專利名稱：一種kras第2號(hào)外顯子基因突變檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及ー種檢測(cè)試劑盒，尤其是涉及ー種KRAS第2號(hào)外顯子基因突變檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
KRAS蛋白處于EGFR信號(hào)通路的下游。在正常生理情況下，EGFR信號(hào)通路被活化后，KRAS蛋白短暫激活，其后迅速失活，KRAS激活/失活效應(yīng)是受控的。而當(dāng)KRAS基因突變時(shí)，會(huì)導(dǎo)致EGRF信號(hào)通路持續(xù)激活，加速腫瘤細(xì)胞増殖。KRAS基因突變96%是發(fā)生在第2號(hào)外顯子的12、13號(hào)密碼子。20%非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、30-35%大腸癌患者中存在KRAS基因突變。吉非替尼、厄洛替尼、西妥昔單抗是和帕尼單抗是目前臨床應(yīng)用較廣的EGFR靶向藥物。研究表明，KRAS第12和13密碼子的突變與西妥昔單抗、帕尼單抗及EGFR-TKIs的 耐藥有夫。目前KRAS基因檢測(cè)已被歐美地區(qū)列為大腸癌患者內(nèi)科治療前必做的常規(guī)檢查。大量臨床研究表明，靶向藥物(如愛必妥和帕尼單抗)對(duì)于未發(fā)生KRAS基因突變的患者有效率可達(dá)到60%，而對(duì)已發(fā)生KRAS基因突變的患者則完全無效。KRAS基因檢測(cè)是目前醫(yī)生了解大腸癌患者癌基因狀況最直接、最有效的方法。通過檢測(cè)KRAS基因有沒有突變，可以篩選出抗EGFR(表皮生長(zhǎng)因子受體)靶向藥物治療有效的大腸癌患者，實(shí)現(xiàn)腫瘤病人的個(gè)體化治療，從而延長(zhǎng)患者生存期。對(duì)于沒有突變的患者，則能減少不必要的治療費(fèi)用和毒副作用。目前臨床檢測(cè)KRAS基因突變的檢測(cè)試劑原料需多方配備，實(shí)驗(yàn)過程分步進(jìn)行，耗時(shí)較長(zhǎng)，容易污染，準(zhǔn)確性不高，所以探索一種檢測(cè)KRAS基因突變快速可靠的方法已經(jīng)成為臨床實(shí)驗(yàn)研究的熱點(diǎn)問題。

實(shí)用新型內(nèi)容為了解決上述技術(shù)問題，本實(shí)用新型提供ー種KRAS基因第2號(hào)外顯子突變檢測(cè)試劑盒，它包括盒體I、盒蓋2，盒體I內(nèi)設(shè)置擴(kuò)增盒3和純化盒4 ;擴(kuò)增盒3內(nèi)設(shè)置有PCR管5、裝KRAS2-1弓丨物的試劑瓶6、裝KRAS2-2弓丨物的試劑瓶7、裝酶混合物的試劑管8、去離子水瓶9 ;純化盒4內(nèi)設(shè)置有醋酸鈉溶液瓶10、電泳分離檢測(cè)試劑瓶11。所述引物KRAS2-1和引物KRAS2-2的濃度均為5 u mo I/L ;所述KRAS2-1的上游引物 5 ' -GAATGGTCCTGCACCAGTAA-3 '，下游引物為 5 ' -GTGTGACATGTTCTAATATAGTCA-3 '；所述KRAS2-2的上游引物5 ' -GTCCTGCACCAGTAATATGC-3 '，下游引物為5' -ATGTTCTAATATAGTCACATTTTC-3'。所述酶混合物包括濃度為0. 4mmol/L 的 dNTPs, 4mmol/L 的 Mg2+, 2xBuffer,I. 25U/25 U I 的 HsTaq0所述電泳分離檢測(cè)試劑是Hi-DiFormamide試劑。本實(shí)用新型與現(xiàn)有產(chǎn)品相比，具有如下積極有益的效果[0010]本試劑盒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、設(shè)計(jì)合理、檢測(cè)過程不易受污染；本試劑盒在檢測(cè)KRAS基因第2號(hào)外顯子突變時(shí)具有敏感性高、特異性強(qiáng)、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)；本試劑盒設(shè)置檢品盒和輔助盒，檢測(cè)時(shí)更方便。

圖I為本實(shí)用新型的整體結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本實(shí)用新型進(jìn)行進(jìn)ー步說明。如圖I所示，本實(shí)用新型的ー個(gè)實(shí)施例為KRAS基因第2號(hào)外顯子突變檢測(cè)試劑盒，ー種KRAS基因第2號(hào)外顯子突變檢測(cè)試劑盒，包括盒體I、盒蓋2，盒體I內(nèi)設(shè)置擴(kuò)增盒3和純化盒4 ;擴(kuò)增盒3內(nèi)設(shè)置有PCR管5、裝KRAS2-1引物的試劑瓶6、裝KRAS2-2引物的試劑瓶7、裝酶混合物的試劑管8、去離子水瓶9 ;純化盒4內(nèi)設(shè)置有醋酸鈉溶液瓶10、電泳分離檢測(cè)試劑瓶11。所述引物KRAS2-1和引物KRAS2-2的的濃度均為5 u mo I/L ；所述KRAS2-1 的上游引物 5' -GAATGGTCCTGCACCAGTAA-3'，下游引物為5' -GTGTGACATGTTCTAATATAGTCA-3'；所述KRAS2-2 的上游引物 5' -GTCCTGCACCAGTAATATGC-3'，下游引物為5' -ATGTTCTAATATAGTCACATTTTC-3'。所述酶混合物包括濃度為0. 4mmol/L 的 dNTPs, 4mmol/L 的 Mg2+, 2xBuffer,
I.25U/25 U I 的 HsTaq0所述電泳分離檢測(cè)試劑是Hi-DiFormamide試劑。操作方法I)模板DNA的準(zhǔn)備取病人腫瘤組織，常規(guī)提取DNA，純度0D260/0D280 = I. 6 2. 0，用量每反應(yīng)60 lOOng。2)第一歩PCR反應(yīng)將各反應(yīng)物質(zhì)按照如下反應(yīng)體系進(jìn)行配比模板DNA ；KRAS2-1上下游引物各I U L ;酶混合物12.5 ii L ;滅菌去離子水補(bǔ)至25 Uし循環(huán)程序設(shè)置如下95 0C 5min ；95°C ^ 30s 64°C— 30s 72°C— 45s (35 循環(huán));72 °C 7min ；4°C保存，2%瓊脂糖電泳，EB染色分析，目的帶為214bp。3)第二步PCR反應(yīng)PCR產(chǎn)物I 2 ii L ；KRAS2-2上下游引物各I U L ;酶混合物12. 5 ii L ;滅菌去離子水補(bǔ)至25 u L0循環(huán)程序設(shè)置如下95 0C 5min ；95°C^ 30s 64°C—30s 72°C—45s (35 循環(huán))；72 °C 7min ；4°C保存，2%瓊脂糖電泳，EB染色分析，目的帶為204bp。4) PCR產(chǎn)物純化使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化。 5) PCR產(chǎn)物測(cè)序反應(yīng)使用ABI公司試劑進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。6)測(cè)序產(chǎn)物純化每管加入2ul 3M的NaAC至PCR管底；每管加入50ul 100%酒精，震蕩混勻，室溫避光放置15min ；12，OOOXg 4°C離心30min，用移液槍吸盡上清；每管加入70ul 70%酒精，12，OOOXg 4°C離心15min，用移液槍吸盡上清；室溫?fù)]發(fā)凈酒精，加入IOuL Hi-DiFormamide溶解DNA ；溶解后的樣品需要在95°C變性4min，迅速置冰中冷卻4min后，上樣電泳。7)結(jié)果判斷使用ABI3500自帶軟件進(jìn)行分析。綜上所述，本實(shí)用新型所述的實(shí)施方式僅提供一種最佳的實(shí)施方式，本實(shí)用新型的技術(shù)內(nèi)容及技術(shù)特點(diǎn)已掲示如上，然而熟悉本項(xiàng)技術(shù)的人士仍可能基于本實(shí)用新型所揭示的內(nèi)容而作各種不背離本發(fā)明創(chuàng)作精神的替換及修飾；因此，本實(shí)用新型的保護(hù)范圍不限于實(shí)施例所掲示的技術(shù)內(nèi)容，故凡依本實(shí)用新型的形狀、構(gòu)造及原理所做的等效變化，均涵蓋在本實(shí)用新型的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求1. ー種KRAS基因第2號(hào)外顯子突變檢測(cè)試劑盒，其特征在于，它包括盒體(I)、盒蓋(2)，盒體⑴內(nèi)設(shè)置擴(kuò)增盒(3)和純化盒⑷；擴(kuò)增盒(3)內(nèi)設(shè)置有PCR管(5)、裝KRAS2-1引物的試劑瓶出)、裝KRAS2-2引物的試劑瓶(7)、裝酶混合物的試劑管(8)、去離子水瓶(9);純化盒(4)內(nèi)設(shè)置有醋酸鈉溶液瓶(10)、電泳分離檢測(cè)試劑瓶(11)。
專利摘要本實(shí)用新型公開了一種KRAS基因第2號(hào)外顯子突變檢測(cè)試劑盒，它包括盒體1、盒蓋2，盒體1內(nèi)設(shè)置擴(kuò)增盒3和純化盒4；擴(kuò)增盒3內(nèi)設(shè)置有PCR管5、裝KRAS2-1引物的試劑瓶6、裝KRAS2-2引物的試劑瓶7、裝酶混合物的試劑管8、去離子水瓶9；純化盒4內(nèi)設(shè)置有醋酸鈉溶液瓶10、電泳分離檢測(cè)試劑瓶11。本試劑盒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、設(shè)計(jì)合理、檢測(cè)過程不易受污染；本試劑盒在檢測(cè)KRAS基因第2號(hào)外顯子突變時(shí)具有敏感性高、特異性強(qiáng)、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)；本試劑盒設(shè)置檢品盒和輔助盒，檢測(cè)時(shí)更方便。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK202519264SQ20122016439
公開日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2012年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月17日
發(fā)明者馮繼鋒, 吳建中, 唐金海, 曹海霞, 馬蓉 申請(qǐng)人:馮繼鋒, 吳建中, 唐金海, 曹海霞, 馬蓉