專利名稱：胸腺五肽純化工藝方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化學(xué)領(lǐng)域中多肽粗制品的純化，具體說是涉及用反相制備液相色譜法純化胸腺五肽的工藝方法。
背景技術(shù)：
胸腺五肽(TP-5)是胸腺生成素II第32～36位的氨基殘基片段，保留了胸腺生成素的有效生物活性，為細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)藥物。具有誘導(dǎo)細(xì)胞分化、促進(jìn)T淋巴細(xì)胞亞群發(fā)育并活化以及增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能等功能，用于治療乙型肝炎及腫瘤的輔助治療。
TP-5的純化國內(nèi)外均有報導(dǎo)，國外報導(dǎo)較多，常采用C18柱的制備液相分離純化方法，流動相均采用0.1V/V％三氟乙酸—甲醇的梯度洗脫，如文獻(xiàn)John P.eta Journal ofChromatography，1982.236237～243及Huber.Kalbccher eta.Peptides，1990.31-33中報導(dǎo)。國內(nèi)有關(guān)純化方法的報導(dǎo)不多，有采用Sephadex G25純化，如楊國玲等在《甘肅科學(xué)學(xué)報》1994.Vol.6135～139中所披露，也有采用C18純化，如張春莉等在《中國生物制品雜志》2003.Vol 16.No.287～89中所披露，但均無詳細(xì)說明。從公開的資料看，流動相采用梯度洗脫，存在分離因子α較低的不足，一般低于1.11，因而分離效果有待進(jìn)一步提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述現(xiàn)有技術(shù)現(xiàn)狀而提供一種分離效果更好的胸腺五肽純化工藝方法。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為該胸腺五肽純化工藝方法，其先采用反相制備液相色譜法分離胸腺五肽得胸腺五肽洗脫液，濃縮洗脫液，然后去鹽，再經(jīng)濃縮后凍干即得純品；其中，反相制備液相色譜法分離胸腺五肽所用的色譜柱為C18柱，流動相由甲醇與緩沖溶液組成，其特征在于所述流動相為恒組成流動相，即甲醇在流動相中的含量恒定。
所述緩沖溶液為三乙胺磷酸緩沖溶液、磷酸鹽緩沖溶液或三氟乙酸溶液。
所述三乙胺磷酸緩沖溶液的濃度為0.08～0.15M。
所述磷酸鹽緩沖溶液的濃度為0.04～0.06M。
于所述流動相中甲醇的體積含量為8～12％。
所述C18柱為Waters Delta-Pak C18300 40mm×100mm×3節(jié)，每次進(jìn)樣量為來100～200mg。
所述去鹽步驟為先調(diào)節(jié)胸腺五肽洗脫液的PH值至7.5～8.0，然后上Sephadex G25柱，收集有紫外吸收部分。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1、采用恒組成洗脫液，相對于現(xiàn)有梯度洗脫而言，分離效果更好；2、分離過程中的保留時間短，生產(chǎn)效率高，尤其是采用三乙胺磷酸緩沖溶液與甲醇組成恒組成流動相時，保留時間僅需12分鐘左右，生產(chǎn)效率顯著提高。
具體實施例方式


圖1為流動相組成是體積比為0.1V/V％三氟乙酸溶液∶甲醇＝90∶10時的液相色譜；圖2為流動相組成是體積比為0.05M磷酸鹽緩沖液∶甲醇＝90∶10時的液相色譜；圖3為流動相組成是體積比為0.1M三乙胺磷酸緩沖液∶甲醇＝90∶10時的液相色譜。
具體實施例方式
以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
一、研究試驗(一)、所用儀器、檢驗條件、試藥及對照品1.儀器制備液相色譜儀Wate Prep LC4000；檢測器Waters 2487二通道；三銳色譜工作站。
2.制備色譜柱Waters Delta-Pak C18 40mm×100mm×3節(jié)；3.試藥甲醇 色譜級 黃巖有機(jī)化工廠Sephadex G25 法瑪西公司三氟乙酸 分析純 Meco公司磷酸、三乙胺、醋酸銨 分析純 上海試劑廠4.分析對照品胸腺五肽規(guī)格純度99％ 有效成分含量89％生產(chǎn)公司Sigma公司5.檢測方法按胸腺五肽國家標(biāo)準(zhǔn)中的檢測方法。
(二)、恒組成洗脫與梯度洗脫的比較以0.1M三乙胺磷酸緩沖液與甲醇體系為流動相，進(jìn)樣量以完全分離為標(biāo)準(zhǔn)。采用以下三種方式比較恒組成時的主峰和主峰前一雜峰的分離因子α，結(jié)果見表1。

表1.不同洗脫方式對分離因子α的影響

從表1中可以看出，恒組成洗脫的分離效果明顯好于梯度洗脫的分離效果。
(三)、不同恒組成流動相分離效果比較流動相1體積比為0.1V/V％三氟乙酸溶液∶甲醇＝90∶10；流動相2體積比為0.05M磷酸鹽緩沖液∶甲醇＝90∶10；流動相3體積比為0.1M三乙胺磷酸緩沖液∶甲醇＝90∶10。
試驗中采用少量進(jìn)樣(相當(dāng)于2mg有效成分)達(dá)到完全分離的方法，結(jié)果分別見圖1、圖2、圖3。
由圖1～圖3可知，三乙胺磷酸甲醇體系在三者中分離效果最好，磷酸鹽甲醇體系的分離效果次之，三氟乙酸溶液甲醇體系的分離效果較差，可見多肽峰疊合在一起。
(四)、進(jìn)樣樣品過載狀況下，洗脫時間長短對產(chǎn)品純度的影響洗脫方式為恒組成洗脫，流動相為三乙胺磷酸甲醇體系，試驗選擇中度過載(100mg有效成分，約200mg粗制品)進(jìn)樣。采用不同甲醇濃度使洗脫時間不一，主峰部分均分為五段，對五段收集液檢測有效成分的純度，結(jié)果見表2。
表2.洗脫時間長短對純度的影響

從表2中可以看出，同樣進(jìn)樣量情況下，洗脫時間長短對產(chǎn)品的純度有著重大的影響，分離時間過長產(chǎn)品純度反而不理想。其原因是，隨著時間的延長，峰的峰形變寬，峰的拖尾現(xiàn)象加重，而由于主峰前雜峰的拖尾現(xiàn)象，從而導(dǎo)致主峰產(chǎn)品收集液純度下降。而時間太短則達(dá)不到完全分離的目的，各種峰都合并在一起。
(五)、進(jìn)樣量大小對有效成分回收率的影響流動相為三乙胺磷酸甲醇體系，甲醇濃度為10V/V％。同樣采用主峰部分均分為五段，對五段收集液檢測有效成分的純度的方法，分別對輕度過載(50mg有效成分，約100mg粗制品)、中度過載(100mg有效成分，約200mg粗制品)、高度過載(200mg有效成分，約400mg粗制品)，其結(jié)果見表3。
表3.不同進(jìn)樣量對有效成分回收率的影響


從表3可以看出，輕度過載雖然回收率高，但生產(chǎn)效率不高，中度過載雖然回收率稍低，但生產(chǎn)效率高，而高度過載則不足取。
(六)、去鹽方法純度合格的收集液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，用0.1M NaOH調(diào)節(jié)PH至7.5～8.0，最好是調(diào)節(jié)至7.5，然后上Sephadex G25柱(80×800mm)，收集有紫外吸收部分，再經(jīng)濃縮后凍干，即得純品。利用Sephadex G25去鹽雖然處理量小，但處理時間短，可反復(fù)上樣，工作效率高。
總上所述，本發(fā)明方法分離純化胸腺五肽，相較于現(xiàn)有梯度洗脫而言，分離效果更好。就流動相而言，三乙胺磷酸緩沖液與甲醇組成的體系的分離效果突出，且有利于提高生產(chǎn)效率。保留時間長短對分離效果的影響也很大，在本試驗條件下，采用三乙胺磷酸甲醇體系的恒組成洗脫，保留時間以12分鐘左右為宜。
為更充分地描述本發(fā)明，提供以下具體實施例(見表4)
表4.實施例(表中a、b分別表示流動相為三乙胺磷酸甲醇體系和磷酸鹽甲醇體系，進(jìn)樣量為約200mg粗制品，含100mg有效成分。)

權(quán)利要求
1.一種胸腺五肽純化工藝方法，其先采用反相制備液相色譜法分離胸腺五肽得胸腺五肽洗脫液，濃縮洗脫液，然后去鹽，再經(jīng)濃縮后凍干即得純品；其中，反相制備液相色譜法分離胸腺五肽所用的色譜柱為C18柱，流動相由甲醇與緩沖溶液組成，其特征在于所述流動相為恒組成流動相，即甲醇在流動相中的含量恒定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胸腺五肽純化工藝方法，其特征在于所述緩沖溶液為三乙胺磷酸緩沖溶液、磷酸鹽緩沖溶液或三氟乙酸溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的胸腺五肽純化工藝方法，其特征在于所述三乙胺磷酸緩沖溶液的濃度為0.08～0.15M。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的胸腺五肽純化工藝方法，其特征在于所述磷酸鹽緩沖溶液的濃度為0.04～0.06M。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一權(quán)利要求所述的胸腺五肽純化工藝方法，其特征在于所述流動相中甲醇的體積含量為8～12％。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的胸腺五肽純化工藝方法，其特征在于所述C18柱為WatersDelta-Pak C1840mm×100mm×3節(jié)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的胸腺五肽純化工藝方法，其特征在于所述去鹽步驟為先調(diào)節(jié)胸腺五肽洗脫液的PH值至7.5～8.0，然后上Sephadex G25柱，收集有紫外吸收部分。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種胸腺五肽純化工藝方法，屬于生物化學(xué)領(lǐng)域中多肽技術(shù)領(lǐng)域，其先采用反相制備液相色譜法分離胸腺五肽得胸腺五肽洗脫液，濃縮洗脫液，然后去鹽，再經(jīng)濃縮后凍干即得純品；其中，反相制備液相色譜法分離胸腺五肽所用的色譜柱為C18柱，流動相由甲醇與緩沖溶液組成，其特征在于所述流動相為恒組成流動相，即甲醇在流動相中的含量恒定。相對于現(xiàn)有梯度洗脫而言，分離效果更好，且分離過程中的保留時間短，生產(chǎn)效率高，尤其是采用三乙胺磷酸緩沖溶液與甲醇組成恒流動相時，保留時間僅需12分鐘左右，生產(chǎn)效率顯著提高。
文檔編號C07K1/20GK1733797SQ200510060559
公開日2006年2月15日 申請日期2005年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月30日
發(fā)明者翁士喬, 俞通泰, 張紅暉 申請人:寧波市激素制品有限公司