專利名稱：甘草黃酮的提取純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種甘草黃酮(Glycyrrhiza Uralensis Fisch.，G.lnflata Bat.，G.glabra L.，等甘草)的提取及純化新方法，本法改革了國內(nèi)外文獻(xiàn)所敘述的以溶劑萃取后相分配及以大孔徑樹脂吸附雜質(zhì)等，以獲得甘草黃酮，代之以使用膜技術(shù)或/和層析進(jìn)行純化，使生產(chǎn)工藝大為簡便，流程縮短，收率提高，成本降低。
此工藝十分繁復(fù)，流程多，生產(chǎn)周期長，且得率低(按甘草黃酮含量而浮動)，并要消耗大量溶劑和昂貴的吸附材料。
所述的膜分離方法是使用孔徑為分子量1000～15000的膜。該超濾壓力為1～10公斤(kg)，換言之為0.1-1mPa.。
所述的溶劑萃取是用有機(jī)溶劑及它們的混合溶劑在回流溫度下萃取或0～40℃時冷浸或滲漉萃取，萃取時間為1～48小時。所述的有機(jī)溶劑可以是乙醚、乙醇、氯仿、醋酸乙酯、石油醚、苯等。
本發(fā)明的方法中，所述的過濾通常用濾布予以粗過濾就能滿足要求。也可以用分子篩、硅藻土或微孔膜進(jìn)行過濾。
所述的濃縮可以是低溫濃縮、冷凍干燥、減壓濃縮或粉末噴霧干燥的方法。
經(jīng)濃縮所得的甘草黃酮可以進(jìn)一步柱層析純化，所述的層析柱可以采用硅膠柱、聚酰胺柱或分子篩柱等柱層析的方法。層析溶劑為包括醇、烷烴、酯、氯代烴，芳香烴等在內(nèi)的一種或二種混合有機(jī)溶劑。
此工藝所得產(chǎn)品和舊工藝所得產(chǎn)品，經(jīng)HPLC和紅外、質(zhì)譜、核磁等光譜數(shù)據(jù)核證得到確認(rèn)，無黃酮丟失。本發(fā)明所采用的工藝大為簡便，收率提高。由于節(jié)省了大量溶劑和消耗性吸附材料，成本也大為降低。
其中，①甘草酸；②芒柄花黃素Formononetin⑧甘草啶Licoricidin；④甘草醇Glycyrol⑤甘草利酮Licoricone⑥光甘草定Glabridine；⑦光甘草醇Glabrol；⑧HISPA光甘草定HISPA Glabridin；⑨4′-O-甲基光甘草啶(4′-O-Methylglabridin)；⑩3′-甲氧基光甘草啶(3′-Methoxyglabridin)。
實(shí)施例2按實(shí)施例1的操作得乙醇提取液，以0.5μM微孔膜作預(yù)濾，然后以2000分子量膜進(jìn)行超濾，(外壓4kg，溫度25～40℃)濾液經(jīng)減壓(溫度35～100℃下)濃縮得產(chǎn)品甘草黃酮2.3公斤。
實(shí)施例3按實(shí)施例1操作，先以水提取除去極性有機(jī)物質(zhì)，干燥后再以乙醇萃取，萃取液以0.5μM微孔膜過濾，然后以10000分子量膜進(jìn)行超濾，(外壓3kg，溫度25～30℃)濾液經(jīng)減壓濃縮(溫度35～100℃下)，得產(chǎn)品甘草黃酮1.56公斤。
實(shí)施例45g上述實(shí)施例3萃取得到的粗甘草黃酮，用氯仿溶解，加入含250ml聚酰胺柱，然后用氯仿-甲醇(94∶4～80∶20)進(jìn)行洗脫，得各種活性甘草黃酮，共1.56g(化合物1～10)。
實(shí)施例55g上述實(shí)施例3萃取得到的粗甘草黃酮，用氯仿溶解，加入裝有150g硅膠的柱，用氯仿-甲醇(99∶1～90∶10)進(jìn)行洗脫，得各種(化合物1～10)含量不同的甘草黃酮。
實(shí)施例6以上實(shí)施例1采用西北蘭州產(chǎn)甘草所得甘草黃酮經(jīng)高壓液相色譜(HPLC)并和標(biāo)準(zhǔn)樣品對照得譜圖如

圖1所示。
HPLC條件如下
儀器Agilent 1100 Series，流速1.8ml/min，柱150×4.6mm 5μ C18， 進(jìn)樣量0.4mg/ml；10μl，流動相CH3CN∶2％CH3COOH＝1∶1， 壓力150bar，波長282nm， 滯留時間2.6min。
經(jīng)層析得樣品，分析數(shù)據(jù)如下甘草醇(Glycyrol)紫外，u.vλETOHmaxnm228，247，256inf，349，358inf.
紅外，RνKBrmaxcm-13400，2920，1715，1612，1595，1516，1446.
核磁，N.M.Rδ4-DXSOPPm1.62(3H，S，CH3ofγ，γ-dimethylallyl)，1.73(3H，S，CH3ofγ，γ-dimethylallyl)，3.24(2H，d，8，CH2ofγ，γ-dimethylallyl)，3.86(3H，S，Ome)，5.15(1H，b.s，OH-5 and OH-4′，exchangeable with D.Q).
質(zhì)譜，M.S m/e366(M+).
甘草利酮(Licoricone)紫外，UVλETOHmaxnm(ε)238(20640)，248(19720)，284(10240)，302(7800)；紅外，λEtOH-NaoaCmaxnm250，253(inf.)，303(sh.)，330.IRγchclmaxcm-13500，3160，1631，1612，1585，1570；γKBrmaxcm-13140，1628，1611，1584.
核磁NMR(60MC，dδ-DMSO)δ1.63(3H，br.s)，1.69(3H，br.s，-CH2-CH＝C(CH3)2，3.20(2H，br.d，J＝7Hz，-CH2-CH＝C(CH3)2)，3.40(3H，s)(OCH3)，5.14(1H，brt，J＝7Hz，-CH2＝CH-C(CH3)2)，6.35(1H，s，H-3)，6.89(1H，d，J＝2.5Hz，H-8)，6.96(1H，d.d，J＝9，2.5Hz，H-6)，7.92(1H，d，J＝9Hz，H-5)，8.01(1H，s，H-2)，9.2(1H，br.)，10.6(1H，br.)(-OH，disappeared after the addition of D2O).
質(zhì)譜，M.S m/e382(M+，base peak)，367(M-CH3，57％)，351(m-och3，44)，327(M-CH＝C(CH3)2，17)，314(M-CHCH＝C(CH3)2，19)，257(25)，137(37).元素分析計(jì)算值C22H22O6C，69.10；H，5.80.分析值C，68.95；H，5.87.
光甘草定(Glabridin)紫外，UVλEtohmaxnm(logε)281.5(4.18)，288(4.13inf)，312(3.47sh.).
紅外，IRγKBrmaxcm-13270，2940，1611，1587，1526，1480.
核磁，NMRδCDCLPPM1.42(3H×2，s，CH3-2″)，2.87(1H，d，6.0，H-4eq)，2.89(1H，d，10.0，H-4ax)，3.3-3.4(1H，m，H-3ax)，4.00(1H，t，10，H-2ax)，4.35(1H，q，10 and 3.5，H-2eq)，5.53(1H，d，10，H-3″)，5.80(2H，broad s，OH-2′and 4′，disappeared by the addition of D2O)，6.23(1H，d，2，H-3′)，6.31(1H，d.d，8 and 2，H-5′)，6.34(1H，d，8H-6)，6.61(1H，d，10，H-4″)，6.76(1H，d，8，H-5)，6.86(1H，d，8，H-6′).M.S m/e324(M+).
元素分析計(jì)算值C20H20O4C，74.05；H，6.22.分析值C，74.33；H，6.23光甘草醇(Grabrol)紫外，UVλEtohmaxnm(logε)281(4.35)，312.5(4.06).
紅外，IRγKBrmaxcm-13360，2920，1649，1586，1505，1442.
核磁，NMRδCDCLPPM1.70(3H×2，broad s，CH3of dimethylallyl)，1.76(3H×2，broad s，CH2of dimethylallyl)，2.8-2.9(2H，m，H-3)，3.38(4H，d，7，benzylic of dimethylallyl)，5.3(2H，m，H-2 andolefinic of dimethylallyl)，5.54(1H，s，OH-4′)，6.48(1H，s，OH-7，exchangeable with D2O)，6.52(1H，d，8.5，H-6)，6.80(1H，d，8.5，H-5′)，7.18(1H，d.d，8.5)HISPAGLABRIDIN A；ir(KBr)υmax3500，3350，2920，1632，1610，1582，1500，and 1472cm-1；pmr(CDCL3，100mHz)δ1.38(s，6H，C(CH3)2)，1.75(s，3H，CH3)，1.81(s，3H，CH3)，2.85(dd，1H，J＜1Hz，A of ABMXX′)，2.88(dd，1H，J＝10Hz，J＜1Hz，B of ABMXX′)，3.30-3.50(m，1H，MofABMXX′)，3.42(br.d.，2H，J＝7Hz，CH2-CHC(CH3)2)，3.97(t，1H，J＝10Hz，X of AMBXX′)，4.36(br.dd，1H，J＝10 and 4Hz，X′of ABMXX′)，4.87(s，1H，exchange D2O)，5.24(br.t.，1H，J＝7Hz，CH2-CHC(CH3)2)，5.42(s，1H，exchangesD2O)，5.51(d，1H，J＝10Hz，HC＝)，6.32(d，1H，J＝8Hz，HC＝)，6.35(d，1H，J＝8Hz，HC＝)，6.65(d，1H，J＝10Hz，HαC＝)，and 6.78(d，2H，J＝8Hz，2Xhc＝)；紫外，uv λmax(MeOH)281nm(logε4.05)，290infl.(3.95)and 312(3.14)；質(zhì)譜，ms，m/e 392(M+，23％)，377(76％)，204(5％)，189(30％)，187(39％)，174(23％)，173(100％)，and 47(19％)；ord(C＝0.000036，mEoh)，[φ]306O，[φ]295+2725，[φ]278-7625，[φ]268-1850，元素分析計(jì)算值C25H28O4C，76.50；H，7.19.C.H分析值C，76.47；H，7.39.
HISPAGLABRIDIN B；紅外，ir(KBr)υmax3400，1635，1605，1583，1497，and 1475cm-1；pmr(CDCL3，60mHz)δ1.40(s，12H，2＝C(CH3)2)，2.83(2H，AB of ABMXX′)，3.3-3.5(1H，M of ABMXX)，3.97(1H，X ofABMXX′)，4.33(1H，X′of ABMXX′)，5.00(s，1H，exchangesD2O)，5.47(d，1H，J＝9.5Hz，HβC＝)，5.50(d，1H，J＝10Hz，HβC)，6.13(d，1H，J＝8Hz，HC＝)，6.28(d，1H，J＝8Hz，HC＝)，6.57(d，1H，J＝9.5Hz，HαC＝)，6.60(d，1H，J＝10Hz，HαC＝)，6.71(d，1H，J＝8Hz，HC＝)，and 6.74(d，1H，J＝8Hz，HC＝)；紫外，uvλmax(MeOH)280nm(logε4.17)，290infl.(4.11)and 309(3.67)；ms，m/e390(M+，29％)，375(100％)，202(2％)，189(29％)，187(67％)，180(38％)，173(100％)，and 147(17％)；ord(C＝0.000043，MeOH)，[φ]310-8350，[φ]300-10875，[φ]292O，[φ]280+14500，and[φ]264O.
元素分析計(jì)算值C25H24O4C，76.88；H，6.71.C.H分析值C，77.16；H，7.21.
3′-甲氧基光甘草定(3′-METHOXYGLABRIDIN)；紅外，ir(KBr)maxυ3480，2980，2940，2850，1630，1610，1580，1508 and1476cm-1；pmr(CDCL3，100mHz)δ1.38(s，6H，C(CH3)2)，2.87(1H，A of ABMXX′)，2.91(1H，B ofABMXX′)，ca.3.5(m，of M of ABMXX′)，3.78(s，3，OCH3)，4.02(1H，X of ABMXX′)，4.37(1H，X′of ABMXX′)，5.51(d，1H，J＝10Hz，HβC＝)，5.58(s，2H，2xOH，D2Oexchangeable)，6.34(d，1H，J＝8Hz，HC＝)，6.38(d，1H，J＝8.5Hz，HC＝)，6.58(d，1H，J＝8.5Hz，HC＝)，6.65(d，1H，J＝10Hz，HαC＝)，6.78(d，1H，J＝8Hz，HC＝)；紫外，uvλmax(MeOH)280nm(logυ3.98)，289 infl.(3.89)and 311(3.36)(uv maxima werenot shifted by an addition of excess AlCl3solution.)；ms，m/e354(M+，23％)，339(78％)，189(10％)，187(29％)，173(100％)，166(5％)，153(18％)and 147(6％)；元素分析計(jì)算值C21H22O5C，71.19；H，6.25.分析值C，71.21；H，6.42.
4′-O-甲基光甘草定(4′-O-METHYLGLABRIDIN)；紅外，ir(KBr)υmax 3410，2980，2920，2860，1615，1600，1583 and1515cm-1；pmr(CDCL3，100mHz)δ1.40(s，6H，C(CH3)2)，290(2H，AB of ABMXX′)，3.3-3.6(1H，M of ABMXX′)，3.70(s，3H，OCH3)，4.05(1H，X of ABMXX′)，4.38(1H，X′ofABMXX′)，5.20(s，1H，exchangeable D2O)，5.50(d，1H，J＝10Hz，HβC＝)，6.29(d，1H，J＝2Hz，HC＝)，6.32(d，1H，J＝8Hz，HC＝)，6.41(dd，1H，J＝2 and 8Hz，HC＝)，6.61(d，1H，J＝10Hz，HαC＝)，6.77(d，1H，J＝8Hz，HC＝)and 6.96(d，1H，J＝8Hz，HC＝)；紫外，uvλmax(MeOH)281nm(logε4.07)，290 sh(3.96)and 312(3.34)；ms，m/e338(M+，25％)，323(91％)，187(32％)，173(100％)，150(12％)，149(22％)and 137(15％)；元素分析計(jì)算值C21H22O4C，74.53；H，6.55；分析值C，74.47；H，6.51.
異甘草黃酮醇核磁，NMRδH(DMSO-d6)1.68(6H，s，(CH3)2O＝CHCH2)，3.28(2H，d，J＝7Hz，(CH3)2C＝CHCH2)，5.28(1H，t，J＝7Hz，(CH3)2C＝CHCH2)，6.15(1H，d，J＝2Hz，6-H)，6.37(1H，d，J＝2Hz，8-H)，6.90(1H，d，J＝8Hz，5′-H)，7.85(1H，dd，J＝8，2Hz，6-H)，7.87(1H，d，J＝2Hz，2′-H)，9.16，9.98，10.64，12.44(均為1H，bs，OH，D2O交換消失).
質(zhì)譜，M.S.m/z354.1103(M+-C4H7)，285.0345(M+-C5H9)，269.0482，189.0939，189.0939，153.0188，134.0313，106.0195.
甘草西定(Licoricidin)[α]25D+19.26(MeOH，C＝1)，UVλEtOHmaxnm(logε)282(3.86)。I.R.γKBrmaxcm-13500，3285，1615，1504.NMR(DMSO-d6，δ)1.70(6H.br.S. Ar)，3.25(2H，d，J＝6Hz，-CH2-Ar)，5.12(1H，t，J＝6Hz，-CH＝C)，5.00(1H，J＝6Hz -CH＝C)，3.63(3H，s，OCH3)，6.08(1H，s)，6.23(1H，d，J＝8Hz)，6.67(1H，d，J＝8Hz)，5.36，4.80(各1H，dd，J＝10，3Hz)，3.84(1H，d，J＝10Hz)，2.80(2H，m)。M.S.m/z424.2192(分子式為C26H32O5)，NMR(CDCl3，δ)，1.61(6H，br.s)，1.67(6H，br.s)，2.20，2.24(各3H，s，3xCOCH3)，2.80(2H，m)，3.08，3.15(各1H，d，J＝6Hz)，3.64(3H，s)，3.90(1H，d，J＝10Hz)，4.20(1H，dd，J＝10，3.5Hz)，6.32(1H，s)，6.95(1H，d，J＝8Hz)，7.02(1H，d，J＝8Hz)。
芒柄花黃素(Formononetin)UVλEtOHmaxnm(logε)255(4.45)，310(4.08)。M.S.m/z268(M+)，253，240，225，132。NMR(DMSO-d6，δ)3.73(3H，s)，6.8-6.96(4H，H3′，5′，6，8)，7.43(2H，d，J＝8Hz，H2′.6′)，7.90(1H，d，J＝8Hz)，8.26(1H，s，H2)。
元素分析計(jì)算值C21H22O4·1/2H2OC，72.63；H，6.67分析值c，72.82；72.71；H，7.03，6.91UVλMeoHnm(logε)256(4.04)，315(4.15)，380(4.46)；λMeONanm(logε)252(4.07)，355(4.04)，456(4.65)IRυKClmax1576，1595，1613，1660，3190-3280厘米-1NMRM.S.m/eM+338(M+，)，307(M-OCH3)，121(HO-C6H4-C≡O(shè)+，).
權(quán)利要求
1.種甘草黃酮的提取純化的方法，包括甘草根干燥、粉碎、溶劑萃取、過濾和濃縮，其特征是溶劑萃取液過濾后用膜進(jìn)行超濾，再濃縮得產(chǎn)品甘草黃酮。
2.如權(quán)利要求1所述的一種甘草黃酮的提取純化的方法，其特征是所述的溶劑萃取是用有機(jī)溶劑及它們的混合溶劑在回流溫度下萃取或0～40℃時冷浸或滲漉 萃取，萃取時間為1～48小時。
3.如權(quán)利要求1所述的一種甘草黃酮的提取純化的方法，其特征是所述的超濾膜具有孔徑為分子量1000-15000的膜。
4.如權(quán)利要求1所述的一種甘草黃酮的提取純化的方法，其特征是所述的超濾壓力為0.1～1mPa.。
5.如權(quán)利要求1所述的一種甘草黃酮的提取純化的方法，其特征是所述的濃縮是低溫濃縮、冷凍干燥、減壓濃縮或粉末噴霧干燥的方法。
6.如權(quán)利要求1所述的一種甘草黃酮的提取純化的方法，其特征是所述的過濾通是用濾布予以粗過濾。
7.如權(quán)利要求1所述的一種甘草黃酮的提取純化的方法，其特征是所述的經(jīng)超濾、濃縮所得的甘草黃酮再經(jīng)柱層析純化。
8.如權(quán)利要求1所述的一種甘草黃酮的提取純化的方法，其特征是使用的層析為聚酰胺或硅膠或分子篩層析，使用的層析溶劑為有機(jī)溶劑(包括醇、烷烴、酯、氯化烴、芳香烴等)或它們的混合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種甘草黃酮的提取純化方法，本發(fā)明改進(jìn)了國內(nèi)外文獻(xiàn)所敘述的以溶劑萃取后相分配及以大孔徑樹脂吸附雜質(zhì)等制備得甘草黃酮的方法，代之以使用膜技術(shù)得甘草黃酮或再進(jìn)行層析純化，使生產(chǎn)工藝大為簡便，流程縮短，收率提高，成本降低。
文檔編號C07D311/30GK1477104SQ03141529
公開日2004年2月25日 申請日期2003年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月11日
發(fā)明者朱育新, 孫東海 申請人:上海奧利實(shí)業(yè)有限公司