專利名稱：從mcf－7提取乳凝集素功能肽及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，可應(yīng)用于抗輪狀病毒感染、調(diào)節(jié)嬰幼兒胃腸道免疫功能及腸上皮細胞功能成熟，以及應(yīng)用于嬰幼兒保健領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
大量的流行病學(xué)調(diào)查顯示，全世界輪狀病毒感染是引起兒童腹瀉的最主要病因。在發(fā)展中國家每年約有870,000個5歲以下兒童死于該病，占5歲以下兒童腹瀉病死亡人數(shù)的25％，占所有病因死亡人數(shù)的6％。其中輪狀病毒GroupA是在人類流行最廣的一型，估計每年由GroupA引起的死亡人數(shù)約800,000。經(jīng)調(diào)查我國每年5歲以下小兒腹瀉病患病達2.5億次，初步統(tǒng)計表明至少有10萬兒童死于輪狀病毒感染腹瀉。但目前尚無特效的抗輪狀病毒藥物。由此可見，輪狀病毒腹瀉造成了重大的社會和經(jīng)濟影響。
1997年WHO正式將發(fā)展輪狀病毒疫苗列為首要的疫苗發(fā)展目標。目前已列為侯選疫苗包括有減毒人輪狀病毒疫苗(human rotavirus vaccinHRV)Wa株、M37、MCN13等株，但它們的保護性作用不穩(wěn)定，如Wa疫苗在費城的保護率為76％，在辛辛那提的保護率為100％，而在中國上海的保護率為49.6％。最近發(fā)展的四價重配株疫苗(rhesus rotavirus RRV-TV)雖然有可靠的安全性但保護性在不同國家仍有較大波動。盡管美國已將該疫苗試用計劃接種，但昂貴的價格阻礙了其在發(fā)展中國家的應(yīng)用。
近來母乳的研究在抗輪狀病毒感染方面有了新的進展，研究發(fā)現(xiàn)在發(fā)展中國家和發(fā)達國家，母乳喂養(yǎng)兒中腹瀉病發(fā)病率較人工喂養(yǎng)兒低，盡管也有一些研究表明腹瀉病的發(fā)病率在兩者中相似，但可以肯定母乳喂養(yǎng)兒輪狀病毒感染后癥狀輕于人工喂養(yǎng)兒。通過親和層析純化得出乳凝集素(Lactadherin)是母乳中與輪狀病毒交聯(lián)最強和抗病毒特異性最高的成分，而配方乳中不含Lactadherin，因此對Lactadherin的進一步研究將有望為抗輪狀病毒感染提供新的思路。
Lactadherin是一種N端糖基化的46KD大小具有免疫原性的糖蛋白，由364個氨基酸組成，含有表皮生長因子(EGF)樣結(jié)構(gòu)的Arg-Gly-Asp(RGD)N端，能與αVβ3整合素(αVβ3-integrin)交聯(lián)。Hamosh檢測了母乳中Lactadherin的含量約為93±10mg/ml，以初乳中含量較多，但對Lactadherin的生理功能目前了解尚少。在不同種系的研究中發(fā)現(xiàn)，Lactadherin的結(jié)構(gòu)域在人、鼠和牛中序列相當保守，所以大量的動物乳汁和人工合成的Lactadherin為我們的研究提供了足夠的資源。
輪狀病毒中VP4(由gene4編碼蛋白)是病毒的粘附蛋白，是病毒復(fù)制和產(chǎn)生免疫原性的基礎(chǔ)，在唾液酸存在下Lactadherin能與病毒交聯(lián)從而抑制病毒復(fù)制、緩解腹瀉癥狀。有研究顯示母乳喂養(yǎng)嬰兒即使在未出現(xiàn)輪狀病毒感染癥狀時仍可以檢測到抗輪狀病毒抗體，提示與輪狀病毒交聯(lián)，阻止病毒復(fù)制并不是Lactadherin抗輪狀病毒的唯一機制。已知食物和微生物抗原刺激后，腸道相關(guān)淋巴組織中的腸上皮內(nèi)淋巴細胞(intraepithelial lymphocytes，IEL)增殖并在腸上皮層形成活性T淋巴細胞集落，被激活的工EL具有(1)溶細胞活性；(2)通過分泌細胞因子而產(chǎn)生輔助活性；(3)刺激上皮間細胞更新；(4)對食物過敏原耐受的作用等，從而保護腸道并激發(fā)其他淋巴組織產(chǎn)生進一步反應(yīng)。有研究表明乳腺和血管內(nèi)皮細胞及淋巴細胞上有αVβ3-integrin，Lactadherin能與之交聯(lián)并促進這些細胞的增殖，但Lactadherin對淋巴細胞及內(nèi)皮細胞的所產(chǎn)生的作用和隨后引發(fā)的腸道保護性免疫作用的確切機制目前尚不清楚。我們已知Lactadherin在胃的任何PH值下均有活性并且結(jié)構(gòu)不被蛋白酶等破壞，保證了Lactadherin以完整的結(jié)構(gòu)和功能到達腸道。我們大膽假設(shè)(1)Lactadherin或Lactaherin與輪狀病毒交聯(lián)后能刺激腸上皮T淋巴細胞增殖并產(chǎn)生細胞因子進而引發(fā)一系列液免疫反應(yīng)；(2)輪狀病毒感染時腸道絨毛膜上皮細胞隨著病毒的大量復(fù)制脫落，加速了分泌層細胞的上移，這些尚處于分泌狀態(tài)的不成熟上皮細胞加重了水、電解質(zhì)的紊亂。有報道指出母乳特別是初乳通過調(diào)節(jié)腸道上皮的基因表達促進腸上皮細胞的發(fā)育，因此我們將從另一方面探討Lactadherin加快腸道上皮細胞成熟，替代受損上皮細胞在抗輪狀病毒中所發(fā)揮的作用。
通過對Lactadherin調(diào)節(jié)GALT功能和腸上皮細胞成熟作用的研究，來探討其抗輪狀病毒感染的可能機制，為臨床開發(fā)和利用Lactadherin治療輪狀病毒感染性腹瀉提供重要的理論依據(jù)。
現(xiàn)有技術(shù)是利用柱層析和親和層析法直接從牛乳中提取目的蛋白質(zhì)乳凝集素。本法具體是通過收集大量新鮮的(擠出4小時內(nèi))未經(jīng)任何處理的牛乳，根據(jù)牛乳中脂肪球膜中的蛋白質(zhì)分子量的不同，進行層析分離，再利用親和層析純化等方法提取得到目的蛋白質(zhì)。
現(xiàn)有技術(shù)有以下不足或缺點原料來源得到大量采集后4小時之內(nèi)的新鮮未經(jīng)處理的牛乳困難。
樣本質(zhì)控不同來源的牛乳其質(zhì)量控制困難。
樣本得率利用親和層析方法分離目的蛋白質(zhì)過程繁瑣、耗時(約1周)、產(chǎn)量低(0.35ug/ml)、不可控因素多。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種從MCF-7提取的乳凝集素功能肽以及制備方法，它(1)不需要必須保證新鮮未經(jīng)任何處理的牛乳，僅需保存重組的DNA即可反復(fù)獲得新鮮有活性的蛋白質(zhì)，解決了原材料來源困難問題；(2)得到一種具有可重復(fù)提取、足量、純度高、無毒性、保留抗原性的目的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方法來實現(xiàn)的本發(fā)明方法包括目的基因乳凝集素功能肽的制備，表達質(zhì)粒的構(gòu)建，其中質(zhì)粒選自pET-28a、pET-28b，目的蛋白乳凝集素功能肽的純化檢測等。
目的基因乳凝集素功能肽的制備首先是從MCF-7乳腺癌細胞株中提取總RNA，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)合成cDNA模板，制備出乳凝集素功能肽的基因產(chǎn)物。
在得到乳凝集素功能肽基因PCR產(chǎn)物后，可以將該基因用于原核系統(tǒng)表達以獲得所需要的目的蛋白，原核表達系統(tǒng)用的最為廣泛和最為成熱的是大腸桿菌表達系統(tǒng)，用于該系統(tǒng)的表達質(zhì)粒的構(gòu)建首先是將PCR制備的目的基因經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，QIAGEN公司的膠回收片段柱純化后，取100ng與50ng pET-28a(+)進行連接，于16℃連接過夜.取5uL連接液轉(zhuǎn)化入50uL DH5αtm library efficiency chemically competent cells，轉(zhuǎn)化細胞經(jīng)42℃熱休克50秒，37℃(震蕩培養(yǎng)1h后涂于卡那霉素平板，37℃培養(yǎng)過夜.挑取單菌落提取質(zhì)粒，進行酶切鑒定和基因的DNA序列測定，測定結(jié)果完全正確后再將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL-21感受態(tài)細胞，檢測表達。
BL21/pET-28a(+)乳凝集素功能肽克隆37℃培養(yǎng)過夜，隔日用LBbroth培養(yǎng)基稀釋10倍，繼續(xù)培養(yǎng)3小時，用ITPG誘導(dǎo)表達4～12小時，收集細菌提取蛋白質(zhì)，利用Triton X-100及超聲方法破細胞膜及包涵體膜，加入蛋白酶抑制劑，保護目的蛋白。經(jīng)超速離心得到上清后，利用特異性鎳螯合的親和層析柱(Ni-chelating colum)，通過不同濃度的結(jié)合緩沖液、洗滌緩沖液、洗脫緩沖液，洗脫得到純化的目的蛋白。純化得到的乳凝集素功能肽經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳檢測、特異性單克隆抗體檢測，以確證所獲蛋白的正確，由于整個蛋白制備過程未經(jīng)化學(xué)變性及復(fù)性的過程，保留了蛋白的活性，節(jié)約了大量的時間。
本發(fā)明所公開的一種乳凝集素功能肽及其乳凝集素功能肽制備方法，其優(yōu)點現(xiàn)在(1)首次利用蛋白質(zhì)工程的手段得到目的蛋白質(zhì)(乳凝集素功能肽；(2)利用所采用方法得到的目的蛋白質(zhì)具有可重復(fù)提取、足量、純度高、無毒性、保留抗原性的特點；(3)解決了原有方法所帶來的各種困難；(4)為目的蛋白質(zhì)的進一步研究和應(yīng)用提供了質(zhì)與量的保證；(5)提供了目的蛋白質(zhì)產(chǎn)業(yè)化的方法。


圖1顯示乳凝集素功能肽基因的PCR產(chǎn)物。M、DNA marker(100bpladdermarker，2000，1500，1200，1000，900，800，700，600，500，400，300，200，100)PCR產(chǎn)物(MFGE8)，MFGE8即乳凝集素功能肽基因。
圖2顯示乳凝集素功能肽重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)。
圖3顯示酶切方法鑒定質(zhì)粒構(gòu)建成功。
圖4顯示酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒進行DNA測序結(jié)果。
圖5顯示乳凝集素功能肽表達情況的結(jié)果。M、標準分子量蛋白1、誘導(dǎo)表達全菌蛋白2、破菌上清3、包涵體溶解后沉淀4、包涵體溶解后上清5、純化時流穿組分6、純化的MFGE8蛋白。
圖6顯示乳凝集素功能肽表達后SDS PAGE電泳結(jié)果。
圖7顯示特異性單克隆抗體Western blot檢測結(jié)果。
圖8顯示牛乳中提取目的蛋白質(zhì)Sepharys-200過柱結(jié)果(純化前)。
圖9顯示牛乳中提取目的蛋白質(zhì)親和層析結(jié)果(純化后)。
圖10顯示兩種方法所得目的蛋白定量分析結(jié)果，A N-5構(gòu)建質(zhì)粒所表達純化蛋白，A 4牛乳中所提取蛋白。
圖11顯示MFGE8基因序列。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步描述。
實施例1一、材料MCF-7乳腺癌細胞購于中科院細胞所；PCR-Kit購于TAKARA公司；Taq酶、DNA分子量標準購于上海生物工程公司；限制性內(nèi)切酶、T4連結(jié)酶購于NEB公司；菌種與質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細胞(DHa-MAX、BL-21)購于Novagen公司；pET-28a購于Promega公司；PCR引物由上海睿星基因技術(shù)有限公司合成。
試劑ITPG購于Sigma公司；親和層析柱購于Roche公司；His-tag抗體購于Pharmingen公司。
二、方法(1)細胞提取總RNA1)取MCF-7乳腺癌細胞1×107個細胞，用TES洗滌，離心棄上清；2)加入1ml Trizol緩沖液劇烈震蕩轉(zhuǎn)移至1.5ml的離心管中；3)加入200uL氯仿劇烈震蕩，室溫靜置5分鐘，4℃ 14000rpm離心10分鐘，取上清，加入等體積的異丙醇，輕輕搖勻靜置5分鐘離心15分鐘速度同上；4)棄上清，沉淀用70％乙醇洗3次，室溫干燥；5)沉淀用50uLDEPC溶解，取5uL提取的RNA，加入495uL蒸餾水水稀釋至500uL，測A260/A280比值，當比值大于1.8時證明提取RNA較純；6)將RNA濃度調(diào)至1～1.2ug/uL，待用。
(2)設(shè)計可行性引物MFGE5 gcgccatgggcCTGGATATCTGTTCCAAAAACCCCTGC
MFGE3 gcgctcgagACAGCCCAGCAGCTCCAGGC。
(3)RT-PCR(V＝50uL)2times Bca 1st butter 25uL25mM MgSO410uL10mM dNTP 5uLRnase inhibitor 2.5uLOligo dTPrimer1uLRNA 2uLRnase free H2O3.5uLBcaBEST polymerase1uL反應(yīng)條件65℃ 1分鐘后30℃ 5分鐘，15分鐘內(nèi)緩慢升溫至65℃(每30秒升溫1.2℃)，持續(xù)65℃ 15分鐘，隨后在98℃的條件下5分鐘滅活反轉(zhuǎn)錄酶，4℃保存。
(4)cDNA PCR(V＝50uL)25mM MgSO4 3uL5times Bca 2nd butter 10uL10mM dNTP 5uLprimer forward 1uLprimer reverse 1uLBca-optimized Taq 1uLRT-PCR產(chǎn)物 20uL反應(yīng)條件94℃ 1分鐘，再按如下程序擴增35個循環(huán)94℃ 30秒，56℃ 1分鐘，72℃ 2分鐘。后72℃延伸10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，取5uL反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖電泳，驗證是否擴增成功(見圖1)。
(5)目的片斷回收向PCR反應(yīng)產(chǎn)物中加 NaAC(pH5.2)3uL，加入預(yù)冷的無水乙醇1ml放入-20℃冰箱20分鐘，14000rpm離心15分鐘，棄上清，70％乙醇洗2次，真空干燥。沉淀溶于50uL水中。
(6)酶切PCR產(chǎn)物及載體(V＝50uL)10times buffer 2 5uL酶Nde I 2.5uLXhoI 2.5uLBAS 1uLPCR產(chǎn)物或載體 40uL37℃隔夜。
(7)pET-28a乳凝集素功能肽重組質(zhì)粒的構(gòu)建膠純化酶切產(chǎn)物，酶切產(chǎn)物的連接；酶切載體 3uL酶切PCR產(chǎn)物 1uLT4連接酶 1uL10times buffer2uLH2O 13uL連接16℃過夜。
將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5a-MAX DH5αtmlibrary efficiencychemically competent細胞內(nèi)(為最高效率轉(zhuǎn)化細胞)，37℃培養(yǎng)隔夜，挑克隆擴增，抽提DNA。
(8)陽性克隆的鑒定1)培養(yǎng)后挑取菌落提取質(zhì)粒進行限制性內(nèi)切酶酶切鑒定(見圖3)2)將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒進行DNA測序分析。
測序引物正向14A；5’tgagcggataacaattcccctc 3′反向PR25’CTAGTTATTGCTCAGCGG 3′。
測序的結(jié)果見圖4與基因文庫一致，見圖11，參閱基因文庫LOCUS NM_005928。
(9)pET-28a/乳凝集素功能肽蛋白表達1)將構(gòu)建成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化如BL-21感受態(tài)菌中，涂平板過夜；2)取克隆培養(yǎng)于50ml LB培養(yǎng)基中，加入50ug/ml卡那霉素，37℃震蕩培養(yǎng)箱過夜；3)次日用LB培養(yǎng)基稀釋10倍，37℃繼續(xù)孵育3小時后，加入ITPG(isopropyl β-σ-thiogalactopyranoside)繼續(xù)孵育4小時，離心收集細菌，轉(zhuǎn)速7000rpm，20分鐘，棄上清；4)加入10ml 1×PBST(0.5％Triton X-100)超聲破細胞膜，超速離心，轉(zhuǎn)速18000rpm，15分鐘，提取上清，待純化。
(10)蛋白純化將上清液(含有目的蛋白)利用特異性鎳螯合的親和層析柱(Ni-chelating colum)，用結(jié)合緩沖液5mM imidazole，0.5M NaCL，20mM Tris HCL PH7.9、洗滌緩沖液60mM imidazole，0.5M NaCL，20mM Tris HCL PH7.9、洗脫緩沖液1M imidazole，0.5M NaCL，20mM Tris HCL PH7.9，將含有6個組氨酸的目的蛋白洗脫下來，得到純化蛋白質(zhì)。
(11)蛋白鑒定將所得純化的目的蛋白進行SDS-PAGE電泳，部分膠進行染色觀察條帶(見圖6)，部分膠用于做Western Blot，利用組氨酸t(yī)ag的特異性抗體明確目的蛋白(見圖7)。
比較例從牛乳中提取乳凝集素的實驗方法(1)牛乳脂肪提取新鮮未經(jīng)任何處理牛乳(擠出4小時內(nèi)使用或立即凍于-80度冰箱內(nèi)待用)中加入1Mm phenylmethylsulforyl fluoride(phMeSO2F)，離心1小時，提取表層脂肪。
(2)Buffer milk的制備緩沖液洗牛乳脂肪2次(buffer0.14M NaCL，3Mm KCL，8Mm Na2HPO4，2Mm KH2PO4 PH7.4)，將牛乳脂肪稀釋為35％，小孔篩網(wǎng)過濾，得到Buffermilk。
(3)牛乳脂肪球膜蛋白提取將過濾液中加入1M HCL調(diào)整PH至4.8，37℃室溫攪拌1小時，離心90分鐘，棄上清，將沉淀混選懸于50MmNH4HCO3PH7.9，包含1MmphMeSO2F(2ml/Lmilk)，按2∶1倍體積加入氯仿，離心后取上清加入0.2MNaCL緩沖液，40ml/100g蛋白，室溫攪拌30分鐘，離心80分鐘，將沉淀混懸于100Mm Tris-HCL PH8.2，6M尿素，1M KCL，0.2M NaCL，phMeSO2F(10ml/100克蛋白)攪拌16小時(4℃)，離心70分鐘。上清中即含有MFGM。
(4)粗提乳凝集素將提取的上清液用洗脫液透析過液，制備sepharys-200層析柱(3cm*115cm)，洗脫緩沖液洗柱過夜，輕輕將濃縮的MFCG覆于膠粒表面，重力使樣本全部進入柱內(nèi)，輕覆洗脫液于柱表面，連接收集系統(tǒng)，每管收集7ml，收集速度為0.3ml/min(約收集48小時)，每收集管各吸取20ul進行SDS-PAGE電泳，膠染色。隔日觀察電泳條帶(見圖8)，收集乳凝集素含量較多，較純的樣本約50ml，待用于親和層析。
(5)牛乳中乳凝集素的純化制備agrose親和層析系統(tǒng)，將透析過夜的樣本全部通過層析柱，結(jié)合緩沖液洗柱1次，沖洗緩沖液洗柱1次，洗脫液洗脫，得到終產(chǎn)物乳凝集素。
(6)蛋白質(zhì)電泳條帶定性(見圖9)。
整個制備過程1周。
兩種方法所得目的蛋白定量分析(見圖10)
MCF-7提取乳凝集素.SEQSEQUENCE LISTING<110>上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬新華醫(yī)院<120>從MCF-7提取乳凝集素功能肽及其制備方法<130>/<140>2005100241051<141>2005-07-19<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(38)<223>引物<400>1gcgccatggg cctggatatc tgttccaaaa acccctgc 38<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(29)<223>引物<400>2
MCF-7提取乳凝集素.SEQgcgctcgaga cagcccagca gctccaggc 29<210>3<211>1164<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>3atgccgcgcc cccgcctgct ggccgcgctg tgcggcgcgc tgctctgcgc ccccagcctc60ctcgtcgccc tggatatctg ttccaaaaac ccctgccaca acggtggttt atgcgaggag 120atttcccaag aagtgcgagg agatgtcttc ccctcgtaca cctgcacgtg ccttaagggc 180tacgcgggca accactgtga gacgaaatgt gtcgagccac tgggcatgga gaatgggaac 240attgccaact cacagatcgc cgcctcatct gtgcgtgtga ccttcttggg tttgcagcat 300tgggtcccgg agctggcccg cctgaaccgc gcaggcatgg tcaatgcctg gacacccagc 360agcaatgacg ataacccctg gatccaggtg aacttgctgc ggaggatgtg ggtaacaggt 420gtggtgacgc agggtgccag ccgcttggcc agtcatgagt acctgaaggc cttcaaggtg 480gcctacagcc ttaatggaca cgaattcgat ttcatccatg atgttaataa aaaacacaag 540gagtttgtgg gtaactggaa caaaaacgcg gtgcatgtca acctgtttga gacccctgtg 600gaggctcagt acgtgagatt gtaccccacg agctgccaca cggcctgcac tctgcgcttt 660gagctactgg gctgtgagct gaacggatgc gccaatcccc tgggcctgaa gaataacagc 720atccctgaca agcagatcac ggcctccagc agctacaaga cctggggctt gcatctcttc 780agctggaacc cctcctatgc acggctggac aagcagggca acttcaacgc ctgggttgcg 840gggagctacg gtaacgatca gtggctgcag gtggacctgg gctcctcgaa ggaggtgaca 900ggcatcatca cccagggggc ccgtaacttt ggctctgtcc agtttgtggc atcctacaag 960gttgcctaca gtaatgacag tgcgaactgg actgagtacc aggaccccag gactggcagc 1020agtaagatct tccctggcaa ctgggacaac cactcccaca agaagaactt gtttgagacg 1080cccatcctgg ctcgctatgt gcgcatcctg cctgtagcct ggcacaaccg catcgccctg 1140cgcctggagc tgctgggctg ttag 116權(quán)利要求
1.一種乳凝集素功能肽，其特征在于它由下列方法制得(1)從MCF-7乳腺癌細胞中提取總RNA；(2)設(shè)計乳凝集素功能肽PCR引物核苷酸序列制成乳凝集素功能肽基因；(3)構(gòu)建乳凝集素功能肽重組質(zhì)粒；(4)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化；(5)乳凝集素功能肽表達；(6)乳凝集素功能肽純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳凝集素功能肽，其特征在于乳凝集素功能肽PCR引物核苷酸序列為MFGE5gcgccatgggcCTGGATATCTGTTCCAAAAACCCCTGCMFGE3gcgctcgagACAGCCCAGCAGCTCCAGGC。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳凝集素功能肽，其特征在于乳凝集素功能肽重組質(zhì)粒中質(zhì)粒選自pET-28a、pET-28b。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳凝集素功能肽，其特征在于乳凝集素功能肽重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH5αtm細胞內(nèi)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳凝集素功能肽，其特征在于乳凝集素功能肽在BL-21感受態(tài)細胞內(nèi)表達。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳凝集素功能肽，其特征在于乳凝集素功能肽利用鎳螯合的親和層析柱，結(jié)合緩沖液、洗滌緩沖液、洗脫緩沖液，洗脫得到純化的蛋白質(zhì)。
7.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳凝集素功能肽的制備方法，其特征在于制備方法包括如下步驟(1)從MCF-7乳腺癌細胞中提取總RNA；(2)設(shè)計乳凝集素功能肽PCR引物核苷酸序列制成乳凝集素功能肽基因；(3)構(gòu)建乳凝集素功能肽重組質(zhì)粒；(4)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化；(5)乳凝集素功能肽表達；(6)乳凝集素功能肽純化。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的乳凝集素功能肽的制備方法，其特征在于乳凝集素功能肽PCR引物核苷酸序列為MFGE5gcgccatgggcCTGGATATCTGTTCCAAAAACCCCTGCMFGE3gcgctcgagACAGCCCAGCAGCTCCAGGC。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的乳凝集素功能肽的制備方法，其特征在于乳凝集素功能肽重組質(zhì)粒中質(zhì)粒選自pET-28a、pET-28b。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的乳凝集素功能肽的制備方法，其特征在于在制備乳凝集素功能肽重組質(zhì)粒過程中，利用DH5αtm細胞進行陽性克隆篩選，繼而將陽性克隆轉(zhuǎn)入BL-21感受態(tài)細胞進行乳凝集素功能肽的表達。
全文摘要
本發(fā)明公開一種乳凝集素功能肽及其乳凝集素功能肽制備方法。本發(fā)明從MCF－7乳腺癌細胞株中提取總RNA，應(yīng)用RT－PCR技術(shù)合成模板cDNA，制備出人乳凝集素功能肽的基因產(chǎn)物。本發(fā)明首次利用蛋白質(zhì)工程的手段得到目的蛋白質(zhì)；利用所采用方法得到的目的蛋白質(zhì)具有可重復(fù)提取、足量、純度高、無毒性、保留抗原性的特點；為目的蛋白質(zhì)的進一步研究和應(yīng)用提供了質(zhì)與量的保證。
文檔編號C07K14/435GK1699414SQ20051002410
公開日2005年11月23日 申請日期2005年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月28日
發(fā)明者何振娟, 裴新紅, 吳圣楣, 朱建幸, 楊凌云 申請人:上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬新華醫(yī)院