專利名稱：特征在于檢測(cè)g－csf外顯子3缺失的癌癥診斷方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)mRNA或蛋白的修飾特征來(lái)診斷癌癥的方法。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種基于在mRNA或蛋白水平上G-CSF基因外顯子3區(qū)域缺失的癌癥診斷和預(yù)診方法，其中G-CSF外顯子3的缺失可用作癌癥診斷標(biāo)志物。
背景技術(shù)：
在發(fā)達(dá)國(guó)家，癌癥是導(dǎo)致死亡的主要原因。因此，癌癥治療的主要興趣是開發(fā)用于早期診斷和治療癌癥的方法。典型地，晚期癌癥幾乎不可治愈，而在早期，可能更有效地治療癌癥，而且早期癌癥的治療方法比較簡(jiǎn)單。因此，迫切需要開發(fā)一種用于精確快速診斷癌癥的方法。
目前，癌癥診斷通常是通過(guò)用顯微鏡，例如光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡進(jìn)行形態(tài)分析，免疫組化檢測(cè)癌組織中特異表達(dá)的蛋白(Iran.Biomed.J.3(3 & 4)99-101，1999；和Lancet 2483-6，1986)，或?qū)Π┙M織中發(fā)現(xiàn)的異常生物分子，例如異常基因進(jìn)行分子分析來(lái)實(shí)現(xiàn)。與分子診斷相比較，形態(tài)診斷和免疫組化診斷需要更長(zhǎng)的時(shí)間和更高的費(fèi)用。由于分子診斷包括相對(duì)簡(jiǎn)單的流程，并可在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生結(jié)果，因此它成為開發(fā)新型癌癥診斷方法的焦點(diǎn)。最近，中國(guó)，上海，Health Digital有限公司開發(fā)了用于診斷各種癌癥的蛋白芯片系統(tǒng)，并從中國(guó)藥品管理局(CSDA)獲得進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)的批準(zhǔn)。這種批準(zhǔn)在世界上是首次的(www.health-digit.com)。但該蛋白芯片系統(tǒng)并不是僅用一種生物標(biāo)志物來(lái)診斷各種癌癥，而是使用10種或更多的蛋白。
為了有效地應(yīng)用這種診斷方法進(jìn)行癌癥診斷，最重要的是選擇能夠更精確更容易發(fā)現(xiàn)癌癥的癌癥診斷標(biāo)志物。已報(bào)道有幾個(gè)基因(Steve M.等，J.Clin.Oncology 203165-3175，2002；和Sridlhar R.et al，J.Clin.Oncology 201932-1941，2002)和蛋白(Goessl等，Urology 58335-338，2001；Zhou等，Breast Cancer Res Treat 66217-224，2001；和CK Kim等，Korea Pat.Publication No.2001-0061173)可用作癌癥診斷標(biāo)志物，它們中有一些已用于臨床癌癥診斷。如下所述的常規(guī)癌癥生物標(biāo)志物不能檢測(cè)各種癌癥。已知具有較低器官特異性的癌癥標(biāo)志物，例如CEA、BFP、TPA和IAP也具有較低的敏感性，因此產(chǎn)生假陽(yáng)性數(shù)據(jù)。同樣，具有高器官特異性的標(biāo)志物，例如AFP、PIVKA II、酯酶I、CA19-9、CA50、Span-1抗原、CA15-3和BCA 225僅用于靶器官。因此，迫切需要開發(fā)一種可診斷各種癌癥的新型標(biāo)志物，用于進(jìn)行精確、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的癌癥診斷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人對(duì)能夠檢測(cè)各種癌癥的標(biāo)志物進(jìn)行全面和深入研究，發(fā)現(xiàn)在癌癥患者中G-CSF基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中外顯子3發(fā)生缺失，從而得到本發(fā)明，并用G-CSF mRNA片段或蛋白作為癌癥診斷標(biāo)志物可以實(shí)現(xiàn)對(duì)各種癌癥進(jìn)行診斷，其中所進(jìn)行的診斷是簡(jiǎn)便快速經(jīng)濟(jì)的。
本發(fā)明的一個(gè)方面提供了具有外顯子3區(qū)域缺失的G-CSF mRNA片段作為癌癥診斷標(biāo)志物。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了具有相應(yīng)于外顯子3區(qū)域的氨基酸序列缺失的突變G-CSF蛋白作為癌癥診斷標(biāo)志物。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了包括(a)相應(yīng)于G-CSF基因外顯子3的DNA片段，和(b)至少一個(gè)相應(yīng)于所述G-CSF基因外顯子1、2、4和5的DNA片段的微陣列或膜用于癌癥診斷。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了包含抗具有相應(yīng)于所述G-CSF蛋白外顯子3區(qū)域的氨基酸序列的缺失的突變G-CSF蛋白的抗體的癌癥診斷試劑。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了包含抗具有相應(yīng)于所述G-CSF蛋白外顯子3區(qū)域的氨基酸序列缺失的突變G-CSF蛋白的抗體的癌癥診斷試劑盒。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了包含抗具有相應(yīng)于外顯子3區(qū)域的氨基酸序列缺失的突變G-CSF蛋白的抗體的微陣列或膜用于癌癥診斷。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一種癌癥診斷方法，包括步驟(a)從哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞中獲得G-CSF核酸樣品；(b)從獲得的核酸樣品中擴(kuò)增G-CSF區(qū)；(c)在擴(kuò)增的樣品檢測(cè)所述G-CSF基因外顯子3的缺失。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一種癌癥診斷方法，包括步驟(a)從哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞中獲得G-CSF蛋白樣品；(b)在G-CSF蛋白樣品中檢測(cè)相應(yīng)于G-CSF基因外顯子3的氨基酸序列缺失。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了從哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞中獲得的G-CSF核酸樣品中擴(kuò)增G-CSF基因所用的引物。
附圖的簡(jiǎn)要描述結(jié)合附圖從以下詳細(xì)描述可以更清楚地理解本發(fā)明的上述和其它目標(biāo)、特征和優(yōu)勢(shì)。其中

圖1是人G-CSF基因的正常轉(zhuǎn)錄、剪接和翻譯過(guò)程；圖2所示的是PCR中所用的引物在包含5個(gè)外顯子的人G-CSF基因結(jié)構(gòu)圖譜中的位置；圖3A是在瓊脂糖凝膠中分離的PCR1產(chǎn)物的照片(M大小標(biāo)記，泳道1正常細(xì)胞系，泳道2YCC-7，泳道3AGS，泳道4SNU-1，泳道5MDA-MB-231，泳道6MCF-7，泳道7SK-BR-3，泳道8HT-1080，泳道9HCT-116，和泳道10COLO205)；圖3B是在瓊脂糖凝膠中分離的PCR1產(chǎn)物的照片(M大小標(biāo)記，泳道1正常細(xì)胞系，泳道2DLD-1，泳道3HT-29，泳道4A549，泳道5NCI-H460，泳道6HeLa，泳道7C-33A，泳道8B16，泳道9U-87MG)；圖4所示的是來(lái)源于正常細(xì)胞的人G-CSF基因的核苷酸序列分析結(jié)果；圖5所示的是來(lái)源于腫瘤細(xì)胞的人G-CSF基因的核苷酸序列分析結(jié)果；圖6A是在瓊脂糖凝膠中分離的PCR2產(chǎn)物的照片(每個(gè)泳道與圖3A是同樣的細(xì)胞系)；
圖6B是在瓊脂糖凝膠中分離的PCR2產(chǎn)物的照片(每個(gè)泳道與圖3B是同樣的細(xì)胞系)；圖7A是在瓊脂糖凝膠中分離的PCR3產(chǎn)物的照片(每個(gè)泳道與圖3A是同樣的細(xì)胞系)；圖7B是在瓊脂糖凝膠中分離的PCR3產(chǎn)物的照片(每個(gè)泳道與圖3B是同樣的細(xì)胞系)；圖8所示的是固定在尼龍膜上的外顯子2 DNA和外顯子3 DNA與來(lái)源于腫瘤細(xì)胞的靶分子的雜交結(jié)果(AYCC-7，BAGC，CHT-29，DA549，EMCF-7，和FU-87MG)；圖9所示的是通過(guò)DNA芯片進(jìn)行的G-CSF基因外顯子3缺失的分析結(jié)果；圖10所示的是具有相應(yīng)于外顯子3區(qū)的氨基酸序列缺失的純化重組突變G-CSF蛋白的SDS-PAGE結(jié)果；圖11是顯示在正常人和癌癥患者中具有相應(yīng)于外顯子3區(qū)氨基酸序列缺失的突變G-CSF蛋白水平圖，用抗突變G-CSF蛋白的抗體進(jìn)行測(cè)定；圖12是質(zhì)粒p19CSF的構(gòu)建過(guò)程；和圖13是表達(dá)具有相應(yīng)于外顯子3的氨基酸序列缺失的突變G-CSF蛋白的重組質(zhì)粒pED-CSF4BLIIE的構(gòu)建過(guò)程。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明通常涉及通過(guò)分析RNA或蛋白水平上G-CSF基因存在或不存在外顯子3缺失來(lái)診斷和預(yù)診癌癥的方法，其中G-CSF外顯子3缺失可用作癌癥診斷標(biāo)志物。
由巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的集落刺激因子(CSF)在正常機(jī)體中廣泛分布。CSF大致上可分為粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)。其中，G-CSF在造血干細(xì)胞增殖和分化期間產(chǎn)生幾種血細(xì)胞的過(guò)程中起到重要作用。G-CSF的主要作用是增加粒細(xì)胞的數(shù)量，特別是嗜中性粒細(xì)胞功能以保護(hù)機(jī)體抵抗外源病原體。近來(lái)廣泛使用的用于增殖性腫瘤的化療，其具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，其在抑制嗜中性粒前體細(xì)胞的分裂和成熟方面是不利的，因此降低了患者對(duì)感染應(yīng)答的免疫保護(hù)能力。當(dāng)對(duì)接受這種化療的患者給藥時(shí)，已知G-CSF將有效刺激嗜中性粒細(xì)胞增殖，因此保護(hù)和治療感染性疾病。1986年，Nagata等報(bào)道了人G-CSF基因的核酸序列及其在COS細(xì)胞中的表達(dá)(Nagata等，Nature319415-418，1986)。
人G-CSF(hG-CSF)是一個(gè)包含30個(gè)氨基酸的分泌信號(hào)肽和174個(gè)氨基酸的糖蛋白，并包含5個(gè)半胱氨酸殘基。在5個(gè)半胱氨酸中，其中4個(gè)形成兩個(gè)二硫鍵(Cys36-Cys42，Cys64-Cys74)，在hG-CSF蛋白的折疊和生物活性中起重要作用(Hill等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905167-5171，1993)。參照?qǐng)D1，hG-CSF基因由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成。成熟的hG-CSF mRNA通過(guò)對(duì)基因組DNA轉(zhuǎn)錄得到的hG-CSF mRNA轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行剪切除去4個(gè)內(nèi)含子而產(chǎn)生。成熟的hG-CSF mRNA翻譯成包含204個(gè)氨基酸的hG-CSF前體蛋白，N末端30個(gè)氨基酸的分泌信號(hào)肽從前體蛋白中除去，從而產(chǎn)生包含174個(gè)氨基酸的生物活性hG-CSF蛋白(Nagata等，EMBOJ.5575-581，1986；Hill等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905167-5171，1993)。
本發(fā)明人在克隆hG-CSF基因及產(chǎn)生其翻譯產(chǎn)物的研究中發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于腫瘤細(xì)胞的G-CSF cDNA具有整個(gè)外顯子3區(qū)(108bp)缺失。雖然在不包括G-CSF基因在內(nèi)的多種基因中已報(bào)道了這種特定外顯子的缺失，但直到目前為止還不了解在hG-CSF基因中的這種缺失。已知hG-CSF蛋白以具有或不具有相應(yīng)于外顯子2的3’端的3個(gè)氨基酸的形式存在，而且兩種形式均具有生物活性(Nagata等，EMBO J.5575-581，1986)。因此，根據(jù)同源性原理，基于G-CSF基因外顯子3缺失的癌癥診斷方法可應(yīng)用于所有G-CSF亞型。另外，由于已知其他哺乳動(dòng)物來(lái)源的G-CSF蛋白與hG-CSF蛋白具有幾乎相同的生物活性，所以本領(lǐng)域中的技術(shù)人員可以理解，根據(jù)同源性原理，本發(fā)明中的基于檢測(cè)G-CSF基因外顯子3缺失的癌癥診斷方法可應(yīng)用于其他哺乳動(dòng)物來(lái)源的G-CSF蛋白。
腫瘤細(xì)胞中特異表達(dá)或抑制的基因和遺傳突變均可通過(guò)常規(guī)分子生物學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)，例如通過(guò)(a)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)(Bottema，C.D.，Mutat Res.23393-102，1993；Nelson，D.L.，Curr.Opin.Genet.Dev.162-68，1991；Pourzand，C.和Cerutti，P.，Mutat.Res.288113-121，1993；和Holland PM等，Proc.Natl.Acad，Sci.USA 87276-7280，1991)，(b)單鏈構(gòu)象多態(tài)(SSCP)(Glavac D.，Hum.Mutat.19384-394，2002；Strippoli，P.等，Int.J.Mol.Med 8567-572，2001；和Methods Mol Biol 187151-63，2002)，(c)DNA測(cè)序分析(Sanger，F(xiàn).等，Proc.Natl.Acad.Sci USA745463-5467，1997)，(d)蛋白質(zhì)平截試驗(yàn)(PTT)(Hardy，C.A.，MethodsMol.Biol.18787-108，2002)，(e)自動(dòng)核苷酸序列分析(Boutin P.等，Hum.Mutat.15(2)201-203，2000)，(f)雜合性丟失研究(LOH)(Yang Q.等，Clin.Cancer Res.82890-2893，2002)，(g)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性研究(MSI)(Furlan，D.等，J Pathol 197603-609，2002)，(h)通過(guò)MALDI-TOF進(jìn)行基因分析(Leushner J.，Expert Rev.Mol.Diagn.111-18，2001)，(i)通過(guò)雜交進(jìn)行基因分析(Wetmur，J.G.，Critical Reviews in Biochem.Mol.Biol.26227-259，1991)，(j)通過(guò)DNA芯片進(jìn)行基因分析(Goessl等，Urology58335-338，2001；Zhou等，Breast Cancer Res.Treat.66217-224，2001；和CK Kim等，韓國(guó)專利公開號(hào)2001-0061173)及(k)通過(guò)蛋白質(zhì)芯片進(jìn)行分析(Pharmacogenomics 1385-393，2000)。本領(lǐng)域中技術(shù)人員可以理解，G-CSF基因或蛋白外顯子3區(qū)域的缺失可通過(guò)包括以上所述例子在內(nèi)的常規(guī)分子生物學(xué)方法很容易地進(jìn)行檢測(cè)。用于檢測(cè)G-CSF基因或蛋白外顯子3區(qū)域缺失的優(yōu)選分子生物學(xué)方法包括PCR、雜交、DNA芯片、蛋白芯片和酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)。
根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行癌癥診斷，首先應(yīng)從組織樣本或細(xì)胞中獲得G-CSF基因或蛋白樣品。由于從正常組織或細(xì)胞獲得特異基因的DNA樣品數(shù)量很少，因此應(yīng)通過(guò)PCR對(duì)特定基因進(jìn)行擴(kuò)增，為了進(jìn)行這種擴(kuò)增，需要設(shè)計(jì)合適的引物。在本發(fā)明中，需要用作PCR引物的核酸片段以擴(kuò)增G-CSF基因外顯子3的部分或整個(gè)區(qū)域，以檢測(cè)外顯子3的缺失。即，此處所用的引物是指能夠擴(kuò)增包括外顯子3的部分或整個(gè)區(qū)域的G-CSF基因核苷酸序列的寡核苷酸。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠很容易地設(shè)計(jì)這種引物。因此，所有本領(lǐng)域的技術(shù)人員設(shè)計(jì)的能夠擴(kuò)增包含外顯子3部分或整個(gè)區(qū)域的G-CSF基因的引物均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。引物的實(shí)例包括命名為SEQ IDNOs.1和2的寡核苷酸，其能夠擴(kuò)增從hG-CSF基因部分外顯子2到外顯子5的區(qū)域(Thr1-Pro174)，命名為SEQ ID NOs.3和5的寡核苷酸，其能夠擴(kuò)增從hG-CSF基因的部分外顯子2到外顯子3的區(qū)域(Ile24-Leu71)，及命名為SEQ ID NOs.4和6的寡核苷酸，其能夠擴(kuò)增從hG-CSF基因外顯子3到部分外顯子4的區(qū)域(Cys36-Ser80)。本發(fā)明人對(duì)8個(gè)正常組織和17個(gè)腫瘤細(xì)胞系中獲得的mRNA和cDNA樣品調(diào)查了G-CSF基因和G-CSF基因中外顯子3的存在或缺失。
根據(jù)本發(fā)明，提供了通過(guò)擴(kuò)增G-CSF基因的外顯子3區(qū)來(lái)檢測(cè)外顯子3缺失過(guò)程中用作引物組的核酸片段，其包括但不限于，下述各組，每組包括正義引物和反義引物正義5′-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3′(SEQ ID NO.1)和反義5′-TCAGGGCTGGGCAAGGTG-3′(SEQ ID NO.2)；正義5′-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3′(SEQ ID NO.1)和反義5′-CAGCTGCAGGGCCTGGCT-3′(SEQ ID NO.5)；正義5′-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3′(SEQ ID NO.1)和反義5′-CGCTATGGAGTTGGCTCAAGC-3′(SEQ ID NO.6)；正義5′-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3′(SEQ ID NO.1)和反義5′-CAGCTTCTCCTGGAGCGC-3′(SEQ ID NO.9)；正義5′-ATCCAGGGCGATGGCGCAGCG-3′(SEQ ID NO.3)和反義5′-TCAGGGCTGGGCAAGGTG-3′(SEQ ID NO.2)；正義5′-ATCCAGGGCGATGGCGCAGCG-3′(SEQ ID NO.3)和反義5′-CAGCTGCAGGGCCTGGCT-3′(SEQ ID NO.5)；正義5′-ATCCAGGGCGATGGCGCAGCG-3′(SEQ ID NO.3)和反義5′-CGCTATGGAGTTGGCTCAAGC-3′(SEQ ID NO.6)；正義5′-TGTGCCACCTACAAGCTGTGC-3′(SEQ ID NO.4)和反義5′-TCAGGGCTGGGCAAGGTG-3′(SEQ ID NO.2)；正義5′-TGTGCCACCTACAAGCTGTGC-3′(SEQ ID NO.4)和反義5′-CAGCTGCAGGGCCTGGCT-3′(SEQ ID NO.5)；和正義5′-TGTGCCACCTACAAGCTGTGC-3′(SEQ ID NO.4)和反義5′-CGCTATGGAGTTGGCTCAAGC-3′(SEQ ID NO.6).
盡管不包含相應(yīng)于外顯子3區(qū)域的核苷酸序列，核酸片段包括能夠檢測(cè)G-CSF基因外顯子3缺失的寡核苷酸，其中寡核苷酸可以包含相應(yīng)于G-CSF基因外顯子2或外顯子4的核苷酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種固定了包含G-CSF基因外顯子3的部分或整個(gè)區(qū)域的DNA片段的基因微陣列或膜，其用于癌癥診斷。該基因微陣列包括通過(guò)雜交有效檢測(cè)相應(yīng)于探針的基因的DNA芯片，所述雜交包括將寡核苷酸探針施用到用特定化學(xué)試劑處理的載玻片的表面上。在雜交中可用來(lái)代替載玻片的膜的非限定實(shí)例包括所有可固定DNA片段的膜，優(yōu)選地是尼龍膜和硝酸纖維素膜。
根據(jù)本發(fā)明，將相應(yīng)于G-CSF基因外顯子3的核酸片段附著在微陣列表面，同時(shí)附著選自相應(yīng)于G-CSF基因外顯子1、2、4和5的核酸片段的1個(gè)或多個(gè)核酸片段，其中每個(gè)用作探針的核酸片段可以包括其相應(yīng)外顯子的部分或整個(gè)區(qū)域。本發(fā)明中用作探針的相應(yīng)于外顯子3區(qū)域的核酸片段的非限定實(shí)例包括寡核苷酸，其具有命名為SEQ ID NO.14TGTGCCACCTACAAGCTGTG的核苷酸序列，命名為SEQ ID NO.15GAGCTGGTGCTGCTCGGACA的核苷酸序列，命名為SEQ ID NO.16GGACACTCTCTGGGCATCCC的核苷酸序列以及命名為SEQ ID NO.17CTGAGCAGCTGCCCCAGCCA的核苷酸序列。用作對(duì)照探針的相應(yīng)于外顯子1、2、4和/或5的核酸片段的非限定實(shí)例包括寡核苷酸，其具有命名為SEQ ID NO.10CTGCAGCTGCTGCTGTGGCAC的核苷酸序列，命名為SEQ ID NO.12AGAAGCTGTGGTGCCAC的核苷酸序列，命名為SEQID NO.13TGAGTGAGTGTGCCAC的核苷酸序列，命名為SEQ ID NO.18GCAGGCTGCTTGAGCCAA的核苷酸序列，命名為SEQ ID NO.19AGAAGCTGGCAGGCTG的核苷酸序列以及命名為SEQ ID NO.20TCAGTGAGGCAGGCTG的核苷酸序列。
可通過(guò)本領(lǐng)域中普通的常規(guī)技術(shù)很容易地將探針點(diǎn)在載玻片和膜表面。另外，探針的制備、雜交和剝離根據(jù)本領(lǐng)域中常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。
本發(fā)明的另一個(gè)方面，包括用于診斷癌癥的組合物，其包含一種DNA片段和診斷用載體，所述DNA片段包含G-CSF基因外顯子3區(qū)域的部分或整個(gè)區(qū)域。本發(fā)明的另一個(gè)方面，包括一種癌癥診斷方法，其使用一種具有相應(yīng)于G-CSF基因外顯子3區(qū)域的氨基酸序列缺失的突變G-CSF蛋白，及抗該突變G-CSF蛋白的多克隆或單克隆抗體。此處所用的術(shù)語(yǔ)“一種具有相應(yīng)于G-CSF基因外顯子3區(qū)域的氨基酸序列缺失的突變G-CSF蛋白”指的是通過(guò)在表達(dá)G-CSF基因時(shí)缺失從外顯子1到5區(qū)域而產(chǎn)生的突變G-CSF蛋白，實(shí)質(zhì)上包括外顯子3的缺失。本發(fā)明的另一個(gè)方面，包括一種診斷試劑盒，其包含一種DNA片段及使用該DNA片段的DNA微陣列，所述DNA片段包含G-CSF基因外顯子3的部分或整個(gè)區(qū)域。本發(fā)明的另一個(gè)方面，包括一種診斷試劑盒，其包含一種突變的G-CSF蛋白及使用抗該突變G-CSF蛋白的多克隆或單克隆抗體的蛋白微陣列，所述突變的G-CSF蛋白具有相應(yīng)于G-CSF基因外顯子3區(qū)域的氨基酸序列缺失。
根據(jù)本發(fā)明，具有相應(yīng)于G-CSF基因外顯子3區(qū)域的氨基酸序列缺失的突變G-CSF蛋白和抗該突變G-CSF蛋白的多克隆或單克隆抗體可通過(guò)本領(lǐng)域普通的常規(guī)方法產(chǎn)生(Harlow，E.和Lane，D.，Antibodies.ALaboratory Manual.Cold Spring Harbor，NYCold Spring Harbor Laboratory，1988；和Wilson，L.和Matsudaira，P.編輯.Antibodies in Cell Biology(Methods in Cell Biology，37卷).New YorkAcademic Press，1933)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)從獲自17個(gè)腫瘤細(xì)胞系的mRNA和eDNA樣品中擴(kuò)增G-CSF基因的外顯子3區(qū)域并分析產(chǎn)物的核苷酸序列時(shí)發(fā)現(xiàn)，在來(lái)源于各種腫瘤細(xì)胞系，包括胃癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、肉瘤細(xì)胞、腸癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、子宮頸癌細(xì)胞及惡性黑色素瘤細(xì)胞的hG-CSF cDNA中缺失外顯子3區(qū)域(108bp)(見圖2和3)。當(dāng)用來(lái)源于17個(gè)腫瘤細(xì)胞系的hG-CSF cDNA作為模板并用根據(jù)本發(fā)明的引物組進(jìn)行PCR時(shí)，發(fā)現(xiàn)來(lái)源于16個(gè)腫瘤細(xì)胞系的PCR產(chǎn)物大小比來(lái)源于正常細(xì)胞系的產(chǎn)物小，通過(guò)PCR產(chǎn)物的核苷酸序列分析，確定缺失正常G-CSF基因5個(gè)外顯子中的外顯子3區(qū)域。
可通過(guò)雜交來(lái)檢測(cè)G-CSF cDNA中外顯子3區(qū)域的缺失。例如，通過(guò)將正常hG-CSF基因用作模板進(jìn)行PCR獲得相應(yīng)于外顯子3的DNA片段和相應(yīng)于外顯子2的DNA片段后，將這兩個(gè)DNA片段固定在尼龍膜上，將尼龍膜與來(lái)源于腫瘤細(xì)胞系的cDNA靶分子進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)探針與固定在膜上的外顯子3DNA片段的結(jié)合來(lái)確定外顯子3區(qū)域的缺失。
可用DNA芯片來(lái)檢測(cè)G-CSF cDNA中外顯子3區(qū)域的缺失，其通過(guò)在載玻片上固定相應(yīng)于G-CSF基因每個(gè)外顯子的寡核苷酸，用hG-CSF基因的外顯子作為模板通過(guò)PCR制備探針，然后將探針與寡核苷酸進(jìn)行反應(yīng)。
另外，通過(guò)使用具有外顯子3區(qū)域缺失的突變G-CSF核苷酸序列制備重組G-CSF蛋白，制備抗該重組突變G-CSF蛋白的多克隆或單克隆抗體，并用該抗體進(jìn)行ELISA反應(yīng)比較正常個(gè)體和癌癥患者中突變G-CSF蛋白水平，可以容易地檢測(cè)G-CSF外顯子3區(qū)域的缺失，。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明包括免疫層析檢測(cè)法。該檢測(cè)法的代表性實(shí)例是橫向流動(dòng)免疫檢測(cè)。用于橫向流動(dòng)免疫檢測(cè)的診斷試劑盒包含一個(gè)裝載樣本的樣品墊、一個(gè)包被以作為探針的抗體的釋放墊、一個(gè)對(duì)樣品進(jìn)行顯色的膜(主要為硝酸纖維素膜)或條帶，在其中樣品遷移并被分離，并發(fā)生抗體-抗原反應(yīng)，以及一個(gè)用于驅(qū)動(dòng)樣本連續(xù)遷移的吸收墊。用作探針的抗體通過(guò)被固定在例如膠體金顆粒上進(jìn)行標(biāo)記。除了膠體金顆粒，也可使用膠乳珠或碳顆粒。典型地，用于橫向流動(dòng)免疫檢測(cè)的診斷試劑盒設(shè)計(jì)為以三明治形式檢測(cè)分析物。將包含在樣本中的分析物上樣到樣品墊上，遷移并與包被在釋放墊上的抗體反應(yīng)，形成抗原-抗體復(fù)合物，形成的復(fù)合物進(jìn)一步遷移并被固定在膜上的用于顯色的附加抗體捕獲，從而產(chǎn)生三明治形式的三聯(lián)體。也就是說(shuō)，由于附加的抗體固定在用于顯色的膜上，三聯(lián)體在固定附加抗體的膜表面積累。由于蛋白是肉眼不可見的，三聯(lián)體的形成及其數(shù)量通過(guò)與包含在三聯(lián)體中的抗體相綴合的金顆粒數(shù)目來(lái)確定。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種基于檢測(cè)G-CSF基因外顯子3區(qū)域缺失來(lái)診斷癌癥的方法。詳細(xì)地，根據(jù)本發(fā)明，癌癥的診斷可通過(guò)以下步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)從動(dòng)物組織或細(xì)胞中獲得核酸樣品，并用分子方法檢測(cè)核酸樣品中G-CSF基因外顯子3區(qū)域的缺失。作為核酸樣品來(lái)源的人的組織或細(xì)胞作為包括生物流體樣品、活體解剖樣本、固相組織樣品例如組織培養(yǎng)物或組織來(lái)源的細(xì)胞，及子代細(xì)胞。另外，樣品來(lái)源包括化學(xué)試劑處理的，可溶性樣品、培養(yǎng)的細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解物。更詳細(xì)地，根據(jù)本發(fā)明的目標(biāo)，人的組織或細(xì)胞包括腫瘤組織或被視為致瘤的(neoplastic)組織，和可通過(guò)本領(lǐng)域普通的常規(guī)方法例如外科切除術(shù)、活體解剖或抽吸而獲得?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法從人的組織或細(xì)胞中獲得核酸樣品。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明，可通過(guò)G-CSF基因的核苷酸序列分析，及通過(guò)使用對(duì)相應(yīng)于G-CSF基因外顯子3區(qū)域的區(qū)域的特異探針，例如通過(guò)使用對(duì)具有相應(yīng)于外顯子3區(qū)域的氨基酸序列缺失的突變G-CSF蛋白特異的抗體，來(lái)實(shí)現(xiàn)基于檢測(cè)G-CSF基因外顯子3缺失的癌癥檢測(cè)方法。
本發(fā)明的癌癥診斷方法可用于診斷各種癌癥，包括胃癌、乳腺癌、肉瘤、腸癌、肺癌、子宮頸癌、肝癌、前列腺癌、舌癌、喉癌、咽癌、口腔癌、甲狀腺癌、結(jié)腸癌、食道癌及睪丸癌。
參照下述實(shí)施例及結(jié)合附圖，將更詳細(xì)地解釋本發(fā)明。然而，提供下述實(shí)施例僅用于舉例說(shuō)明本發(fā)明，本發(fā)明不限于此。
實(shí)施例1從腫瘤細(xì)胞系中制備mRNA和cDNA從8個(gè)正常細(xì)胞系和組織及17個(gè)腫瘤細(xì)胞系制備mRNA和cDNA樣品。本發(fā)明的實(shí)施例中所用的正常細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞系示于下表。
表1本發(fā)明中所用的正常和腫瘤細(xì)胞系


表1中列出的腫瘤細(xì)胞系可從列于表1中的細(xì)胞保藏中心獲得。另外，人正常細(xì)胞系，淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、表皮細(xì)胞、真皮細(xì)胞、毛囊細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和肌肉細(xì)胞可從Yonsei大學(xué)醫(yī)學(xué)院的癌癥轉(zhuǎn)移研究中心獲得。從癌癥細(xì)胞轉(zhuǎn)移研究中心獲得的腫瘤細(xì)胞系YCC-7按如下所述制備。從晚期癌癥病人中無(wú)菌獲取腹水，以10個(gè)單位/ml的量補(bǔ)加肝素以防止細(xì)胞聚集。400×g離心10分鐘后，將沉淀的細(xì)胞在25cm3的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。如果含有大量紅細(xì)胞，則在800×g進(jìn)行Ficoll-hypaque密度梯度離心，使單核細(xì)胞從紅細(xì)胞中分離，將獲得的單核細(xì)胞相在37℃，5％CO2中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)16-18小時(shí)后，培養(yǎng)基在400×g離心10分鐘，將沉淀的細(xì)胞在25cm3的新培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中，在相差顯微鏡下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察，培養(yǎng)基每周更換兩到三次。當(dāng)形成腫瘤細(xì)胞克隆時(shí)，通過(guò)胰蛋白酶-EDTA處理或用刮刀獲得腫瘤細(xì)胞簇，將包含腫瘤細(xì)胞的流體離心除去正常細(xì)胞。得到的純腫瘤細(xì)胞根據(jù)其傳代細(xì)胞貯存在冷凍條件下。
用Tri-試劑(Gibco-BRL，美國(guó))從每個(gè)腫瘤細(xì)胞系、正常細(xì)胞系和正常組織中提取總RNA。用液氮快速冷凍組織樣品，研磨后，加入1mlTrizol試劑，接著室溫下溫育5分鐘。得到的組織樣品補(bǔ)加0.2ml氯仿，劇烈混和15秒，室溫下溫育5分鐘。12,000×g，4℃離心15分鐘后，將得到的水相轉(zhuǎn)移到一個(gè)新管中。向管中加入等體積的異丙醇，并將管在4℃放置10分鐘。12,000×g，4℃離心10分鐘后，仔細(xì)除去上清，沉淀用70％乙醇洗滌并接著在7,500×g，4℃離心5分鐘。干燥后，將RNA沉淀溶解在無(wú)RNA酶的水中。
為了從分離自每個(gè)細(xì)胞系和人源腫瘤和正常細(xì)胞系的mRNA合成cDNA，如下進(jìn)行RT-PCR。將2μg總RNA與1μl寡聚(dT)16-引物混和，并加入無(wú)RNA酶的水至終體積為11μl。該該混合物在90℃加熱5分鐘，加熱后立即放在冰上。在另一個(gè)管中加入4μl反應(yīng)緩沖液，2μl 10mMdNTPs、1μl RNA酶抑制劑和2μl反轉(zhuǎn)錄酶，然后向預(yù)混和的管中加入8.5μl RNA混合物，室溫下溫育10分鐘。反應(yīng)混合物在42℃溫育90分鐘，然后95℃15分鐘?；旌衔镌?5℃溫育后立即放在冰上以中止反應(yīng)，從而得到cDNA樣品。
實(shí)施例2通過(guò)PCR檢測(cè)hG-CSF基因?yàn)榱嗽诿總€(gè)腫瘤細(xì)胞系中檢測(cè)正常hG-CSF基因的表達(dá)，用實(shí)施例1中制備的cDNA為模板進(jìn)行PCR。如圖2所示，根據(jù)其擴(kuò)增產(chǎn)物大小，PCR反應(yīng)可分為如下三種類型擴(kuò)增從hG-CSF基因部分外顯子2到外顯子5的區(qū)域(Thr1-Pro174)的PCR1；擴(kuò)增hG-CSF基因部分外顯子2到外顯子3的區(qū)域(Ile24-Leu71)的PCR2；及擴(kuò)增hG-CSF基因外顯子3到部分外顯子4的區(qū)域(Cys36-Ser80)的PCR3。
用來(lái)自每個(gè)腫瘤細(xì)胞系的cDNA樣品為模板進(jìn)行PCR1，引物組中的正義引物命名為SEQ ID NO.1(5′-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3′)，反義引物命名為SEQ ID NO.2(5′-TCAGGGCTGGGCAAGGTG-3′)。用來(lái)自每個(gè)腫瘤細(xì)胞系的cDNA樣品為模板進(jìn)行PCR2，引物組中的正義引物命名為SEQ ID NO.3(5′-ATCCAGGGCGATGGCGCAGCG-3′)，反義引物命名為SEQ ID NO.5(5′-CAGCTGCAGGGCCTGGCT-3′)。用來(lái)自每個(gè)腫瘤細(xì)胞系的cDNA樣品為模板進(jìn)行PCR3，引物組中的正義引物命名為SEQID NO.4(5′-TGTGCCACCTACAAGCTGTGC-3′)，反義引物命名為SEQID NO.6(5′-CGCTATGGAGTTGGCTCAAGC-3′)。PCR使用高保真PCR體系(Boehringer Mannheim Co.，德國(guó))，在以下條件下進(jìn)行。PCR條件包括94℃變性7min，94℃變性40sec，56℃退火40sec，72℃延伸1min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后在72℃延伸7min。
將PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行分離。作為電泳結(jié)果，對(duì)PCR1而言，除了從U-87MG得到的PCR產(chǎn)物與正常G-CSF基因大小相等外，從腫瘤細(xì)胞系中得到的PCR產(chǎn)物大小比正常G-CSF基因小(見圖3A，其中M大小標(biāo)記，泳道1正常細(xì)胞系，泳道2YCC-7，泳道3AGS，泳道4SNU-1，泳道5MDA-MB-231，泳道6MCF-7，泳道7SK-BR-3，泳道8HT-1080，泳道9HCT-116及，泳道10COLO205；圖3B，其中M大小標(biāo)記，泳道1正常細(xì)胞系，泳道2DLD-1，泳道3HT-29，泳道4A549，泳道5NCI-H460，泳道6HeLa，泳道7C-33A，泳道8B16及泳道9U-87MG)。對(duì)PCR2和PCR3而言，僅從U-87MG細(xì)胞中獲得了PCR產(chǎn)物，而在其它腫瘤細(xì)胞系中沒(méi)有得到PCR產(chǎn)物(參加圖6和7)。另外，PCR2和PCR3產(chǎn)生的U-87MG細(xì)胞的PCR產(chǎn)物與正常細(xì)胞的PCR產(chǎn)物大小相等。
通過(guò)DNA自動(dòng)測(cè)序儀(ABI Prism model 377，Perkin Elmer Co.，美國(guó))分析PCR1產(chǎn)物的核苷酸序列。作為核苷酸序列分析的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)從U-87MG細(xì)胞獲得的PCR產(chǎn)物與正常細(xì)胞的G-CSF基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.7)相同。相反，從其它腫瘤細(xì)胞系獲得的PCR產(chǎn)物與正常細(xì)胞的G-CSF核苷酸序列相比較，發(fā)現(xiàn)其具有一個(gè)108bp缺失的核苷酸序列(SEQ ID NO.8)(參見圖4和5)。當(dāng)將缺失的108bp與G-CSF的核苷酸序列相比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)該缺失的108bp相應(yīng)于5個(gè)外顯子中的外顯子3區(qū)域。
為了調(diào)查正常個(gè)體組織是否表現(xiàn)出與獲自正常細(xì)胞系相同的PCR結(jié)果，當(dāng)用從正常個(gè)體的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、表皮組織、真皮組織、毛囊、脂肪細(xì)胞和肌肉細(xì)胞分離的RNA進(jìn)行RT-PCR時(shí)，并用RT-PCR獲得的cDNA進(jìn)行PCR，在來(lái)源于正常個(gè)體的細(xì)胞和組織中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)外顯子3的缺失(見圖11)，這表明在腫瘤細(xì)胞系的PCR產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的外顯子3缺失并不是PCR錯(cuò)誤而誘導(dǎo)產(chǎn)生的。另外，由具有外顯子3缺失的G-CSF cDNA表達(dá)的突變G-CSF蛋白極可能已喪失活性位點(diǎn)功能，而且具有與正常G-CSF蛋白不同的構(gòu)型。因此，我們認(rèn)為腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的G-CSF蛋白不表現(xiàn)出正常功能。
實(shí)施例3通過(guò)雜交檢測(cè)G-CSF基因通過(guò)雜交檢測(cè)來(lái)源于腫瘤細(xì)胞系的G-CSF cDNA外顯子3的缺失。
用來(lái)源于正常細(xì)胞系的G-CSF基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR，所用的引物組是命名為SEQ ID NO.4(5′-TGTGCCACCTACAAGCTGTGC-3′)的正義引物和命名為SEQ ID NO.5(5′-CAGCTGCAGGGCCTGGCT-3′)的反義引物。獲得了相應(yīng)于G-CSF基因外顯子3區(qū)域的108bp DNA片段。
單獨(dú)地，用來(lái)源于正常細(xì)胞系的G-CSF基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR，所用的引物組是命名為SEQ ID NO.1(5’-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3′)的正義引物和命名為SEQ ID NO.9(5′-CAGCTTCTCCTGGAGCGC-3′)的反義引物。獲得了相應(yīng)于G-CSF基因外顯子2區(qū)域的105bp的DNA片段。
純化后，將每個(gè)DNA片段(50ng/μl)點(diǎn)在尼龍膜上(BoehringerMannheim，德國(guó))，80℃溫育2小時(shí)以將其固定在膜上。
通過(guò)RT-PCR制備固定在膜上、作為雜交相應(yīng)于外顯子2和外顯子3的DNA片段的靶探針。RT-PCR根據(jù)如下條件進(jìn)行。首先，反應(yīng)混合物A(2μg總RNA，1μl寡聚(dT)16-引物，總體積15μl)在94℃溫育2min，使RNA變性，然后在約20分鐘內(nèi)緩慢冷卻到42℃。另一個(gè)反應(yīng)混合物B(每種dATP、dGTP和dCTP各333μM，1×反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液，20μCi[α-32P]dCTP(2,000-3,000Ci/mmol)，50U AMV反轉(zhuǎn)錄酶，總體積30μl)加入到混合物A中，在42℃反轉(zhuǎn)錄2小時(shí)。然后，將不參與聚合反應(yīng)的dNTP，包括[α-32P]dCTP，用QIAquick核苷酸去除試劑盒(Qiagen，美國(guó))除去。
用cDNA探針，在已固定相應(yīng)于G-CSF外顯子2和3DNA片段的尼龍膜上進(jìn)行雜交。首先，用2×SSPE緩沖液(1×SSPE0.18M NaCl，10mM磷酸鈉，1mM EDTA，pH7.7)將尼龍膜浸泡5分鐘，然后用2ml預(yù)熱到65℃的雜交液(5×SSPE，2％SDS，1×Denhardt的試劑，超聲的和100μg/ml變性的鮭魚精DNA)進(jìn)行處理，其中膜封閉在乙烯袋中。65℃溫育1小時(shí)后，向浸泡膜的雜交液中加入由10μl cDNA探針與0.5ml雜交液混和并將混合物煮沸10分鐘而制備的變性cDNA探針，然后在65℃溫育18小時(shí)進(jìn)行雜交。隨后，將膜用洗滌液(0.5xSSPE，0.2％SDS)洗滌三次，于65℃進(jìn)行30分鐘。通過(guò)曝光膜或X-射線膠片并對(duì)膠片進(jìn)行顯影來(lái)檢測(cè)放射性。
如圖8所示，對(duì)用來(lái)自腫瘤細(xì)胞系YCC-7、AGS、HT-29、A549和MCF-7的總RNA制備的探針而言，發(fā)現(xiàn)探針與外顯子2的DNA片段結(jié)合，而不與外顯子3的DNA片段結(jié)合(見圖8A、8B、8C、8D和8E)。相反，發(fā)現(xiàn)使用來(lái)自己知含有正常G-CSF基因的U-87MG細(xì)胞的總RNA制備的探針可與外顯子2和3的兩個(gè)DNA片段結(jié)合(見圖8F)。如上所述，證實(shí)可通過(guò)雜交很容易地檢測(cè)G-CSF外顯子3的缺失。雜交方法可適用于利用最近開發(fā)的DNA微陣列的檢測(cè)方法。因此，認(rèn)為能夠可以很容易地開發(fā)各種利用雜交方法的檢測(cè)方法，從而用該檢測(cè)方法可容易并精確地進(jìn)行癌癥診斷。
實(shí)施例4利用用于檢測(cè)G-CSF的外顯子3缺失的DNA芯片來(lái)檢測(cè)G-CSF基因?yàn)榱苏{(diào)查DNA芯片是否能用作檢測(cè)G-CSF mRNA或cDNA的外顯子3的缺失的工具，如下制備各種可固定在玻璃板上的DNA片段探針。
設(shè)計(jì)一個(gè)相應(yīng)于G-CSF部分外顯子2的探針，四個(gè)相應(yīng)于外顯子3的非重疊探針和一個(gè)相應(yīng)于部分外顯子4的探針，每個(gè)包含20個(gè)核苷酸。另外，設(shè)計(jì)一個(gè)相應(yīng)于連續(xù)地從部分外顯子2至部分外顯子3的區(qū)域的探針，一個(gè)相應(yīng)于連續(xù)地從部分外顯子3到部分外顯子4的區(qū)域的探針，和一個(gè)相應(yīng)于連續(xù)地從部分外顯子2到部分外顯子4的區(qū)域的探針，每個(gè)外顯子有8個(gè)核苷酸。由于在外顯子2區(qū)域的選擇性剪接(Tshuchiya M.等，EMBO J5575-581，1986)而產(chǎn)生兩種不同的G-CSF mRNA(人G-CSFa和人G-CSFbmRNA)，根據(jù)這兩種不同的G-CSF mRNA制備了兩類包含相應(yīng)于外顯子2的區(qū)域的探針。
為了給予被固定在玻璃板上的能力，當(dāng)合成所有DNA片段探針時(shí)，利用氨基連接臂柱(Cruachem，Glasgrow，蘇格蘭)將具有氨基的堿基插入到每個(gè)探針的3’端，并使用用醛殘基(CEL Associates，Inc.，Huston，Taxas，美國(guó))包被的載玻片。在3×SSC(0.45M NaCl，15mM C6H5Na3O7，pH7.0)中溶解后，使用由本發(fā)明人制造的微陣列儀(Yoon等，J.Microbiol.Biotechnol.1021-26，2000)通過(guò)積累DNA探針而將DNA探針固定在載玻片上，并在約55％的濕度下反應(yīng)1小時(shí)以上，然后將載玻片在室溫下放置6小時(shí)。此處，探針在載玻片上以275μm的間距排列，點(diǎn)樣量是100μM，從而得到微陣列。
通過(guò)SYBRO green II(Molecular Probe，Inc.，Leiden，荷蘭)染色來(lái)評(píng)估通過(guò)探針的氨基與玻璃上的醛基反應(yīng)進(jìn)行的探針固定。
通過(guò)利用從每種細(xì)胞系中提取的G-CSF基因進(jìn)行不對(duì)稱PCR來(lái)制備固定在玻璃上作為探針的基因片段，所用的引物組為命名為SEQ ID NO.10(5′-CTGCAGCTGCTGCTGTGGCAC-3′)的正義引物和命名為SEQ IDNO.11(5′-FTTC-CTGCTGCCAGATGGTGGT-3′)的反義引物，其比例是1∶5，其中通過(guò)進(jìn)行一次PCR獲得基因片段。表2給出了固定在載玻片上的探針信息。
表2


不對(duì)稱PCR按以下條件進(jìn)行94℃變性5min，94℃變性1min，56℃退火1min，72℃延伸30see，進(jìn)行10個(gè)循環(huán)，然后94℃變性1min，58℃退火1min，72℃延伸30sec，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后在72℃延伸7min。
將PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行分離。電泳結(jié)果表明，在每個(gè)PCR樣品中均產(chǎn)生雙鏈DNA和單鏈DNA片段。使用攜帶外顯子3缺失的G-CSF基因的質(zhì)粒和攜帶不缺失外顯子3的G-CSF基因的質(zhì)粒，通過(guò)不對(duì)稱PCR擴(kuò)增G-CSF基因后，用DNA芯片分析這兩個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物。雜交液(6×SSPE，20％(v/v)甲酰胺)加入到15μl擴(kuò)增產(chǎn)物中，至終體積為200μl。將混合物上樣到具有固定探針的載玻片上，載玻片用探針夾(probe-clip)壓封的溫育隔室(Sigma Co.，St.Louis，MO.)覆蓋，然后在振蕩溫育箱中30℃溫育6小時(shí)誘導(dǎo)探針與擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)合。隨后，載玻片用3×SSPE(0.45M NaCl，15mM C6H5Na3O7，pH7.0)、2×SSPE(0.3M NaCl，10mM C6H5Na3O7，pH7.0)和然后1×SSPE(0.15M NaCl，5mM C6H5Na3O7，pH7.0)洗滌5分鐘以上，并用scanarray 5000(GSI Lumonics Inc.，Bedford，MA.)進(jìn)行掃描。
如圖9所示，對(duì)攜帶不缺失外顯子3的G-CSF基因的質(zhì)粒而言，對(duì)所有探針均檢測(cè)到信號(hào)。相反，對(duì)含外顯子3缺失的G-CSF的質(zhì)粒而言，在外顯子2和外顯子4區(qū)域檢測(cè)到信號(hào)，其中質(zhì)粒具有相應(yīng)于G-CSF a-型RNA的核苷酸序列。
這些結(jié)果表明，可用以上所述的引物和探針來(lái)開發(fā)能檢測(cè)G-CSFmRNA或cDNA中外顯子3區(qū)域缺失的DNA芯片。
實(shí)施例5生產(chǎn)重組突變G-CSF蛋白為了通過(guò)重組大腸桿菌大規(guī)模生產(chǎn)突變G-CSF蛋白，對(duì)攜帶重組質(zhì)粒pED-CSF4BLIIE的大腸桿菌B21(DE3)(Novagen Inc.，美國(guó))進(jìn)行分批進(jìn)料發(fā)酵。如下通過(guò)將相應(yīng)于具有外顯子3區(qū)域缺失的突變G-CSF蛋白的核苷酸序列克隆到質(zhì)粒pET21c(Novagen Inc.，美國(guó))中來(lái)制備pED-CSF4BLIIE質(zhì)粒。首先，以人乳腺癌cDNA文庫(kù)為模板進(jìn)行PCR，所用引物組為包含EcoRI位點(diǎn)的引物1(正義引物)5′-GCGAATTCATGGCTGGACCTGCCACCCAG-3′和包含BamHI位點(diǎn)的引物2(反義引物)5′-GCGGATCCTTATTAGGGCTGGGCAAGGTGGCG-3′。
用EcoRI和BamHI處理PCR產(chǎn)物，并將其克隆到pUC19(Stratagene，美國(guó))中，從而得到質(zhì)粒p19CSF(見圖12)。克隆到pUC19中的G-CSF基因不包含外顯子3區(qū)域。
以質(zhì)粒p19CSF為模板，進(jìn)行PCR，所用引物組是引物4(正義引物)5′-GCGAATTCATATGACCCCCCTGGGCCCTGCCA GC-3′和引物2(反義引物)5′-GCGGATCCTTATTAGGGCTGGGCAAGGTGGCG-3′，用NdeI和BamHI處理PCR產(chǎn)物，并將其克隆到質(zhì)粒pET21c中。為了更改相應(yīng)于第一個(gè)氨基酸的密碼子為細(xì)菌翻譯系統(tǒng)最適密碼子，用引物5′-GCGAATTCATATGACTCCGTTAGGTCCAGCCAGC-3′代替引物45′-GCGAATTCATATGACCCCCCTGGGCCCTGCCAGC-3′作為正義引物再次進(jìn)行PCR，產(chǎn)生的DNA片段用NdeI和BamHI處理，并克隆到質(zhì)粒pET21c中，從而得到質(zhì)粒pED-CSF4BLIIE(見圖13)。用于分批進(jìn)料發(fā)酵的營(yíng)養(yǎng)成分和附加物質(zhì)在以下表3中列出。
表3

用質(zhì)粒pED-CSF4BLIIE轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞在250ml培養(yǎng)瓶中、37℃攪拌培養(yǎng)8小時(shí)。將200ml培養(yǎng)物接種到包含在5L發(fā)酵罐(NBS發(fā)酵罐)的1.8L培養(yǎng)基中，在37℃進(jìn)行培養(yǎng)，其中培養(yǎng)基的pH恒定維持在6.8。用28％NH4OH溶液維持pH。任選地提供純氧。附加物質(zhì)的提供通過(guò)pH-stat進(jìn)行控制。也就是說(shuō)，當(dāng)pH增加到6.88時(shí)，自動(dòng)添加2-3g葡萄糖、0.3g酵母提取物及0.1g MgSO4·7H2O。在培養(yǎng)過(guò)程中，葡萄糖濃度維持在低于5g/L。當(dāng)OD600達(dá)到30時(shí)，向培養(yǎng)基中加入1mM IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)以誘導(dǎo)細(xì)菌高濃度生長(zhǎng)，從而得到OD600值為90的高濃度細(xì)菌培養(yǎng)物。使用比重計(jì)通過(guò)測(cè)定蛋白條帶的密度，從而評(píng)估生產(chǎn)的突變G-CSF蛋白的量(見圖10)。正常成熟G-CSF蛋白的分子量約為18.7kDa，而從外顯子3缺失的G-CSF cDNA翻譯的突變G-CSF蛋白的分子量約為13kDa。
實(shí)施例6制備特異于突變G-CSF蛋白的多克隆抗體以獲自實(shí)施例5中重組大腸桿菌的突變G-CSF蛋白為抗原，如下制備特異于突變G-CSF蛋白的多克隆抗體。用等體積弗氏佐劑(BRL)乳化400μl以1mg/ml的濃度溶解在磷酸鹽緩沖液中的純化的突變hG-CSF蛋白后，將乳劑肌肉注射到兔(10周齡)中，注射4次，間隔時(shí)間是11天。在第四次注射10天后，通過(guò)心臟穿刺從免疫兔中采血。將收集的血液室溫溫育30分鐘，然后4℃放置過(guò)夜，使血液完全凝聚。在2,500rpm離心30分鐘后，得到上清，即血清。將硫酸銨加到血清中，至終濃度為40％以沉淀蛋白。在10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中透析過(guò)夜后，使用DEAE Affi-Gel Blue膠(Bio-Rad Inc.)純化抗體(Smith，C.P.，Jensen，D.，Allen，T.和Kreger，M.(編輯)Information Resources for Adjuvants and Antibody Production.U.S.Dept.of Agriculture，1997；和Hanly W.C.等，ILAR Journal 3793-118，1995)。
實(shí)施例7制備特異于突變G-CSF蛋白的單克隆抗體用等體積弗氏佐劑(BRL)乳化100μl純化的hG-CSF蛋白(1mg/ml)后，將得到的乳劑腹膜注射BALB/c小鼠(6-8周齡)，注射3次，間隔時(shí)間是2周。第三次注射后，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了抗突變G-CSF蛋白的抗體。再過(guò)2周后，小鼠用100μg純化的突變hG-CSF蛋白再次注射。注射3天后，從免疫小鼠中獲得脾細(xì)胞，并與SP2/0-Ag14骨髓瘤細(xì)胞以10∶1比例混合，通過(guò)向細(xì)胞混合物中加入50％聚乙二醇1500溶液誘導(dǎo)融合，然后溫育3分鐘。1,200rpm離心8分鐘后，將細(xì)胞沉淀以3.5×106細(xì)胞/ml的密度懸浮在包含10％胎牛血清(FCS)的HAT RPMI-1640培養(yǎng)基中。然后將0.1ml細(xì)胞懸液放置在96孔板的每個(gè)孔中，在37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3天后，向培養(yǎng)板的各孔中加入0.1ml包含10％FCS的HAT RPMI-1640培養(yǎng)基，而且每4天用新鮮培養(yǎng)基代替一半的原培養(yǎng)基(Amyx，H.L.，JAVMA 1911287-1289，1987；Akerstrom，B.等，J Immunol 1352589-2592，1985；和Anon，VetHealth Inspectorate 6頁(yè).Rijswijk，The Netherlands，1989)。
在HAT培養(yǎng)基中選擇培養(yǎng)后，如下通過(guò)ELISA篩選產(chǎn)生抗突變G-CSF蛋白抗體的融合細(xì)胞。首先，將免疫小鼠所用的突變hG-CSF蛋白在0.01M碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)中稀釋至濃度為0.1μg/ml，將50μl得到的稀釋液加入到培養(yǎng)板的各孔中，然后在4℃放置過(guò)夜，使蛋白與各孔的底部結(jié)合。培養(yǎng)板用PBST(磷酸鹽緩沖液，137mM NaCl，2.7mMKCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，0.15％Tween 20)洗滌4次，并用白蛋白在37℃溫育30分鐘進(jìn)行封閉，隨后，將50μl細(xì)胞培養(yǎng)物上清加到各孔中，將培養(yǎng)板在室溫溫育2小時(shí)，然后用PBST洗滌4次。在0.1％BSA-PBST中稀釋作為第二抗體的生物素綴合的抗小鼠免疫球蛋白抗體，使其濃度為1μg/ml后，將50μl稀釋液加到各孔中，然后37℃溫育1小時(shí)。用PBST洗滌4次后，各孔中加入50μl 1∶1000稀釋的鏈親和素-辣根過(guò)氧化物酶，37℃溫育30分鐘，然后用PBST洗滌4次。向各孔中加入50μl四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液，室溫下進(jìn)行溫育，其中TMB用作過(guò)氧化物酶的底物。用2N硫酸鹽終止反應(yīng)后，使用ELISA讀數(shù)儀在450nm測(cè)定光密度。從ELISA陽(yáng)性孔中獲得的細(xì)胞通過(guò)有限稀釋亞克隆3次，其中細(xì)胞稀釋為每孔0.3個(gè)細(xì)胞，從而獲得產(chǎn)生抗突變體hG-CSF蛋白單克隆抗體的融合瘤(hydridoma)細(xì)胞。可從穩(wěn)定的hydridoma細(xì)胞獲得抗突變體hG-CSF蛋白的單克隆抗體(Amyx，H.L.，JAVMA 1911287-1289，1987；Akerstrom，B.等，J Immunol 1352589-2592，1985；和Anon，Vet HealthInspectorate 6頁(yè).Rijswijk，The Netherlands，1989)。
實(shí)施例8通過(guò)ELISA檢測(cè)突變的G-CSF蛋白水平在0.01M碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)中稀釋后，將抗兔和抗小鼠突變的hG-CSF蛋白的抗體加入到培養(yǎng)板的各孔中，同時(shí)加入血漿銅藍(lán)蛋白，將板在4℃溫育過(guò)夜，使抗體結(jié)合到各孔底部。用PBST(0.15％Tween 20)洗滌2次后，用0.1％白蛋白在37℃將培養(yǎng)板封閉1小時(shí)。用PBST洗滌2次后，向培養(yǎng)板中加入50μl標(biāo)準(zhǔn)稀釋緩沖液和來(lái)源于正常個(gè)體和癌癥患者的每個(gè)樣本并仔細(xì)混合，將培養(yǎng)板在37℃溫育2小時(shí)，隨后用PBST洗滌4次。在包含0.15M NaCl的10mM磷酸鹽緩沖液中稀釋后，將作為第二抗體的2.5μg過(guò)氧化物酶綴合的抗人免疫球蛋白抗體加到各孔中，將培養(yǎng)板在室溫下溫育30分鐘，然后用PBST洗滌4次。向各孔中加入50μl四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液，避光條件下室溫溫育，其中TMB是過(guò)氧化物酶的底物。用2.5N硫酸鹽終止反應(yīng)后，通過(guò)ELISA讀數(shù)儀在450nm測(cè)定光密度。
如圖11所示，發(fā)現(xiàn)在癌癥患者中突變的hG-CSF蛋白水平比正常個(gè)體中的高很多。當(dāng)互相比較癌癥患者中突變的hG-CSF蛋白水平時(shí)，乳腺癌患者表現(xiàn)最高水平的突變的hG-CSF蛋白。
如以上實(shí)施例詳細(xì)解釋，通過(guò)PCR或使用DNA芯片檢測(cè)G-CSF外顯子3的缺失，或通過(guò)ELISA檢測(cè)突變的G-CSF蛋白可以容易地進(jìn)行癌癥診斷。如下所述，常規(guī)的癌癥生物標(biāo)志物不能檢測(cè)所有癌癥。已知的具有低器官特異性的癌癥標(biāo)志物，例如CEA、BFP、TPA和IAP，具有低的靈敏度，從而產(chǎn)生假陽(yáng)性數(shù)據(jù)。同樣，具有高器官特異性的生物標(biāo)志物，例如AFP、PIVKA II、脂酶I，CA19-9，CA50、Span-1抗原，CA15-3和BCA 225，僅用于靶器官。由本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的基于檢測(cè)G-CSF外顯子3區(qū)缺失的診斷性癌癥標(biāo)志物可通過(guò)免疫化學(xué)方法和分子方法用于簡(jiǎn)便地檢測(cè)癌癥。開發(fā)和使用這種癌癥標(biāo)志物可有利于促進(jìn)癌癥的早期發(fā)現(xiàn)，從而極大地有助于癌癥的有效治療。
工業(yè)實(shí)用性如上所述，本發(fā)明提供一種基于檢測(cè)G-CSF基因外顯子3區(qū)域缺失來(lái)診斷癌癥的方法。該癌癥診斷方法可用于診斷廣泛范圍的癌癥，不僅是特定的癌癥，并具有通過(guò)分子方法，例如PCR、雜交或使用DNA芯片，或相對(duì)簡(jiǎn)單的免疫化學(xué)檢測(cè)，例如ELISA來(lái)容易地診斷癌癥的有效性。另外，用于檢測(cè)G-CSF外顯子3區(qū)域缺失的DNA芯片的優(yōu)勢(shì)是能夠以比常規(guī)癌癥診斷方法更簡(jiǎn)單、更快、更精確地的方式來(lái)診斷各種癌癥，并能夠同時(shí)處理大量臨床樣本，從而導(dǎo)致發(fā)展和提高人類的醫(yī)療水平并改善公益，以及促進(jìn)DNA芯片技術(shù)的發(fā)展。
另外，由本發(fā)明人發(fā)明的具有相應(yīng)于外顯子3區(qū)域的氨基酸序列缺失的突變G-CSF蛋白，及抗該突變G-CSF蛋白的抗體，可促進(jìn)區(qū)分正常個(gè)體和癌癥患者。這個(gè)事實(shí)表明僅檢測(cè)G-CSF突變體即可以精確診斷癌癥并適用于大量臨床樣本，從而促進(jìn)蛋白芯片技術(shù)的發(fā)展。
序列表[序列表]<110>醫(yī)學(xué)基因公司李相燁丁基峻鄭賢哲柳來(lái)春琴基昌劉元敏<120>特征在于檢測(cè)G-CSF外顯子3缺失的癌癥診斷方法<160>20<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1acccccctgg gccctgcc 18<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2tcagggctgg gcaaggtg 18<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物
<400>3atccagggcg atggcgcagc g 21<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>4tgtgccacct acaagctgtg c 21<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5cagctgcagg gcctggct 18<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>6cgctatggag ttggctcaag c 21<210>7<211>525<212>DNA<213>人
<221>基因<222>(1)..(523)<223>G-CSF<400>7acccccctgg gccctgccag ctccctgccc cagagcttcc tgctcaagtg cttagagcaa60gtgaggaaga tccagggcga tggcgcagcg ctccaggaga agctgtgtgc cacctacaag120ctgtgccacc ccgaggagct ggtgctgctc ggacactctc tgggcatccc ctgggctccc180ctgagcagct gccccagcca ggccctgcag ctggcaggct gcttgagcca actccatagc240ggccttttcc tctaccaggg gctcctgcag gccctggaag ggatctcccc cgagttgggt300cccaccttgg acacactgca gctggacgtc gccgactttg ccaccaccat ctggcagcag360atggaagaac tgggaatggc ccctgccctg cagcccaccc agggtgccat gccggccttc420gcctctgctt tccagcgccg ggcaggaggg gtcctagttg cctcccatct gcagagcttc480ctggaggtgt cgtaccgcgt tctacgccac cttgcccagc cctga525<210>8<211>417<212>DNA<213>人<220>
<221>基因<222>(1)..(417)<223>外顯子3缺失G-CSF<400>8acccccctgg gccctgccag ctccctgccc cagagcttcc tgctcaagtg cttagagcaa60gtgaggaaga tccagggcga tggcgcagcg ctccaggaga agctggcagg ctgcttgagc120caactccata gcggcctttt cctctaccag gggctcctgc aggccctgga agggatctcc180cccgagttgg gtcccacctt ggacacactg cagctggacg tcgccgactt tgccaccacc240atctggcagc agatggaaga actgggaatg gcccctgccc tgcagcccac ccagggtgcc300atgccggcct tcgcctctgc tttccagcgc cgggcaggag gggtcctagt tgcctcccat360
ctgcagagct tcctggaggt gtcgtaccgc gttctacgcc accttgccca gccctga 417<210>9<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>9cagcttctcc tggagcgc 18<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物和探針<400>10ctgcagctgc tgctgtggca c 21<210>11<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>11ctgctgccag atggtggt 18<210>12<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>12agaagctgtg gtgccac 17<210>13<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>13tgagtgagtg tgccac16<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>14tgtgccacct acaagctgtg20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>15gagctggtgc tgctcggaca20<210>16<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>探針<400>16ggacactctc tgggcatccc20<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>17ctgagcagct gccccagcca20<210>18<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>18gcaggctgct tgagccaa 18<210>19<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>19agaagctggc aggctg16
<210>20<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>20tgagtgaggc aggctg
權(quán)利要求
1.一種用作癌癥診斷標(biāo)志物的具有外顯子3區(qū)域缺失的突變的G-CSFmRNA或cDNA片段。
2.一種用作癌癥診斷標(biāo)志物的具有相應(yīng)于外顯子3區(qū)域的氨基酸序列缺失的突變的G-CSF蛋白。
3.一種用于診斷癌癥的微陣列，其包含結(jié)合(a)一個(gè)相應(yīng)于G-CSF基因外顯子3的DNA片段，和(b)至少一個(gè)相應(yīng)于所述G-CSF基因的外顯子1、2、4和5的DNA片段。
4.一種用于癌癥的診斷試劑，其包含一種抗具有相應(yīng)于所述G-CSF蛋白的外顯子3區(qū)域的氨基酸序列缺失的突變G-CSF蛋白的抗體。
5.一種用于癌癥的診斷試劑盒，其包含一種抗具有相應(yīng)于所述G-CSF蛋白的外顯子3區(qū)域的氨基酸序列缺失的突變G-CSF蛋白的抗體。
6.一種用于診斷癌癥的微陣列，其包含一種抗具有相應(yīng)于所述G-CSF蛋白的外顯子3區(qū)域的氨基酸序列缺失的突變G-CSF蛋白的抗體。
7.一種引物，其用于在獲自哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞的G-CSF核酸樣品中擴(kuò)增G-CSF基因。
8.權(quán)利要求7的引物，其中所述引物選自下述核苷酸序列對(duì)正義5′-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3′(SEQ ID NO.1)和反義5′-TCAGGGCTGGGCAAGGTG-3′(SEQ ID NO.2)；正義5′-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3′(SEQ ID NO.1)和反義5′-CAGCTGCAGGGCCTGGCT-3′(SEQ ID NO.5)；正義5′-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3′(SEQ ID NO.1)和反義5′-CGCTATGGAGTTGGCTCAAGC-3′(SEQ ID NO.6)；正義5′-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3′(SEQ ID NO.1)和反義5′-CAGCTTCTCCTGGAGCGC-3′(SEQ ID NO.9)；正義5′-ATCCAGGGCGATGGCGCAGCG-3′(SEQ ID NO.3)和反義5′-TCAGGGCTGGGCAAGGTG-3′(SEQ ID NO.2)；正義5′-ATCCAGGGCGATGGCGCAGCG-3′(SEQ ID NO.3)和反義5′-CAGCTGCAGGGCCTGGCT-3′(SEQ ID NO.5)；正義5′-ATCCAGGGCGATGGCGCAGCG-3′(SEQ ID NO.3)和反義5′-CGCTATGGAGTTGGCTCAAGC-3′(SEQ ID NO.6)；正義5′-TGTGCCACCTACAAGCTGTGC-3′(SEQ ID NO.4)和反義5′-TCAGGGCTGGGCAAGGTG-3′(SEQ ID NO.2)；正義5′-TGTGCCACCTACAAGCTGTGC-3′(SEQ ID NO.4)和反義5′-CAGCTGCAGGGCCTGGCT-3′(SEQ ID NO.5)；和正義5′-TGTGCCACCTACAAGCTGTGC-3′(SEQ ID NO.4)和反義5′-CGCTATGGAGTTGGCTCAAGC-3′(SEQ ID NO.6)。
9.一種突變的G-CSF蛋白，其具有相應(yīng)于外顯子3區(qū)域的氨基酸序列缺失。
10.一種與權(quán)利要求9的突變的G-CSF蛋白特異結(jié)合的抗體。
11.權(quán)利要求10的抗體，其中所述抗體是一種多克隆抗體。
12.權(quán)利要求10的抗體，其中所述抗體是一種單克隆抗體。
13.一種用于癌癥的診斷方法，其包含步驟(a)從哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞中獲得G-CSF核酸樣品；(b)從所述獲得的核酸樣品擴(kuò)增G-CSF區(qū)域；(c)在所述擴(kuò)增樣品中檢測(cè)所述G-CSF基因的外顯子3的缺失。
14.一種診斷癌癥的方法，其包含步驟(a)從哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞中獲得G-CSF蛋白樣品；(b)在所述G-CSF蛋白樣品中檢測(cè)相應(yīng)于G-CSF基因的外顯子3的氨基酸序列的缺失。
全文摘要
公開了基于檢測(cè)G－CSF基因外顯子3區(qū)域缺失或具有相應(yīng)于外顯子3區(qū)域的氨基酸序列缺失的突變G－CSF蛋白水平來(lái)診斷和預(yù)診癌癥的方法、組合物、微陣列、抗體和試劑盒，其中G－CSF基因外顯子3區(qū)域的缺失用作癌癥生物標(biāo)志物。
文檔編號(hào)C07K14/535GK1561395SQ02819189
公開日2005年1月5日 申請(qǐng)日期2002年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月28日
發(fā)明者李相燁, 丁基峻, 鄭賢哲, 柳來(lái)春, 琴基昌, 劉元敏, 劉昭永 申請(qǐng)人:醫(yī)學(xué)基因公司