專利名稱：蜂毒肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及氨基酸類型的小分子多肽及其應(yīng)用，更具體地說是一種蜂毒肽以及在用于制備通過殺菌、中和內(nèi)毒素(lipopolysaccharide，LPS)和抑制呼吸爆發(fā)達到治療膿毒癥藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
膿毒癥是導(dǎo)致臨床危重病人死亡的主要原因，特別是伴有嚴(yán)重LPS血癥的革蘭氏陰性(G-)桿菌的感染。G-菌菌血癥的病死率為20～30％，而由菌血癥發(fā)展而來的膿毒癥休克其病死率可高達50～80％。目前針對膿毒癥的治療，臨床上尚無有效措施，因此導(dǎo)致感染性疾病的治療更為棘手，研究其發(fā)病機理并尋找有效的治療措施一直是臨床醫(yī)學(xué)關(guān)注的焦點。
近年來，隨著對膿毒癥研究的深入，存在于G-桿菌外膜上LPS的作用日益受到重視。LPS被認為是膿毒癥休克病人死亡原因—失控性炎癥反應(yīng)綜合征(systemicinflammatory response syndrome，SIRS)和代償性抗炎癥綜合征(compensatoryanti-inflammatory response syndrome，CARS)的主要啟動子。進入血中的LPS其主要生物學(xué)作用包括以下幾個方面(1)與巨噬細胞接觸后能誘生、釋放多種炎癥介質(zhì)如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、自細胞介素-1(IL-1)、白細胞介素-6(IL-6)等，通過這些介質(zhì)直接或間接發(fā)揮局部及全身效應(yīng)。(2)可與多種組織、實質(zhì)細胞結(jié)合直接導(dǎo)致細胞損傷。(3)激活凝血、纖溶、補體系統(tǒng)，誘發(fā)DIC。(4)作用于α受體，促使腎上腺兒茶酚胺分泌，導(dǎo)致微循環(huán)障礙、血漿外滲，直至發(fā)生休克以及其它如發(fā)熱、白細胞減少，Shwartzman反應(yīng)等。在復(fù)雜的炎癥反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中，分別針對TNF、IL-1等各種炎癥因子的調(diào)控措施也不斷提出，但結(jié)果令人失望。其主要原因在于各種不同的炎癥因子相互作用密不可分，僅針對某個或數(shù)個細胞因子并不能解決問題。因此抓住矛盾的主要方面——LPS，尋找解決問題的突破點意義重大。
國內(nèi)外有關(guān)LPS的研究發(fā)現(xiàn)LPS存在于G-桿菌的細胞膜上，化學(xué)成分為脂多糖，其基本構(gòu)成為O-特異性多糖鏈、核心多糖、類脂A三部分。其中類脂A是LPS的活性中心。LPS主要生物學(xué)作用為刺激單核-吞噬細胞系統(tǒng)誘生、釋放多種炎癥介質(zhì)如TNF-α、IL-1、IL-6等，通過這些介質(zhì)啟動炎癥反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)并直接或間接發(fā)揮局部及全身效應(yīng)。
盡管針對LPS的研究較多，但臨床上尚無一種能夠安全有效地用于治療膿毒癥的藥物。因此，將重點放在中和LPS上從而達到降低感染死亡率的目的具有非常重要的意義。
近十余年來，國際上膿毒癥的防治研究，主要有抗LPS核心糖脂(Lipid A)的多抗、單抗、各種抗細胞因子抗體及受體拮抗劑，如抗TNF抗體，抗IL-1抗體、抗IL-6抗體以及NO拮抗劑等。在動物實驗研究中，上述制劑對膿毒癥所致的臟器損傷有一定的保護作用，但在臨床試驗中都因療效不確切而未獲美國FDA批準(zhǔn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種抗菌/抗內(nèi)毒素的氨基酸類型的小分子多肽—蜂毒肽。
本發(fā)明的另一目的在于提供蜂毒肽在用于制備殺菌、中和拮抗內(nèi)毒素、抑制細胞呼吸爆發(fā)達到治療膿毒癥的藥物中的應(yīng)用。
蜂毒肽是一類來源于昆蟲的由十余個氨基酸組成的小分子多肽，經(jīng)過研究得知蜂毒肽具有廣泛的生物學(xué)活性，如激活G蛋白和改變細胞內(nèi)外Ca2+的分布，具有擴血管、促進胰島素分泌和促腎上腺皮質(zhì)激素的釋放等功能。但在失控性炎癥反應(yīng)和膿毒癥中，蜂毒肽對炎癥反應(yīng)細胞呼吸爆發(fā)有無影響及其在炎癥反應(yīng)中的作用，卻知之甚少。
本發(fā)明人根據(jù)LPS是一陰離子，其生物學(xué)活性的發(fā)揮依賴于其二糖骨架上帶負電荷的陰離子基團與其受體中帶正電荷的氨基酸殘基的結(jié)合而實現(xiàn)，以及LPS的抑制劑多粘菌素B(PMB)、殺菌性/通透性增加蛋白、鱟抗內(nèi)毒素因子等均為陽離子的特點，對天然蜂毒肽氨基酸序列進行改進，期望能篩選出拮抗膿毒癥的新型多肽，以達到上述發(fā)明目的。
通過目前具有殺菌活性的天然蜂毒肽，對其氨基酸序列進行分析，發(fā)現(xiàn)第11、12位氨基酸為賴氨酸的多肽其殺菌活性較強，通過改變其它位置的氨基酸合成多條多肽，進一步通過生物傳感器和動物實驗，篩選出與LPS的結(jié)合作用最強，其抗膿毒癥模型小鼠效果最好的蜂毒肽。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的蜂毒肽，類型為氨基酸；分子類型為肽；分子的序列由氨基酸的一字簡碼組成，表示如下INLKAIAALAKKLL-NH2。
Merrifield創(chuàng)建的固相多肽化學(xué)合成方法(Merrifield RB.1963 J Am ChemSoc.852149)已發(fā)展成為一種成熟的眾所周知的固相多肽化學(xué)合成技術(shù)。應(yīng)用該技術(shù)，本發(fā)明采用Merrifield創(chuàng)建的固相多肽化學(xué)合成方法，通過Fmoc保護的氨基酸方法或Tboc保護的氨基酸方法人工合成或通過自動多肽合成儀進行合成，得到一系列的抗菌/抗內(nèi)毒素蜂毒肽。得到的多肽經(jīng)過高壓液相(HPLC)純化，并經(jīng)生物活性鑒定。再通過初步的拮抗膿毒癥動物試驗，最后篩選出效果最好的本發(fā)明所述的蜂毒肽。
本發(fā)明通過測定上述蜂毒肽的體外殺菌活性、體外結(jié)合、中和LPS和抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細胞TNF-α和IL-6產(chǎn)生的活性、體外抑制LPS刺激的巨噬細胞呼吸爆發(fā)的活性、所述蜂毒肽對大腸桿菌ATCC25922/LPS攻擊小鼠的死亡保護作用以及所述蜂毒肽對膿毒癥模型大鼠臟器的改善情況等一系列試驗表明本發(fā)明所述的蜂毒肽對細菌/PS攻擊造成的膿毒癥模型動物具有保護作用，具體表現(xiàn)在①所述蜂毒肽對大腸桿菌ATCC25922等細菌具有一定的殺菌活性；②所述蜂毒肽具有一定的結(jié)合、中和LPS的活性，可抑制LPS刺激的小鼠腹腔巨噬細胞TLR4、TNF-a和IL-6mRNA的表達；③所述蜂毒肽抑制LPS刺激的小鼠腹腔巨噬細胞的呼吸爆發(fā)。
故本發(fā)明所述的蜂毒肽可用于制備抗細菌藥物。
本發(fā)明所述的蜂毒肽可用于制備抗大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯桿菌、陰溝腸桿菌、鮑曼不動桿菌和奇異變形桿菌感染藥物。
本發(fā)明所述蜂毒肽可用于制備內(nèi)毒素所致疾病中對內(nèi)毒素進行中和拮抗的藥物。
本發(fā)明所述蜂毒肽可用于制備內(nèi)毒素所致疾病中抑制細胞呼吸爆發(fā)的藥物。
本發(fā)明所述蜂毒肽可用于制備治療膿毒癥的藥物。


下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明及其效果作進一步說明圖1蜂毒肽(3mg/kg)對細菌和LPS(20mg/kg)攻擊小鼠的保護作用圖2蜂毒肽與LPS結(jié)合的親和力測定圖3PMB與LPS結(jié)合的親和力測定圖4蜂毒肽和PMB中和LPS的活性比較圖5蜂毒肽對LPS刺激腹腔巨噬細胞TLR4 mRNA表達的抑制圖6蜂毒肽對LPS刺激腹腔巨噬細胞TNF-αmRNA表達的抑制圖7蜂毒肽對LPS刺激腹腔巨噬細胞IL-6mRNA表達的抑制圖8肝的病理切片，其中8-1為LPS對照組，8-2為蜂毒肽/LPS處理組圖9腸粘膜的病理切片，其中9-1為LPS對照組，9-2為蜂毒肽/LPS處理組圖10肺的病理切片，其中10-1為LPS對照組，10-2為蜂毒肽/LPS處理組圖11腎的病理切片，其中11-1為LPS對照組，11-2為蜂毒肽/LPS處理組。
在圖5中MMarker；1陰性對照；2陽性對照；3LPS+蜂毒肽(10μmol/L)；4LPS+蜂毒肽(20μmol/L)；5LPS+蜂毒肽(40μmol/L)在圖6中MMarker；1陰性對照；2陽性對照；3LPS+蜂毒肽(10μmol/L)；4LPS+蜂毒肽(20μmol/L)；5LPS+蜂毒肽(40μmol/L)在圖7中MMarker；1陰性對照；2陽性對照；3LPS+蜂毒肽(10μmol/L)；4LPS+蜂毒肽(20μmol/L)；5LPS+蜂毒肽(40μmol/L)具體實施方式
下面是本發(fā)明的具體實施例，所述的實施例是用于描述本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明。
實施例1蜂毒肽的合成1.1蜂毒肽樹肽脂的合成稱取Fmoc-L-Lys-PEG-PS樹脂(或其它多肽合成樹脂)0.05mmol倒入合成柱中，加入約15ml精制二甲基甲酰胺(DMF)溶脹30min，另取1.0mmol二異丙基乙胺(DIPEA)50ml(8.7mlDIPEA+41.3ml DMF)、0.5mmol氮雜苯并三唑甲基脲六氟磷酸鹽(HATM)50ml(9.5g HATM+40.5ml DMF)和含20％六氫吡啶的DMF(Deblock液)適量分別加入試劑瓶中，再按本發(fā)明所述蜂毒肽氨基酸序列依次稱取2mmol的Fmoc-氨基酸于適宜的容器中。按照merrifield發(fā)明的固相化學(xué)合成方法依照蜂毒肽氨基酸序列從C端開始依次進行在合成柱中加入Deblock液脫肽樹脂F(xiàn)moc保護基團、加入適量DMF溶解Fmoc-氨基酸后加入合成柱中、再分別加入適量DIPEA、HATM于柱中進行偶連反應(yīng)、偶連后合成柱中的肽樹脂用DMF洗去殘余的Fmoc-氨基酸、惰性氣體吹干等制備過程，如此循環(huán)完成整個蜂毒肽的肽鏈形成而得到其肽樹脂；從合成柱中取出蜂毒肽肽樹脂，置到冷凍干燥機中凍干，得到肽樹脂備用。
1.2蜂毒肽肽樹脂的裂解取上述肽樹脂0.5g于適宜的容器中，加入5ml裂解液(4.5ml三氟乙酸+0.25ml硫代苯甲醚+0.1ml苯甲醚+0.15ml 1，2-乙二硫醇)，于室溫避光反應(yīng)2小時，過濾，濾液于室溫濃縮至1/2體積后，滴加入10倍量預(yù)先冷凍的無水乙醚中，冰凍過夜，離心，棄上清，沉淀用適量冰醋酸溶解，冷凍后置冷凍干燥機中干燥，得粗肽。
1.3蜂毒肽粗肽的純化取蜂毒肽粗肽加入適量無熱源水溶解，得到0.5mg/ml的樣品溶液，用針頭式過濾器過濾樣品液，收集濾液于一小燒杯中；將乙腈及無熱源水用0.45μ濾膜過濾，分別加入0.1％的三氟乙酸，混勻，按以下色譜條件進行純化柱C18反相柱流動相A100％H2O+0.1％三氟乙酸流動相B100％乙晴+0.1％三氟乙酸(0→15min梯度洗脫)得蜂毒肽INLKAIAALAKKLL-NH2，精肽60mg。
以下實施例2-實施例8為采用實施例1所述的方法制得的蜂毒肽進行的實驗，用于說明蜂毒肽的藥用效果。
實施例2蜂毒肽對大腸桿菌ATCC25922活菌/LPS攻擊小鼠的保護作用2.1實驗方法將昆明系小鼠隨機分為5組，每組20只，蜂毒肽對照組、活菌對照組和LPS對照組分別經(jīng)尾靜脈注射蜂毒肽(3mg/kg)、大腸桿菌ATCC25922(2×109CFU/20g體重)和LPS 20mg/kg；蜂毒肽/活菌處理組在注射活菌(2×109CFU/20g體重)20s內(nèi)注射蜂毒肽(3mg/kg)，蜂毒肽/LPS處理組在注射蜂毒肽3mg/kg 10秒后注射LPS 20mg/kg。注射總體積為200μl/20g體重。觀察小鼠3天內(nèi)死亡情況。
2.2實驗結(jié)果蜂毒肽處理組小鼠精神狀態(tài)一度萎靡但恢復(fù)較快，食欲、活動度及對外界刺激的反應(yīng)性在較短時間內(nèi)得到改善，并好于活菌/LPS對照組，其3天存活率與活菌/LPS對照組相比有顯著性差別。蜂毒肽對照組與正常小鼠相比無明顯改變。效果對比見圖1。
實施例3蜂毒肽的抗菌作用3.1實驗方法采用微量稀釋法，檢測蜂毒肽對18株細菌的抗菌活性并與其它抗生素比較。①取大腸桿菌ATCC25922接種于LB培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)18h，再轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)液中培養(yǎng)4h，用LB培養(yǎng)液調(diào)整菌液濃度至1×105CFU/ml。②取96孔培養(yǎng)板，以8孔為一列，共計12列。第一列加菌液200μl，第2列至第11列加菌液100μl，最后一列加LB培養(yǎng)液100μl作陰性對照。③取蜂毒肽及6種等抗生素，各以生理鹽水稀釋為10.24mg/ml。④第一行為蜂毒肽倍比稀釋用，第1孔加入10μl的蜂毒肽，混勻后吸出100μl加到第2孔中，依次倍比稀釋至第10孔，吸出100μl棄去。第11孔未加抗生素作為陽性對照。各孔蜂毒肽的最終含量依次為512，256，128，64，32，16，8，4，2，1μg/ml。同法處理其它抗生素，每一行作為一種藥物對該細菌的最小抑菌濃度(MIC)及最小殺菌濃度(MBC)測定。⑤培養(yǎng)板置35℃孵育20h后閱讀結(jié)果讀取陽性和陰性對照管，見陰性對照孔清亮，陽性對照孔混濁，再讀取MIC。抑制細菌肉眼可見生長的最低藥物濃度為該藥對細菌的MIC。⑥MBC讀取將培養(yǎng)板繼續(xù)置35℃孵育20h后閱讀結(jié)果，抑制細菌肉眼可見生長的最低藥物濃度為該藥對細菌的MBC。⑦同法觀察蜂毒肽和其它抗生素對其余菌株的MIC及MBC。
3.2實驗結(jié)果如表1所示。
表1 蜂毒肽對18株細菌的MIC和MBC檢測

注數(shù)據(jù)以MIC/MBC表示，無“/”表示MIC同MBC，”#”為臨床分離菌株。
實施例4蜂毒肽對小鼠腹腔巨噬細胞呼吸爆發(fā)的抑制4.1實驗方法分離純化小鼠腹腔巨噬細胞于24孔培養(yǎng)板，其LPS的刺激濃度為400ng/ml，蜂毒肽的干預(yù)濃度分別為5、10、20、40μmol/L，依照細胞色素C還原法，用紫外分光光度計檢測超氧陰離子(O2-·)產(chǎn)量和NADPH氧化酶活性；另瑩光法檢測過氧化氫(H2O2)產(chǎn)量。
4.2實驗結(jié)果蜂毒肽對小鼠腹腔巨噬細胞活性氧的產(chǎn)生有抑制作用，同時對其細胞膜上NADPH氧化酶有顯著的抑制作用，這可能是其抑制活性氧產(chǎn)生的機制，見表2。
表2 蜂毒肽對LPS刺激腹腔巨噬細胞產(chǎn)生活性氧和NADPH氧化酶活性的抑制

與對照組比較*P＜0.05** P＜0.01；與LPS組比較▲P＜0.05▲▲P＜0.01實施例5蜂毒肽與LPS親和力的檢測5.1實驗方法根據(jù)Thermo公司疏水樣品池的包被流程，將LPS包被在疏水樣品池中，分別以不同濃度的蜂毒肽(750、375、187.5、93.75、46.9nmol/L)、PMB(130、65、32.5、16.3、8.2、4.1、2.05nmol/L)為流動相，與疏水樣品池中的LPS結(jié)合，并通過FASTplot和FASTfit作圖，測定其親和力。
5.2實驗結(jié)果結(jié)果見圖2、圖3，在不同濃度蜂毒肽與LPS發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的親和圖基礎(chǔ)上，通過FASTfit程序計算其與LPS結(jié)合的Kd值為4.84×10-7M，而PMB的Kd值為1.89×10-8M。
實施例6蜂毒肽體外中和LPS的活性6.1實驗方法將相應(yīng)終濃度的蜂毒肽和PMB(均為5、10、20、40μmol/L)分別與終濃度為2ng/ml的LPS 37℃孵育30min后，采用動態(tài)濁度法鱟試驗檢測孵育后的LPS值，對照組加等量無熱原水，依據(jù)上述濃度藥物孵育后所測得的LPS值計算蜂毒肽和PMB對LPS的中和率，每個濃度重復(fù)檢測4次。具體操作按EDS-99細菌內(nèi)毒素測定系統(tǒng)說明書進行。
6.2實驗結(jié)果蜂毒肽具有中和LPS的活性，其中和作用弱于PMB，在40μmol/L水平約為PMB的一半。統(tǒng)計學(xué)分析表明蜂毒肽在5μmol/L水平對2ng/ml的LPS有顯著的中和作用(P＜0.05)，在20μmol/L水平其中和作用非常顯著(P＜0.01)(見圖4)。
實施例7蜂毒肽對LPS刺激的小鼠腹腔巨噬細胞TLR4、TNF-α和IL-6mRNA表達的抑制7.1實驗方法分離純化小鼠腹腔巨噬細胞，置于6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔3×106個細胞。將腹腔巨噬細胞與不同濃度的蜂毒肽(0、10、20、40μmol/L)預(yù)先孵育2h后，加入LPS(終濃度100ng/ml)繼續(xù)孵育4h后，提取腹腔巨噬細胞RNA采用RT-PCR進行mRNA表達的測定。
7.2實驗結(jié)果如圖5、6、7所示，蜂毒肽對LPS刺激腹腔巨噬細胞的TLR4、TNF-α、IL-6mRNA的表達有明顯的抑制作用。
實施例8蜂毒肽對膿毒癥模型大鼠的臟器保護作用8.1實驗方法將大鼠隨機分為2組，每組8只，LPS對照組經(jīng)靜脈注射LPS 1mg/kg；蜂毒肽/LPS處理組在注射蜂毒肽3mg/kg 10秒后注射LPS 1mg/kg。觀察大鼠3天后肝、腸、肺、腎的病理變化。
8.2實驗結(jié)果LPS對照組大鼠肝、腸、肺、腎總體上充血明顯，蜂毒肽/LPS處理組則充血、炎癥細胞浸潤情況明顯改善，詳見圖8-圖11對照情況。
經(jīng)過上述具體實施例的詳細說明，我們能夠得出本發(fā)明所述的蜂毒肽可用于制備抗細菌藥物；可用于制備抗大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯桿菌、陰溝腸桿菌、鮑曼不動桿菌和奇異變形桿菌感染藥物；可用于制備內(nèi)毒素所致疾病中對內(nèi)毒素進行中和拮抗藥物；可用于制備內(nèi)毒素所致疾病中抑制細胞呼吸爆發(fā)的藥物；最后達到治療膿毒癥疾病的效果。
權(quán)利要求
1.蜂毒肽，類型為氨基酸；分子類型為肽；分子的序列由氨基酸的一字簡碼組成，表示如下INLKAIAALAKKLL-NH2。
2.權(quán)利要求1所述的蜂毒肽在用于制備抗細菌藥物中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1或2所述的蜂毒肽在用于制備抗大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯桿菌、陰溝腸桿菌、鮑曼不動桿菌和奇異變形桿菌感染藥物中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述的蜂毒肽在用于制備內(nèi)毒素所致疾病中對內(nèi)毒素進行中和拮抗藥物中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述的蜂毒肽在用于制備內(nèi)毒素所致疾病中抑制細胞呼吸爆發(fā)的藥物中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1所述的蜂毒肽在用于制備治療膿毒癥藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗菌/抗內(nèi)毒素的氨基酸類型的小分子多肽—蜂毒肽，結(jié)構(gòu)式為INLKAIAALAKKLL－NH
文檔編號C07K7/08GK1704431SQ20041002274
公開日2005年12月7日 申請日期2004年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月4日
發(fā)明者鄭江, 郭毅斌, 周紅, 呂根法, 衛(wèi)國 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院