞的數(shù)目在多種間隙連接抑制物與或不與不同劑量的所述間隙連接開啟物，例如化合物2或化合物40，在10-10-10-8nM范圍的時(shí)候計(jì)數(shù)。在與間隙連接開啟物接觸后，在給定范圍內(nèi)的化合物濃度下可鑒定出間隙連接通訊改善超過25-50％。
化合物勃起功能的體內(nèi)藥理學(xué)測試在鏈脲菌素(35mg/kg腹膜內(nèi)注射)誘導(dǎo)大鼠(8周齡)糖尿病后10周進(jìn)行測試，如Rehman J，Cheven E，Brink P，Peterseon B，Walcott B，Wen YP，Melman A，Christ G.(Am J Physiol 1997；272H1960-71)所述。在局部和全身給予不同劑量的不同間隙連接開啟物期間，用同一個(gè)研究組所描述的方法和技術(shù)測量陰莖反射和海綿體內(nèi)壓力?？梢钥吹疥幥o反射以及海綿體內(nèi)壓力增加25％或更多。
勃起障礙的治療可以是陰莖體局部給藥，如皮下注射，或者口服。治療可以是單一療法或者附加于此種病癥的常規(guī)治療。
糖尿病視網(wǎng)膜病可在發(fā)病后很早得到診斷，通過鑒別血流速率的改變(Bursell S-V，Clermont AC，Shiba T，King GL.(Curr Eye Res.1992；11287-95)、血-視網(wǎng)膜屏障的崩潰(Cunha-Vaz JG，F(xiàn)aria deAbrue JR，Campos AJ，F(xiàn)igo GM.(Br J Ophthalmol.1975；59649-56)，Do Carmo A，Ramos P ，Reis A，Proenca R，Cunha-Vaz JG.(Exp EyeRes.1998；67569-75))和/或自動(dòng)調(diào)節(jié)的喪失(Kohner EM，Patel V，Rassam SMB.(Diabetes 1995；44603-607))。通過示蹤物轉(zhuǎn)運(yùn)和雙細(xì)胞膜片鉗兩種技術(shù)的應(yīng)用，Oku H，Koda T，Sakagami K，Puro DG.(Invest Ophthalmol Vis Sci.2001；421915-1920)證明了廣泛的細(xì)胞到細(xì)胞偶聯(lián)。間隙連接通路的關(guān)閉破壞視網(wǎng)膜微血管的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并引起糖尿病視網(wǎng)膜血管功能障礙。Zhou ZY，Sugawara K，Hashi R，Muramoto K，Mawatari K，Matsukawa T，Liu ZW，Devadas M，KatoS.(Neuroscience.2001；102959-67)進(jìn)一步證明活性氧參與了視網(wǎng)膜間隙連接的解偶聯(lián)以及供給谷胱甘肽時(shí)的再偶聯(lián)。
間隙連接開啟物對糖尿病視網(wǎng)膜病的影響將利用如上所述鏈脲菌素誘導(dǎo)的大鼠糖尿病模型進(jìn)行體外研究。將新鮮分離的視網(wǎng)膜微血管(Sakagami K，Wu DM，Puro DG.J Physiol(Lond).1999；521637-50)轉(zhuǎn)移到蓋片上，如Oku H，Koda T，Sakagami K，Puro DG.(InvestOphthalmol VIs Sci.2001；421915-1920)所述。在這種制備物中，血管壁細(xì)胞之間的胞間通訊用染料或用示蹤物進(jìn)行測量。測試范圍在10-10-10-7M內(nèi)不同濃度的間隙連接開啟物化合物2或化合物40，在糖尿病視網(wǎng)膜中可看到與基線相比胞間通訊顯著增加。當(dāng)與對照(健康動(dòng)物)相比時(shí)可看到相似的改善。
用間隙連接開啟物治療可終止或減慢該病癥的進(jìn)展。
治療可以是全身的、局部的或口服的。
療法優(yōu)選附加于常規(guī)的抗糖尿病治療。
通過間隙連接開啟物的治療，不僅糖尿病視網(wǎng)膜病，而且視網(wǎng)膜的其它血管異常比如動(dòng)脈硬化，都將受益于改善的間隙連接通訊。間隙連接已被證明連接橫向細(xì)胞，并負(fù)責(zé)神經(jīng)元間的電偶聯(lián)(RaVIola E，Gilula NB.(Proc Natl Acad Sci USA.1975；65192-222)，Raviola E，Dacheux RF.(J Neurocytol.1990；19731-36)，Schneeweis DM，Schnapf JL.(Science 1995；2681053-56))。視桿和視錐之間通過間隙連接的暗視信號(hào)的傳輸也得以顯示(Bloofield SA，Dacheux RF.(Retinal Eye Res.2001；20351-384))。間隙連接開啟物因而不僅可以增加神經(jīng)元之間的通訊，而且還能夠繞過不太重要的視桿或視錐并依舊將暗視信號(hào)轉(zhuǎn)遞到視神經(jīng)。
間隙連接開啟物對飲食誘導(dǎo)的動(dòng)脈硬化視網(wǎng)膜病的影響將利用如上所述的大鼠模型(非糖尿病)進(jìn)行體外研究。血管壁細(xì)胞之間的胞間通訊用顯微注射后熒光黃染料轉(zhuǎn)移方法或者用FACS方法測量。測試范圍在10-10-10-7M內(nèi)不同濃度的間隙連接開啟物化合物2或化合物40，可看到與基線相比胞間通訊顯著增加。當(dāng)與對照(健康動(dòng)物)相比時(shí)可看到相似的改善。
化合物可以腸胃外給藥。
膀胱中的平滑肌以位相性收縮為特征并且表現(xiàn)出自發(fā)位相性收縮?？墒侵挥性诮】禒顩r下膀胱才能容納數(shù)百毫升的尿而不顯示出膀胱內(nèi)壓增加。與正常膀胱形成對照，不穩(wěn)定膀胱產(chǎn)生與急迫失禁相關(guān)的膀胱內(nèi)壓自發(fā)增加(Turner WH，Brading AF.(Pharmacol Therap.1997；7577-110)。與腸胃平滑肌相比，膀胱平滑肌不自發(fā)產(chǎn)生協(xié)調(diào)的收縮(Stevens RJ，Weinert JS，Publcover NG.(Am J Physiol.199；2777C448-60)，Hashitani H，F(xiàn)ukuta H，Takano H，Klemm MF，Suzuki H.(JPhysio.2001；530273-86))。膀胱平滑肌細(xì)胞之間經(jīng)由間隙連接的電和形態(tài)兩種通訊最近都得到證實(shí)(Hashitani H，F(xiàn)ukuta H，Takano H，Klemm MF，Suzuki H.(J Physio.2001；530273-86)，Wang H-Z，LeeSW，Day NS，Christ GL(Urology.2001；Suppl 6A111))。這些間隙連接的重要性通過特異性抑制通訊得到證實(shí)。膀胱平滑肌中的自發(fā)性興奮波通過間隙連接傳播。
不受控制的急迫失禁因此將通過用間隙連接開啟物治療來調(diào)節(jié)。
在取自膀胱的平滑肌細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)物中，利用FACS分析研究間隙連接開啟物治療后間隙連接通訊的改善?；衔镆詮?0-10到10-7M范圍的濃度給藥，在暴露于低氧或氧應(yīng)激的細(xì)胞培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)通訊的顯著增加。
在正常豚鼠和實(shí)驗(yàn)擾亂膀胱功能的動(dòng)物中，在用間隙連接開啟物優(yōu)選化合物2或化合物40預(yù)處理和急性處理后，測量膀胱內(nèi)壓。用苯巴比妥麻醉動(dòng)物，用一個(gè)允許水流入和流出的導(dǎo)尿管和一個(gè)帶有頂端傳感器的導(dǎo)管行膀胱插管。間隙連接開啟物不會(huì)改變正常的容量-壓力關(guān)系而在擾亂的膀胱中這種關(guān)系會(huì)被正?；?br> 給藥可以是腸胃外的、口服或進(jìn)入膀胱內(nèi)。給藥優(yōu)選是附加于旨在使膀胱肌肉收縮正?；乃幬镏委?。
頜下腺導(dǎo)管、尿道、膽管、胰管、淚腺管中存在的肌上皮細(xì)胞是以間隙連接連接的，而且胞間通訊對于肌上皮細(xì)胞收縮功能的同步化是必要的(Taugner R，Schiller A.(Cell Tissue Res.1980；20665-72)。這些導(dǎo)管中擾亂的收縮性可以通過間隙連接開啟物腸胃外或口服給藥治療而正?；?。
心臟房室結(jié)中的胞間通訊通過間隙連接維持。功能下降導(dǎo)致傳導(dǎo)降低從而可導(dǎo)致a-v傳導(dǎo)阻滯。AV傳導(dǎo)阻滯見于急性心肌梗塞、局部缺血心臟病、洋地黃中毒、鈣通道阻斷劑中毒，間隙連接開啟物可改善av傳導(dǎo)。
在精神抑制劑麻醉的小鼠中靜脈內(nèi)輸注CaCl2(100mg/kg/min)誘導(dǎo)2度av傳導(dǎo)阻滯。當(dāng)用間隙連接開啟物以10-11到10-6mol/kgi.v.的劑量預(yù)處理時(shí)，CaCl2的劑量要顯著增高才能觀察到av傳導(dǎo)阻滯。
該作用的另一個(gè)衡量是直到觀察到Cal誘導(dǎo)的2度av傳導(dǎo)阻滯前的延遲時(shí)間增加30-65％。CaCl2誘導(dǎo)av傳導(dǎo)阻滯由Ronsberg M，Saunders TK，Chan PS，Cervoni P.Med Sci.1986；14350-51)描述。
不同程度的av傳導(dǎo)阻滯增加的間隙連接通訊可以正?；痑v傳導(dǎo)并重建正常竇性節(jié)律。
間隙連接開啟物給藥可以是腸胃外或口服。
間隙連接開啟物對白內(nèi)障的效果脊椎動(dòng)物眼晶狀體為一個(gè)固體細(xì)胞囊，其在整個(gè)生命過程中通過在表面添加新的細(xì)胞而生長。較老的細(xì)胞包埋在新生一代細(xì)胞中，分化成長的棱柱狀纖維，喪失其細(xì)胞器并且在其細(xì)胞質(zhì)中充滿了高濃度的可溶性蛋白晶體蛋白。這種壽命長的晶狀體纖維彼此之間以及與晶狀體表面簡單立方上皮細(xì)胞前層之間通過間隙連接相互連接。對于小分子來說這種間隙連接網(wǎng)絡(luò)將晶狀體細(xì)胞連接成合胞體，容許代謝協(xié)作胞間離子、代謝物和水的擴(kuò)散。與晶狀體表面營養(yǎng)物相接觸的上皮細(xì)胞保有其細(xì)胞器，并能夠提供代謝能量以維持晶狀體纖維細(xì)胞質(zhì)中的正確離子和代謝物濃度，使得晶體蛋白保持在溶液中而不聚集(白內(nèi)障)。三種連接蛋白存在于晶狀體中Cx43、Cx46和Cx50，而且這些間隙連接蛋白中每一個(gè)的突變都與白內(nèi)障有關(guān)聯(lián)[79-81]。這些結(jié)果證明GJIC對于晶狀體的正常代謝和功能是必要的。因此，我們提出本發(fā)明的物質(zhì)，已知其能夠增加GJIC，可用于預(yù)防和/或治療白內(nèi)障。
由Cx46和Cx50連接蛋白形成的間隙連接通道為正常透明晶狀體中纖維細(xì)胞間的通訊提供了途徑。缺乏這些連接蛋白的敲除小鼠形成與晶體蛋白水解有關(guān)的核性內(nèi)障。這些研究確定了間隙連接通過提供細(xì)胞-細(xì)胞信號(hào)作用途徑或者適當(dāng)構(gòu)成晶狀體膜的結(jié)構(gòu)成分以及細(xì)胞質(zhì)蛋白在維持正常晶狀體透明度方面的重要性(Gong等，Cell 1997Dec 12；91(6)833-43)。增加的胞內(nèi)鈣濃度是活化鈣依賴性半胱氨酸蛋白酶Lp82的主要刺激物，Lp82是白內(nèi)障形成過程的關(guān)鍵起始物(Baruch等，J Biol Chem 2001；276(31)28999-9006)。為檢測本發(fā)明的化合物2和40預(yù)防白內(nèi)障的能力，在Churchill等(J Cell Sci 1996；109(Pt 2)355-65))所描述的培養(yǎng)的綿羊晶狀體細(xì)胞模型中測試所述化合物的效果(10-10-10-6mol/l)。簡而言之，在綿羊上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)物中利用Ca(2+)-報(bào)道染料fura-2和熒光顯微鏡研究細(xì)胞到細(xì)胞Ca2+信號(hào)作用。以微量吸液管機(jī)械刺激單個(gè)細(xì)胞啟動(dòng)胞質(zhì)游離Ca2+增加，從被刺激的細(xì)胞傳播通過2-8層周圍的細(xì)胞。我們預(yù)期本發(fā)明的化合物2和40可以增加晶狀體纖維細(xì)胞間的細(xì)胞到細(xì)胞偶聯(lián)并預(yù)防白內(nèi)障。
給藥模式是局部給予。
從而，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供化合物用于制備用以預(yù)防和/或治療白內(nèi)障的藥物。這個(gè)目的用本發(fā)明的肽化合物實(shí)現(xiàn)，例如式I到VIII、式2到12的化合物，以及本文表1和8的化合物，更具體地，本文合成實(shí)施例1-55的化合物。
間隙連接開啟物在耳病中的作用已經(jīng)在遺傳性周圍神經(jīng)病-耳聾X-連鎖的Charcot-Marie-Tooth綜合征中發(fā)現(xiàn)許多不同的Cx32突變，并且已經(jīng)在耳聾中檢測到一些Cx26和Cx31的突變[80]。因此，我們提出本發(fā)明的物質(zhì)，已知其能增加GJIC，可用于預(yù)防和/或治療與耳中GJIC受損相關(guān)的某些種類的耳聾。從而，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供化合物用于制備用以預(yù)防和/或治療與受損的GJIC相關(guān)的耳聾的藥物。這個(gè)目的用本發(fā)明的肽化合物實(shí)現(xiàn)，例如式I到VIII、式2到12的化合物，以及本文表1和8的化合物，更具體地，本文合成實(shí)施例1-55的化合物以及本文表8、表1、和式I到VIII的化合物。
間隙連接開啟物在腸道中的作用Cx43和Cx45兩者均表達(dá)于小腸壁中[82]。據(jù)信沿著小腸的深肌叢的表達(dá)Cx45的細(xì)胞可能充當(dāng)起搏系統(tǒng)的組份，它可能包括一個(gè)傳導(dǎo)系統(tǒng)，形成一個(gè)經(jīng)由特定類型的間隙連接運(yùn)作的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。在腸和結(jié)腸中，Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICC)為位于腸平滑肌之間的起搏細(xì)胞；它們產(chǎn)生平滑肌層的自發(fā)慢波并介導(dǎo)神經(jīng)傳遞。ICC三維細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)是通過ICC之間以及ICC與平滑肌細(xì)胞之間的Cx43間隙連接而連接的。在Hirschsprung病患者中，無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的腸中Cx43表達(dá)的缺乏提示ICC與平滑肌細(xì)胞間受損的胞間通訊可能是這種疾病中運(yùn)動(dòng)機(jī)能障礙的部分原因。Chagas病患者(由于原生動(dòng)物克魯斯氏錐蟲感染而致)表現(xiàn)出Cx表達(dá)顯著減少，這被認(rèn)為是形成于這些患者中所見到的心肌病和嚴(yán)重?cái)U(kuò)張的巨結(jié)腸的原因[7]。因而，ICC之間及ICC和平滑肌細(xì)胞之間的正常間隙連接通訊被認(rèn)為對于小腸和結(jié)腸的正常運(yùn)動(dòng)是必要的，所以本發(fā)明的另一目的是提供一種增加腸內(nèi)間隙連接傳導(dǎo)從而可用于治療腸胃運(yùn)動(dòng)紊亂的物質(zhì)。
生殖器官和間隙連接卵巢顆粒細(xì)胞之間以及卵母細(xì)胞與周圍顆粒細(xì)胞之間的間隙連接在卵泡發(fā)育期間起著重要作用。出生時(shí)，卵巢含有原始卵泡，其由停滯于減數(shù)分裂的被單層支持(顆粒)細(xì)胞包圍的卵母細(xì)胞組成。周期性地，原始卵泡亞群經(jīng)歷進(jìn)一步發(fā)育，其間卵母細(xì)胞大小增加而顆粒細(xì)胞增殖、分層并形成一個(gè)充滿液體的腔。排卵后，卵母細(xì)胞重新開始減數(shù)分裂而滯留在卵泡中的顆粒層細(xì)胞分化成為類固醇生成細(xì)胞，形成黃體。
間隙連接直接連接毗鄰細(xì)胞，允許離子、代謝物、及其它潛在的重要信號(hào)分子的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，以調(diào)控卵巢周期和雌性生育力。已經(jīng)證明Cx37缺失小鼠缺乏成熟(格拉夫)卵泡，無法排卵并產(chǎn)生數(shù)目眾多的不適當(dāng)?shù)狞S體，支持間隙連接對正常卵巢功能的重要作用。此外，卵母細(xì)胞發(fā)育停滯在獲得減數(shù)分裂能力之前。因而，通過胞間通道的細(xì)胞-細(xì)胞信號(hào)作用精密地調(diào)控成功卵子發(fā)生和排卵所需的高度協(xié)調(diào)的細(xì)胞相互作用[84]。
促卵泡激素(FSH)是卵泡生長和發(fā)育的主要調(diào)節(jié)物。除了其對卵泡成熟的許多作用之外，F(xiàn)SH改善顆粒細(xì)胞之間的細(xì)胞到細(xì)胞偶聯(lián)并且它增加Cx43基因表達(dá)，而且可能促進(jìn)形成新的間隙連接。相反的，促黃體生成激素(LH)中斷卵泡內(nèi)細(xì)胞到細(xì)胞的通訊，導(dǎo)致卵母細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度的下降緊接著是減數(shù)分裂的恢復(fù)[86]。
這些數(shù)據(jù)說明通過Cx37和Cx43的正常間隙連接通訊的存在對正常卵泡生長和排卵是必要的。從而，很可能某些形式的雌性不育歸因于卵巢中細(xì)胞到細(xì)胞偶聯(lián)差。所以，增加細(xì)胞到細(xì)胞偶聯(lián)的物質(zhì)可用于治療卵巢間隙連接功能表達(dá)和/或調(diào)控受損的婦女的雌性不育。本發(fā)明具有增加GJIC能力的化合物可用于治療因卵巢中細(xì)胞到細(xì)胞偶聯(lián)差所致的雌性不育。
子宮子宮在分娩時(shí)強(qiáng)有力的同步收縮依賴于子宮肌層平滑肌細(xì)胞通過間隙連接的電偶聯(lián)。在人和其它哺乳動(dòng)物中，非孕子宮肌層中缺乏間隙連接，但是到足月時(shí)和/或分娩發(fā)動(dòng)時(shí)間隙連接變得充足。人子宮肌層平滑肌細(xì)胞表達(dá)的主要間隙連接蛋白為Cx43，但是在人子宮肌層中也鑒定Cx26、Cx40和Cx45[87；88]。
由于分娩期間協(xié)調(diào)的肌肉收縮的重要性，本發(fā)明的另一目的是提供增加子宮肌層中細(xì)胞到細(xì)胞偶聯(lián)的物質(zhì)，預(yù)期它對肌肉收縮的同步化具有正面影響，并且所述物質(zhì)可與催產(chǎn)素一起使用以誘導(dǎo)和易化分娩。所述目的用本發(fā)明的肽化合物實(shí)現(xiàn)，例如式I到VIII、式2到12的化合物，以及本文表1和8的化合物，更具體地，本文合成實(shí)施例1-55的化合物以及本文表8、表1、和式I到VIII的化合物，而且本發(fā)明進(jìn)一步涉及本發(fā)明的肽化合物用于制備誘導(dǎo)和易化分娩的藥物的用途。
Huidobro-Toro JP，Gonzalez R，Varas JA，Rahmer A，Gonzalez R.(Rev Med Chil 2001 Oct；129(10)1105-12)評估了與人胎盤血管節(jié)律性運(yùn)動(dòng)活性有關(guān)的起搏機(jī)制的存在，并且發(fā)現(xiàn)間隙連接的阻斷減少了自發(fā)收縮的頻率和幅度。他們得出結(jié)論，絨毛和臍帶血管環(huán)層中的節(jié)律收縮是由位于血管平滑肌環(huán)層中的起搏細(xì)胞觸發(fā)的，并且經(jīng)由間隙連接傳播；它們或許有助于對血流的控制。從而，本發(fā)明的另一目的是提供增加胎盤血管中細(xì)胞到細(xì)胞偶聯(lián)的物質(zhì)，預(yù)期它對胎盤血液循環(huán)和胎兒的發(fā)育具有正面影響。所述目的用本發(fā)明的肽化合物實(shí)現(xiàn)，例如式I到VIII、式2到12的化合物，以及本文表1和8的化合物，更具體地，本文合成實(shí)施例1-55的化合物以及本文表8、表1和式I到VII的化合物，而且本發(fā)明進(jìn)一步涉及本發(fā)明的肽化合物用于制備可用以治療胎盤血液循環(huán)減少的藥物的用途。
雄性生殖器官Cx43是睪丸中最豐富的連接蛋白，有趣的是，Cx43表達(dá)減少的大鼠品系精子發(fā)生受損(ebo/ebo，jun-d-/-，Cx43+/-小鼠)[89]。而且，早期的工作提示低或無精子患者睪丸中的間隙連接減少[90]。這些數(shù)據(jù)支持睪丸細(xì)胞到細(xì)胞偶聯(lián)的減少可導(dǎo)致雄性不育的想法，因而本發(fā)明的另一目的是提供增加細(xì)胞到細(xì)胞偶聯(lián)的物質(zhì)，并且從而可能是有用的治療與削弱的細(xì)胞到細(xì)胞偶聯(lián)相關(guān)的雄性不育的治療劑。
間隙連接在胰腺中的作用由Cx43構(gòu)成的間隙連接通道功能性地偶聯(lián)胰島以及大鼠胰島瘤細(xì)胞系的葡萄糖敏感細(xì)胞[91]。與之相對照，幾種異常分泌胰島素的細(xì)胞系的細(xì)胞并不表達(dá)Cx43，間隙連接很少，而且偶聯(lián)貧乏。通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Cx43 cDNA矯正這些缺陷后，細(xì)胞表達(dá)適度水平的Cx43及偶聯(lián)，如在天然β-細(xì)胞中觀察到的，與野生型(未偶聯(lián))細(xì)胞和過度表達(dá)Cx43的轉(zhuǎn)染細(xì)胞中所觀察到的相比，表現(xiàn)出胰島素基因表達(dá)和胰島素含量的顯著升高。這些發(fā)現(xiàn)說明Cx43的恰當(dāng)偶聯(lián)是適當(dāng)產(chǎn)生和貯存胰島素所需的[91]。此外，格列本脲在體內(nèi)刺激胰島素釋放與胰島內(nèi)Cx43表達(dá)增加和鄰近β-細(xì)胞之間細(xì)胞到細(xì)胞偶聯(lián)增加有關(guān)[92]。
為檢測化合物2和化合物40對非胰島素依賴型糖尿病的影響，采用6-16周齡的db/db。動(dòng)物圈養(yǎng)(3只小鼠/籠)于受控制的環(huán)境條件下(20℃，55-75％濕度)，遵循12/12小時(shí)的光/暗周期循環(huán)，早上6點(diǎn)開始光照。供應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)Altromin No.1324飲食，自由飲用自來水。所有的動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境至少一周，并在第一次口服葡萄糖耐受試驗(yàn)前每天進(jìn)行處置共2天。而且為減少應(yīng)激誘導(dǎo)的葡萄糖偏移，實(shí)驗(yàn)前使動(dòng)物經(jīng)歷至少一次不含如下所述化合物的口服葡萄糖耐受試驗(yàn)。
將肽溶解于含有0.1％牛白蛋白的0.1M磷酸緩沖鹽水(PBS)中，其中pH通過加入5M NaOH調(diào)節(jié)至7.4。所有溶液在當(dāng)天早上實(shí)驗(yàn)開始前現(xiàn)用現(xiàn)配?；衔镆?0-10-10-6mol/kg的劑量腸胃外給予。載體處理的動(dòng)物僅給予含0.1％白蛋白的PBS。
葡萄糖耐受試驗(yàn)前動(dòng)物禁食17小時(shí)。上午9點(diǎn)起從尾尖取血(t＝-15分)并測量血糖。全血葡萄糖(mM)濃度用一滴血液通過固定化葡萄糖氧化酶方法分析(＜5ml，Elite Autoanalyser，Bayer，丹麥)。排除實(shí)驗(yàn)當(dāng)天早晨血糖嚴(yán)重升高的動(dòng)物(＞10.5mM)。初始血樣后動(dòng)物立即接受腹膜內(nèi)注射載體或不同劑量的化合物。腹膜內(nèi)給予該物質(zhì)后15分鐘，p.o.或i.p.給予一劑溶解于水中的1g/kg葡萄糖(200ml/50g體重)，動(dòng)物返回籠中(t＝0)。在t＝30分鐘，t＝60分鐘，t＝120分鐘及t＝240分鐘時(shí)測量血糖水平。動(dòng)物在觀察期間保持禁食。
為了分析化合物對葡萄糖耐受的影響，對葡萄糖負(fù)荷后每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)計(jì)算與基線(t＝0)的絕對和相對血糖差值。整個(gè)實(shí)驗(yàn)(AUC0-240分鐘)的曲線下面積(AUC)利用梯形方法測定。這樣，產(chǎn)生了兩組AUC0-240分鐘值，一組基于絕對血糖數(shù)值(單位mM×分鐘)而一組基于血糖相對變化(單位％×分鐘)。
我們預(yù)測本發(fā)明的化合物2和40，作為對db/db小鼠葡萄糖負(fù)荷的應(yīng)答，將減少血糖水平的增加。
給藥可以是口服或腸胃外。
這些發(fā)現(xiàn)顯示胰島β-細(xì)胞之間間隙連接偶聯(lián)對于胰島素產(chǎn)生和釋放的重要作用。從而，本發(fā)明的另一目的是提供增加間隙連接胞間通訊和/或間隙連接電傳導(dǎo)，并且從而改善非胰島素依賴型糖尿病患者的葡萄糖耐受的物質(zhì)。所述目的用本發(fā)明的肽化合物實(shí)現(xiàn)，例如例如式I到VIII、式2到12的化合物，以及本文表1和8的化合物，更具體地本文合成實(shí)施例1-55的化合物。
此外，Ito T，Ogoshi K，Nakano I，Ueda F，Sakai H，Kinjo M，Nawata H(Pancreas 1997 Oct 15297-303)發(fā)現(xiàn)了在蛙皮縮膽囊肽-誘導(dǎo)的大鼠急性胰腺炎中伊索格拉定對間隙連接的影響。在正常胰腺腺泡細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)經(jīng)由間隙連接的胞間通訊(IC)能力，并且用一種經(jīng)由間隙連接的IC增強(qiáng)劑伊索格拉定研究了IC在蛙皮縮膽囊肽(Cn)誘導(dǎo)的大鼠急性胰腺炎中的作用。在大鼠中通過兩次腹膜內(nèi)注射40μg/kg Cn誘導(dǎo)急性水腫胰腺炎。在第一次Cn注射前15和2小時(shí)，大鼠口服接受多種不同劑量的伊索格拉定(25、50或100mg/kg體重)。正常對照組僅接受載體。在第一次Cn注射后5小時(shí)，用酶學(xué)和組織學(xué)方法評估胰腺炎的嚴(yán)重程度。在Cn誘導(dǎo)的急性胰腺炎中，伊索格拉定以一種劑量依賴性方式顯著減低血清淀粉酶水平、胰腺濕重、以及胰腺淀粉酶和DNA含量。特別是，淀粉酶含量改善至正常對照的水平。組織學(xué)上，通過伊索格拉定處理，胰腺炎的嚴(yán)重程度顯著下降，并且在用100mg/kg伊索格拉定處理的組中看不到可辨認(rèn)的空泡形成。用抗-連接蛋白32(Cx32；一種間隙連接蛋白)抗體對胰腺進(jìn)行免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)對照組中胰腺腺泡呈廣泛Cx32陽性，但是在胰腺炎組中Cx32-陽性顆粒的數(shù)目顯著下降至19％。用100mg/kg伊索格拉定處理，Cx32顆粒的數(shù)目恢復(fù)到正常對照值的70％。這些發(fā)現(xiàn)顯示經(jīng)由間隙連接的IC在Cn-誘導(dǎo)的胰腺炎中被擾亂，其可能導(dǎo)致組織穩(wěn)態(tài)的崩潰和急性胰腺炎的進(jìn)展。
因此，本文所述的肽可用于治療胰腺炎。為證實(shí)這一陳述，可以利用前文Ito T等2001年的大體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行大鼠實(shí)驗(yàn)，以10-11-10-8M范圍的濃度對大鼠給予化合物2和化合物40。這些實(shí)驗(yàn)預(yù)期會(huì)顯示化合物2和化合物40對間隙連接偶聯(lián)的促進(jìn)作用并抵消蛙皮縮膽囊肽的效應(yīng)。
肽的給藥可以是靜脈內(nèi)。
間隙連接開啟物(抗心律失常肽)在血栓形成中的作用與本發(fā)明的物質(zhì)緊密相關(guān)的兩種肽的抗血栓形成活性早先已經(jīng)被表明具有抗血栓形成活性。對此，Dikshit等[15]發(fā)現(xiàn)肽Gly-Pro-Prp-Gly-Ala-Gly和Gly-Pro-Gly-Gly-Ala-Gly可阻止給予了i.v.劑量的膠原和腎上腺素的小鼠發(fā)生肺栓塞。US 4,775,743公開了AAP的一種肽衍生物HP5具有序列N-3-(4-羥基苯基)丙酰-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH并能有效對抗血小板凝集。本發(fā)明的化合物與之具有驚人的相似性，很可能它們可對血栓形成表現(xiàn)出相似的效應(yīng)。因而，本發(fā)明的物質(zhì)可用于預(yù)防血栓形成。
免疫學(xué)細(xì)胞到細(xì)胞相互作用對于淋巴細(xì)胞成熟和活化是至關(guān)重要的。多種膜分子確保胞間粘附并使得在免疫系統(tǒng)中細(xì)胞遷移和活化期間能夠進(jìn)行細(xì)胞-細(xì)胞信號(hào)作用。循環(huán)的人T、B和NK淋巴細(xì)胞表達(dá)Cx43，并且利用如先前所描述的染料方法證明了細(xì)胞之間的活性間隙連接。還已經(jīng)證明胞間間隙連接偶聯(lián)的減少顯著降低IgM、IgG和IgA的分泌，表明穿過間隙連接的胞間信號(hào)作用是免疫系統(tǒng)代謝協(xié)作機(jī)制的一個(gè)重要組成成分(Ovoiedo-Orta E，Hoy T，Evans WH.(Immunology.2000；99578-90)，Oviedo-Orta E，Gasque P，Evans WH.(FASEB.2001；15768-774))。
在亞慢性或慢性炎癥中，不依賴于病原學(xué)，需要免疫球蛋白合成的局部增加。組織在炎癥期間通常與正常健康組織不同，而低氧張力造成胞間間隙連接通訊的解偶聯(lián)(低氧對GJIC解偶聯(lián)的重要性已在多種不同的細(xì)胞系統(tǒng)中證明，表明氧張力是GJIC的普遍調(diào)節(jié)物)。
在新生大鼠心室心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)物中，剝奪氧和葡萄糖導(dǎo)致去甲腎上腺素-誘導(dǎo)的對磷酸肌醇(PI)周轉(zhuǎn)的刺激下降至正常大氣和營養(yǎng)條件下水平的約50％。間隙連接修飾物化合物2已表明可在氧和葡萄糖剝奪期間正?；@種削弱的去甲腎上腺素-誘導(dǎo)的對PI周轉(zhuǎn)的刺激，提高PI周轉(zhuǎn)至正常水平的大約90％。而且還表明在正常大氣和營養(yǎng)條件下化合物2不改變?nèi)ゼ啄I上腺素-誘導(dǎo)的PI周轉(zhuǎn)水平(Meier，E和Beck，M MZS42-0123 enhances norepinephrine(NE)-inducedphosphoinositol(PI)turnover in cultured cardiomyocytes duringmetabolic stress.2001 International Gap Junction Conference，Aug4-9，2001，Hawaii，USA，abstract no.132)。同樣的，在培養(yǎng)的人成骨細(xì)胞培養(yǎng)物和成骨細(xì)胞性大鼠骨肉瘤細(xì)胞系中，缺氧減少胞內(nèi)鈣波傳播，如在熒光黃注射后由染料轉(zhuǎn)移所測量的。這種減少可以通過用化合物2處理而完全逆轉(zhuǎn)(Teilmann，S C，Henriksen，Z，Meier，E，Petersen，JS，Srensen，O H和Jorgensen，N RThe gap junction openerZS42-0123 enhances intercelluar communication in osteoblastic cell.2001 International Gap Junction Conference，Aug 4-9，2001，Hawaii，USA，abstract no.176)。
由于炎癥期間的細(xì)胞解偶聯(lián)，間隙連接開啟物將改善炎癥期間免疫球蛋白的合成。
間隙連接開啟物對免疫球蛋白合成的作用的體外測試在分離自人扁桃體并如Oviedo-Orta E，Gasque P，Evans WH.所述(FASEB.2001；15768774))純化的刺激和未刺激的T和B淋巴細(xì)胞中進(jìn)行。通過ELISA檢測免疫球蛋白并通過FACS分析間隙連接。間隙連接開啟物的測試濃度從10-10到10-7M。
體內(nèi)藥理學(xué)測試在非感染性和感染性模型兩種實(shí)驗(yàn)性炎癥模型中進(jìn)行。體內(nèi)藥理學(xué)測試可在一系列動(dòng)物模型中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)1)對角叉藻聚糖誘導(dǎo)的大鼠后爪水腫(爪體積)的抑制，2)減輕角叉藻聚糖-誘導(dǎo)的大鼠細(xì)胞募集到氣囊(白血球募集和分泌量)，3)減輕鏈球菌細(xì)胞壁(SCW)-誘導(dǎo)的大鼠脛跗骨關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)炎(踝腫脹)，以及4)減輕膠原-誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎(臨床體征和關(guān)節(jié)腫脹)的進(jìn)展。
Ye P，Chapple CC，Kumar RK及Hunter N(J Pathol 19258；2000 Sep)表明在發(fā)炎齒齦內(nèi)襯上皮細(xì)胞中連接蛋白26和43的驚人減少，支持上皮細(xì)胞作為防御微生物產(chǎn)物進(jìn)入組織的有效屏障的能力在牙周炎中嚴(yán)重受損的觀點(diǎn)。因而，用間隙連接開啟物治療發(fā)炎齒齦，舉例來說，與抗生素聯(lián)合，在恢復(fù)GJIC和上皮愈合方面可能是有利的。
周圍神經(jīng)病和神經(jīng)病性疼痛如在糖尿病、透析期間、肝硬化及許多其它病癥中所看到的周圍神經(jīng)病和疼痛據(jù)報(bào)道既涉及體神經(jīng)又涉及自主神經(jīng)。在多種病癥中的外周神經(jīng)損傷的確切機(jī)制仍然是推測性的，但是已經(jīng)描述了神經(jīng)末梢破壞、傳導(dǎo)性下降、脫髓鞘、以及炎癥反應(yīng)增加。在實(shí)驗(yàn)設(shè)置下各種病癥的共同之處是觀察到增加的自由基、增加的氧化氮、氧應(yīng)激及自由基清除劑的缺乏，而且記錄到間隙連接通訊的減少(Pitre DA，SeifertJL，Bauer JA(Neurosci Lett.2001；3036771)，Bolanos JP，MedinaJM.(J Neurochem.1996；662019-9)，Low PA，Nickander，KK.(Diabetes.1991；40873-7)，Levy D，Hoke A，Zochone DW.(NeurosciLett.1999；260207-9)，Bruzzone R，Ressot C.J Eur Neurosci.1997；91-6))。
體外研究在大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞或施萬細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行，并且在氧化氮應(yīng)激細(xì)胞中如Bolanos JP，Medina JM.所述測試間隙連接開啟物，例如化合物2和化合物40(J Neurochem.1996；662019-9)，利用硝普鈉作為氧化氮供體(Blasits S，Maune S，Santos-Sacchi J.(Phlugers Arch.2000；440710-12))。化合物的濃度在10-10和10-7M范圍內(nèi)，并用FACS分析測量劑量依賴性間隙連接開啟。
給藥是腸胃外的。
聽力缺陷噪聲誘發(fā)的聽力喪失、老年性耳聾已知與自由基的產(chǎn)生相關(guān)，與耳蝸柯替氏器中的Hensen細(xì)胞以及Deiters細(xì)胞之間的間隙連接偶聯(lián)的抑制有關(guān)(Todt I，Ngezahayo A，Ernst A，Kolb H-A.(J MembraneBiol.2001；181107-114)，Blasits S，Maune S，Santos-Sacchi J.(Phlugers Arch.2000；440710-12)Lagostena L，Ashmore JF，KacharB.(J Physio.2001；531693707))。這些支持耳蝸細(xì)胞間的間隙連接通訊為感覺細(xì)胞提供了重要的穩(wěn)態(tài)平衡從而使外毛細(xì)胞的神經(jīng)元活性正常(Johnstone BM，Pantuzzi R，Syka J，Sykova E.(J Physiol 1989；40877 92))。這種通訊在氧化應(yīng)激期間被破壞(Todt I，Ngezahayo A，Ernst A，Kolb H-A.(J Membrane Biol.2001；181107-114)。獲得性的或年齡依賴性的聽力喪失當(dāng)用能夠維持支持細(xì)胞間隙連接通訊的化合物治療時(shí)可以被阻止。
對間隙連接開啟物的體外測試可以在來自豚鼠的Hensen細(xì)胞中進(jìn)行，如Todt I，Ngezahayo A，Ernst A，Kolb H-A.(J Membrane Biol.2001；181107-114)所述。對濃度范圍在10-10-10-8M的化合物2或化合物40進(jìn)行研究，研究它們對氧應(yīng)激和機(jī)械應(yīng)激條件的影響。所述化合物可顯著對抗所誘導(dǎo)的間隙連接解偶聯(lián)。
靜脈輸注化合物2的大鼠經(jīng)受失真產(chǎn)物耳元音發(fā)射(DPOAE)測試。將兩個(gè)頻率接近的正弦波音調(diào)(f1和f2)同時(shí)呈放給耳朵。從內(nèi)耳發(fā)射的聲音由外毛細(xì)胞產(chǎn)生的失真產(chǎn)物組成。這些失真產(chǎn)物中最強(qiáng)的通常在2f1-f2頻率。例如，如果所用的音調(diào)是在1000Hz(f1)和1200Hz(f2)，最強(qiáng)的失真產(chǎn)物將在2×1000-1200，或800Hz。與兩個(gè)正弦波相比，失真產(chǎn)物的相對強(qiáng)度可用來評估外毛細(xì)胞的完整性。
化合物為腸胃外給藥。
前庭器官暗細(xì)胞區(qū)域的黑素細(xì)胞經(jīng)由間隙連接發(fā)生大量通訊，可能在內(nèi)淋巴和外淋巴之間的物質(zhì)運(yùn)輸中起作用，而且在維持內(nèi)耳的微環(huán)境穩(wěn)態(tài)平衡方面具有重要性(Masuda M，Usami S-I，Yamazaki K，Takumi Y，Shinkawa H，Kurashima K.(Anat Rec.2001；262；137-146))。內(nèi)淋巴積水與表現(xiàn)出眩暈和聽力下降特征的多種不同的臨床病癥相關(guān)。間隙連接通訊能力下降可能對于調(diào)控原本分泌的或由特定類型的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白排泄的若干物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸很重要。
年齡依賴性貧血和骨髓移植造血微環(huán)境中造血祖細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞之間功能性間隙連接的存在多年來都是有爭議的，但是研究現(xiàn)已證實(shí)了人間隙連接通訊的存在(Rosendaal M，Gregan A，Green C.Tissue Cell.1991；23457-470)，Durig J，Rosenthal C，Halfmeyer K，Wiemann M，Novotny J，Bingmann D，Duhrsen U，Schirrmacher K.(Brit J Haematol.2000；111416-25))。還已經(jīng)證明這種通訊是雙向的，支持基質(zhì)細(xì)胞控制造血祖細(xì)胞的增生行為，但同時(shí)它們的功能狀態(tài)可受到未成熟造血細(xì)胞調(diào)控的假說(Gupta P，Blazar B，Gupta K，Verfaillie C.(Blood.1998；913724-3733))。
隨著年齡，造血組織的功能下降，貧血常見于老年人。
造血組織能力的下降還見于血液系統(tǒng)惡性腫瘤以及化學(xué)療法治療后。來自供體的骨髓移植用來預(yù)防全血細(xì)胞減少。
在預(yù)處理的暴露于高劑量環(huán)磷酰胺的大鼠中研究易化間隙連接通訊的化合物的效果。這些動(dòng)物中骨髓停止產(chǎn)生成熟造血細(xì)胞。在用間隙連接開啟物化合物2以大約為100μl 10-10M到大約10-8M化合物2的劑量預(yù)處理的動(dòng)物中，在環(huán)磷酰胺后不同時(shí)間間隔的網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)目會(huì)顯著高于未經(jīng)預(yù)處理的動(dòng)物。
藥物可經(jīng)腸胃外給予。
垂體和下丘腦功能減退來自于垂體前葉的激素的分泌表現(xiàn)出近似晝夜節(jié)律的變動(dòng)(分鐘、小時(shí)、天和季節(jié)之中)。神經(jīng)系統(tǒng)中負(fù)責(zé)大多數(shù)晝夜節(jié)律的部分定位于下丘腦中公知為交叉上核的一對結(jié)構(gòu)。在此中心這種生物鐘是個(gè)體細(xì)胞內(nèi)在所固有的。不過協(xié)同的電活性經(jīng)由間隙連接通訊介導(dǎo)至鄰近細(xì)胞(Colwell CS.(J Neurobiol.2000；43379-88))。還因?yàn)榇贵w前葉缺乏直接的神經(jīng)支配，該腺體內(nèi)間隙連接介導(dǎo)的細(xì)胞到細(xì)胞通訊對于確保適宜和及時(shí)的激素分泌所必需的恰當(dāng)?shù)募?xì)胞到細(xì)胞協(xié)同和同步化來說肯定是必不可少的(Vitale ML，Cardin J，Gilula NB，Carbajal ME，Pelletier R-M.(Biol Reporo.2001；64625-633))。Guerineau NC，Bonnefont X，Stoeckel L，Mollard P.(J Biol Chem.1998；27310389-95)得出的結(jié)論是自發(fā)有活性的內(nèi)分泌細(xì)胞要么是單個(gè)的單元，要么是排列成散布在整個(gè)垂體前葉中的同步化間隙連接-偶聯(lián)的集群?？勺园l(fā)興奮的細(xì)胞間的同步可有助于塑造基礎(chǔ)分泌的模式。來自于垂體前葉的生長激素、催乳素、腎上腺皮質(zhì)激素、甲狀腺激素以及促性腺激素在下丘腦刺激激素的控制下被合成。復(fù)雜的下丘腦-垂體-內(nèi)分泌腺軸之一的節(jié)律紊亂的一種機(jī)制因而也與經(jīng)由間隙連接通訊的減少有關(guān)。所述疾病是尿崩癥、促性腺激素不足性性腺功能減退、粘液性水腫、腎上腺皮質(zhì)功能減退以及矮小。用間隙連接開啟物治療將改善這些癥狀。
此外下丘腦交叉上核的神經(jīng)元也有賴于最佳的間隙連接通訊。在上文提及的軸中，具有在該區(qū)域中作用模式的間隙連接開啟物還可有益于晝夜節(jié)律擾亂的患者(Shinohara K，F(xiàn)unabashi T，Mitsishiba D，Kimura F.(NeuSosci Lett.2000；286107-10)。
腎血管性高血壓和腎中毒腎臟及內(nèi)皮特異性間隙連接廣泛分布于腎臟，發(fā)現(xiàn)于腎小球、腎小管及血管系統(tǒng)包括腎小球內(nèi)毛細(xì)血管和腎小球旁小動(dòng)脈中(Haefliger J-A，Demotz S，Braissant O，Suter E.(Kidney Int.2001；60190201))。在那項(xiàng)研究中作者證實(shí)了連接入球小動(dòng)脈腎素-分泌細(xì)胞的間隙連接的存在。間隙連接的作用可有助于發(fā)現(xiàn)和傳播血液攜載的信號(hào)，例如那些由升高的血壓發(fā)起的信號(hào)。在腎臟內(nèi)，這樣的信號(hào)需要被入球小動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化成自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌刺激，然后傳遞給腎素-分泌細(xì)胞。因而間隙連接通訊在形成相互連接的腎小球旁復(fù)合體方面扮演著重要角色。間隙連接通道開啟到關(guān)閉的迅速轉(zhuǎn)換進(jìn)一步暗示了對局部血管變化的易于反應(yīng)，以確保匹配腎小球和腎小管功能所需的連續(xù)反饋以及根據(jù)生理需要的腎素分泌。特征在于削弱的腎間隙連接通訊的疾病可獲益于特定間隙連接開啟物口服或腸胃外給藥治療。
重金屬是腎毒性的并導(dǎo)致腎損傷。已經(jīng)證明毒性金屬鎘(Fukumoto M，Kujiraoka T，Hara M，Shibasaki T，Hosoya T，YoshidaM.(Life Sciences.2001；69247-54))和汞(Yoshida M，Kujiraoka T，Hara M，Nakazawas H，Sumi Y.(Arch Toxicol.1998；72192-96))在來自大鼠近端小管的原代細(xì)胞培養(yǎng)物中使間隙連接解偶聯(lián)，而且兩個(gè)組都提示腎臟功能障礙與減少的胞間通訊有關(guān)。
用間隙連接開啟物治療重金屬中毒可減少組織損傷并阻止進(jìn)行性的組織毀壞。
在來自腎小管細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行體外測試，并研究在暴露于重金屬時(shí)化合物(濃度大約10-10-10-7M的化合物2或化合物40)對間隙連接解偶聯(lián)的預(yù)防。間隙連接通訊如先前所描述用熒光染料方法檢測。
向試驗(yàn)動(dòng)物(大鼠)全身給予重金屬后，利用3H-胰島素作為腎小球?yàn)V過率的清除標(biāo)記、14C-標(biāo)記的四乙銨作為腎血漿流量的清除標(biāo)記、以及鋰作為近端小管功能的標(biāo)記(Petersen JS，Schalmi M，Lam HR，Christensen S，J.Pharmacol.Esp.Ther.1991，2581-7)在重金屬持續(xù)處理前和處理后的不同時(shí)間來測量腎功能。腎功能受到危害時(shí)可開始用特定間隙連接開啟物如化合物2持續(xù)處理，隨著處理進(jìn)行可看到腎功能參數(shù)(腎小球?yàn)V過率和血壓)的顯著改善。
化合物可經(jīng)腸胃外給藥。
非感染性炎癥和不同微生物所致的感染誘導(dǎo)腎功能顯著的非特異性慢性變化，也表現(xiàn)出腎小球?yàn)V過率減少、電解質(zhì)和水排泄下降以及血壓的變化等特征。這些癥狀中的一些也可以用特定的間隙連接開啟物治療，癥狀會(huì)減退。
牙齒的發(fā)育和重塑Murakami S和Muramatsu T(Anat Embryo.2001；203367-374)證實(shí)先前的研究，即間隙連接通訊存在于成牙質(zhì)細(xì)胞之間，而且細(xì)胞活性通過這些胞間橋得以協(xié)調(diào)(Iguchi Y，Yamamura T，Ichikawa T，Hashomot O S，Houriuchi T，Shimono M.(Arch Oral Biol.1984；29489-497))但在他們最近的研究中，他們還證明這些間隙連接通訊存在于牙齒早期發(fā)育期間(前-成牙質(zhì)細(xì)胞)以及成牙本質(zhì)細(xì)胞中的年輕和老齡成牙質(zhì)細(xì)胞中。而成牙質(zhì)細(xì)胞之下的髓細(xì)胞也同樣具有間隙連接。這些發(fā)現(xiàn)表明胞間間隙連接通訊在牙齒發(fā)育期間以及牙齒重塑或被蟲蛀的生命周期中都很重要。
用間隙連接開啟物治療可使牙齒擾亂的發(fā)育正?；?。治療還可以促進(jìn)牙齒重塑并令牙齒對齲更具抗性。
可在體外與本文描述的成骨細(xì)胞試驗(yàn)基本相當(dāng)?shù)脑囼?yàn)中測試本發(fā)明的間隙連接易化化合物，例如化合物2，對成牙質(zhì)細(xì)胞胞間通訊的影響作用。
干細(xì)胞Lumelsky等(2001)由小鼠胚胎干細(xì)胞生成了表達(dá)胰島素和其它胰腺內(nèi)分泌激素的細(xì)胞(Nadya Lumelsky，Olivier Blondel，Pascal Laeng，Ivan Velasco，Rea Ravin，Ron McKayDifferentiation of Stem cells toInsulin-Secreting Structures Similar to Pancreatic Islets.Scienee，292，1389-1394，2001)。細(xì)胞自組裝形成與正常胰島形態(tài)相似的三維簇群，其中胰腺細(xì)胞類型與神經(jīng)元緊密相聯(lián)。葡萄糖觸發(fā)這些細(xì)胞簇釋放胰島素，其機(jī)制與體內(nèi)采用的類似。當(dāng)注射到糖尿病小鼠中時(shí)，胰島素生成細(xì)胞經(jīng)歷迅速的血管化作用，并維持一個(gè)簇集的、胰島樣的結(jié)構(gòu)。
在臨床情境中，這種基于胚胎干細(xì)胞的系統(tǒng)可以同時(shí)生成胰島素分泌細(xì)胞及其它已知在調(diào)節(jié)胰島素分泌中具有重要作用的胰島細(xì)胞類型并將其裝配成功能性結(jié)構(gòu)單元。這些單元可提供材料以優(yōu)化胰島素產(chǎn)生和分析葡萄糖穩(wěn)態(tài)平衡的精細(xì)調(diào)控。胚胎干細(xì)胞對于這些研究是理想的，因?yàn)榭捎眠z傳工具來定義胰島發(fā)育和功能的分子基礎(chǔ)。基于細(xì)胞的治療的可能性顯然是涉及人類和非人類胚胎干細(xì)胞及胚胎生殖細(xì)胞應(yīng)用的一個(gè)誘人目標(biāo)。成人組織同樣可以成為功能性胰腺細(xì)胞的一個(gè)有用來源。這里所描述的分化系統(tǒng)可為糖尿病治療提供功能性胰島來源。據(jù)我們所知，這是表明幾種內(nèi)分泌胰腺細(xì)胞類型可在體外自胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生的首次報(bào)道。盡管獲自尸體的胰島移植后可在肝臟中行使功能，組織排斥及可得到性問題仍有待解決。顯然改造胚胎干細(xì)胞以產(chǎn)生移植用的免疫相容性組織的充足來源對于克服有關(guān)糖尿病的這樣和那樣的問題持有越來越多的希望。
心肌梗塞導(dǎo)致組織損失和心臟性能受損。余下的肌細(xì)胞不能夠重建壞死組織，而梗塞后的心臟隨時(shí)間進(jìn)一步惡化。靶器官的損傷由遠(yuǎn)處的干細(xì)胞感知，其遷移到損傷部位并經(jīng)歷交替的干細(xì)胞分化；這些事件促進(jìn)結(jié)構(gòu)和功能修復(fù)。這種高度的干細(xì)胞可塑性促使Orlic等(Orlic，D，kajstura，J，Chimenti，S，Jakoniuk，I，Anderson，S M，Li，B，Pickel，J，McKay，R，Nadal-Ginard，B，Bodine，DM，Leri，A及Anversa，PBone marrow cells regenerate infarcted myocardium.Nature 410，701-705(2001))測試梗塞小鼠中死亡的心肌是否可通過移植骨髓細(xì)胞得以恢復(fù)。他們通過熒光激活細(xì)胞分選術(shù)，在c-kit表達(dá)的基礎(chǔ)上，從表達(dá)增強(qiáng)的綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠中挑選親緣-陰性的(Lin-)骨髓細(xì)胞。冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后立刻將Lin-c-kitPOS細(xì)胞注射入接近梗塞的收縮壁。他們發(fā)現(xiàn)移植骨髓細(xì)胞后9天新形成的心肌占心室梗塞部分的68％。發(fā)育中的組織包括增生的肌細(xì)胞和血管結(jié)構(gòu)。他們的研究顯示局部遞送骨髓細(xì)胞可以重新產(chǎn)生心肌，改善冠狀動(dòng)脈疾病的結(jié)果。
為進(jìn)一步表征這些肌細(xì)胞的特性，他們測定了連接蛋白43的表達(dá)。這個(gè)蛋白通過在肌細(xì)胞之間產(chǎn)生質(zhì)膜通道，負(fù)責(zé)胞間連接和電偶聯(lián)；在細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中和緊密排列的分化細(xì)胞的表面，連接蛋白43很明顯。這些結(jié)果與預(yù)期的心肌表型的功能勝任性一致。
既然功能細(xì)胞產(chǎn)生于胚胎干細(xì)胞，并且既然連接蛋白確實(shí)在心臟梗塞組織的這些細(xì)胞中表達(dá)，我們假定對于其它由胚胎干細(xì)胞分化而來的細(xì)胞也是這種情況。由于連接蛋白在這些組織的功能中起著主要的作用(包括胰腺β細(xì)胞和心肌細(xì)胞)，我們進(jìn)一步假定化合物如化合物2和化合物40通過增強(qiáng)間隙連接偶聯(lián)可以促進(jìn)移植入干細(xì)胞的器官中的胚胎干細(xì)胞增殖為有功能細(xì)胞。
由此我們主張間隙連接開啟物象化合物2和化合物40可刺激干細(xì)胞轉(zhuǎn)變成功能性細(xì)胞，在移植器官例如胰臟中治療糖尿病、在心臟中治療心臟梗塞、以及在腦部基底神經(jīng)節(jié)中治療帕金森病。
為證實(shí)這一陳述，可以利用前文Orlic等所描述的心肌梗塞的大體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(Nature 410，701-705(2001))，在增殖過程中重復(fù)給予化合物2和化合物40。這些實(shí)驗(yàn)預(yù)期可顯示化合物2和化合物40對連接蛋白43表達(dá)的增進(jìn)作用或者更快的再生過程。
煙草相關(guān)疾病McKarns SC、Doolittle DJ(Toxicol Appl Pharmacol 1991 Oct 11158-68)研究了香煙煙霧冷凝物對胞間通訊的影響。他們研究的目的是量化和比較來自煙草-加熱和煙草-燃燒香煙的主流香煙煙霧冷凝物(CSC)在體外對胞間通訊的速率和總量兩者的作用。用熒光黃吸收和乳酸脫氫酶釋放測定來評價(jià)質(zhì)膜毒性。通過在暴露于對質(zhì)膜無毒性濃度的CSC 1小時(shí)接著進(jìn)行光漂白(FRAP)之后定量熒光再分布而測定間隙連接胞間通訊(GJIC)。在同步于細(xì)胞周期G1期的大鼠肝上皮細(xì)胞(WB細(xì)胞)和人皮膚成纖維細(xì)胞(MSU-2細(xì)胞)中量化GJIC。在每一種測試細(xì)胞類型中，來自煙草-加熱香煙的CSC在任何濃度不抑制GJIC，而來自煙草-燃燒香煙的CSC顯著抑制GJIC的總量和速率兩者。因此我們聲明間隙連接開啟物如化合物2和化合物40或者式I到VIII以及本文表1和8的肽可以防止或減輕香煙煙霧冷凝物對GJIC的抑制作用。與間隙連接解偶聯(lián)有關(guān)的煙草相關(guān)疾病包括減弱的傷口愈合特別是外科手術(shù)后和皮膚老化。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用以治療或預(yù)防本文所述的一種或多種醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥或病癥的方法。這樣的方法典型地但不僅僅包括給予至少一種前述的化合物，優(yōu)選一種所述化合物，以足以治療、預(yù)防或減輕該適應(yīng)癥或病癥的嚴(yán)重程度的量。詳細(xì)的給藥策略對于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員而言是顯而易見的，并且根據(jù)例如性別、體重、總體健康狀況及待治療或預(yù)防的具體適應(yīng)癥或病癥會(huì)有所變化。正如討論的，本文披露的化合物可以用作為發(fā)明方法中唯一的活性因子。作為選擇地，它們可以用在“添加”治療中，例如已經(jīng)顯示了所述化合物與已認(rèn)可治療方法聯(lián)合應(yīng)用的那些。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的待治療或預(yù)防的適應(yīng)癥或病癥通常與削弱的細(xì)胞通訊或削弱的間隙連接功能有關(guān)。與發(fā)明有關(guān)的更具體的適應(yīng)癥或病癥已在前文討論。
用一種更特別影響間隙連接功能的物質(zhì)來治療與削弱的細(xì)胞通訊或減少的GJIC有關(guān)的疾病會(huì)具有優(yōu)勢，例如預(yù)期可以通過來自AAP受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)GJIC的AAP受體激動(dòng)劑，或者一種以不同的方式促進(jìn)連接蛋白和間隙連接的正常功能的物質(zhì)或化合物。
在本發(fā)明優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，易化胞間通訊的化合物選自具有通式I的化合物組
上式代表一肽序列，其中的氨基酸殘基可以為D-和/或L-構(gòu)型，且具有位于N*處的N-末端及C*處的C-末端，而且可任選是環(huán)狀的，以N*和C*之間虛線所示的或者Rd和C*之間虛線U所示的共價(jià)鍵連接；N*和C*之間的虛線，如果存在則排除化學(xué)鍵U，代表一個(gè)選擇性的共價(jià)鍵，而當(dāng)所述鍵不存在時(shí)，則N*結(jié)合一個(gè)氫原子；當(dāng)Rd和C*之間選擇性的共價(jià)鍵U存在時(shí)，則R7不存在，且R7的存在排除化學(xué)鍵U；其中X代表一個(gè)N-末端部分，例如一個(gè)能夠結(jié)合到氨基末端N*的光探針，或者一個(gè)來自C(2-22)烷基羧酸的?；鶊F(tuán)，所述羧酸例如乙酸、丙酸、丁酸及其它脂肪酸，例如山萮酸，其任選被選自羥基、鹵素、C(1-6)烷基、硝基和氰基的一個(gè)或多個(gè)取代基取代；或者X代表氫；當(dāng)N*和C*之間沒有化學(xué)鍵時(shí)，R7代表OH、NH2、NHNH2、NHR8或OR8，或者當(dāng)N*和C*之間有化學(xué)鍵時(shí)，R7不存在；R8代表H或一個(gè)直鏈或支鏈的C(1-6)烷基基團(tuán)、芳基或芳烷基基團(tuán)。
Ra代表Hyp或Pro的氨基酸側(cè)鏈；Rb代表Hyp或Pro的氨基酸側(cè)鏈；Rc代表Gly、Sar的氨基酸側(cè)鏈，芳族氨基酸的側(cè)鏈，其任選在其芳環(huán)被一個(gè)或多個(gè)羥基、鹵素、硝基、氰基、疊氮基、氨基、苯甲?；虻图壨檠趸蛄虼檠趸鶊F(tuán)取代；
Rd代表Ala、Gly、Glu、Asp、Dab、Dapa、Lys、Asn、Gln、Orn、Thr、Ser或Cys的氨基酸側(cè)鏈；Re代表Ala的氨基酸側(cè)鏈；Rf代表Ala、Sar或Gly的氨基酸側(cè)鏈；Rg代表除L-4Hyp的側(cè)鏈之外的任何氨基酸側(cè)鏈，或者式Z或Za的部分；Rh代表Ala的氨基酸側(cè)鏈，或者Rh代表式Z或Za的部分；Ri代表Gly的氨基酸側(cè)鏈，或者Ri代表一個(gè)芳族氨基酸，其任選在其芳環(huán)被一個(gè)或多個(gè)羥基、鹵素、硝基、氰基、疊氮基、氨基、苯甲?；虻图壨檠趸蛄虼檠趸鶊F(tuán)取代；Rj代表Asn、Gln、Asp、Glu、Cys或Tyr的氨基酸側(cè)鏈；且j、k、l、m、n、p及q各自獨(dú)立為0或1；及式I肽序列的反轉(zhuǎn)形式、全D形式、或者反轉(zhuǎn)全-D形式，以及其鹽和酰胺。
在式I的化合物中，優(yōu)選R7是NH2，Ra是Pro的氨基酸側(cè)鏈，Rb是Hyp的氨基酸側(cè)鏈，Rc是Gly或Tyr的氨基酸側(cè)鏈，Rd選自Gly、Asp或Glu、Dapa和Dab的氨基酸側(cè)鏈，Rf是Ala或Gly的氨基酸側(cè)鏈，Rg是Pro、Asn或Gly的氨基酸側(cè)鏈，當(dāng)式I代表一個(gè)線狀肽時(shí)，Rg是Asn、Gly、D-4Hyp或L-/D-Pro的氨基酸側(cè)鏈，或者當(dāng)式I代表一個(gè)在N*和C*之間環(huán)化的肽時(shí)，則Rg代表L-/D-4Hyp或L-/D-Pro的氨基酸側(cè)鏈；當(dāng)U不存在時(shí)，Rh是Ala的氨基酸側(cè)鏈，或者當(dāng)U存在時(shí)，Rh是Pro或Hyp的氨基酸側(cè)鏈；Ri優(yōu)選是Tyr、Phe、Trp、Nal的氨基酸側(cè)鏈，任選在其芳環(huán)被一個(gè)或多個(gè)羥基、F或Cl取代，Rj選自Asp、Glu和Tyr的氨基酸側(cè)鏈，以及反轉(zhuǎn)全-D構(gòu)型的式I線狀肽。
還優(yōu)選式I的肽化合物由3到9個(gè)氨基酸殘基組成，更優(yōu)選3到7個(gè)氨基酸殘基，并且其中當(dāng)U存在時(shí)，j和k優(yōu)選為0，當(dāng)U不存在且式I代表環(huán)狀肽時(shí)，j和k優(yōu)選為1，當(dāng)U不存時(shí)，m優(yōu)選為0，當(dāng)U存在時(shí)，p優(yōu)選為1，而且當(dāng)U存在時(shí)，q優(yōu)選為0。
更優(yōu)選的是具有通式II的化合物(II)X-(G′)a-A-G′-(Px)2-(Y′)b-R7上式標(biāo)明了一種肽序列，其中氨基酸殘基可以是L和/或D構(gòu)型，且其中X代表H或Ac；G′代表甘氨酸殘基或甘氨酸類似物例如Sar；A代表丙氨酸；Px代表式Z或Za的氨基酸殘基，例如Hyp或Pro；Y′代表酪氨酸或苯丙氨酸，任選在苯環(huán)被鹵素或羥基取代；a和b獨(dú)立地為0或1，R7代表OH、NH2、NHNH2、Asn-NH2或Gln-NH2；以及其反轉(zhuǎn)形式和其鹽，并且其中，優(yōu)選地X代表Ac且所有的氨基酸殘基為L-構(gòu)型，G′為甘氨酸，Px為Pro，Y′為Tyr，R7為NH2。
優(yōu)選的是式II的反轉(zhuǎn)化合物具有結(jié)構(gòu)式X-(Y′)b-(Px)2-G′-A-(G′)a-R7，其中所有的氨基酸殘基為D-構(gòu)型且其中所有的符號(hào)具有與上面式II所定義的相同的含義，式II的肽化合物其中至少一個(gè)Px殘基是D-氨基酸且其余均為L-氨基酸，以及式II的環(huán)狀序列，其中X代表H，R7代表具有與Y′共價(jià)鍵連接的Asn或Gln，Y’代表Tyr；b為1，且a為1。
式2的化合物H-GAG-(Pa)2-NH2，例如H-Gly-Ala-Gly-D-Hyp-Pro-Tyr-NH2，H-Gly-Ala-Gly-D-Pro-Pro-Tyr-NH2，H-Gly-Ala-Gly-D-Pro-Ala-Tyr-NH2，H-Gly-Ala-Gly-Gly-D-Pro-Tyr-NH2，H-Gly-Ala-Gly-D-Hyp-Ala-Tyr-NH2，H-Gly-Ala-Gly-D-Hyp-D-Pro-Tyr-NH2，或其鹽。
式3的化合物H-GAG-(Px)2-Y-NH2，例如H-Gly-Ala-Gly-NCG-Pro-Tyr-NH2，
H-Gly-Ala-Gly-T4C-Pro-Tyr-NH2，H-Gly-Ala-Gly-A2C-Pro-Tyr-NH2，H-Gly-Ala-Gly-Pc-Pro-Tyr-NH2，及其藥學(xué)上可接受的鹽。
式8的化合物H-G′-A-G′-(Px)2-Y-NH2，例如H-Sar-Ala-Sar-Hyp-Pro-Tyr-NH2，H-Gly-Ala-Sar-Hyp-Pro-Tyr-NH2，及其藥學(xué)上可接受的鹽。
式6的化合物X-D-Y-(D-Px)2-G-D-A-G-NH2或其反轉(zhuǎn)形式X-G-D-A-G-(D-Px)2-D-Y-D-(Asn)-NH2，例如H-Gly-D-Ala-Gly-D-Hyp-D-Pro-D-Tyr-NH2，H-Gly-D-Ala-Gly-D-Hyp-D-Pro-D-Tyr-D-Asp-OH，Ac-D-Tyr-D-Pro-D-Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2，及其藥學(xué)上可接受的鹽。
式10的化合物環(huán)(-GAG-(Px)2-Y-N/Q-)，例如環(huán)(-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Gln-)，環(huán)(-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Asn-)，環(huán)(-Gly-Ala-Gly-Pro-Pro-Tyr-Asn-)，及其藥學(xué)上可接受的鹽。如本文定義的及其鹽。
式11的化合物環(huán)(-Y-(Px)2-GA-(G)q-N/Q-)，例如環(huán)(-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-Asn-)，環(huán)(-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Asn-)，環(huán)(-Tyr(3-I，5-I)-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-Asn)，及其藥學(xué)上可接受的鹽。
式12的化合物X-Zd-G(N/Q)Y-NH2，例如H-Gly-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH2，Ac-Gly-Asn-Tyr-NH2，H-Gly-Asn-Tyr-NH2，Ac-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH2，H-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH2，及其藥學(xué)上可接受的鹽。
式I的環(huán)狀肽化合物，進(jìn)一步特征在于具有通式III
其中X代表H或N-末端部分，例如能夠與N末端氨基基團(tuán)形成共價(jià)鍵的光探針或來自與C(2-22)烷基羧酸反應(yīng)的酰基基團(tuán)，例如乙?；?、丙?；?、丁?；推渌舅釟埢缟饺h酰基，任選被選自羥基、鹵素、C(1-6)烷基、硝基和氰基的一個(gè)或多個(gè)取代基取代；R1代表H或CH3；R2和R3是不同的或相同的，且代表任何可能的氨基酸側(cè)鏈；代表一個(gè)選擇性的鍵；R5和R4代表任何可能的氨基酸側(cè)鏈；或者當(dāng)選擇性鍵存在時(shí)，R5和R4與所附的C和N原子一起代表一個(gè)脯氨酸環(huán)，任選其被OH取代，優(yōu)選在4-位；或R5和R4與所附的C和N原子一起代表上面式Z或Za的部分；R6代表一個(gè)芳族氨基酸側(cè)鏈，任選在苯環(huán)被選自鹵素、硝基和羥基的一個(gè)或多個(gè)取代基取代；p為0或1；n為1、2、3或4；
以及其鹽，并且優(yōu)選其中R1代表H，R2和R3是不同的或相同的，且代表H或CH3，R5和R4與所附的C和N原子一起代表Pro或Hyp，R6代表Tyr，p為1，且n為1。
式III例示性的化合物為及其藥學(xué)上可接受的鹽。
式I的優(yōu)選化合物進(jìn)一步特征在于具有通式IV
其中R8代表H或C(1-6)烷基基團(tuán)；R6代表H或CH3；R4和R5是不同的或相同的，并代表任何可能的氨基酸側(cè)鏈；代表一個(gè)選擇性的鍵；R2和R3代表任何可能的氨基酸側(cè)鏈；或者當(dāng)選擇性鍵存在時(shí)，R2和R3與所附的C和N原子一起代表一個(gè)脯氨酸環(huán)，任選其被OH取代，優(yōu)選在4-位；或者R2和R3代表式Z或Za的部分；R1代表一個(gè)芳族氨基酸側(cè)鏈；p為0或1；n為1、2、3或4；以及其鹽，并且優(yōu)選其中R8代表H，R4和R5是不同的或相同的，并且代表Gly或Ala的氨基酸側(cè)鏈，R2和R3與所附的C和N原子一起代表Pro或Hyp，R1代表Tyr，p為1，且n為1。
式IV例示性的化合物為
及其藥學(xué)上可接受的鹽。
進(jìn)一步優(yōu)選的化合物為肽化合物，其中氨基酸殘基可以為L-和/或D-構(gòu)型，并且具有通式V 其中R1代表該肽N和C末端之間一個(gè)選擇性的酰胺鍵、H或Ac；Aa1代表一個(gè)具有0到4個(gè)氨基酸殘基的肽序列；Al代表一個(gè)氨基酸殘基，選自Gly、β丙氨酸和Sar；Aa2代表一個(gè)氨基酸殘基，選自Asn、Gln、Gly、Tyr或一個(gè)化學(xué)單元，例如羥酸、氨基磺酸、磷酸基團(tuán)、或者通過4個(gè)共價(jià)鍵連接Al和Ar的烴鏈；
Ar代表一個(gè)芳族氨基酸殘基，例如Tyr、Trp、Phe、His或Nal，任選被選自鹵素如F、Cl、Br，或I，OH，NO2、NH2、COOH和CONH的一個(gè)或多個(gè)取代基取代；R2代表OH、NH2或不存在；以及其反轉(zhuǎn)類似物、反轉(zhuǎn)全-D類似物(反轉(zhuǎn)-逆向類似物)和鹽，并且優(yōu)選其中Aa1選自Ala、Gly-Ala、Gly-Asn-Tyr和Gly-Asn-Tyr-Ala，其中Al代表Gly或Sar，Aa2代表Asn或Gln，其中Ar代表Tyr或Phe，任選被一個(gè)或多個(gè)鹵素如I取代，其中當(dāng)化合物為非環(huán)狀時(shí)，R2代表NH2，或者當(dāng)化合物是環(huán)狀時(shí)，R2不存在。
式V例示性的化合物為H-Gly-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH2，環(huán)(-Tyr-Ala-Ser-Ala-Gly-Asn-)，環(huán)(-Tyr-Ala-Ser-Ala-Gly-Asn-)，環(huán)(-Tyr-Gly-Asn-Tyr-Ala-Gly-Asn-)，環(huán)(-Tyr-Val-Ser-Gly-Ala-Gly-Asn-)，Ac-Gly-Asn-Tyr-NH2，H-Gly-Asn-Tyr-NH2，Ac-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH2，H-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH2，及其藥學(xué)上可接受的鹽。
可用于本發(fā)明的方法的其它化合物包括抗心律失常肽及它們的功能性類似物，例如AAP、AAP10、[Pro4]AAP10-NH2、HP5和新的肽綴合物H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-OHH-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH23(4-羥基苯基)丙酰-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-OH及3(4-羥基苯基)丙酰-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2穩(wěn)定性本發(fā)明化合物的穩(wěn)定性此外，本發(fā)明的化合物特征在于對酶降解穩(wěn)定和/或?qū)ρ獫{中的降解穩(wěn)定和/或具有延長的體內(nèi)半衰期。優(yōu)選本發(fā)明的化合物包括抗心律失?；衔飳γ附到夥€(wěn)定和/或在血漿中穩(wěn)定。本發(fā)明所呈現(xiàn)的天然肽序列AAP的各種不同的衍生物和化學(xué)修飾，舉例來說，C-末端的酰胺化或酯化、D-氨基酸和天然氨基酸衍生物的應(yīng)用、N-末端修飾及其環(huán)狀類似物均代表了目的是在保留天然AAP基本的抗心律失常和/或抗血栓形成特性的同時(shí)增強(qiáng)穩(wěn)定性的修飾。
通常肽非常容易被存在于胃腸系統(tǒng)和活組織及體液中的蛋白水解酶降解。因此，本文優(yōu)選利用經(jīng)修飾以賦予其增加的穩(wěn)定性的肽。優(yōu)選該化合物包括本發(fā)明的抗心律失?；衔飳γ附到夥€(wěn)定和/或在血漿中穩(wěn)定。本發(fā)明的方法所用的優(yōu)選肽在溶液中的半衰期按照標(biāo)準(zhǔn)穩(wěn)定性試驗(yàn)測量為大于50分鐘，優(yōu)選大于4小時(shí)。如將在下面表7和8中顯示的，本發(fā)明的多種肽在標(biāo)準(zhǔn)穩(wěn)定性試驗(yàn)中的降解半衰期大于5小時(shí)。穩(wěn)定性是藥效的一個(gè)重要參數(shù)，優(yōu)選本文的肽具有延長的半衰期，例如T1/2大于300分鐘。本文所用的標(biāo)準(zhǔn)穩(wěn)定性試驗(yàn)指下面所描述的體外血漿穩(wěn)定性測定。
體外血漿穩(wěn)定性測定方法在血清和血漿中分析肽的穩(wěn)定性。肽在血漿和血清中于37℃溫育，而且在t＝0和t＝156之間以大約9次規(guī)律間隔取樣進(jìn)行HPLC分析。
估計(jì)HPLC分析的適當(dāng)條件(柱、溶劑、梯度及溫度)以確保藥物峰和血漿峰不具有相同的保留時(shí)間。這通過先后注入藥物、血漿以及同時(shí)注入藥物和血漿接著優(yōu)化LC方法參數(shù)，直到獲得滿意的分離而進(jìn)行。每個(gè)血漿類型進(jìn)行3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。將100ml肽與900ml血漿在t＝0時(shí)混合，并在37℃溫育(藥物-血漿混合物濃度為0.1mg/ml)。以適當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔取100ml該藥物-血漿混合物樣品，并通過用10mlMeCNTFA 5050v/v沉淀樣品而終止降解。同樣取以相同方式處理的不含藥物的對照血漿樣品。血漿樣品在12,000rpm(Eppendorfcentrifuge)室溫離心15分鐘。將所得的上清液轉(zhuǎn)移到300ml HP自動(dòng)取樣器小瓶中并用HPLC分析。樣品按如下順序分析空白、0.1mg/mL肽、不含肽的血漿、t＝0時(shí)的3個(gè)平行樣品、t＝5分鐘時(shí)的3個(gè)平行樣品，t＝10分鐘時(shí)的3個(gè)平行樣品等。最后重復(fù)t＝0時(shí)的3個(gè)平行樣品，以確保分析期間沒有發(fā)生降解或其它失誤。樣品濃度(以mAU表示的峰高)對時(shí)間繪圖，并使其擬合描述單指數(shù)式衰減的函數(shù)(Excel)。與AAP10、AAP和HP5相比較的本發(fā)明多種不同化合物在人血漿中的降解半衰期(T1/2)(分鐘)以平均值(n＝3)±標(biāo)準(zhǔn)偏差在下面的表7中給出。本發(fā)明的化合物2、3、27、48和49比起半衰期小于10分鐘的AAP10和半衰期小于12分鐘的HP5，在血漿和血清中更為穩(wěn)定得多。
表7.在血漿和血清中的體外穩(wěn)定性測試結(jié)果，T1/2以分鐘和小時(shí)表示
下面的表8顯示了化合物在氯化鈣誘導(dǎo)的心律失常模型中的活性和半衰期
*在EDTA血漿中測量的人血漿半衰期，HPP指3(4-羥基苯基)丙酰基
可用于本發(fā)明方法的其它優(yōu)選的化合物是如文獻(xiàn)中所報(bào)道的易化GJIC的非肽化合物，例如白藜蘆醇(反式-3，5，4′-三羥基茋和順式-3，5，4′-三羥基茋)，包括其多種不同的二聚體、三聚體、四聚體和其衍生物以及結(jié)構(gòu)相關(guān)的化合物咖啡酸苯乙酯及其衍生物；以及阿樸啡類生物堿波爾定和塔斯品堿。白藜蘆醇對GJIC的影響在本文所述的CaCl2誘導(dǎo)的AV傳導(dǎo)阻滯體內(nèi)模型中檢測。白藜蘆醇以i.v.100nmol/kg(n＝6只小鼠)相對于用載體處理的動(dòng)物(n＝7只小鼠)阻止了直到鈣誘導(dǎo)的鈣阻滯的時(shí)間，(136±9％相對于100±7％；p＜0.01)。
美國專利No.6,008,260涉及白藜蘆醇作為抵抗化學(xué)誘導(dǎo)的癌癥預(yù)防藥給予哺乳動(dòng)物的應(yīng)用，而且Nielsen M，Ruch RJ，Vang O(Biochem Biophys Res Commun 2000 Sep 7；275(3)804-9)表明天然存在的茋/補(bǔ)體白藜蘆醇，特別是反式-白藜蘆醇(反式-3，5，4′-三羥基茋)，逆轉(zhuǎn)腫瘤促進(jìn)物誘導(dǎo)的對間隙連接胞間通訊的抑制作用，并提示其作為癌癥預(yù)防劑的應(yīng)用。研究白藜蘆醇對WB-F344大鼠肝上皮細(xì)胞中間隙連接胞間通訊(GJIC)的影響，因?yàn)橐种艷JIC是腫瘤促進(jìn)作用的一個(gè)重要機(jī)制。當(dāng)WB-F344細(xì)胞暴露于白藜蘆醇6小時(shí)，與溶劑載體對照相比，17到50μM的白藜蘆醇顯著增加GJIC 1.3倍。大多數(shù)腫瘤促進(jìn)物包括佛波酯TPA和殺蟲劑DDT阻斷GJIC。17-50μM的白藜蘆醇還顯著阻止TPA和DDT對GJIC的下調(diào)，分別為2.7和1.8倍。從TPA抑制的這種GJIC恢復(fù)部分地與受到妨礙的Cx43的超磷酸化有關(guān)。總之，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可增強(qiáng)GJIC并抵消腫瘤促進(jìn)物對GJIC的作用，而且這很可能是對白藜蘆醇的抗致癌特性有貢獻(xiàn)的一種機(jī)制。
WO 0059466(LVMH Recherche)披露了含有生物堿波爾定的Skeletonema costatum脂提取物在用于改善皮膚老化跡象的化妝品組合物中的應(yīng)用。所述脂提取物和化合物波爾定改善角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和前脂肪細(xì)胞中的間隙連接胞間通訊。發(fā)明人顯示用波爾定處理可增加中年和老年人角質(zhì)形成細(xì)胞中連接蛋白43的含量，達(dá)到年輕人角質(zhì)形成細(xì)胞中所發(fā)現(xiàn)的含量，所述作用呈劑量依賴性方式，波爾定濃度為50nM是最佳的。因?yàn)檫B接蛋白43細(xì)胞含量的增加肯定有助于間隙連接胞間通訊的易化，化合物波爾定可用于本發(fā)明中。
從而，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用以用于改善皮膚老化、脂肪團(tuán)(cellulite)和皺紋的方法，包括向需要這樣治療的患者給予治療有效量的至少一種本文公開的易化胞間通訊的式I到VIII或表1和8的肽。
其它享有波爾定結(jié)構(gòu)的化合物包括阿樸啡類生物堿例如塔斯品堿，在1992年10月20日頒布的美國專利No.5,156,847中報(bào)道其可用于治療傷口。
制劑和組合物含有本文所述的化合物用于治療前文提及的疾病和醫(yī)學(xué)狀況的制劑可以按照需要為醫(yī)務(wù)人員或患者可以施用的任何合適的形式。例子有i.v.給藥的注射制劑、口服給藥制劑包括片劑和膠囊，以及栓劑。本發(fā)明的化合物可以作為獨(dú)立的藥物給予，或者與其它適于治療特定疾病的藥物用于聯(lián)合治療。在本文所述的化合物是相對低分子量的、可能具有相對較低的口服生物利用度的肽的情況下，優(yōu)選非口服制劑，舉例來說，用于注射給藥或者經(jīng)由鼻或直腸上皮或通過皮膚如離子電滲療法輔助的給藥的制劑。
在本發(fā)明的治療方法中，治療化合物可以通過幾種方式中的任何一種給予患者，包括體內(nèi)的或局部的給藥。此外，本發(fā)明優(yōu)選的化合物，例如化合物3、化合物2、化合物40可以作為預(yù)防藥給予以防止所針對的病癥發(fā)生或降低其嚴(yán)重程度。作為選擇地，這樣的優(yōu)選化合物可以在所針對病癥的過程中給予，例如以有助于減輕癥狀。
治療化合物可以或者單獨(dú)地或者與一種或多種治療試劑聯(lián)合，與常規(guī)的賦形劑也就是適于腸胃外、腸內(nèi)或鼻內(nèi)應(yīng)用的、不與活性化合物發(fā)生有害反應(yīng)并且對其接受者無害的藥學(xué)上可接受的有機(jī)或無機(jī)載體物質(zhì)混合作為藥物組合物給予患者。合適的藥學(xué)上可接受的載體包括但不限于水、鹽溶液、醇、植物油、聚乙二醇、明膠、乳糖、直鏈淀粉、硬脂酸鎂、滑石、硅酸、粘性石蠟、香精油、脂肪酸甘油單酯和甘油二酯、petroethral脂肪酸酯、羥甲基-纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等。藥物制劑可進(jìn)行滅菌，而且如果需要，與助劑混合，舉例來說，潤滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑、影響滲透壓的鹽、緩沖劑、色素、調(diào)味劑和/或芳香物質(zhì)以及類似的不與活性化合物發(fā)生有害反應(yīng)的物質(zhì)。
這樣的組合物可制備用于腸胃外給藥，特別是以液體溶液或懸液形式；用于口服給藥，特別是片劑或膠囊形式；鼻內(nèi)給藥，特別是粉劑、滴鼻劑或氣霧劑形式；陰道給藥；局部給藥，比如乳霜形式；直腸給藥，比如作為栓劑；等等。
藥劑可以以單位劑型便利地給藥，并且可以通過任何藥學(xué)領(lǐng)域公知的方法制備，舉例來說，如Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，Easton，PA，1980)中所描述的。腸胃外給藥的制劑可以含有例如無菌水或鹽水、聚亞烷基二醇例如聚乙二醇、植物來源的油、氫化萘以及類似物質(zhì)作為常用賦形劑。特別地，生物相容性可生物降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物、或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可以是控制本發(fā)明的某些化合物特別是化合物3、化合物2、化合物40等釋放的有用賦形劑。
其它潛在有用的腸胃外送遞系統(tǒng)包括乙烯乙酸乙烯酯共聚物顆粒、滲透泵、可植入輸注系統(tǒng)及脂質(zhì)體。吸入給藥的配方含有例如乳糖作為賦形劑，或者可以是水溶液含有例如聚氧乙烯-9-月桂醚、甘氨膽酸和脫氧膽酸，或者是以滴鼻形式給藥的油性溶液，或者作為凝膠在鼻內(nèi)施用。腸胃外給藥的配方還可以包括甘氨膽酸用于含服、包括甲氧基水楊酸用于直腸給藥，或者包括檸檬酸用于陰道給藥。其它送遞系統(tǒng)可以直接將治療試劑施用于外科手術(shù)部位，舉例來說利用支架給藥。
治療組合物中一種或多種治療化合物的濃度將取決于多種因素而有所變化，包括待給予的本發(fā)明化合物的劑量、使用的組合物的化學(xué)性質(zhì)(比如疏水性)、以及預(yù)期的給藥模式和途徑。籠統(tǒng)地講，一種或多于一種的本發(fā)明化合物且優(yōu)選化合物3、化合物2、化合物40中的至少一種可以以含有大約0.1到10％w/v化合物的含水生理緩沖液提供用于腸胃外給藥。
人們將會(huì)理解在給定治療中所用的活性化合物的實(shí)際優(yōu)選量會(huì)根據(jù)比如說利用的具體化合物、所配制的特定組合物、給藥模式和患者的特征例如物種、性別、體重、總體健康狀況及患者的年齡而變化。特定給藥方案的最佳給藥速率可以由所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通過利用根據(jù)前述指導(dǎo)方針進(jìn)行常規(guī)的劑量測試實(shí)驗(yàn)容易地確定。合適的劑量范圍可以包括每天大約1mg/kg到大約100mg/kg體重。
本發(fā)明治療性化合物以一種質(zhì)子化和水溶性的形式適當(dāng)?shù)亟o藥，舉例來說，作為一種藥學(xué)上可接受的鹽，典型地酸加成鹽如無機(jī)酸加成鹽，舉例來說，鹽酸鹽、硫酸鹽或磷酸鹽，或者作為有機(jī)酸加成鹽例如乙酸鹽、馬來酸鹽、延胡索酸鹽、酒石酸鹽或檸檬酸鹽。本發(fā)明治療性化合物的藥學(xué)上可接受的鹽還可包括金屬鹽，特別是堿金屬鹽例如鈉鹽或鉀鹽；堿土金屬鹽例如鎂或鈣鹽；銨鹽例如銨鹽或四甲基銨鹽；或氨基酸加成鹽例如賴氨酸、甘氨酸或苯基丙氨酸鹽。
組合物本發(fā)明還涉及一種組合物，包括如本文定義的藥理學(xué)活性的抗心律失常肽，與藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑。這樣的組合物可以是一種適于口服、皮下、腸胃外(靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi))、肌肉內(nèi)、直腸、硬膜外、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、真皮、陰道、口含、眼、直接大腦或肺部給藥的形式，優(yōu)選是適于皮下、靜脈內(nèi)或口服給藥的形式，并且這樣的組合物可以以一種所屬領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方式制備，舉例來說，如″Remington′s Pharmaceutical Sciences″第17版，Alfonso R.Gennaro(編輯)，Mark Publishing Company，Easton，PA，美國，1985和更近版本中以及″Drugs and the Pharmaceutical Sciences″叢書，MarcelDekker的專論中一般描述的。該組合物可呈現(xiàn)為常規(guī)的形式，例如用于注射包括靜脈注射的溶液和懸液、輸注濃縮物、膠囊和片劑，優(yōu)選為腸制劑的形態(tài)，舉例來說如US 5,350,741所披露的用于口服給藥的形式。
所使用的藥學(xué)載體或稀釋液可以是常規(guī)的固相或液相載體。固相載體的例子有乳糖、石膏粉、蔗糖、環(huán)糊精、滑石、明膠、瓊脂、果膠、阿拉伯樹膠、硬脂酸鎂、硬脂酸或纖維素的低級烷基醚。液相載體的例子有糖漿、花生油、橄欖油、磷脂、脂肪酸、脂肪酸胺、聚氧乙烯和水。
同樣的，載體或稀釋液可以包括任何本領(lǐng)域公知的持續(xù)釋放材料，例如甘油單硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯，單獨(dú)或與蠟混合。
如果固相載體用于口服給藥，制劑可以壓片、以粉末或小丸形式置于硬明膠膠囊中，或者它可以是糖錠或錠劑形式。固相載體的量可以變化多樣，但通常是從大約25mg到大約1g。
可由常規(guī)壓片技術(shù)制備的典型片劑可以包含片芯100mg活性化合物(作為游離化合物或其鹽)；1.5mg膠態(tài)二氧化硅(Aerosil)；70mg微晶纖維素(Avicel)；7.5mg改性的纖維素膠(Ac-Di-Sol)；硬脂酸鎂。
包衣HPMC大約9mg；*Mywacett 9-40T大約0.9mg；*?；母视蛦熙ビ米髟鏊軇┯糜诒∧ぐ隆?br> 如果應(yīng)用液相載體，則制劑可以是糖漿、乳劑、軟明膠膠囊或無菌注射液如含水或非水液體懸液或溶液的形式。
組合物還可以是適于局部或全身注射或輸注的形式，而且因此可以與無菌水或等滲鹽水或葡萄糖溶液一起配制。組合物可以用本領(lǐng)域熟知的常規(guī)滅菌技術(shù)滅菌。所得的水溶液可以包裝備用或者在無菌條件下過濾并凍干，給藥前凍干制劑與無菌水溶液混合。根據(jù)接近生理?xiàng)l件的需要，組合物可以包含藥學(xué)上可接受的輔料，例如緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑及諸如此類，舉例來說醋酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣等。
用于靜脈注射的肽制劑多劑量制劑可以制備成本發(fā)明化合物的無菌等滲鹽水溶液，貯存于加蓋的小瓶中，而且如果必要可加入防腐劑(舉例來說苯甲酸酯)。固定劑量制劑可以制備成化合物的無菌等滲鹽水溶液，貯存于玻璃安瓿中，而且如果必要可填充惰性氣體。每個(gè)劑量的化合物干燥貯存于安瓿或加蓋的小瓶中，如有必要填充惰性氣體。多劑量制劑要求化合物最高程度的穩(wěn)定性。如果化合物的穩(wěn)定性低，可用固定劑量制劑。肽還可以配制成靜脈輸注濃縮物。
對于經(jīng)鼻給藥，制劑可以包含溶解于或懸浮于液相載體特別是含水載體中的本發(fā)明化合物，作氣霧劑應(yīng)用。載體可含有添加劑，諸如增溶劑例如丙二醇、表面活性劑例如膽汁酸鹽或聚氧乙烯高級醇醚、吸收增強(qiáng)劑例如卵磷脂(磷脂酰膽堿)或環(huán)糊精、或者防腐劑例如對羥基苯甲酸酯。
此外，本發(fā)明的肽化合物體積較小，對于口服或經(jīng)鼻給藥可能有利，因?yàn)榕c較大的肽相比，相對快速的粘膜吸收使酶降解降到最低限度，特別是在十二指腸和回腸中。
含化合物2的腸片劑的制備將400mg L-酒石酸和40mg聚乙二醇-氫化蓖麻油溶解于5ml甲醇中。溶液置于一個(gè)預(yù)先升溫到30℃的研缽中。向溶液中加入1.5mg化合物2。加入化合物2后立即用研棒在40℃的熱氣流中攪拌混合物，隨后放置在真空干燥機(jī)中過夜以除去溶劑。所得的固體物質(zhì)用研棒研磨成粉并與30mg碳酸氫鈉和少量70％乙醇捏和?；旌衔锝又珠_塑形成片劑并干燥。干燥的片劑涂以羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸鹽包衣以得到腸片劑。
本發(fā)明還涉及如本文公開的藥理學(xué)活性的抗心律失常肽或肽衍生物或其功能類似物在治療方面的用途，以及如本文所定義的其在生產(chǎn)用于治療的藥物組合物方面的用途，舉例來說，用于治療心血管病期間的心律失常和血栓形成并發(fā)癥，例如急性缺血性心臟病(舉例來說，穩(wěn)定性心絞痛、不穩(wěn)定心絞痛、急性心肌梗塞)、充血性心力衰竭(舉例來說，收縮性、舒張性、高輸出、低輸出、右或左側(cè)心力衰竭)、先天性心臟病、肺心病、心肌病、心肌炎、高血壓心臟病以及冠狀換血管術(shù)期間。
在具體實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗心律失常肽可用于治療和/或預(yù)防緩慢性心律失常(舉例來說，由竇房結(jié)、房室結(jié)、希斯氏束或者右或左束支的疾病所致)、與折返有關(guān)的快速心律失常(舉例來說，心房期前復(fù)合波、AV銜接復(fù)合波、心室期前復(fù)合波、房顫、房撲、陣發(fā)性室上性心動(dòng)過速、竇房結(jié)折返心動(dòng)過速、房室結(jié)折返心動(dòng)過速以及非持續(xù)性室性心動(dòng)過速)，或者單獨(dú)或者聯(lián)合其它抗心律失常化合物，例如I類藥劑(舉例來說，利多卡因)、II類藥劑(舉例來說，美托洛爾或普萘洛爾)、III類藥劑(舉例來說，胺碘酮或索他洛爾)或IV類試劑(舉例來說，維拉帕米)。
在具體實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗心律失常肽可用于預(yù)防患有血管壁疾病(舉例來說，動(dòng)脈硬化癥)、血小板生成增加(普遍的紅細(xì)胞增多癥)和/或血流減少(心臟病、血管病)患者中的血栓形成事件，或者單獨(dú)或者與GP IIb/IIIa抑制劑(舉例來說，c7E3 Fab；abciximab)、環(huán)加氧酶抑制劑(舉例來說，阿司匹林)、凝血_烷A2拮抗劑、芐丙酮香豆素鈉衍生物(舉例來說，華法林)、或合成肽整連蛋白聯(lián)合應(yīng)用。
在具體實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗心律失常肽，歸因于其對胞間間隙連接通道的影響，可用于治療和/或預(yù)防骨丟失和增加骨折的愈合[93]；治療和/或預(yù)防血管化差的軟骨和關(guān)節(jié)的疾病[94]；治療和/或預(yù)防白內(nèi)障[81]；治療和/或預(yù)防角膜營養(yǎng)貧乏的疾病狀態(tài)下角膜的血管化，并增加角膜損害的愈合[95]；治療和/或預(yù)防癌細(xì)胞的生長及擴(kuò)散，例如來源于上皮細(xì)胞系的癌細(xì)胞[96]；通過增加血管舒縮治療和/或預(yù)防高血壓[74]；預(yù)防生物體中移植物如細(xì)胞和器官的排斥。
肽合成下面描述一種優(yōu)選的一般步驟。不過，在WO98/11125中有關(guān)于固相肽合成更詳細(xì)的描述，其全文并入本文。
設(shè)備和合成策略肽在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中分批合成，利用9-芴甲氧羰基(Fmoc)作為N-α-氨基保護(hù)基團(tuán)以及適合的側(cè)鏈官能團(tuán)的常用保護(hù)基團(tuán)。
溶劑溶劑DMF(N，N-二甲基甲酰胺，Riedel de-Haen，Germany)通過一個(gè)裝有強(qiáng)陽離子交換樹脂的柱子(Lewatit S 100 MB/H強(qiáng)酸，BayerAG Leverkusen，Germany)純化并在用前通過加入3，4-二氫-3-羥基-4-氧-1，2，3-苯并三嗪(Dhbt-OH)分析游離胺，如果存在游離胺，則出現(xiàn)黃色(Dhbt-O-陰離子)。溶劑DCM(二氯甲烷，分析級，Riedel de-Haen，Germany)不經(jīng)純化直接應(yīng)用。乙腈(HPLC-級，Lab-Scan，都柏林，愛爾蘭共和國)不經(jīng)純化直接應(yīng)用。
氨基酸Fmoc-保護(hù)的氨基酸以合適的側(cè)鏈保護(hù)形式購自AdvancedChemTech(ACT)。其它方式保護(hù)的氨基酸(Fmoc-Glu(OH)-O烯丙基；Fmoc-Asp(OH)-O烯丙基來自NovaBiochem(瑞士)，F(xiàn)moc-4-Hyp(OtBu)-OH來自Bachem(瑞士)。
偶聯(lián)試劑偶聯(lián)試劑二異丙基碳二亞胺(DIC)購自(Riedel de-Haen，Germany)，PyBop來自Advanced ChemTech。
連接物(4-羥甲基苯氧基)乙酸(HMPA)，購自Novabiochem，瑞士；并以通過DIC的方法預(yù)先形成的1-羥基苯并三唑(HOBt)酯與樹脂偶聯(lián)。
固相支持物肽根據(jù)Fmoc-策略在TentaGel S樹脂上合成0.22-0.31mmol/g(TentaGel-S-NH2；TentaGel S-Ram，TentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc；Rapp polymere，Germany)；催化劑及其它試劑二異丙基乙胺(DIEA)購自Aldrich，Germany，而乙二胺來自Fluka，哌啶和吡啶來自 Riedel-de Haen，F(xiàn)rankfurt，Germany。4-(N，N-二甲氨基)吡啶(DMAP)購自瑞士Fluka，并在包含對稱酐的偶聯(lián)反應(yīng)中用作催化劑。乙二硫醇購自Riedel-de Haen，F(xiàn)rankfurt，Germany。3，4-二氫-3-羥基-4-氧-1，2，3-苯并三嗪(Dhbt-OH)，1-羥基苯并三唑(HOBt)(HOAt)獲自Fluka，瑞士。
偶聯(lián)步驟偶聯(lián)第一個(gè)氨基酸，作為在DMF中的對稱酐由適當(dāng)?shù)腘-α-保護(hù)的氨基酸和DIC生成。偶聯(lián)隨后的氨基酸，作為原位生成的HOBt或HOAt酯，由適當(dāng)?shù)腘-α-保護(hù)的氨基酸與HOBt或HOAt在DMF中通過DIC方式制備。?；饔猛ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)檢測，以防止試驗(yàn)過程中Fmoc去保護(hù)[97]。
N-α-氨基保護(hù)基團(tuán)(Fmoc)的去保護(hù)
Fmoc基團(tuán)去保護(hù)的進(jìn)行是在DMF中用20％哌啶處理(1×5和1×10分鐘)，接著用DMF洗滌(5×15ml，每次5分鐘)直到向排出的DMF中加入Dhbt-OH后看不到黃色為止。
烯丙基的去保護(hù)向肽樹脂中加入溶于15-20ml CHCl3，AcOH，NMM(37∶2∶1)中的3 eq.Pd(PPh3)4溶液。室溫下持續(xù)這種處理3個(gè)小時(shí)，并伴隨著向混合物中通入N2氣流起泡。
HOBt-酯的偶聯(lián)3eq.N-α-氨基保護(hù)的氨基酸與3eq.HOBt和3eq.DIC一起溶于DMF中然后加入樹脂中。
預(yù)制的對稱酐6eq.N-α-氨基保護(hù)的氨基酸溶于DCM中并冷卻至0℃。加入DIC(3eq.)持續(xù)反應(yīng)10分鐘。真空除去溶劑，剩余物溶于DMF。立即向樹脂中加入該溶液，接著是0.1eq.DMAP。
樹脂上肽的環(huán)化1.5eq.PyBop與1.5eq.HOBt一起溶于DMF中，并向肽樹脂中加入3eq.NMM。反應(yīng)持續(xù)過夜。
用酸將肽自樹脂上裂解肽用95％三氟乙酸(TFA，Riedel-de Haen，F(xiàn)rankfurt，Germany)-水V/V或用95％TFA和5％乙二硫醇V/V室溫處理2小時(shí)從樹脂上將肽裂解下來。過濾的樹脂用95％TFA-水沖洗，而濾液和沖洗液減壓蒸干。殘余物用乙醚沖洗，并從乙酸-水中凍干。粗制凍干產(chǎn)物用高效液相色譜(HPLC)分析，并用電噴射離子化質(zhì)譜分析(ESMS)鑒定。
在TentaGel樹脂上的分批肽合成(PEG-PS)TentaGel樹脂(1g，0.22-0.31mmol/g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中。樹脂在DMF(15ml)中膨脹，用溶于DMF的20％哌啶處理，以確保樹脂上非質(zhì)子化的氨基基團(tuán)的存在。樹脂瀝干并用DMF沖洗直到向排出的DMF中加入Dhbt-OH后看不到黃色為止。HMPA(3eq.)作為如前所述預(yù)制的HOBt-酯進(jìn)行偶聯(lián)，持續(xù)該偶聯(lián)24小時(shí)。樹脂瀝干并用DMF沖洗(5×15ml，每次5分鐘)并通過茚三酮試驗(yàn)檢測?；饔?。第一個(gè)氨基酸如前所述作為預(yù)制的對稱酐偶聯(lián)。以后的氨基酸按照序列如前所述作為預(yù)制的Fmoc保護(hù)的HOBt酯(3eq.)偶聯(lián)。偶聯(lián)持續(xù)2小時(shí)，除非另有說明。樹脂瀝干并用DMF沖洗(5×15ml，每次5分鐘)以除去過量的試劑。所有的?；饔猛ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)檢測。在全部合成后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次5分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、最后用二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
HPLC條件利用Hewlett Packard HP 1100 HPLC系統(tǒng)進(jìn)行梯度HPLC分析，其由HP 1100 Quaternary Pump、HP 1100自動(dòng)取樣器、HP 1100Column Thermostat及HP 1100多波長檢測器組成。LC軟件的Hewlett Packard Chemstation(rev.A.06.01)被用于儀器控制和數(shù)據(jù)獲取。
采用了下列柱和HPLC緩沖系統(tǒng)柱Kromasil，Phenomenex 00F-3033-E0，329889(新)；5μm C-18，100_150×4.6mm；批號(hào)5243-10。
緩沖系統(tǒng)A溶于MQV中的0.1％TFA；B0.085％TFA，10％MQV，90％MeCN。
梯度1-1.5分鐘 25％B1.5-13.5分鐘 25-50％B13.5-14.5分鐘 50-100％B14.5-15.5分鐘 100％B15.5-17.5分鐘 100-25％B17.5-20分鐘 25％B流速 1.5 ml/分鐘箱溫 40℃
UV檢測 λ＝215nm質(zhì)譜由Micro-mass LCT儀獲取。
前述發(fā)明的詳細(xì)描述已經(jīng)在遞交于2001年2月22日的USSN09/792,286申請中公開。
轉(zhuǎn)向本發(fā)明，其通?？捎糜谥委熁蝾A(yù)防與減少的或削弱的胞間通訊有關(guān)的疾病。間隙連接胞間通訊(GJIC)對于哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織的正常功能是至關(guān)重要的，而且間隙連接的開啟或門控常常與疾病狀態(tài)有關(guān)。已有文獻(xiàn)報(bào)道與疾病狀態(tài)有關(guān)的減少的胞間間隙連接通訊的幾個(gè)例子。盡管已知阻斷間隙連接的物質(zhì)，有關(guān)應(yīng)用促進(jìn)或介導(dǎo)間隙連接通訊或增加GJIC的化合物治療非增生性疾病的報(bào)道局限于化合物伊索格拉定(6-(2，5-二氯苯基)-2，4-二氨基-1，3，5-三嗪)的應(yīng)用，據(jù)報(bào)道其通過GJIC被抑制的M1毒蕈堿性乙酰膽堿受體激活間隙連接胞間通訊，但是10(-10)到10(-6)M的伊索格拉定單獨(dú)并不影響GJIC(Ueda，F(xiàn).等，J Pharmacol Exp Ther 1995 Aug；274(2)815-9)。
因此，本發(fā)明進(jìn)一步涉及胞間通訊易化化合物，特別是AAP受體激動(dòng)劑優(yōu)選本文式I-VI，用來制備藥物的用途。藥物附加成分包括藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑，例如選自上文提及的那些。
個(gè)別肽的肽合成合成實(shí)施例1.在TentaGel-S-NH-2；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行Ac-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH(化合物1)的肽合成。
第一批干燥TentaGel-S-NH2(0.27 mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中，并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端酪氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。在Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后N-末端氨基基團(tuán)由乙酸酐(1ml，10.5mmol)連同100μl溶于2ml DMF中的吡啶進(jìn)行乙?；Ｔ撆悸?lián)持續(xù)過夜。?；饔萌缭缦人鐾ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在全部合成完成后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。粗制凍干產(chǎn)物用HPLC分析，發(fā)現(xiàn)純度高于70％，而且肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+619.24，計(jì)算值MH+619.26)。粗物質(zhì)產(chǎn)率為137.7mg。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到58mg純度高于95％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為35％。
第二批干燥TentaGel-S-NH2(0.27mmol/g，1g)放置在在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中，并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端酪氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。在Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后N-末端氨基基團(tuán)由乙酸酐(1ml，10.5mmol)連同100μl溶于2ml DMF中的吡啶進(jìn)行乙酰化。該偶聯(lián)持續(xù)過夜。?；饔萌缭缦人鐾ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在全部合成完成后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。粗制凍干產(chǎn)物用HPLC分析，發(fā)現(xiàn)純度高于70％，而且肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+619.25，計(jì)算值MH+619.26)。粗物質(zhì)產(chǎn)率為137.3mg。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到27.9mg純度高于91％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為15.5％。
合成實(shí)施例2.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2(化合物2)的肽合成。
第一批干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中，并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端D-酪氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。在Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后N-末端氨基基團(tuán)由乙酸酐(1ml，10.5mmol)連同100μl溶于2ml DMF中的吡啶進(jìn)行乙?；Ｔ撆悸?lián)持續(xù)過夜。酰化作用如早先所述通過在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在全部合成完成后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。產(chǎn)生的粗制凍干產(chǎn)物為119.7mg。肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+618.25，計(jì)算值MH+618.28)。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到42mg純度高于95％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為30％。
第二批干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中，并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端D-酪氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。在Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后N-末端氨基基團(tuán)由乙酸酐(1ml，10.5mmol)連同100μl溶于2ml DMF中的吡啶進(jìn)行乙?；?。該偶聯(lián)持續(xù)過夜。?；饔萌缭缦人鐾ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在全部合成完成后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。產(chǎn)生的粗制凍干產(chǎn)物為119.7mg。肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+618.29，計(jì)算值MH+618.28)。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到100mg純度高于99％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為71％。
合成實(shí)施例3.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行環(huán)(Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-Asn)(化合物3)的肽合成。
第一批干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中，并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理。第一個(gè)氨基酸Fmoc-Asp(OH)-OAll通過側(cè)鏈羧酸連接到TentaGel-S-Ram樹脂，它最終在裂解后會(huì)變成酰胺化的(Asn)。遵循“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中描述的步驟直到完成N-末端酪氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。在Fmoc基團(tuán)和烯丙基基團(tuán)去保護(hù)后(根據(jù)上文所述步驟)樹脂結(jié)合的肽用PyBop作為偶聯(lián)試劑如上文所述進(jìn)行環(huán)化，并且偶聯(lián)持續(xù)過夜。酰化作用如早先所述通過在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在全部合成完成后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干，產(chǎn)生57mg粗制產(chǎn)物。利用如上所述的制備HPLC純化后，收集到2.7mg純度高于95％的環(huán)狀肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為1.3％。肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+676.32，計(jì)算值MH+673.28)。
第二批干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中，并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理。第一個(gè)氨基酸Fmoc-Asp(OH)-OAll通過側(cè)鏈羧酸連接到TentaGel-S-Ram樹脂，它最終在裂解后會(huì)變成酰胺化的(Asn)。遵循“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中描述的步驟直到完成N-末端酪氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。在Fmoc基團(tuán)和烯丙基基團(tuán)去保護(hù)后(根據(jù)上文所述步驟)樹脂結(jié)合的肽用PyBop作為偶聯(lián)試劑如上文所述進(jìn)行環(huán)化，并且偶聯(lián)持續(xù)過夜。?；饔萌缭缦人鐾ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在全部合成完成后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干，產(chǎn)生57mg粗制產(chǎn)物。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到10mg純度高于99％的環(huán)狀肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為7％。肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+673.30，計(jì)算值MH+673.29)。
合成實(shí)施例4.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere Germany上進(jìn)行環(huán)(Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Asn)(化合物4)的肽合成。
第一批干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中，并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理。第一個(gè)氨基酸Fmoc-Asp(OH)-OAll通過側(cè)鏈羧酸連接到TentaGel-S-Ram樹脂，它最終在裂解后會(huì)變成酰胺化的(Asn)。遵循“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中描述的步驟直到完成N-末端酪氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。在Fmoc基團(tuán)和烯丙基基團(tuán)去保護(hù)后(根據(jù)上文所述步驟)樹脂結(jié)合的肽用PyBop作為偶聯(lián)試劑如上文所述進(jìn)行環(huán)化，并且偶聯(lián)持續(xù)過夜。?；饔萌缭缦人鐾ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在全部合成完成后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干以產(chǎn)生粗制產(chǎn)物。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集環(huán)狀肽產(chǎn)物。
第二批干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中，并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理。第一個(gè)氨基酸Fmoc-Asp(OH)-OAll通過側(cè)鏈羧酸連接到TentaGel-S-Ram樹脂，它最終在裂解后會(huì)變成酰胺化的(Asn)。遵循“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中描述的步驟直到完成N-末端酪氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。在Fmoc基團(tuán)和烯丙基基團(tuán)去保護(hù)后(根據(jù)上文所述步驟)樹脂結(jié)合的肽用PyBop作為偶聯(lián)試劑如上文所述進(jìn)行環(huán)化，并且偶聯(lián)持續(xù)過夜。酰化作用如早先所述通過在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在全部合成完成后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干結(jié)果產(chǎn)生粗制產(chǎn)物58.6mg。
利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到5.7mg純度高于98％的環(huán)狀肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為4.4％。肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+616.25，計(jì)算值MH+616.27)。
合成實(shí)施例5.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行H-Gly-Ala-Gly-D-Hyp-Pro-Tyr-NH2(化合物5)的肽合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中。并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端甘氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。?；饔萌缭缦人鐾ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在N-末端氨基基團(tuán)Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到46.6mg純度高于99％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為28.6％。
肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+576.27，計(jì)算值MH+576.26)。
合成實(shí)施例6.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere.Germany上進(jìn)行H-Gly-Ala-Gly-D-Pro-Pro-Tyr-NH2(化合物6)的肽合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中。并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端甘氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。酰化作用如早先所述通過在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在N-末端氨基基團(tuán)Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到26mg純度高于98％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為16.3％。
肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+560.25，計(jì)算值MH+560.28)。
合成實(shí)施例7.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行H-Gly-Ala-Gly-D-Pro-Ala-Tyr-NH2(化合物7)的肽合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中。并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端甘氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。酰化作用如早先所述通過在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在N-末端氨基基團(tuán)Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到18.9mg純度高于98％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為12.2％。
肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+534.25，計(jì)算值MH+534.26)。
合成實(shí)施例8.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行H-Gly-Ala-Gly-Gly-D-Pro-Tyr-NH2(化合物8)的肽合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中。并按照在 “TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端甘氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。?；饔萌缭缦人鐾ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在N-末端氨基基團(tuán)Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。粗物質(zhì)產(chǎn)率為130mg。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到70.1mg純度高于94％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為48.2％。
肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+520.25，計(jì)算值MH+520.56)。
合成實(shí)施例9.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行H-Gly-Ala-Gly-D-Hyp-Ala-Tyr-NH2(化合物9)的肽合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中。并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端甘氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。?；饔萌缭缦人鐾ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在N-末端氨基基團(tuán)Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。粗物質(zhì)產(chǎn)率為131mg。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到72.4mg純度高于92％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為49％。
肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+550.28，計(jì)算值MH+550.59)。
合成實(shí)施例10.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行H-Gly-Ala-Gly-D-Hyp-D-Pro-Tyr-NH2(化合物10)肽的合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中。并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端甘氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。?；饔萌缭缦人鐾ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在N-末端氨基基團(tuán)Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。粗物質(zhì)產(chǎn)率為150.8mg。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到93.1mg純度高于99％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為58％。
肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+576.63，計(jì)算值MH+576.63)。
合成實(shí)施例11.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行H-Gly-Ala-Gly-NCG-Pro-Tyr-NH2(化合物11)的肽合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中。并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端甘氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。?；饔萌缭缦人鐾ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在N-末端氨基基團(tuán)Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。粗物質(zhì)產(chǎn)率為24.3mg。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到10.2mg純度高于91％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為4％。
肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+602.23，計(jì)算值MH+602.32)。
合成實(shí)施例12.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行H-Gly-Ala-Gly-T4C-Pro-Tyr-NH2(化合物12)的肽合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中。并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端甘氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。?；饔萌缭缦人鐾ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在N-末端氨基基團(tuán)Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。粗物質(zhì)產(chǎn)率為29.9mg。利用如上所述的制備HPLC純化后，收集到19mg純度高于97％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為50％。
肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+578.18，計(jì)算值MH+578.23)。
合成實(shí)施例13.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行H-Gly-Ala-Gly-A2C-Pro-Tyr-NH2(化合物13)的肽合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中。并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端甘氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。?；饔萌缭缦人鐾ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在N-末端氨基基團(tuán)Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。粗物質(zhì)產(chǎn)率為27.3mg。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到12.7mg純度高于97％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為34％。
肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+546.28，計(jì)算值MH+546.55)。
合成實(shí)施例14.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行H-Gly-Ala-Gly-PC-Pro-Tyr-NH2(化合物14)的肽合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中。并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端甘氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。?；饔萌缭缦人鐾ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在N-末端氨基基團(tuán)Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。粗物質(zhì)產(chǎn)率為23.4mg。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到13.5mg純度高于97％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為34.6％。
肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+574.32，計(jì)算值MH+574.29)。
合成實(shí)施例15.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行Ac-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2(化合物15)的肽合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中。并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端酪氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。在Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后，N-末端氨基基團(tuán)由乙酸酐(1ml，10.5mmol)連同100μl溶于2ml DMF中的吡啶進(jìn)行乙?；Ｔ撆悸?lián)持續(xù)過夜。?；饔萌缭缦人鐾ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在完成合成后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。在N-末端氨基基團(tuán)Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。粗物質(zhì)產(chǎn)率為89.9mg。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到80.1mg純度高于99％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為58.9％。
肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+618.30，計(jì)算值MH+618.28)。
合成實(shí)施例16.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere Germany上進(jìn)行H-Cys(Acm)-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Cys(Acm)-NH2(化合物16)的肽合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中。并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端胱氨酸(Acm)的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。?；饔萌缭缦人鐾ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在N-末端氨基基團(tuán)Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。粗物質(zhì)產(chǎn)率為47.3mg。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到29.1mg純度高于97％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為12.9％。
肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+924.50，計(jì)算值MH+924.36)。
合成實(shí)施例17.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行H-Cys(Acm)-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Cys(Acm)-NH2(化合物17)的肽合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中。并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端胱氨酸(Acm)的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。?；饔萌缭缦人鐾ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在N-末端氨基基團(tuán)Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。粗物質(zhì)產(chǎn)率為45.67mg。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到29.15mg純度高于94％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為14.9％。
肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+796.25，計(jì)算值MH+796.30)。
合成實(shí)施例18.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行H-Cys(Acm)-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-Cys(Acm)-NH2(化合物18)的肽合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中。并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端胱氨酸(Acm)的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。?；饔萌缭缦人鐾ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在N-末端氨基基團(tuán)Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。粗制凍干產(chǎn)物用HPLC分析和純化，并以與化合物17相似的方式表征。
合成實(shí)施例19.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行H-Cys(Acm)-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Cys(Acm)-NH2(化合物19)的肽合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中。并按照在“TentaGeI樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端胱氨酸(Acm)的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。酰化作用如早先所述通過在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在N-末端氨基基團(tuán)Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到2.76mg純度高于94％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為17.9％。
肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+796.25，計(jì)算值MH+796.30)。
合成實(shí)施例20. (化合物20)的合成19mg肽H-Cys-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Cys-NH2通過將其溶解于1.5ml(5％乙酸溶于水和DMSO 4∶1 V/V pH～6)中氧化?；旌衔镌诒渲蟹胖?天。
利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到91mg純度高于97％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為47％。
肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+652.29，計(jì)算值MH+652.21)。
合成實(shí)施例21. 化合物21)的合成32mg肽H-Cys-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-Cys-NH2通過將其溶解于1.5ml(5％乙酸溶于水和DMSO 4∶1 V/V pH～6)中氧化?；旌衔镌诒渲蟹胖?天。
利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到6.13mg純度高于99％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為3％。
肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+652.23，計(jì)算值MH+652.21)。
合成實(shí)施例22.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行H-Gly-D-Ala-Gly-D-Hyp-D-Pro-D-Tyr-NH2(化合物22)的肽合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中。并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端甘氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。?；饔萌缭缦人鐾ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在N-末端氨基基團(tuán)Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到47mg純度高于94％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為30％。
肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+576.26，計(jì)算值MH+576.26)。
合成實(shí)施例23.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行H-Gly-D-Ala-Gly-D-Hyp-D-Pro-D-Tyr-D-Asn-OH(化合物23)的肽合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中。并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端甘氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。酰化作用如早先所述通過在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在N-末端氨基基團(tuán)Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。產(chǎn)生粗物質(zhì)93.7mg。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到60.7mg純度高于93％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為47.5％。
肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+690.32，計(jì)算值MH+690.30)。
合成實(shí)施例24.Ac-D-Tyr(3，5-二-碘)-D-Pro-D-Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2(化合物24)的合成40.6mg(64μmol)肽(化合物2)溶解于10ml 0.1M磷酸鹽緩沖液pH 6.5(溶液A)中。
75.6mg KI(400μmol)溶解于10ml磷酸鹽緩沖液pH 6.5中，并加入120碘珠(IODO-BEADS，N-氯-苯磺酰胺，氧化能力0.55μmol/珠；PIERCE，28665ZZ)，而且該溶液在室溫留置10分鐘(溶液B)。
合并溶液A和B并輕輕攪拌15分鐘。碘處的肽利用如上所述的制備型HPLC分離和純化，收集到39.5mg純度高于90％的肽產(chǎn)物。肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+870.09，計(jì)算值MH+870.08)。
合成實(shí)施例25.Ac-D-Tyr(單-碘)-D-Pro-D-Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2(化合物25)的合成40.6mg(64μmol)肽(化合物2)溶解于10ml 0.1M磷酸鹽緩沖液pH 6.5(溶液A)中。
75.6mg KI(400μmol)溶解于10ml磷酸鹽緩沖液pH 6.5中，并加入120碘珠(IODO-BEADS，N-氯-苯磺酰胺，氧化能力0.55μmol/珠；PIERCE，28665ZZ)，而且該溶液在室溫留置10分鐘(溶液B)。
合并溶液A和B并輕輕攪拌15分鐘。碘化的肽利用如上所述的制備型HPLC分離和純化，收集到3.3mg純度高于90％的肽產(chǎn)物。肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+744.19，計(jì)算值MH+744.18)。
合成實(shí)施例26.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-(1，213C，15N-Gly)-D-Ala-(1，213C，15N-Gly)-NH2(化合物26)的肽合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中，并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端D-酪氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。在Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后N-末端氨基基團(tuán)由乙酸酐(1ml，10.5mmol)連同100μl溶于2ml DMF中的吡啶進(jìn)行乙?；Ｔ撆悸?lián)持續(xù)過夜。?；饔萌缭缦人鐾ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在全部合成完成后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。產(chǎn)生的粗物質(zhì)為142.4mg。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到79.7mg純度高于99％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為50％。
肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+624.25，計(jì)算值MH+624.26)。
合成實(shí)施例27.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行H-Pro-Tyr-Asn-Gly-Ala-Gly-Hyp-NH2(化合物27)的肽合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中。并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端脯氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。酰化作用如早先所述通過在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在N-末端氨基基團(tuán)Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到135.7mg純度高于98％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為82.7％。
肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+690.38，計(jì)算值MH+690.31)。
合成實(shí)施例28.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行H-Hyp-Pro-Tyr-Asn-Gly-Ala-Gly-NH2(化合物28)的肽合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中。并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端4-羥基-脯氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。酰化作用如早先所述通過在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在N-末端氨基基團(tuán)Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到127mg純度高于98％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為69.8％。
肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+690.25，計(jì)算值MH+690.31)。
合成實(shí)施例29.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行H-Sar-Ala-Sar-Hyp-Pro-Tyr-NH2(化合物29)的肽合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中。并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端肌氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。?；饔萌缭缦人鐾ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在N-末端氨基基團(tuán)Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。產(chǎn)生的粗物質(zhì)為150mg。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到85.5mg純度高于93％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為57％。
肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+604.33，計(jì)算值MH+604.30)。
合成實(shí)施例30.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行H-Gly-Ala-Sar-Hyp-Pro-Tyr-NH2(化合物30)的肽合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中。并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端甘氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。酰化作用如早先所述通過在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在N-末端氨基基團(tuán)Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。產(chǎn)生的粗物質(zhì)為124mg。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到64.8mg純度高于96％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為41.6％。
肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+590.19，計(jì)算值MH+590.29)。
合成實(shí)施例31.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行ASAL-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2(化合物31)的肽合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中。并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端脯氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。在Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后N-末端氨基基團(tuán)通過如上所述的標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)步驟用疊氮水楊酸乙酰化。該偶聯(lián)持續(xù)過夜。?；饔萌缭缦人鐾ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在全部合成完成后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到15.9mg純度高于94％的肽產(chǎn)物。
肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+575.23，計(jì)算值MH+575.56)。
合成實(shí)施例32.ASAL(單-碘)-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2(化合物32)的肽合成10.3mg肽(化合物31)溶解于2.5m1 0.1M磷酸鹽緩沖液pH 6.5(溶液A)中。
18.9mg KI(100μmol)溶解于2.5ml磷酸鹽緩沖液pH 6.5中，并加入30碘珠(IODO-BEADS，N-氯-苯磺酰胺，氧化能力0.55μmol/珠；PIERCE，28665ZZ)，而且該溶液在室溫留置10分鐘(溶液B)。
合并溶液A和B并輕輕攪拌1小時(shí)。碘化的肽利用如上所述的制備型HPLC分離和純化，收集到4.4mg純度高于99％的肽產(chǎn)物。肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+701.13，計(jì)算值MH+701.46)。
合成實(shí)施例33.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行AB-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2(化合物33)的肽合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中。并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端酪氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。在Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后N-末端氨基基團(tuán)通過如上所述的標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)步驟用疊氮苯甲酸乙?；?。該偶聯(lián)持續(xù)過夜。?；饔萌缭缦人鐾ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在全部合成完成后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到20.5mg純度高于90％的肽產(chǎn)物。
肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+721.28，計(jì)算值MH+721.26)。
合成實(shí)施例34.AB-Tyr(3，5-二-碘)-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2(化合物34)的肽合成10.3mg肽(化合物34)溶解于2.5ml 0.1M磷酸鹽緩沖液pH 6.5(溶液A)中。
18.9mg KI(100μmol)溶解于2.5ml磷酸鹽緩沖液pH 6.5中，并加入30碘珠(IODO-BEADS，N-氯-苯磺酰胺，氧化能力0.55μmol/珠；PIERCE，28665ZZ)，而且該溶液在室溫留置10分鐘(溶液B)。
合并溶液A和B并輕輕攪拌1小時(shí)。碘化的肽利用如上所述的制備型HPLC分離和純化，收集到1.2mg純度高于90％的肽產(chǎn)物。肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+973.08，計(jì)算值MH+973.46)。
合成實(shí)施例35.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行環(huán)(-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Gln-)(化合物35)的肽合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中，并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理。第一個(gè)氨基酸Fmoc-Glu(OH)-OAll通過側(cè)鏈羧酸連接到TentaGel-S-Ram樹脂，它最終在裂解后會(huì)變成酰胺化的(Gln)。遵循“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中描述的步驟直到完成N-末端甘氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。在Fmoc基團(tuán)和烯丙基基團(tuán)去保護(hù)后(根據(jù)上文所述步驟)樹脂結(jié)合的肽用PyBop作為偶聯(lián)試劑如上文所述進(jìn)行環(huán)化，并且偶聯(lián)持續(xù)過夜。酰化作用如早先所述通過在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在全部合成完成后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。產(chǎn)生的粗物質(zhì)為135.3mg。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到19.1mg純度高于98％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為6.6％。
肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+687.38，計(jì)算值MH+687.32)。
合成實(shí)施例36.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行環(huán)(-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Asn-)(化合物36)的肽合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23 mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中，并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理。第一個(gè)氨基酸Fmoc-Asp(OH)-OAll通過側(cè)鏈羧酸連接到TentaGel-S-Ram樹脂，它最終在裂解后會(huì)變成酰胺化的(Asn)。遵循“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中描述的步驟直到完成N-末端甘氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。在Fmoc基團(tuán)和烯丙基基團(tuán)去保護(hù)后(根據(jù)上文所述步驟)樹脂結(jié)合的肽用PyBop作為偶聯(lián)試劑如上文所述進(jìn)行環(huán)化，并且偶聯(lián)持續(xù)過夜。?；饔萌缭缦人鐾ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在全部合完成成后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。產(chǎn)生的粗物質(zhì)為63.4mg。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到13.2mg純度高于97％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為6.2％。
肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+673.38，計(jì)算值MH+673.30)。
合成實(shí)施例37.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行環(huán)(-Gly-Ala-Gly-Pro-Pro-Tyr-Asn-)(化合物37)的肽合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中，并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理。第一個(gè)氨基酸Fmoc-Asp(OH)-OAll通過側(cè)鏈羧酸連接到TentaGel-S-Ram樹脂，它最終在裂解后會(huì)變成酰胺化的(Asn)。遵循“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中描述的步驟直到完成N-末端甘氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。在Fmoc基團(tuán)和烯丙基基團(tuán)去保護(hù)后(根據(jù)上文所述步驟)樹脂結(jié)合的肽用PyBop作為偶聯(lián)試劑如上文所述進(jìn)行環(huán)化，并且偶聯(lián)持續(xù)過夜。?；饔萌缭缦人鐾ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在全部合成完成后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。產(chǎn)生的粗物質(zhì)為85.1mg。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到9.8mg純度高于98％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為3.5％。
肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+657.38，計(jì)算值MH+657.31)。
合成實(shí)施例38.環(huán)(Tyr(3，5-二碘)-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-Asn)(化合物38)的合成10.3mg肽(化合物3)溶解于2.5ml 0.1M磷酸鹽緩沖液pH 6.5(溶液A)中。
18.9mg KI(400μmol)溶解于2.5ml磷酸鹽緩沖液pH 6.5中，并加入30碘珠(IODO-BEADS，N-氯-苯磺酰胺，氧化能力0.55μmol/珠；PIERCE，28665ZZ)，而且該溶液在室溫留置10分鐘(溶液B)。
合并溶液A和B并輕輕攪拌2小時(shí)。碘化的肽利用如上所述的制備型HPLC分離和純化，收集到9.8mg純度高于95％的肽產(chǎn)物。肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+925.10，計(jì)算值MH+925.30)。
合成實(shí)施例39.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行H-Gly-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH2(化合物39)的肽合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中，并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端甘氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。酰化作用如早先所述通過在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在N-末端氨基基團(tuán)Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。產(chǎn)生的粗物質(zhì)為124mg。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到26.5mg純度高于96％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為20.5％。
肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+480.24，計(jì)算值MH+480.50)。
合成實(shí)施例40.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行Ac-Gly-Asn-Tyr-NH2(化合物40)的肽合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中，并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端甘氨酸的偶聯(lián)。在Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后N-末端氨基基團(tuán)由乙酸酐(1ml，10.5mmol)連同100μl溶于2mlDMF中的吡啶進(jìn)行乙?；?。該偶聯(lián)持續(xù)過夜。?；饔萌缭缦人鐾ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。N-末端氨基基團(tuán)?；?，肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。產(chǎn)生的粗物質(zhì)為90.4mg。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到63.4mg純度高于99％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為65.1％。
肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+394.16，計(jì)算值MH+394.20)。
合成實(shí)施例41.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行H-Gly-Asn-Tyr-NH2(化合物41)的肽合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中，并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端甘氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。酰化作用如早先所述通過在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在N-末端氨基基團(tuán)Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。產(chǎn)生的粗物質(zhì)為91.4mg。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到62.1mg純度高于95％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為54.5％。
肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+352.16，計(jì)算值MH+352.18)。
合成實(shí)施例42.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行Ac-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH2(化合物42)的肽合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中，并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端丙氨酸的偶聯(lián)。在Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后N-末端氨基基團(tuán)由乙酸酐(1ml，10.5mmol)連同100μl溶于2mlDMF中的吡啶進(jìn)行乙?；Ｔ撆悸?lián)持續(xù)過夜。?；饔萌缭缦人鐾ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。N-末端氨基基團(tuán)?；?，肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上剪切下來并從乙酸中凍干。產(chǎn)生的粗制原料為105mg。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到52mg純度高于98％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為45％。
肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+465.22，計(jì)算值MH+465.30)。
合成實(shí)施例43.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行H-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH2(化合物43)的肽合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中，并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端丙氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。?；饔萌缭缦人鐾ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在N-末端氨基基團(tuán)Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。產(chǎn)生的粗物質(zhì)為104.5mg。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到77.8mg純度高于96％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為58.8％。
肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+423.19，計(jì)算值MH+423.28)。
合成實(shí)施例44.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行環(huán)(-Tyr-Ala-Ser-Ala-Gly-Asn-)(化合物44)的肽合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中，并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理。第一個(gè)氨基酸Fmoc-Asp(OH)-OAll通過側(cè)鏈羧酸連接到TentaGel-S-Ram樹脂，它最終在裂解后會(huì)變成酰胺化的(Asn)。遵循“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中描述的步驟直到完成N-末端酪氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。在Fmoc基團(tuán)和烯丙基基團(tuán)去保護(hù)后(根據(jù)上文所述步驟)樹脂結(jié)合的肽用PyBop作為偶聯(lián)試劑如上文所述進(jìn)行環(huán)化，并且偶聯(lián)持續(xù)過夜。酰化作用如早先所述通過在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在全部合成完成后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。產(chǎn)生的粗物質(zhì)為60.2mg。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到5.0mg純度高于87％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為4.3％。
肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+564.25，計(jì)算值MH+564.57)。
合成實(shí)施例45.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行環(huán)(-Tyr-Gly-Asn-Tyr-Gly-Asn-)(化合物45)的肽合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中，并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理。第一個(gè)氨基酸Fmoc-Asp(OH)-OAll通過側(cè)鏈羧酸連接到TentaGel-S-Ram樹脂，它最終在裂解后會(huì)變成酰胺化的(Asn)。遵循“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中描述的步驟直到完成N-末端酪氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。在Fmoc基團(tuán)和烯丙基基團(tuán)去保護(hù)后(根據(jù)上文所述步驟)樹脂結(jié)合的肽用PyBop作為偶聯(lián)試劑如上文所述進(jìn)行環(huán)化，并且偶聯(lián)持續(xù)過夜。?；饔萌缭缦人鐾ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在全部合成完成后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。產(chǎn)生的粗物質(zhì)為79.1mg。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到20mg純度高于90％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為14.0％。
肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+569.25，計(jì)算值MH+569.67)。
合成實(shí)施例46.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行環(huán)(-Tyr-Gly-Asn-Tyr-Ala-Gly-Asn-)(化合物46)的肽合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中，并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理。第一個(gè)氨基酸Fmoc-Asp(OH)-OAll通過側(cè)鏈羧酸連接到TentaGel-S-Ram樹脂，它最終在裂解后會(huì)變成酰胺化的(Asn)。遵循“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中描述的步驟直到完成N-末端酪氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。在Fmoc基團(tuán)和烯丙基基團(tuán)去保護(hù)后(根據(jù)上文所述步驟)樹脂結(jié)合的肽用PyBop作為偶聯(lián)試劑如上文所述進(jìn)行環(huán)化，并且偶聯(lián)持續(xù)過夜。?；饔萌缭缦人鐾ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在全部合成完成后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。產(chǎn)生的粗物質(zhì)為58.9mg。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到15.9mg純度高于98％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為11％。
肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+740.31，計(jì)算值MH+740.75)。
合成實(shí)施例47.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行環(huán)(-Tyr-Val-Ser-Gly-Ala-Gly-Asn-)(化合物47)的肽合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中，并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理。第一個(gè)氨基酸Fmoc-Asp(OH)-OAll通過側(cè)鏈羧酸連接到TentaGel-S-Ram樹脂，它最終在裂解后會(huì)變成酰胺化的(Asn)。遵循“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中描述的步驟直到完成N-末端酪氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。在Fmoc基團(tuán)和烯丙基基團(tuán)去保護(hù)后(根據(jù)上文所述步驟)樹脂結(jié)合的肽用PyBop作為偶聯(lián)試劑如上文所述進(jìn)行環(huán)化，并且偶聯(lián)持續(xù)過夜。酰化作用如早先所述通過在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在全部合成完成后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。產(chǎn)生的粗物質(zhì)為54.1mg。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到19.6mg純度高于95％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為15％。
肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+649.10，計(jì)算值MH+649.68)。
合成實(shí)施例48.在TentaGel-S-NH-2；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行H-Gly-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-OH(化合物CE-1)的肽合成。
干燥TentaGel-S-NH-2(0.27 mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中，并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端甘氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。酰化作用如早先所述通過在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在N-末端氨基基團(tuán)Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到16.9mg純度高于92％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為10.1％。
肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+471.22，計(jì)算值MH+471.21)。
合成實(shí)施例49.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-NH2(化合物CE-2)的肽合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中，并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端甘氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。?；饔萌缭缦人鐾ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在N-末端氨基基團(tuán)Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。產(chǎn)生的粗物質(zhì)為159mg。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到101mg純度高于98％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為60％。
肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+576.26，計(jì)算值MH+576.26)。
合成實(shí)施例50.在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行3-(4-羥基苯基)丙酰-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2(化合物CE-3)的肽合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，lg)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中，并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端脯氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。在Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后N-末端氨基基團(tuán)通過如上所述的標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)步驟用3-(4-羥基苯基)丙酸乙?；?。該偶聯(lián)持續(xù)過夜。?；饔萌缭缦人鐾ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在全部合成完成后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。產(chǎn)生的粗物質(zhì)為143mg。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到73.7mg純度高于95％的肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為50％。
肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+561.30，計(jì)算值MH+561.24)。
本發(fā)明化合物的合成實(shí)施例51K6延伸肽的合成在TentaGel-S-NH2；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-OH(化合物48)肽合成。
干燥TentaGel-S-NH2(0.27mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中，并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端甘氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜并如早先所述通過在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在N-末端氨基基團(tuán)Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+1344.7，計(jì)算值MH+1344.82)。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到121mg純度高于99％的肽產(chǎn)物。
在TentaGel-S-NH2；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行肽3(4-羥基苯基)丙酰-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-OH(化合物49)的合成。
干燥TentaGel-S-NH2(0.27mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中。并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端脯氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。在Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后N-末端氨基基團(tuán)通過如上所述的標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)步驟用3(4-羥基苯基)丙酸乙酰化。該偶聯(lián)持續(xù)過夜。?；饔萌缭缦人鐾ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在全部合成完成后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+1329.88，計(jì)算值MH+1329.81)。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到99.7mg純度高于98％的肽產(chǎn)物。
在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行肽H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2(化合物50)的合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中，并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端甘氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。?；饔萌缭缦人鐾ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在N-末端氨基基團(tuán)Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+1343.6，計(jì)算值MH+1343.84)。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到84.7mg純度高于98％的肽產(chǎn)物。
在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行肽3(4-羥基苯基)丙酰-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2(化合物51)的合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中，并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端脯氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。N-末端氨基基團(tuán)在Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后通過如上所述的標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)步驟用3(4-羥基苯基)丙酸乙酰化。該偶聯(lián)持續(xù)過夜。?；饔萌缭缦人鐾ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在全部合成完成后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。粗制凍干產(chǎn)物的產(chǎn)量為299mg。肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+1328.9，計(jì)算值MH+1329.1)。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到155mg純度高于94％的肽產(chǎn)物。
實(shí)施例52H-Gly-ψ(CH2-NH)-Asn-Tyr-OH×TFA(化合物52)的合成1)Boc-Asn-Tyr(tBu)-OtBuBoc-Asn-OH(3.5g 15mmol)溶解于二氯甲烷(100ml，戊烯穩(wěn)定的，不含醇)中并加入HOBt(2.24g無水16.5mmol)。該混合物在冰/水浴中冷卻并加入DIC(2.45ml 16mmol)。讓該混合物反應(yīng)20分鐘。底部的HOBt將會(huì)反應(yīng)而且會(huì)形成DIU沉淀(在頂部)。H-Tyr(tBu)-OtBu×HCl(5.1g 15.4mmol)溶解于DMF(30ml無水)中。含有活性酯的二氯甲烷混合物從DIU直接過濾到DMF溶液中。合并的混合物在冰/水浴中冷卻并加入NMM(1.75ml 15.8mmol)。讓該混合物過夜反應(yīng)。真空除去溶劑。加入200ml乙酸乙酯，去除沉淀，并將溶液用檸檬酸(2×50ml 10％)、碳酸氫鈉(2×50ml飽和的)和鹽水(2×50ml)洗。該溶液用硫酸鎂干燥，真空除去溶劑，以0.2mBar 30分鐘結(jié)束。將該粗產(chǎn)物懸浮于戊烷(40ml)中，并從DIU沉淀中過濾。真空除去戊烷得到標(biāo)題的化合物。
2)Asn-Tyr×TFABoc-Asn-Tyr(tBu)-OtBu(7.1g 14mmol)溶解于TFA/EDT 19/1(30ml)中并使其靜置2小時(shí)。真空除去TFA并加入乙醚(200ml)以沉淀產(chǎn)物。將乙醚從以乙醚清洗(3×100ml)的產(chǎn)物中輕輕潷出。產(chǎn)物真空干燥得到無需進(jìn)一步純化即可用的產(chǎn)物。
3)Boc-Gly-ψ(CH2-NH)-Asn-Tyr-OHAsn-Tyr×TFA(5.6g 13.7mmol)和乙酸(1ml)溶解于甲醇(100ml無水)中并加入Boc-甘氨酸(2.72g 17mmol)?；旌衔飻嚢?0分鐘。接著在30分鐘內(nèi)分幾部分加入氰基硼氫鈉(2.15g)?；旌衔镌贁嚢?小時(shí)。真空除去大部分甲醇。加入乙酸乙酯(200ml)并且通過與飽和碳酸氫鈉(100ml)搖動(dòng)15分鐘水解硼復(fù)合物。乙酸乙酯進(jìn)一步用飽和碳酸氫鈉(100ml)清洗。合并的水相用乙酸乙酯(100ml)抽提。合并的有機(jī)相用鹽水(2×50ml)清洗并通過硫酸鎂干燥。真空除去乙酸乙酯得到所需的產(chǎn)物。
4)H-Gly-ψ(CH2-NH)-Asn-Tyr-OH×TFA類似于2)，起始于Boc-Gly-ψ(CH2-NH)-Asn-Tyr-OH(5.20g 11.9mmol)出產(chǎn)(預(yù)期)大約5.37g(100％)。分析純樣品可通過RP HPLC純化1g而獲得。預(yù)期產(chǎn)量大約90％，純度＞98％。
實(shí)施例53固相合成Ac-Gly-Asn-Tyr-NH2(化合物53)、環(huán)(Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-Asn)(化合物54)、Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2(化合物55)、Ac-Asn-Tyr-NH2(化合物56)、Ac-Gly-Tyr-NH2(化合物57)、羥基乙?；?Asn-Tyr-NH2(化合物58)，H-Gly(YCH2NH)-Gly-Tyr-NH2(化合物59)及H-Gly-Asn-Phe(pNO2)-NH2(化合物60)。
固相合成的一般方法在Larsen，B.D等標(biāo)題為新的肽綴合物的PCT申請PCT/US01/19113中有報(bào)道。
在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行環(huán)(Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-Asn)(化合物54)的肽合成。
第一批干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中，并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理。第一個(gè)氨基酸Fmoc-Asp(OH)-OAll通過側(cè)鏈羧酸連接到TentaGel-S-Ram樹脂，它最終在裂解后會(huì)變成酰胺化的(Asn)。遵循“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中描述的步驟直到完成N-末端酪氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。在Fmoc基團(tuán)和烯丙基基團(tuán)去保護(hù)后(根據(jù)上文所述步驟)樹脂結(jié)合的肽用PyBop作為偶聯(lián)試劑如上文所述進(jìn)行環(huán)化，并且偶聯(lián)持續(xù)過夜。?；饔萌缭缦人鐾ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在全部合成完成后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干，產(chǎn)生57mg粗制產(chǎn)物。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到2.7mg純度高于95％的環(huán)狀肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為1.3％。肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+673.32，計(jì)算值MH+673.28)。
第二批干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中，并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理。第一個(gè)氨基酸Fmoc-Asp(OH)-OAll通過側(cè)鏈羧酸連接到TentaGel-S-Ram樹脂，它最終在裂解后會(huì)變成酰胺化的(Asn)。遵循“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中描述的步驟直到完成N-末端酪氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。在Fmoc基團(tuán)和烯丙基基團(tuán)去保護(hù)后(根據(jù)上文所述步驟)樹脂結(jié)合的肽用PyBop作為偶聯(lián)試劑如上文所述進(jìn)行環(huán)化，并且偶聯(lián)持續(xù)過夜。酰化作用如早先所述通過在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在全部合成完成后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干，產(chǎn)生57mg粗制產(chǎn)物。利用如上所述的制備型HPLC純化后，收集到10mg純度高于99％的環(huán)狀肽產(chǎn)物。純化肽產(chǎn)物的總產(chǎn)率為7％。肽的鑒定由ES-MS證實(shí)(實(shí)測值MH+673.30，計(jì)算值MH+673.29)。
在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行肽Ac-Asn-Tyr-NH2(化合物56)的合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中，并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端天冬酰胺的偶聯(lián)。在Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后N-末端氨基基團(tuán)由乙酸酐(1ml，10.5mmol)連同100μl溶于2ml DMF中的吡啶進(jìn)行乙?；?。該偶聯(lián)持續(xù)過夜。?；饔萌缭缦人鐾ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。N-末端氨基基團(tuán)?；?，肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。
在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行肽Ac-Gly-Tyr-NH2(化合物57)的合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmoL/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中，并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端甘氨酸的偶聯(lián)。在Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后N-末端氨基基團(tuán)由乙酸酐(1ml，10.5mmol)連同100μl溶于2mlDMF中的吡啶進(jìn)行乙酰化。該偶聯(lián)持續(xù)過夜。酰化作用如早先所述通過在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。N-末端氨基基團(tuán)?；?，肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。
在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行羥基乙?；?Asn-Tyr-NH2(化合物58)的肽合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中，并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端天冬酰胺的偶聯(lián)。在Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后N-末端氨基基團(tuán)通過如上所述的標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)步驟用羥基乙酸乙酰化。該偶聯(lián)持續(xù)過夜。?；饔萌缭缦人鐾ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。N-末端氨基基團(tuán)?；?，肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。
在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行肽H-Gly(YCH2NH)-Gly-Tyr-NH2(化合物59)的合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中，并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成C-末端酪氨酸的偶聯(lián)。在Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后N-末端氨基基團(tuán)通過如上所述的標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)步驟用溴乙酸乙酰化。該偶聯(lián)持續(xù)過夜。酰化作用如早先所述通過在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。N-末端氨基基團(tuán)?；螅?樹脂用大量過量的溶于DMF中的乙二胺處理。反應(yīng)持續(xù)過夜。然后肽樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。
在TentaGel-S-Ram；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行肽H-Gly-Asn-Phe(pNO2)-NH2(化合物60)的合成。
干燥TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中，并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端甘氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。?；饔萌缭缦人鐾ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后肽樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。
實(shí)施例54Gly-(DBF)-Tyr-NH2×TFA(化合物61)的合成固相合成的一般方法在Larsen，B.D等標(biāo)題為新的肽綴合物的PCT申請PCT/US01/19113中有報(bào)道，并有下列變化。
在TentaGel-S-RAM樹脂上的分批肽合成(PEG-PS)TentaGel樹脂(1g，0.22-0.31mmol/g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中。樹脂在DMF中(15ml)膨脹，，并除去Fmoc基團(tuán)，參見N-α-氨基保護(hù)基團(tuán)(Fmoc)的去保護(hù)。氨基酸按照序列如前所述作為預(yù)先形成的Fmoc-保護(hù)的HOBt酯(3eq.)偶聯(lián)。偶聯(lián)持續(xù)2小時(shí)，除非另有說明。樹脂瀝干并用DMF沖洗(5×15ml，每次5分鐘)以除去過量的試劑。所有的?；饔猛ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)檢測。在全部合成完成后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次5分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)最后用二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
氨基酸4-(Fmoc-2-氨乙基)-6-二苯并呋喃丙酸(Fmoc-DBF-OH)購自Neosystem，Strassbourg法國。
分析型HPLC柱VYDAC 238TP5415 150×4.6mm單體RP C18 5μm 300_流量1.00ml/分鐘溫度40℃檢測215nm梯度10-1.5分鐘 A1.5-25分鐘線性梯度至50％B25-30分鐘線性梯度至100％B30-35分鐘B35-40分鐘線性梯度至A40-45分鐘 A用酸自樹脂裂解肽用95％三氟乙酸(TFA，Riedel-de H_en，F(xiàn)rankfurt，Germany和5％乙二硫醇V/V室溫處理2小時(shí)將肽從樹脂上裂解下來。過濾的樹脂用TFA沖洗，濾液和沖洗液減壓壓縮至5-10％。向殘余物加入10倍的乙醚以沉淀肽，在燒結(jié)的玻璃過濾器中沖洗過濾，以乙醚沖洗并在excicator中經(jīng)P2O5真空干燥。粗制產(chǎn)物用高效液相色譜(HPLC)分析，并用電噴射離子化質(zhì)譜測量法(ESMS)鑒定。
Gly-(DBF)-Tyr-NH2×TFA(化合物61)的合成TentaGel-S-RAM-FMOC(0.23mmol/g，1.02g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中，而且樹脂在DMF中膨脹并按照在“TentaGel-S-RAM樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端甘氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。Fmoc-DBF-OH在DMF中溶解性不佳，因而與DIC反應(yīng)之前將在DMF中的該被保護(hù)的氨基酸和HOBt懸液加熱到50℃并加入10％NMP。肽如上文所述從樹脂上裂解下來，產(chǎn)出101.3mg(70％)。HPLC顯示93％的純度。
在帶有自動(dòng)級分收集的Biocad上利用RP-HPLC進(jìn)行純化。
柱Kromasil RP C8；K 100-10-C8 250×50.8mm。
溫度室溫大約20℃流速35ml/分鐘檢測UV在215nm和280nm。
緩沖液A在水中的0.10％TFA。緩沖液B0.10％TFA、9.9％水、90％乙腈。
梯度起始于純A。5分鐘內(nèi)急升至20％B，然后50分鐘內(nèi)梯度至60％B。合并含有純產(chǎn)物的級分并凍干產(chǎn)生79.4mg(55％樹脂裝載量)的白色物質(zhì)，根據(jù)HPLC純度99％。保留時(shí)間10.2分鐘(分析梯度1)。MS顯示預(yù)期的502.21的單一同位素質(zhì)量。
化合物以下式代表 PCT/US01/19113申請公開的內(nèi)容并入本文作為參考。
實(shí)施例55在TentaGel-S-NH2；Rapp polymere，Germany上進(jìn)行肽Gly-Dapa-Gly-Hyp-Pro-Tyr(化合物62)的合成。
干燥TentaGel-S-NH2(0.27mmol/g，1g)放置在配備有過濾用的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中，并按照在“TentaGel樹脂上的分批肽合成”中的描述進(jìn)行處理直到完成N-末端Fmoc-甘氨酸的偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)均持續(xù)過夜。?；饔萌缭缦人鐾ㄟ^在80℃進(jìn)行的茚三酮試驗(yàn)測試。在全部合成完成后肽-樹脂用DMF(3×15ml，每次1分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)、二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)沖洗并真空干燥。
肽如上文所述從樹脂上裂解下來并從乙酸中凍干。
Fmoc-保護(hù)的肽溶解于DMF中并用PyBOP_(苯并三唑-1-基氧-三磷_六氟磷酸)作為偶聯(lián)試劑如上所述進(jìn)行環(huán)化。環(huán)化反應(yīng)持續(xù)過夜。在加入乙醚后沉淀環(huán)化肽并過濾分離。粗制環(huán)化肽用乙醚沖洗(×3)并溶于含20％V/V哌啶的DMF中以除去N-末端Fmoc-基團(tuán)。粗制的去保護(hù)肽在加入乙醚后過濾分離。沉淀物溶解于乙酸并凍干。粗制肽用制備型HPLC如上所述純化。
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權(quán)利要求
1.式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8中的化合物在制備藥物方面的用途。
2.式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8中的化合物在制備用于治療心律失常的藥物方面的用途。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求的用途，其中所述心律失常為心房或心室起源的折返心律失常，包括交替復(fù)極心律失常，其中室上性和室性快速心律失常均可表現(xiàn)為心動(dòng)過速、撲動(dòng)或纖維性顫動(dòng)。
4.式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8中的化合物在制備用于預(yù)防和/或治療心臟中減緩的傳導(dǎo)的藥物方面的用途。
5.式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8中的化合物在制備用于改善心臟收縮性的藥物方面的用途。
6.式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8中的化合物在制備用于治療在代謝應(yīng)激包括葡萄糖和氧剝奪期間與削弱的GJIC相關(guān)的疾病狀態(tài)的藥物方面的用途。
7.式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8中的化合物在制備用于抗血栓形成治療的藥物方面的用途。
8.式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8中的化合物在制備用于預(yù)防和/或治療骨質(zhì)疏松癥的藥物方面的用途。
9.式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8中的化合物在制備用于預(yù)防和/或治療關(guān)節(jié)病包括關(guān)節(jié)炎的藥物方面的用途。
10.式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8中的化合物在制備用于預(yù)防和/或治療血管化差的軟骨和關(guān)節(jié)疾病包括關(guān)節(jié)炎的藥物方面的用途。
11.式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8中的化合物在制備用于預(yù)防和/或治療骨丟失和增加骨折愈合的藥物方面的用途。
12.式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8中的化合物在制備用于預(yù)防和/或治療在角膜營養(yǎng)不良的疾病狀態(tài)下角膜的血管化以及增加角膜損害愈合的藥物方面的用途。
13.式I到VIII、式2到12的化合物以及本文表1和8中的化合物在制備用于治療傷口特別是局部缺血性潰瘍的藥物方面的用途。
14.式I到VIII、式2到12的化合物以及本文表1和8中的化合物在制備用于治療胃和十二指腸潰瘍的藥物方面的用途。
15.增加血管壁中間隙連接偶聯(lián)和/或GJIC的式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8化合物在制備用于預(yù)防和/或治療高血壓的藥物方面的用途。
16.式I到VIII、式2到12的化合物以及本文表1和8中的化合物在制備用于預(yù)防腦局部缺血性損傷和治療可呈現(xiàn)出諸如抑郁、焦慮、學(xué)習(xí)和記憶缺陷、恐怖癥或幻覺的癥狀的器質(zhì)性精神病的藥物方面的用途。
17.式I到VIII、式2到12的化合物以及本文表1和8中的化合物在制備用于預(yù)防和/或治療白內(nèi)障的藥物方面的用途。
18.式I到VIII、式2到12的化合物以及本文表1和8中的化合物在制備用于預(yù)防和/或治療與削弱的GJIC相關(guān)的耳聾的藥物方面的用途。
19.式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8中的化合物在制備用于預(yù)防和/或治療腸胃運(yùn)動(dòng)紊亂的藥物方面的用途。
20.式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8中的化合物在制備用于治療因卵巢中細(xì)胞-到-細(xì)胞偶聯(lián)差而致的雌性不育的藥物方面的用途。
21.式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8中的化合物在制備用于聯(lián)合催產(chǎn)素一起誘導(dǎo)和易化分娩的藥物方面的用途。
22.式I到VIII、式2到12的化合物以及本文表1和8中的化合物在制備用于治療與削弱的細(xì)胞-到-細(xì)胞偶聯(lián)相關(guān)的雄性不育的藥物方面的用途。
23.式I到VIII、式2到12的化合物以及本文表1和8中的化合物在制備用于改善因β-細(xì)胞之間削弱的GJIC而致的非-胰島素依賴型糖尿病患者的葡萄糖耐受的藥物方面的用途.
24.一種治療心律失常的方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8中的化合物。
25.根據(jù)前述權(quán)利要求的治療方法，其中所述心律失常為心房或心室起源的折返心律失常，包括交替復(fù)極心律失常，其中室上性和室性快速心律失常均可表現(xiàn)為心動(dòng)過速、撲動(dòng)或纖維性顫動(dòng)，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8中的化合物。
26.一種增加經(jīng)受葡萄糖和/或氧剝奪的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的間隙連接胞間通訊的方法，包括給予有效量的式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8中的化合物.
27.一種抗血栓形成治療方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8中的化合物。
28.一種治療骨質(zhì)疏松癥的方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8中的化合物。
29.一種治療或預(yù)防骨丟失和增加骨折愈合的方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8中的化合物。
30.一種治療關(guān)節(jié)病包括關(guān)節(jié)炎的方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8中的化合物。
31.一種治療內(nèi)胚層、中胚層或外胚層起源組織癌癥包括癌和肝細(xì)胞及膽管細(xì)胞腫瘤以及骨癌的方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8中的化合物。
32.一種治療傷口特別是局部缺血性潰瘍的方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8中的化合物。
33.一種治療皮膚傷口或損害的方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8中的化合物。
34.一種治療口腔粘膜傷口或損害的方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8中的化合物。
35.一種治療胃和十二指腸潰瘍的方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8中的化合物。
36.一種通過增加血管壁間隙連接偶聯(lián)和/或GJIC來治療或預(yù)防高血壓的方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8中的化合物。
37.一種預(yù)防腦局部缺血性損傷和治療可表現(xiàn)出如抑郁、焦慮、學(xué)習(xí)和記憶缺陷、恐怖或幻覺的癥狀的器質(zhì)性精神病的方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8中的化合物。
38.一種治療與削弱的GJIC相關(guān)的耳聾的方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8中的化合物。
39.一種治療胃腸運(yùn)動(dòng)紊亂的方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8中的化合物。
40.一種治療因卵巢中細(xì)胞-到-細(xì)胞偶聯(lián)差而致的雌性不育的方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8中的化合物。
41.一種誘導(dǎo)和易化分娩的方法，包括向需要這種治療的患者聯(lián)合催產(chǎn)素一起給予治療有效量的式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8中的化合物。
42.一種治療與削弱的細(xì)胞-到-細(xì)胞偶聯(lián)相關(guān)的雄性不育的方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8中的化合物。
43.一種改善因β-細(xì)胞之間削弱的GJIC而致的非-胰島素依賴性糖尿病患者的葡萄糖耐受的方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8中的化合物。
44.一種治療或預(yù)防血管化差的軟骨和關(guān)節(jié)疾病的方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8中的化合物。
45.根據(jù)之前權(quán)利要求的方法，其中所述疾病是關(guān)節(jié)炎。
46.一種治療或預(yù)防白內(nèi)障的方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8中的化合物。
47.一種治療或預(yù)防在角膜營養(yǎng)不良的疾病狀態(tài)下角膜的血管化和增加角膜損害愈合的方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8中的化合物。
48.一種治療或預(yù)防癌細(xì)胞生長和擴(kuò)散的方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8中的化合物。
49.一種治療患者的胰腺炎的方法，包括向所述患者給予有效量的式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8中的化合物。
50.一種治療患者細(xì)胞、組織或器官中葡萄糖和氧剝奪的方法，包括向所述患者給予有效量的式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8中的化合物。
51.根據(jù)之前權(quán)利要求的方法，其中所述器官是心臟。
52.一種預(yù)防或治療非增生性疾病的方法，包括給予治療有效量的易化胞間通訊的化合物，該化合物的作用通過在CaCl2心律失常小鼠模型中的效應(yīng)所確定。
53.根據(jù)權(quán)利要求52的方法，其中所述化合物在所述小鼠模型中的評分為2或3。
54.權(quán)利要求52的方法，其中所述化合物易化間隙連接胞間通訊。
55.權(quán)利要求52-54的方法，其中所述化合物是抗心律失常肽受體的激動(dòng)劑。
56.權(quán)利要求52-55的方法，其中所述化合物選自白藜蘆醇，包括各種不同的異構(gòu)體、二聚體、三聚體、四聚體及其衍生物。
57.權(quán)利要求56的方法，其中所述化合物是反式-白藜蘆醇(反式-3，5，4′-三羥基茋)。
58.權(quán)利要求52-54的方法，其中所述化合物選自伊索格拉定或(6-(2，5-二氯苯基)-2，4-二氨基-1，3，5-三嗪)及其衍生物。
59.權(quán)利要求52-54的方法，其中所述化合物選自阿樸啡類生物堿，優(yōu)選波爾定和塔斯品堿及其衍生物。
60.一種預(yù)防或治療以患病組織中GJIC減少為特征的疾病的方法，包括給予治療有效量的易化胞內(nèi)通訊的化合物，所述化合物的作用通過在氯化鈣心律失常小鼠模型中的效應(yīng)所確定，其中所述化合物選自具有通式I的化合物組(I) 其代表一肽序列，其中的氨基酸殘基可以為D-和/或L-構(gòu)型，且具有位于N*處的N-末端及C*處的C-末端，而且可任選是環(huán)狀的，以N*和C*之間虛線所示的或者Rd和C*之間虛線U所示的共價(jià)鍵連接；N*和C*之間的虛線，如果存在則排除化學(xué)鍵U，代表一個(gè)選擇性的共價(jià)鍵，而當(dāng)所述鍵不存在時(shí)，則N*結(jié)合一個(gè)氫原子；當(dāng)Rd和C*之間選擇性的共價(jià)鍵U存在時(shí)，則R7不存在，而R7的存在排除化學(xué)鍵U；其中X代表一個(gè)N-末端部分，例如一個(gè)能夠結(jié)合到氨基末端N*的光探針，或者一個(gè)來自C(2-22)烷基羧酸的?；鶊F(tuán)，所述羧酸例如乙酸、丙酸、丁酸及其它脂肪酸，例如山萮酸，任選被選自羥基、鹵素、C(1-6)烷基、硝基和氰基的一個(gè)或多個(gè)取代基取代；或者X代表氫；R7在N*和C*之間沒有化學(xué)鍵時(shí)，代表OH、NH2、NHNH2、NHR8或OR8，或者在N*和C*之間有化學(xué)鍵時(shí)，R7不存在；R8代表H或一個(gè)直鏈或支鏈的C(1-6)烷基基團(tuán)、芳基或芳烷基基團(tuán)。Ra代表Hyp或Pro的氨基酸側(cè)鏈；Rb代表Hyp或Pro的氨基酸側(cè)鏈；Rc代表Gly、Sar的氨基酸側(cè)鏈，芳族氨基酸側(cè)鏈，可任選在其芳環(huán)被一個(gè)或多個(gè)羥基、鹵素、硝基、氰基、疊氮基、氨基、苯甲?；虻图壨檠趸蛄虼檠趸鶊F(tuán)取代；Rd代表Ala、Gly、Glu、Asp、Dab、Dapa、Lys、Asn、Gln、Orn、Thr、Ser或Cys的氨基酸側(cè)鏈；Re代表Ala的氨基酸側(cè)鏈；Rf代表Ala、Sar或Gly的氨基酸側(cè)鏈；Rg代表除L-4Hyp的側(cè)鏈之外的任何氨基酸側(cè)鏈，或者式Z或Za的部分；Rh代表Ala的氨基酸側(cè)鏈，或者Rh代表式Z或Za的部分；Ri代表Gly的氨基酸側(cè)鏈，或者Ri代表一個(gè)芳族氨基酸，任選在其芳環(huán)被一個(gè)或多個(gè)羥基、鹵素、硝基、氰基、疊氮基、氨基、苯甲?；虻图壨檠趸蛄虼檠趸鶊F(tuán)取代；Rj代表Asn、Gln、Asp、Glu、Cys或Tyr的氨基酸側(cè)鏈；且j、k、l、m、n、p及q各自獨(dú)立地為0或1；及式I肽序列的反轉(zhuǎn)形式、全D形式、或者反轉(zhuǎn)全-D形式，以及其鹽和酰胺。
61.權(quán)利要求60的方法，其中所述疾病是本文公開的任何一種疾病或病癥，優(yōu)選氣道上皮炎癥、肺泡組織疾病、傷口、勃起障礙、膀胱失禁、由耳蝸疾病所致的聽力損傷、內(nèi)皮病變、糖尿病性視網(wǎng)膜病和糖尿病性神經(jīng)病、神經(jīng)病性疼痛、中樞神經(jīng)系統(tǒng)局部缺血、脊髓損傷、牙組織疾病包括牙周病、腎病、亞慢性和慢性炎癥、癌癥及骨髓或干細(xì)胞移植失敗。
62.權(quán)利要求52-61的方法，其中所述化合物由下式中的任何一個(gè)代表其中R1代表H或乙?；?Ac)R2代表氨基酸G、Y、D-Y、F和D-F之一的側(cè)鏈，R3代表O或HR4代表任何氨基酸側(cè)鏈R5代表O或HR6代表一個(gè)C(1-4)烷基基團(tuán)，例如CH2、(CH2)2、(CH2)3和(CH2)4R7代表O或HR8代表O或HR9代表氨基酸G、Y、D-Y、F和D-F之一的側(cè)鏈，R10代表OH或NH2，且S、T、U、V和Z為如下定義的整數(shù)S0、1或2T0、1或2U0或1V0或1Z0或1，或者R1-X1-X2-X3-R2(VIII)其中，X1為0、Ala、Gly、β-Ala、Tyr、D-Tyr、Asp、HAAX2為0；Ala-Gly-T4c-Pro；Ala-Sar-Hyp-Pro；Ala-6環(huán)-；Ala-Asn；D-Asn-D-Ala；D-Asn；γAbu；Gly、Ala；D-Ala；β-Ala；Pamh；Asn或HAA；X3為Tyr；D-Tyr；Gly、Pamb或Phe；且R1為H或Ac，條件是X1和X2不都為0；及其鹽。
63.權(quán)利要求52-61的方法，其中化合物在標(biāo)準(zhǔn)穩(wěn)定性試驗(yàn)中所測定的半衰期大于50分鐘并且優(yōu)選大于5小時(shí)。
64.權(quán)利要求52-61的方法，其中化合物在標(biāo)準(zhǔn)穩(wěn)定性試驗(yàn)中所測定的半衰期大于5小時(shí)。
65.一種治療氣道上皮的炎癥的方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的本文公開的易化胞間通訊的化合物中的至少一種化合物。
66.一種治療觸發(fā)腦炎癥反應(yīng)的損傷包括頭部損傷和局部缺血、神經(jīng)變性疾病包括帕金森病、自身免疫病、感染性疾病、朊病毒疾病及腦腫瘤的方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的至少一種本文公開的易化胞間通訊的化合物。
67.一種治療中風(fēng)所引起的反應(yīng)性神經(jīng)膠質(zhì)增生的方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的至少一種本文公開的易化胞間通訊的化合物。
68.一種治療或預(yù)防神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤形成的方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的至少一種本文公開的易化胞間通訊的化合物。
69.一種治療與脊髓軸突切開術(shù)有關(guān)的神經(jīng)元和肌肉癥狀的方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的至少一種本文公開的易化胞間通訊的化合物。
70.一種預(yù)防或治療糖尿病性視網(wǎng)膜病的方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的至少一種本文公開的易化胞間通訊的化合物。
71.一種治療視網(wǎng)膜血管異常比方說動(dòng)脈硬化的方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的至少一種本文公開的易化胞間通訊的化合物。
72.一種治療局部缺血的方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的至少一種本文公開的易化胞間通訊的化合物，其有效提供毛細(xì)管萌發(fā)。
73.一種改善頸動(dòng)脈球囊導(dǎo)管損傷后血管愈合過程的方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的至少一種本文公開的易化胞間通訊的化合物。
74.一種治療勃起功能障礙的方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的至少一種本文公開的易化胞間通訊的化合物。
75.一種治療急迫失禁的方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的至少一種本文公開的易化胞間通訊的化合物。
76.一種治療傷口的方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的至少一種本文公開的易化胞間通訊的化合物。
77.一種通過提供免疫球蛋白合成局部增加來治療亞慢性或慢性炎癥的方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的至少一種本文公開的易化胞間通訊的化合物。
78.一種治療周圍神經(jīng)病和神經(jīng)病性疼痛的方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的至少一種本文公開的易化胞間通訊的化合物。
79.一種預(yù)防或治療獲得性或年齡依賴性的聽力喪失的方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的至少一種本文公開的易化胞間通訊的化合物。
80.一種治療例如在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中和在化學(xué)療法治療之后造血組織能力下降的方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的至少一種本文公開的易化胞間通訊的化合物。
81.一種預(yù)防或治療以重金屬中毒、非感染性炎癥或微生物感染所導(dǎo)致的腎臟間隙連接通訊調(diào)節(jié)異常為特征的疾病的方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的至少一種本文公開的易化胞間通訊的化合物。
82.一種治療垂體前葉激素不適當(dāng)分泌的方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的至少一種本文公開的易化胞間通訊的化合物。
83.一種預(yù)防或治療擾亂的牙齒發(fā)育的方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的至少一種本文公開的易化胞間通訊的化合物。
84.一種改善皮膚老化、脂肪團(tuán)和皺紋的方法，包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的至少一種本文公開的易化胞間通訊的化合物。
85.一種治療患者與間隙連接解偶聯(lián)有關(guān)聯(lián)的煙草相關(guān)疾病例如傷口愈合不良和皮膚老化的方法，包括向所述患者給予有效量的至少一種本文公開的易化胞間通訊的化合物。
86.權(quán)利要求52-85的方法，其中給予的化合物是權(quán)利要求52-62任一項(xiàng)公開的化合物。
87.權(quán)利要求52-86的方法，其中給予的化合物是以下化合物中的至少一種HPP-5-K6-OHH-AAP-10-K6-OH環(huán)(反轉(zhuǎn)-AAP-10-Asn)Ac-反轉(zhuǎn)(AAP-10)-(all D)-NH2Ac-反轉(zhuǎn)(AAP-10)-OHHPP-5-K6-NH2H-[D-Hyp4]AAP-10-NH2H-[D-Pro4，Ala5]AAP-10-NH2AAP-10-K6-NH2H-C(Acm)GAGHypPYC(Acm)-NH2H-AAP-10-Asn-NH2環(huán)(AAP-10-Asn)環(huán)(AAP-10-Gln)H-HypPYNGAG-NH2H-GAG-T4c-PY-NH2H-GA-Sar-Hyp-PY-NH2H-Sar-A-Sar-Hyp-PY-NH2H-GAG-Pc-PY-NH 2H-GAGGPY-NH2H-GAG-DHypAY-NH2H-GAG-DHyp-DProY-NH2des-Hyp4-[Asn5]AAP-10-NH2AcGNYGNYH-GANY-NH2H-DY-DN-G-NH2H-YNG-NH2H-GGY-NH2H-G-DN-Y-NH2H-Y-DN-G-OHAc-Y-DN-G-OHAc-G-D-N-Y-NH2Ac-Y-D-N-G-NH2和H-GK(DNP)Y-NH2及其鹽。
88.權(quán)利要求52-86的方法，其中所述化合物選自白藜蘆醇及其異構(gòu)體和聚合體。
89.權(quán)利要求52-86的方法，其中所述化合物選自阿樸啡類生物堿，優(yōu)選波爾定和塔斯品堿及其衍生物。
90.一種藥物組合物，包含式I到VIII、式2到12的化合物以及表1和8或者根據(jù)任何一項(xiàng)前述權(quán)利要求的化合物，以及藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
91.根據(jù)前述權(quán)利要求的組合物，為一種腸片劑。
92.根據(jù)權(quán)利要求89的組合物，為一種注射制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了具有提高的穩(wěn)定性的包括抗心律失常肽在內(nèi)的新肽。還公開了包含所述肽的組合物，以及利用該組合物尤其是作為藥物的方法。
文檔編號(hào)C07K7/64GK1988914SQ02807402
公開日2007年6月27日申請日期2002年2月22日優(yōu)先權(quán)日2001年8月23日
發(fā)明者B·D·拉森, J·S·彼得森, E·邁爾, A·L·舍爾拜, N·R·約恩森, M·S·尼爾森, N－H·霍爾斯坦－拉特勞, J·B·馬丁斯, P·H·詹森申請人:西蘭制藥公司

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該技術(shù)已申請專利。僅供學(xué)習(xí)研究，如用于商業(yè)用途，請聯(lián)系技術(shù)所有人。
技術(shù)研發(fā)人員：B.D.拉森;J.S.彼得森;E.邁爾;A.L.舍爾拜;N.R.約恩森;M.S.尼爾森;N-H.霍爾斯坦-拉特勞;J.B.馬丁斯;P.H.詹森
技術(shù)所有人：西蘭制藥公司
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