專利名稱：一種獲得血液中實(shí)體腫瘤相關(guān)游離蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種獲得血液中實(shí)體腫瘤相關(guān)游離蛋白的方法。
背景技術(shù)：
腫瘤已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類生存健康的重大疾病之一，其發(fā)病率及死亡率均呈上升趨勢。來醫(yī)院就診的患者大多已經(jīng)處于中期或晚期，錯過了治療的最佳時機(jī)，多數(shù)患者預(yù)后不佳。因此，尋找實(shí)體腫瘤相關(guān)蛋白，研究蛋白之間的相互作用，進(jìn)而做到腫瘤的早期診斷，對提高病人的診斷率和生存率，顯得尤為重要。
目前日益發(fā)展并完善的大規(guī)模蛋白質(zhì)組研究技術(shù)，將成為發(fā)掘腫瘤相關(guān)游離蛋白的有力手段。并且，血漿生物標(biāo)志物的研究和發(fā)展促進(jìn)了蛋白質(zhì)組學(xué)、醫(yī)學(xué)以及生物信息學(xué)等多學(xué)科的交叉協(xié)作。如果通過檢測人血漿中某一組蛋白表達(dá)水平的高低，這樣一種創(chuàng)傷較小的方法，便可得知其患腫瘤的可能性或其腫瘤的發(fā)展程度，那么將為臨床醫(yī)生能盡早做出正確的診斷和治療方案大大提供幫助。然而，人類血漿中蛋白成分不僅極為復(fù)雜，并且存在高豐度的白蛋白，因此用現(xiàn)有手段從血漿中直接尋找腫瘤的相關(guān)游離蛋白無異于大海里撈針。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種獲得血液中實(shí)體腫瘤相關(guān)游離蛋白的方法。
本發(fā)明所提供的獲得血液中實(shí)體腫瘤相關(guān)游離蛋白的方法，包括以下步驟1)培養(yǎng)實(shí)體腫瘤細(xì)胞及相應(yīng)正常組織獲取原代細(xì)胞或?qū)?shí)體腫瘤及相應(yīng)正常組織進(jìn)行器官培養(yǎng)；2)培養(yǎng)步驟1)中獲得的原代細(xì)胞或器官，制備條件培養(yǎng)基(conditionedmedium)，進(jìn)行SDS-PAGE電泳與納升液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀分析，得到差異蛋白質(zhì)；3)在所述實(shí)體腫瘤患者和正常人血漿中檢測步驟2)中所述差異蛋白質(zhì)，確定所述實(shí)體腫瘤相關(guān)游離蛋白。
所述實(shí)體腫瘤可為肺癌，食管癌，宮頸癌，膀胱癌，皮膚癌等實(shí)體腫瘤。
步驟1)中所用的培養(yǎng)基可為加入無血清的常規(guī)培養(yǎng)基，如LHC-9培養(yǎng)基(購自sigma公司)，培養(yǎng)溫度可為36.5℃；所述實(shí)體腫瘤及相應(yīng)正常組織的器官培養(yǎng)條件優(yōu)選為高氧條件，如在50％O2，45％N2和5％CO2的混合氣體環(huán)境中培養(yǎng)；所述實(shí)體腫瘤細(xì)胞是腫瘤組織經(jīng)脫氧核糖核酸酶I、膠原酶Type I、透明質(zhì)酸酶、EGTA和PVP消化處理得到的。步驟2)中獲取的條件培養(yǎng)基為無垂體的LHC-9培養(yǎng)基；步驟3)中所述檢測方法為酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbantassay，ELISA)和免疫組織化學(xué)方法。
上述方法中，當(dāng)所實(shí)體述腫瘤為肺癌時，所述相應(yīng)正常組織為正常支氣管上皮組織，所述實(shí)體腫瘤相關(guān)游離蛋白為基質(zhì)金屬蛋白酶I(MMP1)，F(xiàn)ascin(Singed-likeprotein，55kDa actin bundling protein)，14-3-3 eta，Ezrin(cytovillin)，4F2cell surface antigen heavy chain(Lymphocyte actiavation antigen 4F2 largesubunit，CD98 antigen)和Annexin A4。
本發(fā)明方法得到的MMP1的濃度與腫瘤的TNM分期密切相關(guān)(p＜0.05)；Fascin(actin-bundling protein)，14-3-3 eta，在肺癌病人血漿中濃度比年齡匹配的正常人對照組的濃度低(p＜0.05)；Ezrin，CD98在肺癌病人血漿中的濃度無顯著變化；Annexin A4在SCLC病人血漿中濃度比NSCLC低(p＜0.05)。
本發(fā)明的方法可快速、準(zhǔn)確地獲得一組實(shí)體腫瘤相關(guān)游離蛋白，利用獲得的實(shí)體腫瘤相關(guān)游離蛋白可以制備其抗體，進(jìn)一步制成ELISA試劑盒或蛋白芯片用于實(shí)體腫瘤病人的診斷，進(jìn)而指導(dǎo)治療，將在腫瘤的臨床診斷和治療中發(fā)揮重要作用。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、肺癌和正常支氣管原代細(xì)胞的培養(yǎng)及肺癌和正常支氣管的器官培養(yǎng)手術(shù)室離體30分鐘之內(nèi)的肺癌標(biāo)本，選取約0.5-1.0cm長的一段正常支氣管和約2cm3的腫瘤組織，迅速放入盛有洗液(含1％青鏈霉素的L15培養(yǎng)基，sigma公司)的無菌瓶中。
1、培養(yǎng)正常支氣管上皮獲取原代細(xì)胞將支氣管切成2mm3左右的小塊，放入已涂好膠原的平皿(直徑60mm，costar公司)中，6塊/平皿，4℃冰箱放置2-3小時。取出后，加入LHC-9培養(yǎng)基。36.5℃孵箱中培養(yǎng)1-2周。
2、肺癌細(xì)胞培養(yǎng)方法(1)消化酶溶液的制備按照表1的數(shù)據(jù)配制消化酶，將已經(jīng)配制好的消化酶脫氧核糖核酸酶I、膠原酶Type I、透明質(zhì)酸酶、PVP各0.5ml以及EGTA 0.25ml加入7.8ml MCDB 151工作液(購自sigma公司)，混勻，濾膜(0.22μm，MILLIPORE公司)過濾，備用。
表1 消化酶配制方法(所有試劑均購自sigma公司)


(2)消化肺癌組織從上述無菌瓶中取出肺癌組織，去除結(jié)締組織等雜物，用洗液洗干凈。另取一個小平皿，將組織移入，剪碎。將過濾好的消化酶加入組織中，混勻，放于4℃冰箱中消化4-8小時。開始每隔兩小時觀察一次，到有細(xì)胞消化下來后，隨時觀察。消化過程中可以用移液管吹吸混合液，幫助消化。到有成串的大量細(xì)胞下來，并觀察到組織大部分呈空網(wǎng)狀，終止消化。將消化后的混合液用銅網(wǎng)(200目)過濾，然后將銅網(wǎng)取出。在過濾完畢的濾液中加入幾滴小牛血清，終止消化。濾液移入玻璃離心管中，1000rpm離心5min。
(3)種細(xì)胞離心完畢后，棄上清。視細(xì)胞多少種入2-3個小平皿中，每個平皿加4ml含2％胎牛血清的LHC-9培養(yǎng)基。36.5℃孵箱中培養(yǎng)1-2周，得到肺癌的原代細(xì)胞。
3、器官培養(yǎng)方法(1)將支氣管或肺癌組織切成4mm3左右的小塊，放入已涂好膠原的平皿中，6塊/平皿，4℃冰箱放置2-3小時。
(2)取出平皿后，加入LHC-9培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)盒中，充入含有50％ O2，45％N2和5％CO2的混合氣體，封好盒子(確保不漏氣)。
(3)將培養(yǎng)盒放在搖擺床上，搖擺頻率3-4次/分鐘，36.5℃孵箱中培養(yǎng)1-2周。
實(shí)施例2、肺癌相關(guān)游離蛋白的獲得(1)制備條件培養(yǎng)基(conditioned medium)將實(shí)施例1中按步驟1和2的培養(yǎng)方法得到的原代細(xì)胞傳代于直徑100mm平皿，加入LHC-9培養(yǎng)基，36.5℃孵箱中培養(yǎng)至約106個細(xì)胞/平皿。然后用1×HBS(Hepes，NaCl，KCl，Glucose，NaH2PO4·7H2O)潤洗細(xì)胞三次，加入3ml LHC-9培養(yǎng)基(無垂體)，放入36.5℃孵箱中培養(yǎng)1小時；然后HBS潤洗兩次，加入3ml LHC-9培養(yǎng)基(無垂體)，放入36.5℃孵箱中培養(yǎng)48小時；收集條件培養(yǎng)基；8000rpm離心5min，4℃；取上清，4℃保存。將實(shí)施例1中按步驟3的方法得到的培養(yǎng)器官，按上述方法收集培養(yǎng)基。
(2)SDS-PAGE電泳與質(zhì)譜聯(lián)用分析細(xì)胞釋放的到條件培養(yǎng)基中的蛋白將上一步收集到的條件培養(yǎng)基用雙蒸水透析24小時，收集透析后培養(yǎng)基，冰凍干燥。干燥后樣本用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)加樣緩沖液溶解，加熱煮沸3分鐘完全變性，用10％ SDS-PAGE分離，考馬斯亮藍(lán)染色。將SDS-PAGE膠從上至下切成對應(yīng)的33個條帶，進(jìn)一步切成膠粒后脫色，用胰蛋白酶進(jìn)行膠內(nèi)多肽的酶切提取，提取后的多肽用納升液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀分析，鑒定差異蛋白質(zhì)。由質(zhì)譜鑒定共得到近200種蛋白，如MMP1，Protein disulfide isomerase A3precursor，Annexin家族，14-3-3家族等。
(3)確定肺癌相關(guān)游離蛋白使用ELISA試劑盒(Oncogene公司)測定血漿中MMP1的濃度。將血漿和標(biāo)準(zhǔn)蛋白加入ELISA板中，室溫2小時；然后用洗液洗板5次，加入HRP標(biāo)記抗體，室溫1小時；用洗液洗板5次，加入顯色液，室溫30分鐘；終止顯色，于酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司)測450/570nm處吸光度；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算濃度。用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MMP1的濃度與腫瘤的TNM分期密切相關(guān)(p＜0.05)。
用下述方法檢測血漿中無標(biāo)準(zhǔn)ELISA試劑盒蛋白(Fascin，14-3-3 eta，Ezrin，CD98和Annexin A4)抗體(Santa Cruz公司)以2μg/ml濃度包被ELISA板(Costar公司)4℃過夜；加入1％BSA封閉液，37℃，4小時；1×PBST(0.5％Tween 20)洗板3次，加入待測血漿，室溫1小時；1×PBST洗板7次，加入與包被抗體不同種屬的抗體(Santa Cruz公司)，300-600ng/ml，室溫30分鐘；1×PBST洗板7次，加入抗上一步相同種屬的HRP標(biāo)記二抗(Jackson或DAKO公司)，室溫30分鐘；1×PBST洗板7次，加入0.1mg/mlTMB顯色，室溫30分鐘；2M H2SO4終止反應(yīng)；于酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司)測450/570nm處吸光度。用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。Fascin，14-3-3 eta，在肺癌病人血漿中濃度比年齡匹配的正常人對照組的濃度低(p＜0.05)；Ezrin，CD98在肺癌病人血漿中的濃度無顯著變化；Annexin A4在SCLC病人血漿中濃度比NSCLC低(p＜0.05)。
實(shí)施例3、設(shè)計(jì)肺癌組織微陣列，進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析一張免疫組化片子上設(shè)計(jì)100個病例。將石蠟切片脫蠟至水，3％H2O2處理10分鐘，1×PBS洗3次；血清封閉10分鐘；加一抗(Santa Cruz公司)，4℃過夜；1×PBS洗3次，加生物素標(biāo)記的二抗(中山公司免疫組化試劑盒)，37℃，10-30分鐘；1×PBS洗3次，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，37℃，10分鐘；DAB顯色，蘇木素復(fù)染；切片經(jīng)二甲苯脫水，中性樹脂膠封片。顯微鏡下觀察。MMP1在轉(zhuǎn)移性鱗癌(175例)表達(dá)的陽性率顯著高于非轉(zhuǎn)移鱗癌(141例)(p＜0.05)。
權(quán)利要求
1.一種獲得血液中實(shí)體腫瘤相關(guān)游離蛋白的方法，包括以下步驟1)培養(yǎng)實(shí)體腫瘤細(xì)胞及相應(yīng)正常組織獲取原代細(xì)胞或?qū)?shí)體腫瘤及相應(yīng)正常組織進(jìn)行器官培養(yǎng)；2)培養(yǎng)步驟1)中獲得的原代細(xì)胞或器官，制備條件培養(yǎng)基(conditionedmedium)，進(jìn)行SDS-PAGE電泳與納升液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀分析，得到差異蛋白質(zhì)；3)在所述實(shí)體腫瘤患者和正常人血漿中檢測步驟2)中所述差異蛋白質(zhì)，確定所述實(shí)體腫瘤相關(guān)游離蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟1)中所用的培養(yǎng)基為加入無血清的常規(guī)培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基為LHC-9培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟1)中所實(shí)體述腫瘤及相應(yīng)正常組織的器官在50％O2，45％N2和5％CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟1)中所述實(shí)體腫瘤細(xì)胞是實(shí)體腫瘤組織經(jīng)脫氧核糖核酸酶I、膠原酶TypeI、透明質(zhì)酸酶、EGTA和PVP消化處理得到的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟2)中獲取的條件培養(yǎng)基為無垂體的LHC-9培養(yǎng)基
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟3)中所述檢測方法為ELISA和免疫組化方法。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于所述實(shí)體腫瘤為肺癌；所述相應(yīng)正常組織為支氣管上皮組織。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述實(shí)體腫瘤相關(guān)游離蛋白為MMP1，F(xiàn)ascin，14-3-3 eta， Ezrin，CD98和Annexin A4。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種獲得血液中實(shí)體腫瘤相關(guān)游離蛋白的方法。本發(fā)明所提供的獲得血液中實(shí)體腫瘤相關(guān)游離蛋白的方法，包括以下步驟1)培養(yǎng)實(shí)體腫瘤細(xì)胞及相應(yīng)正常組織獲取原代細(xì)胞或?qū)?shí)體腫瘤及相應(yīng)正常組織進(jìn)行器官培養(yǎng)；2)培養(yǎng)步驟1)中獲得的原代細(xì)胞或器官，制備條件培養(yǎng)基，進(jìn)行SDS－PAGE電泳與納升液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀分析，得到差異蛋白質(zhì)；3)在所述實(shí)體腫瘤患者和正常人血漿中檢測步驟2)中所述差異蛋白質(zhì)，確定所述實(shí)體腫瘤相關(guān)游離蛋白。本發(fā)明的方法可快速、準(zhǔn)確地獲得一組實(shí)體腫瘤相關(guān)游離蛋白，利用獲得的實(shí)體腫瘤相關(guān)游離蛋白可以制備其抗體，進(jìn)一步制成ELISA試劑盒或蛋白芯片用于實(shí)體腫瘤病人的診斷，進(jìn)而指導(dǎo)治療，將在腫瘤的臨床診斷和治療中發(fā)揮重要作用。
文檔編號C07K14/435GK1635111SQ20031011298
公開日2005年7月6日 申請日期2003年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月29日
發(fā)明者程書鈞, 錢小紅, 高燕寧, 應(yīng)萬濤, 肖汀, 李蕾, 胡智, 張開泰 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所, 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所