專利名稱：抑制血管發(fā)生和腫瘤生長(zhǎng)的多肽化合物的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求于2004年9月23日遞交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/612,908、于2004年9月23日遞交的美國(guó)申請(qǐng)10/949,720以及2004年3月12日遞交的美國(guó)申請(qǐng)10/800,350的優(yōu)先權(quán)。相關(guān)申請(qǐng)的完整教導(dǎo)全部在此處引用作為參考。
背景技術(shù)：
EphB4，有時(shí)也稱為肝配蛋白受體B4或肝細(xì)胞瘤跨膜激酶(HTK)，是跨膜受體蛋白-酪氨酸激酶家族中的一員。EphB4含有一個(gè)由配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(也稱為球蛋白結(jié)構(gòu)域)、富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域以及一對(duì)III型纖連蛋白重復(fù)(見(jiàn)如圖5)組成的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。胞漿結(jié)構(gòu)域中含具有兩個(gè)保守酪氨酸殘基的近膜區(qū)、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域、不育α基序(SAM)以及PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合基序。EphB4與膜結(jié)合配體肝配蛋白B2相互作用(Sakano，S.等人，Oncogene.1996 Aug 15；13(4)813-22；Brambilla R.等人EMBO J.1995 Jul 3；14(13)3116-26)。EphB4與Eph家族的其他成員一樣，通過(guò)結(jié)合成簇的膜連接肝配蛋白配體而被活化(Davis S等人，Science.1994 Nov4；266(5186)816-9)，提示Eph受體的活化需要表達(dá)受體的細(xì)胞與表達(dá)配體的細(xì)胞間的接觸。一旦配體結(jié)合，EphB4受體形成二聚體并自磷酸化近膜區(qū)的酪氨酸殘基從而達(dá)到完全活化。一般認(rèn)為當(dāng)表達(dá)EphB4的細(xì)胞遇到表達(dá)肝配蛋白B2的細(xì)胞時(shí)，EphB4-肝配蛋白B2的相互作用和聚合會(huì)激發(fā)兩種細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
EphB4-肝配蛋白B2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及血管發(fā)生(Wang等人.Cell.1998May 29；93(5)741-53；Gerety等人，Mol Cell.1999 Sep；4(3)403-14)。血管發(fā)生是從先前存在的微管結(jié)夠的內(nèi)皮中產(chǎn)生新的血管，是宿主體內(nèi)實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。在正常的生理性血管發(fā)生中，血管內(nèi)皮與其周圍基質(zhì)成分間的自分泌、旁分泌以及鄰分泌相互作用在空間和時(shí)間上都受到嚴(yán)格的調(diào)節(jié)。此外，促血管發(fā)生和血管穩(wěn)定的細(xì)胞因子以及生長(zhǎng)因子的水平和活性也保持平衡。與之相反，活躍腫瘤生長(zhǎng)所必需的病理性血管發(fā)生持續(xù)不衰，是正常血管發(fā)生系統(tǒng)失調(diào)節(jié)的表現(xiàn)。特別是實(shí)體和造血系統(tǒng)類型的腫瘤，更與高水平的異常血管發(fā)生相關(guān)。
一般認(rèn)為腫瘤的發(fā)生包括一系列有序而相互作用的步驟，最終導(dǎo)致產(chǎn)生具有侵襲性生長(zhǎng)潛能的自主性克隆。這些步驟包括持續(xù)的生長(zhǎng)和無(wú)限的自我更新。腫瘤細(xì)胞種群的一般特征在于生長(zhǎng)信號(hào)的自供給、對(duì)生長(zhǎng)抑制信號(hào)敏感性降低以及對(duì)凋亡的耐受。起始異常生長(zhǎng)的遺傳的或細(xì)胞發(fā)生的事件通過(guò)阻斷凋亡，將細(xì)胞維持在一個(gè)延長(zhǎng)的“就緒”狀態(tài)。
本公開(kāi)內(nèi)容的目的在于提供可抑制血管發(fā)生和腫瘤生長(zhǎng)的試劑和治療手段。
發(fā)明概述本公開(kāi)內(nèi)容一方面提供了抑制EphB4介導(dǎo)功能的多肽試劑，包括可以結(jié)合EphB4并通過(guò)特定途徑影響EphB4的抗體及其抗原結(jié)合部分。正如此處所述，EphB4和肝配蛋白B2參與了多種疾病狀態(tài)，包括癌癥和與有害或過(guò)度血管發(fā)生相關(guān)的疾病。因此，此處公開(kāi)的某些多肽試劑也可用于治療此類疾病。此外，本公開(kāi)內(nèi)容涉及在多種腫瘤中EphB4和/或肝配蛋白B2常常高水平表達(dá)這一發(fā)現(xiàn)。因此，能夠下調(diào)EphB4或肝配蛋白B2功能的多肽試劑可以通過(guò)直接作用于腫瘤細(xì)胞而影響腫瘤，也可以通過(guò)間接作用于腫瘤募集的血管發(fā)生過(guò)程而對(duì)腫瘤產(chǎn)生影響。在某些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容提供了特別適于用下調(diào)EphB4或肝配蛋白B2功能的試劑治療的腫瘤類型的鑒定。
本公開(kāi)內(nèi)容的某些方面提供了可與EphB4胞外部分的表位相結(jié)合而抑制EphB4活性的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分。分離的抗體或其抗原結(jié)合部分可結(jié)合于位于

圖1 EphB4序列中的氨基酸16-198的表位。例如，該表位可能處在與肝配蛋白B2結(jié)合的EphB4球蛋白結(jié)構(gòu)域(GD)中。分離的抗體或其抗原結(jié)合部分可結(jié)合于位于圖1 EphB4序列中的氨基酸324-429或430-537的表位。例如，分離的抗體或其抗原結(jié)合部分可以結(jié)合于EphB4的第一纖連蛋白樣結(jié)構(gòu)域(FND1)或第二纖連蛋白樣結(jié)構(gòu)域(FND2)。分離的抗體或其抗原結(jié)合部分可以抑制EphB4二聚化或多聚化并可以任選地抑制肝配蛋白B2刺激的EphB4自磷酸化。分離的抗體或其抗原結(jié)合部分可以抑制培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞形成脈管、體內(nèi)組織的血管形成、植入動(dòng)物角膜的組織的血管形成、植入動(dòng)物體內(nèi)的基質(zhì)膠(matrigel)組織栓的血管形成和/或小鼠中人類腫瘤異種移植物的生長(zhǎng)。優(yōu)選的結(jié)合圖1EphB4序列中氨基酸16-198的表位的抗體包括此處以No.001、No.023、No.035和No.079表示的抗體。優(yōu)選的結(jié)合圖1 EphB4序列中氨基酸428-537的表位的抗體包括此處以No.047、No.057、No.85H、No.098和No.138表示的抗體。
本公開(kāi)內(nèi)容的某些方面提供了可與EphB4胞外部分的表位相結(jié)合而刺激EphB4活性的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分。例如此處所述的分離抗體或其抗原結(jié)合部分可結(jié)合位于圖1 EphB4序列中氨基酸324-429或430-537的表位，并刺激EphB4激酶活性。該分離的抗體或其抗原結(jié)合部分可以結(jié)合EphB4的FND1或FND2。該抗體可以選自此處以No.85L、No.091、No.121和No.131表示的抗體。
本公開(kāi)內(nèi)容提供此處公開(kāi)的任一抗體的人源化形式，以及含有至少一個(gè)來(lái)源于此處公開(kāi)抗體CDR部分(特別是CDR3)的抗體及其抗原結(jié)合部分。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體為與其將施用的受試者免疫相容的單克隆抗體，優(yōu)選可臨床施用于人體的抗體。
本公開(kāi)內(nèi)容的某些方面提供了能夠產(chǎn)生此處公開(kāi)抗體的雜交瘤，特別是能產(chǎn)生選自以下抗體的雜交瘤，所述抗體表示為No.001、No.023、No.035、No.079、No.047、No.057、No.85H、No.098、No.138、No.085L、No.091和No.131?？僧a(chǎn)生抗體No.023(位于氨基酸16-198內(nèi)的表位)、抗體No.091(活化激酶的抗體；位于氨基酸324-429的表位)、抗體No.098(位于氨基酸430-537的表位)、抗體No.131(位于氨基酸324-429的表位)以及抗體No.138(位于氨基酸430-537的表位)的雜交瘤儲(chǔ)存于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，10801 University Boulevard，Manassas，VA20110-2209。ATCC中產(chǎn)抗體No.023、No.091、No.098、No.131和No.138的雜交瘤保藏識(shí)別號(hào)分別為PTA-6208、PTA-6209、PTA-6210、PTA-6214和PTA-6211。
因此，本公開(kāi)內(nèi)容的某些具體方面提供了選自具有ATCC保藏識(shí)別號(hào)PTA-6208、PTA-6209、PTA-6210、PTA-6214和PTA-6211的雜交瘤細(xì)胞。
驚奇的是，抑制配體結(jié)合的抗體、抑制EphB4激酶活化的抗體和活化EphB4激酶活性的抗體在生物測(cè)定中都抑制EphB4介導(dǎo)的事件。因此，本公開(kāi)內(nèi)容提供了治療癌癥的方法，包括向所需患者施用有效劑量的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，所述抗體或其抗原結(jié)合部分可與位于EphB4胞外部分的表位結(jié)合并抑制EphB4活性或活化EphB4激酶活性。任選患者已被診斷為患有選自結(jié)腸癌、乳腺腫瘤、間皮瘤、前列腺腫瘤、鱗狀細(xì)胞癌、卡波西肉瘤以及白血病的癌癥?？梢匀砘蚓植渴┯梅蛛x的抗體或其抗原結(jié)合部分。此外，本公開(kāi)內(nèi)容提供了抑制患者血管發(fā)生的方法，包括向所需患者施用有效劑量的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，所述抗體或其抗原結(jié)合部分可與位于EphB4胞外部分的表位結(jié)合并抑制EphB4活性或活化EphB4激酶活性。任選患者被診斷患有黃斑變性。
本公開(kāi)內(nèi)容的某些方面提供了含有此處公開(kāi)的任一分離的抗體或其抗原結(jié)合部分的藥物制品，以及此類抗體或其抗原結(jié)合部分在制備用于治療癌癥的藥物制品中的用途。所述癌癥可任選地選自結(jié)腸癌、乳腺腫瘤、間皮瘤、前列腺腫瘤、鱗狀細(xì)胞癌、卡波西肉瘤以及白血病。
某些方面而言，此處公開(kāi)的抗體可以共價(jià)連接(或者穩(wěn)定相聯(lián))于一個(gè)額外的功能性部分，例如標(biāo)記或賦于所需藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的部分。標(biāo)記的實(shí)例包括那些適于用熒光檢測(cè)法、正電子成像術(shù)檢測(cè)法以及核磁共振檢測(cè)法的標(biāo)記。例如，標(biāo)記可以選自熒光標(biāo)記、放射活性標(biāo)記以及具有特殊核磁共振信號(hào)的標(biāo)記。諸如聚乙二醇(PEG)部分的部分可被固定于抗體或其抗原結(jié)合部分上，以提高其血清半衰期。
附圖簡(jiǎn)述圖1顯示人EphB4前體蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO1)。
圖2顯示人EphB4蛋白的cDNA核苷酸序列。
圖3顯示B4ECv3蛋白的氨基酸序列(顯示了包含未切割Eph B4前導(dǎo)肽的前體的預(yù)測(cè)序列)。
圖4顯示B4ECv3NT蛋白的氨基酸序列(顯示了包含未切割Eph B4前導(dǎo)肽的前體的預(yù)測(cè)序列)。
圖5顯示針對(duì)EphB4產(chǎn)生的單克隆抗體以及這些抗體的表位圖。EphB4胞外結(jié)構(gòu)域的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)如圖所示，包括球蛋白結(jié)構(gòu)域(G)、富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(C)以及兩個(gè)3型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域(F1和F2)。
圖6顯示肝配蛋白B2多克隆抗體和EphB4多克隆抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。A)H28細(xì)胞系；B)H2373細(xì)胞系；以及C)H2052細(xì)胞系。
圖7顯示EphB4單克隆抗體的親和力測(cè)試結(jié)果。顯示了親和力排序(從最弱到最強(qiáng))。
圖8顯示在bFGF存在或不存在時(shí)，利用示例性EphB4抗體(No.138)進(jìn)行小鼠角膜微囊測(cè)定的結(jié)果。
圖9顯示EphB4抗體抑制SCC15異種移植腫瘤的生長(zhǎng)。
圖10顯示EphB4抗體導(dǎo)致SCC15頭頸部癌腫瘤類型中的凋亡、壞死和血管發(fā)生減少。
圖11顯示全身性施用EphB4抗體導(dǎo)致腫瘤消退。
發(fā)明詳述I.EphB4抗體以及其他結(jié)合多肽本公開(kāi)內(nèi)容中部分提供了能夠被多肽結(jié)合劑有效靶定的EphB4分子的確定部分，所述多肽結(jié)合劑如抗體、抗體的抗原結(jié)合部分以及非免疫球蛋白抗原結(jié)合支架。此處所述的EphB4多肽結(jié)合劑可用于治療多種疾病，特別是癌癥和與有害性血管發(fā)生相關(guān)的疾病。本公開(kāi)內(nèi)容提供了抑制一種或多種EphB4介導(dǎo)的功能(如肝配蛋白B2結(jié)合或EphB4激酶活性)的抗體及其抗原結(jié)合部分。此類結(jié)合劑可用于在體外或體內(nèi)抑制EphB4的功能，優(yōu)選用于治療癌癥和與有害性血管發(fā)生相關(guān)的疾病。本公開(kāi)內(nèi)容也提供了活化EphB4激酶活性(通常通過(guò)評(píng)估EphB4磷酸化狀態(tài)進(jìn)行測(cè)定)的抗體及其抗原結(jié)合部分。驚奇的是，在細(xì)胞水平和體內(nèi)測(cè)定中此類抗體也抑制EphB4功能。因此，此類結(jié)合劑可用于在體外和體內(nèi)抑制EphB4功能，并優(yōu)選用于治療癌癥和與有害性血管發(fā)生相關(guān)的疾病。盡管并不指望局限于某一特定的機(jī)制，但這些抗體不僅刺激了EphB4激酶的活性，也刺激了從膜內(nèi)去除EphB4，從而降低了EphB4的整體水平。
EphB4屬于跨膜受體蛋白酪氨酸激酶家族。EphB4的胞外部分由配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(也稱為球蛋白結(jié)構(gòu)域)、富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域以及一對(duì)III型纖連蛋白重復(fù)(見(jiàn)如圖1)組成。胞漿結(jié)構(gòu)域中含具有兩個(gè)保守酪氨酸殘基的近膜區(qū)、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域、不育α基序(SAM)以及PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合基序。EphB4對(duì)膜結(jié)合配體肝配蛋白B2具有特異性(Sakano，S.等人1996；Brambilla R.等人1995)。EphB4通過(guò)結(jié)合成簇的、膜連接的肝配蛋白配體而被活化(Davis S等人1994)，提示Eph受體的活化需要表達(dá)受體的細(xì)胞與表達(dá)配體的細(xì)胞間的接觸。一旦結(jié)合配體，EphB4受體形成二聚體并自磷酸化近膜區(qū)的酪氨酸殘基從而達(dá)到完全活化。
此處使用的術(shù)語(yǔ)“EphB4”是指來(lái)自包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物的EphB4多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生針對(duì)某一分離和/或重組的哺乳動(dòng)物EphB4或其部分(如肽)，或針對(duì)表達(dá)重組哺乳動(dòng)物EphB4的宿主細(xì)胞的抗體(免疫球蛋白)。在某些方面，本發(fā)明的抗體特異地結(jié)合于EphB4蛋白質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域(此處稱為EphB4可溶性多肽)。例如EphB4可溶性多肽含有球蛋白結(jié)構(gòu)域，并能夠與肝配蛋白B2相結(jié)合。圖2提供了EphB4可溶性多肽的實(shí)例。此處使用的EphB4可溶性多肽包括EphB4可溶性多肽的片段、功能性變體以及修飾的形式。
“免疫球蛋白”為四聚體分子。天然存在的免疫球蛋白中，每一四聚體是由兩對(duì)相同的多肽鏈組成的，每一對(duì)中含有一條“輕”鏈(約25kDa)和一條“重”鏈(約50-70kDa)。每條鏈的氨基端部分包含負(fù)責(zé)主要識(shí)別抗原的長(zhǎng)約100至110或更多氨基酸的可變區(qū)。而每一條鏈的羧基端則存在主要負(fù)責(zé)效應(yīng)器功能的恒定區(qū)。人輕鏈可分為κ和λ輕鏈。重鏈可分為μ、δ、γ、α或ε，并定義抗體的同種型分別為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在輕鏈和重鏈中，可變區(qū)和恒定區(qū)之間通過(guò)長(zhǎng)約12個(gè)或更多氨基酸的“J”區(qū)相連，重鏈中還含有一個(gè)長(zhǎng)約10個(gè)氨基酸的“D”區(qū)。詳見(jiàn)《FundamentalImmunology》第7章(Paul，W.編輯，第二版.Raven Press，N.Y.(1989))(此處整體引用作為參考)。每一輕/重鏈對(duì)的可變區(qū)形成抗體結(jié)合位點(diǎn)，這樣完整的免疫球蛋白具有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。免疫球蛋白可以組成更高級(jí)的結(jié)構(gòu)。IgA一般為兩個(gè)四聚體的二聚體。IgM一般為五個(gè)四聚體的五聚體。
免疫球蛋白鏈的一般結(jié)構(gòu)相同，具有由三個(gè)高變區(qū)(也稱為互補(bǔ)決定區(qū)或CDR)連接的相對(duì)保守構(gòu)架區(qū)(FR)。來(lái)自每對(duì)兩條鏈的CDR由構(gòu)架區(qū)連接，使之能結(jié)合于特異的表位。從N-末端到C-末端，輕鏈和重鏈都含有結(jié)構(gòu)域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。氨基酸在每一結(jié)構(gòu)域中的分配與Kabat Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987 and 1991))，或Chothia&Lesk J.Mol.Biol.196901-917(1987)；Chothia等人，Nature342878-883(1989)中的定義一致。
“抗體”是指完整的免疫球蛋白或其與完整抗體競(jìng)爭(zhēng)特異性結(jié)合的抗原結(jié)合部分?？梢酝ㄟ^(guò)重組DNA技術(shù)、或酶或化學(xué)裂解完整抗體來(lái)產(chǎn)生抗原結(jié)合部分。抗原結(jié)合部分中包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、dAb，以及至少含有足以使特異性抗原結(jié)合于多肽的部分免疫球蛋白的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、單結(jié)構(gòu)域抗體、嵌合抗體、雙抗體及多肽。此處術(shù)語(yǔ)“抗EphB4抗體”和“EphB4抗體”可互換使用。
Fab片段是由VL、VH、CL和CH I結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；F(ab′).sub.2片段是含有兩個(gè)在鉸鏈區(qū)通過(guò)二硫鍵橋相連的Fab片段的二價(jià)片段；Fd片段由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成；Fv片段由抗體的單臂VL和VH結(jié)構(gòu)域組成；而dAb片段(Ward等人，Nature 341544-546，1989)由VH結(jié)構(gòu)域組成。
單鏈抗體(scFv)中，VL和VH區(qū)通過(guò)合成的連接子配對(duì)形成單價(jià)分子，所述連接子可使它們成為一條單獨(dú)的蛋白質(zhì)鏈(Bird等人，Science 242423-426，1988；以及Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883，1988)。雙抗體為二價(jià)的雙特異性抗體，其中VH和VL結(jié)構(gòu)域表達(dá)于同一條多肽鏈上，但其使用的連接子太短而不能使這兩個(gè)區(qū)域之間在同一條鏈上配對(duì)，因此其中的結(jié)構(gòu)域不得不與另一條鏈上的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域發(fā)生配對(duì)，從而產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)(見(jiàn)如Holliger，P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448，1993，以及Poljak，R.J.等人，Structure 21121-1123，1994)。一個(gè)分子中可能以共價(jià)結(jié)合或非共價(jià)結(jié)合的形式含有一個(gè)或多個(gè)CDR。
抗體中可能含有一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。如果結(jié)合位點(diǎn)多于一個(gè)，則這些結(jié)合位點(diǎn)可能彼此相同，也可能不一樣。例如天然存在的免疫球蛋白中具有兩個(gè)相同的結(jié)合位點(diǎn)，單鏈抗體或Fab片段中含有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，而“雙特異性”或“雙功能”抗體含有兩個(gè)不同的結(jié)合位點(diǎn)。
術(shù)語(yǔ)“人抗體”包括具有一個(gè)或多個(gè)來(lái)自人免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的所有抗體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所有的可變區(qū)和恒定區(qū)都來(lái)自人免疫球蛋白序列(完整的人抗體)?？扇缦峦ㄟ^(guò)多種途徑制備這些抗體。
術(shù)語(yǔ)“嵌合抗體”是指含有來(lái)自一個(gè)抗體的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域以及來(lái)自其他一個(gè)或多個(gè)抗體的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域的抗體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)CDR來(lái)自人抗EphB4抗體。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所有的CDR均來(lái)自人抗EphB4抗體。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，來(lái)自多于一個(gè)人抗EphB4抗體的CDR混合并匹配在一個(gè)嵌合抗體中。例如，在一個(gè)嵌合抗體中，來(lái)自第一種人抗EphB4抗體輕鏈的CDR1可能與來(lái)自第二種人抗EphB4抗體輕鏈的CDR2和CDR3結(jié)合，而重鏈的CDR則可能來(lái)自第三種抗EphB4抗體。此外，構(gòu)架區(qū)可能來(lái)自相同的抗EphB4抗體之一、來(lái)自一個(gè)或多個(gè)不同的抗體(如人抗體或人源化抗體)。
“中和抗體”是指能夠抑制EphB4與肝配蛋白B2結(jié)合的抗體，足量抗EphB4抗體可將與肝配蛋白B2結(jié)合的EphB4(可溶性)量減少至少約20％，優(yōu)選至少40％，更優(yōu)選60％，甚至更優(yōu)選80％，或甚至更優(yōu)選85％?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何方法測(cè)量結(jié)合的減少，例如通過(guò)體外競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定測(cè)量。測(cè)量結(jié)合減少的實(shí)例可見(jiàn)以下的實(shí)施例。
“活化EphB4激酶的抗體”是指當(dāng)加入到表達(dá)EphB4的細(xì)胞、組織或有機(jī)體中時(shí)，可活化至少約20％EphB4激酶活性的抗體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，活化EphB4激酶活性的抗體可活化至少40％、更優(yōu)選60％、甚至更優(yōu)選80％，或甚至更優(yōu)選85％的激酶活性。一般而言，通過(guò)EphB4自身的磷酸化狀態(tài)(酪氨酸自磷酸化)來(lái)測(cè)量激酶活性。
此處所用的術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記”或“標(biāo)記的”是指將另一種分子整合于抗體中。在一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)記為可檢測(cè)的記號(hào)，例如摻入放射性標(biāo)記的氨基酸，或向多肽連接具有可由標(biāo)記抗生物素蛋白(例如含有熒光標(biāo)記或酶活性而能被光學(xué)或比色法檢測(cè)的鏈霉抗生物素蛋白)檢測(cè)的生物素化部分。在另一實(shí)施方案中，標(biāo)記或記號(hào)可為治療性的，例如藥物綴合物或毒素?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的多種標(biāo)記多肽和糖蛋白的方法。多肽標(biāo)記的實(shí)例包括(但不僅限于)如下放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc；111In、125I、131I)、熒光標(biāo)記(例如FITC、羅丹明、鑭磷光體)、酶標(biāo)記(例如辣根過(guò)氧化物酶、β半乳糖苷酶、熒光素酶、堿性磷酸酶)、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、生物素化基團(tuán)、由第二報(bào)告子識(shí)別的預(yù)確的定多肽表位(例如亮氨酸拉鏈對(duì)序列、第二抗體結(jié)合位點(diǎn)、金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域、表位標(biāo)簽)、磁性試劑(如釓螯合物)、毒素(如百日咳毒素)、 紫杉醇、細(xì)胞松弛素B、短桿菌肽D、溴乙啶、吐根堿、絲裂霉素、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、秋水仙堿、阿霉素、柔毛霉素、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、mitliramycin、放線菌素D、1-脫氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普奈洛爾和嘌呤霉素以及它們類似物或同系物。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記通過(guò)不同長(zhǎng)度的間隔臂連接以降低可能的空間位阻。
如下文實(shí)施例所示，申請(qǐng)人已經(jīng)制造出若干針對(duì)EphB4的單克隆抗體，以及能夠產(chǎn)生EphB4單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。這些抗體還具有其他許多方面的特征，例如它們抑制EphB4及其配體(例如肝配蛋白B2-中和抗體)間的相互作用的能力，它們抑制EphB4受體二聚化或多聚化的能力，它們誘導(dǎo)EphB4的酪氨酸磷酸化的能力、它們與其他Eph家族成員之間的交互反應(yīng)性、它們抑制血管發(fā)生的能力以及它們抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力。此外，表位測(cè)圖研究顯示這些EphB4抗體可特異結(jié)合EphB4的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域(例如球蛋白結(jié)構(gòu)域、富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域或III型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域)。例如EphB4抗體可結(jié)合兩個(gè)III型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域。
某些方面而言，本發(fā)明的抗體可以特異結(jié)合EphB4蛋白質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)(此處也稱為可溶性EphB4多肽)?？扇苄訣phB4多肽可含有包含球蛋白(G)結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO1中的氨基酸29-197)的序列，并任選含有其他結(jié)構(gòu)域，如富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO1中的氨基酸239-321)、第一3型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO1中的氨基酸324-429)及第二3型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO1中的氨基酸434-526)。圖3-4中提供了示例性的EphB4可溶性多肽。如此處使用的，EphB4可溶性多肽包括EphB4可溶性多肽的片段、功能性變體以及修飾的形式。
本發(fā)明在某些方面提供了對(duì)EphB4或EphB4部分具有結(jié)合特異性的抗體(抗EphB4)。這些抗體的實(shí)例包括(但不僅限于)圖5所示的EphB4抗體編號(hào)1、23、35、47、57、79、85L、85H、91、98、121、131和138。所述免疫球蛋白任選以至少約1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9M或更低的親和力結(jié)合EphB4。任選抗體及其部分結(jié)合肝配蛋白B2的親和力與結(jié)合含球蛋白配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的EphB4多肽可溶性胞外部分大致相同。
此處公開(kāi)的抗體優(yōu)選對(duì)EphB4具有特異性，而與Eph或肝配蛋白家族的其他成員結(jié)合微小。在本發(fā)明的另一方面，抗EphB4抗體同時(shí)具有物種和分子選擇性。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗EphB4抗體結(jié)合人、cynomologous或恒河猴(rhesus)的EphB4。在優(yōu)選實(shí)施方案中，抗EphB4抗體并不與小鼠、大鼠、豚鼠、狗或兔的EphB4結(jié)合。任選地，抗體能結(jié)合來(lái)自不同物種(例如人和小鼠)的多種不同的EphB4。按照說(shuō)明書的這一教導(dǎo)，可以利用本領(lǐng)域公知的方法確定抗EphB4抗體的物種選擇性。例如，可以使用Western印跡、FACS、ELISA或RIA確定物種的選擇性。在優(yōu)選實(shí)施方案中，可以利用Western印跡確定物種的選擇性。在另一實(shí)施方案中，抗EphB4抗體與EphB4結(jié)合的趨勢(shì)比之與來(lái)自同一物種的EphB4家族其他成員的結(jié)合趨勢(shì)至少高50倍，優(yōu)選高100或200倍。可以按照本說(shuō)明的教導(dǎo)利用本領(lǐng)域公知的方法確定選擇性。例如，可以利用Western印跡、FACS、ELISA或RIA確定選擇性。在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)Western印跡確定分子的選擇性。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合EphB4的一個(gè)或多個(gè)特異性結(jié)構(gòu)域。例如，抗體與一個(gè)或多個(gè)EphB4的胞外結(jié)構(gòu)域(如球蛋白結(jié)構(gòu)域、富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域以及第一3型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域和第二3型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域)結(jié)合。例如，EphB4抗體編號(hào)1、23、35和79結(jié)合圖1序列中跨越球蛋白結(jié)構(gòu)域的氨基酸16-198區(qū)域的表位。EphB4抗體編號(hào)85L、85H、91和131結(jié)合圖1序列中內(nèi)含第一3型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域的氨基酸324-429區(qū)域的表位。EphB4抗體編號(hào)47、57、85H、98、121和138可結(jié)合圖1序列中內(nèi)含第二3型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域的氨基酸430-537區(qū)域的表位。任選地，受試抗體(如EphB4抗體號(hào)85H)可結(jié)合EphB4的至少兩個(gè)結(jié)構(gòu)域(圖5)。
抗EphB4抗體可以為IgG、IgM、IgE、IgA或IgD分子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體為IgG，且屬于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞型。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗EphB4抗體為IgG2亞類?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法確定EphB4抗體的類別和亞類。一般而言，可以使用對(duì)某一特定類別和亞類的抗體具有特異性的抗體，來(lái)確定抗體的類別和亞類。此類抗體可以購(gòu)得?？梢酝ㄟ^(guò)ELISA、Western印跡以及其他技術(shù)確定類別和亞類?；蛘咭部梢酝ㄟ^(guò)對(duì)抗體重鏈和/或輕鏈中恒定區(qū)全部或部分測(cè)序，將其氨基酸序列與不同類別和亞類的免疫球蛋白的已知氨基酸序列進(jìn)行比較，并確定抗體的類別和亞類。為說(shuō)明所需，示例性的EphB4抗體的類別和亞類見(jiàn)于下表1。
在某些實(shí)施方案中，含有來(lái)自不同物種的部分的單鏈抗體，和嵌合、人源化或靈長(zhǎng)類化(CDR移植的)抗體，以及嵌合或CDR移植的單鏈抗體也包括在本發(fā)明抗體的抗原結(jié)合部分中?？梢酝ㄟ^(guò)常規(guī)技術(shù)將這些抗體的多個(gè)部分化學(xué)性的連接在一起，也可以利用遺傳工程技術(shù)將之制備成連續(xù)的蛋白質(zhì)。例如，可以表達(dá)編碼嵌合或人源化鏈的核酸來(lái)制備連續(xù)的蛋白質(zhì)。見(jiàn)如Cabilly等人，美國(guó)專利No.4,816,567；Cabilly等人，歐洲專利No.0,125,023；Boss等人，美國(guó)專利No.4,816,397；Boss等人，歐洲專利No.0,120,694；Neuberger，M.S.等人.，WO 86/01533；Neuberger，M.S.等人.，歐洲專利No.0,194,276B1；Winter，美國(guó)專利No.5,225,539；以及Winter，歐洲專利No.0,239,400B1。關(guān)于靈長(zhǎng)類抗體，也參見(jiàn)Newman，R.等人.，BioTechnology，101455-1460(1992)。關(guān)于單鏈抗體，見(jiàn)如Ladner等人.，美國(guó)專利No.4,946,778；以及Bird，R.E.等人，Science，242423-426(1988)。
此外，也可以生產(chǎn)抗體的功能性片段，包括嵌合、人源化、靈長(zhǎng)類化或單鏈抗體的片段。受試抗體的功能性片段保留了其來(lái)源的全長(zhǎng)抗體中至少一項(xiàng)結(jié)合功能和/或調(diào)控功能。優(yōu)選的功能性片段保留了相應(yīng)全長(zhǎng)抗體中的抗原結(jié)合功能(例如，對(duì)EphB4的特異性)。某些優(yōu)選的功能性片段保留了抑制一種或多種EphB4特征性功能(如結(jié)合特異性、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性，和/或激活細(xì)胞反應(yīng))的能力。例如在一個(gè)實(shí)施方案中，EphB4抗體的功能性片段能夠抑制EphB4與其一種或多種配體(如肝配蛋白B2)之間的相互作用，和/或抑制其一項(xiàng)或多項(xiàng)受體介導(dǎo)功能，如細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖、血管發(fā)生和/或腫瘤生長(zhǎng)。
例如，包括(但不僅限于)Fv、Fab、Fab′和F(ab′)2在內(nèi)能結(jié)合EphB4受體或其部分的抗體片段，都包括在本發(fā)明中?？赏ㄟ^(guò)酶裂解或重組技術(shù)生產(chǎn)此類片段。例如，木瓜蛋白酶或胃蛋白酶裂解分別能夠產(chǎn)生Fab或F(ab′)2片段。也可以利用其中已于天然終止位點(diǎn)上游引入一個(gè)或多個(gè)終止子密碼的抗體基因，來(lái)產(chǎn)生多種截短形式的抗體。例如，可以設(shè)計(jì)編碼F(ab′)2重鏈的嵌合基因中含有編碼重鏈CH1結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)的DNA序列。
人源化抗體為來(lái)自于非人物種的抗體，其中突變了構(gòu)架和重鏈及輕鏈恒定區(qū)中的某些氨基酸以避免或消除在人中的免疫反應(yīng)?；蛘咭部赏ㄟ^(guò)將來(lái)自人抗體的恒定區(qū)與非人物種的可變區(qū)融合來(lái)產(chǎn)生人源化抗體。如何制備人源化抗體的實(shí)例可見(jiàn)于美國(guó)專利No.6,054,297、5,886,152和5,877,293。人源化抗體可含有來(lái)自不同免疫球蛋白的部分，其中任選至少有一個(gè)部分來(lái)源于人。因此，本發(fā)明涉及對(duì)EphB4(如人EphB4)具有結(jié)合特異性的人源化免疫球蛋白，所述免疫球蛋白中包括非人源(如嚙齒類的)的抗原結(jié)合區(qū)，以及至少部分的人免疫球蛋白(如人構(gòu)架區(qū)、人恒定區(qū)或其部分)。例如，人源化抗體可以含有具所需特異性的非人(如小鼠)來(lái)源的免疫球蛋白部分，以及來(lái)自人的免疫球蛋白序列(如嵌合免疫球蛋白)，通過(guò)常規(guī)技術(shù)(如合成)將其化學(xué)連接，或利用遺傳工程技術(shù)制備連續(xù)的多肽(如可以表達(dá)編碼嵌合抗體的蛋白質(zhì)部分的DNA以產(chǎn)生連續(xù)的多肽鏈)。
本發(fā)明人源化免疫球蛋白的另一實(shí)例是含有一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白鏈的免疫球蛋白，所述免疫球蛋白鏈中具有非人源CDR(如來(lái)自非人抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR)和來(lái)自人輕鏈和/或重鏈的構(gòu)架區(qū)(如有或無(wú)構(gòu)架改變的移植CDR的抗體)。在一個(gè)實(shí)施方案中，人源化免疫球蛋白能夠與鼠單克隆抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合EphB4多肽。術(shù)語(yǔ)人源化免疫球蛋白也包括嵌合或移植CDR的單鏈抗體。
本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供了EphB4拮抗物抗體。此處所述的術(shù)語(yǔ)“拮抗物抗體”是指能夠抑制一項(xiàng)或多項(xiàng)EphB4功能的抗體，例如抑制其結(jié)合活性(如配體結(jié)合)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性(如EphB4的成簇或磷酸化、刺激細(xì)胞應(yīng)答，如刺激細(xì)胞遷移或細(xì)胞增殖)。例如，拮抗物抗體能夠抑制(減弱或防止)EphB4受體與天然配體(如肝配蛋白B2或其片段)之間的相互作用。優(yōu)選的針對(duì)EphB4的拮抗物抗體能夠抑制EphB4介導(dǎo)的功能，包括內(nèi)皮細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖、血管發(fā)生和/或腫瘤生長(zhǎng)。任選地，拮抗物抗體結(jié)合EphB4的胞外結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明的其他實(shí)施方案提供了活化EphB4激酶的抗體。此類抗體可增強(qiáng)EphB4激酶的活性，即使在沒(méi)有肝配蛋白B2時(shí)也是如此。在某些情況下，此類抗體可用于刺激EphB4。然而，申請(qǐng)人注意到令人驚奇的是，在大部分細(xì)胞水平和體內(nèi)測(cè)定中此類抗體表現(xiàn)如拮抗物抗體。此類抗體似乎與兩個(gè)III型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)相結(jié)合，特別是圖1中的氨基酸324-429區(qū)域。
某些實(shí)施方案也提供抗獨(dú)特型抗體?？躬?dú)特型抗體識(shí)別與另一抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)的抗原決定簇?？梢酝ㄟ^(guò)免疫相同物種的動(dòng)物制備針對(duì)第二抗體的抗獨(dú)特型抗體，所述動(dòng)物優(yōu)選為與用來(lái)產(chǎn)生第二抗體的動(dòng)物同一品系。見(jiàn)如美國(guó)專利No.4,699,880。在一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生針對(duì)受體或其部分的抗體，而這些抗體可隨后用于產(chǎn)生抗獨(dú)特型抗體。由此產(chǎn)生的抗獨(dú)特型抗體能夠結(jié)合與受體結(jié)合的化合物(如受體功能的配體)，且可用于免疫測(cè)定中以檢測(cè)或鑒定或定量此類化合物。盡管此類抗獨(dú)特型抗體自身不結(jié)合受體，它也可以作為EphB4受體功能的抑制劑。這樣的抗獨(dú)特型抗體也可稱為拮抗劑抗體。
本發(fā)明的某些方面提供了雜交瘤細(xì)胞系，以及這些雜交瘤細(xì)胞系所產(chǎn)生的單克隆抗體。本發(fā)明的細(xì)胞系除了生產(chǎn)單克隆抗體之外還有其他用途。例如，本發(fā)明的細(xì)胞系可融合于其他細(xì)胞(如有合適藥物標(biāo)記的人骨髓瘤、小鼠骨髓瘤、人-小鼠雜合骨髓瘤(heteromyeloma)或人類淋巴母細(xì)胞細(xì)胞)，以產(chǎn)生其他的雜交瘤，從而可促成編碼單克隆抗體基因的轉(zhuǎn)移。此外，該細(xì)胞系還可用作編碼抗EphB4免疫球蛋白鏈的核酸的來(lái)源，可以分離和表達(dá)所述核酸(例如利用任何合適的技術(shù)轉(zhuǎn)移到其他細(xì)胞(見(jiàn)如Cabilly等人，美國(guó)專利No.4,816,567；Winter，美國(guó)專利No.5,225,539)。例如，可以分離含有重排抗EphB4輕鏈或重鏈的克隆(如通過(guò)PCR)，或者可以從分離自該細(xì)胞系的mRNA制備cDNA文庫(kù)，并分離編碼抗EphB4免疫球蛋白鏈的cDNA克隆。因此，可得到抗體重鏈和/或輕鏈或其部分的編碼核酸，并根據(jù)重組DNA技術(shù)用之于多種宿主細(xì)胞或體外翻譯系統(tǒng)中產(chǎn)生特定的免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或它們的變體(如人源化免疫球蛋白)。例如，可將編碼人源化免疫球蛋白或免疫球蛋白鏈的變體的核酸(包括cDNA)或其衍生物置于合適的原核或真核載體(如表達(dá)載體)中，并通過(guò)合適的方法(例如轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、電穿孔法、感染)導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞，從而使該核酸可與一個(gè)或多個(gè)表達(dá)控制元件有效連接(如進(jìn)入載體或整合入宿主細(xì)胞基因組)。為生產(chǎn)所需，可將宿主細(xì)胞保持在適于表達(dá)的條件下(例如存在誘導(dǎo)子并添加適當(dāng)鹽、生長(zhǎng)因子、抗生素、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物等的合適培養(yǎng)基)，以生產(chǎn)編碼多肽。如有需要，可以回收和/或分離編碼蛋白質(zhì)(如從宿主細(xì)胞中或培養(yǎng)基中)。應(yīng)當(dāng)理解生產(chǎn)方法包括在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的宿主細(xì)胞中表達(dá)(見(jiàn)如，WO92/03918，GenPharm International，1992年3月19日公開(kāi))。
II.抗體生產(chǎn)方法可以如此處所述或利用其他合適的技術(shù)制備免疫抗原，并生產(chǎn)多克隆和單克隆抗體。已描述了多種方法。見(jiàn)如Kohler等人.，Nature，256495-497(1975)以及Eur.J.Immunol.6511-519(1976)；Milstein等人.，Nature266550-552(1977)；Koprowski等人.，美國(guó)專利No.4,172,124；Harlow，E.和D.Lane，1988，AntibodiesA Laboratory Manual，(Cold Spring HarborLaboratoryCold Spring Harbor，N.Y.)；Current Protocols In MolecularBiology，Vol.2(Supplement 27，Summer′94)，Ausubel，F(xiàn). M.等人.，Eds.，(John Wiley&SonsNew York，N.Y.)，Chapter11，(1991)。一般而言，可以通過(guò)將永生細(xì)胞系(如骨髓瘤細(xì)胞系，如SP2/0)與抗體產(chǎn)生細(xì)胞融合而制備雜交瘤細(xì)胞?？贵w產(chǎn)生細(xì)胞(優(yōu)選脾臟或淋巴結(jié)細(xì)胞)獲自利用目標(biāo)抗原免疫的動(dòng)物?？梢岳眠x擇性培養(yǎng)條件分離融合細(xì)胞(雜交瘤)，并通過(guò)有限稀釋克隆。通過(guò)適當(dāng)?shù)臋z測(cè)(如ELISA)選擇能產(chǎn)生具有所需特異性抗體的細(xì)胞。
也可使用其他適當(dāng)?shù)姆椒ㄉa(chǎn)或分離具有所需特異性的抗體，包括如從文庫(kù)中選擇重組抗體的方法、或依賴于免疫能夠生產(chǎn)全組人抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(如小鼠)的方法。見(jiàn)如Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902551-2555(1993)；Jakobovits等人.，Nature，362255-258(1993)；Lonberg等人.，美國(guó)專利No.5,545,806；Surani等人.，美國(guó)專利No.5,545,807。
作為說(shuō)明，可以利用來(lái)自EphB4多肽的免疫原(如能夠引發(fā)發(fā)抗體應(yīng)答的EphB4多肽或其抗原性片段，或EphB4融合蛋白)免疫哺乳動(dòng)物，如小鼠、倉(cāng)鼠或兔。見(jiàn)如《AntibodiesA Laboratory Manual.》Harlow和Lane編輯(Cold Spring Harbor Press1988)。使蛋白質(zhì)或肽具有免疫原性的技術(shù)包括與載體綴合或其他本領(lǐng)域公知的技術(shù)?？梢栽谧魟┐嬖跁r(shí)施用EphB4多肽的免疫原性部分?？梢酝ㄟ^(guò)檢測(cè)血漿或血清中的抗體效價(jià)來(lái)監(jiān)測(cè)免疫的進(jìn)展。可以利用標(biāo)準(zhǔn)ELISA或其他免疫測(cè)定法，利用免疫原作為抗原來(lái)評(píng)估抗體水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體對(duì)EphB4蛋白的胞外部分(如SEQ ID NO2)或其片段具有特異性。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體對(duì)EphB4蛋白的胞內(nèi)部分或跨膜部分具有特異性。
在利用EphB4多肽的抗原性制品免疫動(dòng)物后可以獲得抗血清，且如有需要，可從血清中分離出多克隆抗體。為生產(chǎn)單克隆抗體，從經(jīng)免疫的動(dòng)物中收集抗體產(chǎn)生細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)，并用標(biāo)準(zhǔn)體細(xì)胞融合的方法將之與永生細(xì)胞(如骨髓瘤細(xì)胞)融合，以產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞。此類技術(shù)為本領(lǐng)域所公知，包括如雜交瘤技術(shù)(原創(chuàng)于Kohler和Milstein，(1975)Nature，256495-497)，人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbar等人.，(1983)Immunology Today，472)，以及EBV雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生人單克隆抗體(Cole等人.，(1985)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.77-96頁(yè))?？梢酝ㄟ^(guò)免疫化學(xué)的方法篩查雜交瘤細(xì)胞中對(duì)EphB4多肽有特異反應(yīng)性抗體的產(chǎn)生，以及從含有此類雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)物中分離的單克隆抗體。
在某些實(shí)施方案中，可以利用常規(guī)技術(shù)將本發(fā)明的抗體進(jìn)行片段化，并通過(guò)上述所有與抗體相同的方法篩查這些片段的功效。例如，用胃蛋白酶處理抗體能夠產(chǎn)生F(ab)2片段。可以處理所產(chǎn)生的F(ab)2片段還原其中的二硫鍵，進(jìn)而產(chǎn)生Fab片段。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體還包括抗體的由至少一個(gè)CDR區(qū)域所致的對(duì)EphB4多肽具有親和力的雙特異性、單鏈、以及嵌合和人源化分子。也可以應(yīng)用生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(美國(guó)專利No.4,946,778)生產(chǎn)單鏈抗體。還可以用轉(zhuǎn)基因小鼠或包括其他哺乳動(dòng)物在內(nèi)的其他生物來(lái)表達(dá)人源化抗體。產(chǎn)生這些抗體的方法為本領(lǐng)域所公知。見(jiàn)如Cabilly等人.，美國(guó)專利No.4,816,567；Cabilly等人.，歐洲專利No.0,125,023；Queen等人.，歐洲專利No.0,451,216；Boss等人.，美國(guó)專利No.4,816,397；Boss等人.，歐洲專利No.0,120,694；Neuberger，M.S.等人.，WO 86/01533；Neuberger，M.S.等人.，歐洲專利No.0,194,276；Winter，美國(guó)專利No.5,225,539；winter，歐洲專利No.0,239,400；Padlan，E.A.等人.，歐洲專利申請(qǐng)No.0,519,596 A1。也見(jiàn)Ladner等人.，美國(guó)專利No.4,946,778；Huston，美國(guó)專利No.5,476,786；以及Bird，R.E.等人.，Science，242423-426(1988)).
可以使用合成的和/或重組核酸來(lái)制備編碼所需人源化鏈的基因(如cDNA)，從生產(chǎn)此類人源化免疫球蛋白。例如，可以利用PCR誘變方法來(lái)改變編碼人或人源化鏈的DNA序列(如先前的人源化可變區(qū)的DNA模板)，以構(gòu)建人源化可變區(qū)的編碼核酸(如DNA)序列(見(jiàn)如Kamman，M.等人.，Nucl.Acids Res.，175404(1989))))))；Sato，K.等人.，CancerResearch，53851-856(1993)；Daugherty，B.L等人.，Nucleic Acids Res.，19(9)2471-2476(1991)；以及Lewis，A.P.和J.S.Crowe，Gene，101297-302(1991))。利用這些或其他合適的方法，也可以生產(chǎn)變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，可誘變克隆的可變區(qū)并可選擇具有所需特異性的變體的編碼序列(如從噬菌體文庫(kù)中，見(jiàn)如Krebber等人.，美國(guó)專利No.5,514,548；Hoogenboom等人.，WO93/06213，發(fā)表于1993年4月1日)。
在某些實(shí)施方案中，進(jìn)一步將抗體附著于能被檢測(cè)的標(biāo)記(如標(biāo)記可為放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子)。其活性部分可以為放射活性劑，如放射活性重金屬(如鐵螯合物；釓或錳的放射活性螯合物；氧、氮、鐵、碳或鎵的正電子發(fā)射體；43K、52Fe、57Co、67Cu、67Ga、68Ga、123I、125I、131I、132I或99Tc。固定于此類部分的結(jié)合劑可用作顯像劑，以診斷用有效劑量施用于哺乳動(dòng)物(如人)，然后檢測(cè)該顯像劑的定位和累積。可以通過(guò)放射性閃爍掃描、核磁共振成像、計(jì)算機(jī)斷層成像或正電子發(fā)射成像來(lái)檢測(cè)顯像劑的定位和累積。利用針對(duì)EphB4的抗體或其他結(jié)合多肽進(jìn)行免疫閃爍掃描來(lái)檢測(cè)和/或診斷癌癥和脈管系統(tǒng)。例如標(biāo)記99锝、111銦、125碘的針對(duì)EphB4標(biāo)志的單克隆抗體即可用于此類顯像。顯然對(duì)于技術(shù)人員而言，施用的放射性同位素的量取決于所用的放射性同位素。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員即能根據(jù)某一用作活性部分的放射性核素的比活性和能量，熟練地得出所需施用的顯像劑劑量。一般而言，每劑顯像劑施用0.1-100毫居里，優(yōu)選1-10毫居里，最常施用的劑量為2-5毫居里。因此，本發(fā)明中用作顯像劑的組合物，包括綴合于含有0.1-100毫居里的放射活性部分的靶部分，在某些實(shí)施方案中優(yōu)選1-10毫居里，在某些實(shí)施方案中優(yōu)選2-5毫居里，在某些實(shí)施方案中更優(yōu)選1-5毫居里。
在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體為單克隆抗體，而在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供生產(chǎn)新抗體的方法。例如，一種生產(chǎn)能特異性結(jié)合EphB4多肽的單克隆抗體的方法包括向小鼠施用一定劑量的免疫原性組合物(所述組合物中含可有效激活可測(cè)水平免疫應(yīng)答的EphB4多肽)，從小鼠中獲得產(chǎn)生抗體的細(xì)胞(如來(lái)自脾臟的細(xì)胞)，并將抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合以獲取產(chǎn)生抗體的雜交瘤，測(cè)試該產(chǎn)生抗體的雜交瘤以鑒定能產(chǎn)生可特異性結(jié)合EphB4多肽的單克隆抗體的雜交瘤。一旦得到，即可在細(xì)胞培養(yǎng)物中增殖該雜交瘤，任選在雜交瘤衍生細(xì)胞產(chǎn)生可與EphB4多肽特異性結(jié)合的單克隆抗體的培養(yǎng)條件中進(jìn)行?？梢詮募?xì)胞培養(yǎng)物中純化該單克隆抗體。
此外，用于篩查抗體以鑒定所需抗體的技術(shù)可能會(huì)影響所得抗體的性質(zhì)。例如，將用于某些治療目的的抗體應(yīng)當(dāng)優(yōu)選能夠針對(duì)特定的細(xì)胞類型。因此，為得到此類抗體，可能需要篩選出結(jié)合表達(dá)目標(biāo)抗原的細(xì)胞的抗體(例如通過(guò)熒光活化的細(xì)胞分選)。與之類似，如果將用于結(jié)合溶液中的抗原，可能需要測(cè)試其溶液結(jié)合力。有多種不同的方法可用于測(cè)試抗體-抗原的相互作用，以鑒定所需的特定抗體。此類技術(shù)包括ELISA、表面等離振子共振結(jié)合測(cè)定(如Biacore結(jié)合測(cè)定，Bia-core AB，Uppsala，Sweden)、夾層測(cè)定(如順磁珠系統(tǒng)，IGEN International，Inc.，Gaithersburg，Maryland)、western印跡、免疫沉淀測(cè)定和免疫組織化學(xué)。
本發(fā)明的抗體可用于多種應(yīng)用，包括研究、診斷和治療性應(yīng)用。例如，它們可用于分離和/或純化受體或其部分，也可用于研究受體結(jié)構(gòu)(如構(gòu)象)和功能。
III.診斷性應(yīng)用在某些方面，本發(fā)明的多種抗體可用于檢測(cè)或測(cè)量EphB4受體的表達(dá)，例如在內(nèi)皮細(xì)胞(如靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)中，或在被轉(zhuǎn)染EphB4受體基因的細(xì)胞中。因此，它們也可為診斷或研究目的，用于如細(xì)胞分選和成像(例如流式細(xì)胞術(shù)，以及熒光活化細(xì)胞分選)的應(yīng)用中。
在某些實(shí)施方案中，為診斷目的可以標(biāo)記或不標(biāo)記抗體或抗體的抗原結(jié)合片段。一般而言，診斷測(cè)定需要檢測(cè)由于抗體與EphB4結(jié)合而導(dǎo)致的復(fù)合物形成。可以直接標(biāo)記這些抗體?？墒褂玫亩喾N標(biāo)記包括但不僅限于放射性核素、熒光劑、酶、酶底物、酶輔因子、酶抑制劑和配體(如生物素、半抗原)。多種合適的免疫測(cè)定為技術(shù)人員所公知(見(jiàn)如美國(guó)專利No.3,817,827；3,850,752；3,901,654；和4,098,876)。未標(biāo)記的抗體可用于如凝集測(cè)定等測(cè)定中。未標(biāo)記抗體也可與另外的(一種或多種)可用于檢測(cè)抗體的適當(dāng)試劑組合使用，所述試劑如可與第一抗體反應(yīng)的標(biāo)記抗體(如第二抗體)(如對(duì)未標(biāo)記免疫球蛋白具有特異性的抗獨(dú)特型抗體或其他抗體)，或其他合適的試劑(如標(biāo)記的A蛋白)。也可用化學(xué)基團(tuán)如聚乙二醇(PEG)、甲基或乙基、或糖基衍生EphB4抗體。這些基團(tuán)有助于改善抗體的生物學(xué)特性，例如可提高其血清半衰期或提高組織結(jié)合力。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可用于酶免疫測(cè)定中，其中受試抗體或第二抗體與酶綴合。當(dāng)含有EphB4蛋白的生物樣品與受試抗體結(jié)合時(shí)，在抗體和EphB4蛋白之間產(chǎn)生了結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，含有表達(dá)EphB4蛋白質(zhì)細(xì)胞(如內(nèi)皮細(xì)胞)的樣品與受試抗體組合，在抗體和具有EphB4蛋白作為抗體識(shí)別表位的細(xì)胞之間產(chǎn)生了結(jié)合。這些被結(jié)合的細(xì)胞可以從未結(jié)合試劑中分離出來(lái)，并且通過(guò)例如將樣品與經(jīng)酶作用后會(huì)產(chǎn)生顏色或其他可檢測(cè)變化的酶底物相接觸，來(lái)確定是否存在特異結(jié)合細(xì)胞的抗體-酶綴合物。在另一實(shí)施方案中，可以不標(biāo)記受試抗體，而加入能夠識(shí)別受試抗體的第二標(biāo)記抗體。
在某些方面，也可以制備用于檢測(cè)生物樣品中是否存在EphB4蛋白的試劑盒。此類試劑盒包含可以結(jié)合EphB4蛋白或所述受體部分的抗體，以及一種或多種適于檢測(cè)抗體和EphB4復(fù)合物或其部分存在的輔助試劑。本發(fā)明的抗體組合物可提供單獨(dú)凍干形式或與對(duì)其他表位具特異性的其他抗體的組合凍干形式。試劑盒中可含有這些標(biāo)記或未標(biāo)記的抗體，以及附加成分(如緩沖液，如Tris、磷酸鹽和碳酸鹽；穩(wěn)定劑；賦形劑；殺生物劑和/或惰性蛋白質(zhì)，如牛血清白蛋白)。例如，可以提供抗體與附加成分一道的凍干混合物，也可單獨(dú)提供附加成分以任使用者組合。一般而言，這些附加材料的重量小于活性抗體量的5％，根據(jù)抗體濃度通常其總量為至少約0.001％重量。當(dāng)使用能夠結(jié)合單克隆抗體的第二抗體時(shí)，該抗體可包含在試劑盒中，例如在獨(dú)立的小瓶或容器中。如果存在，則第二抗體一般是標(biāo)記的，可以通過(guò)與上述抗體制劑類似的方法配制。
與之類似，本發(fā)明也涉及檢測(cè)和/或定量細(xì)胞中EphB4或其受體部分的表達(dá)，其中含有細(xì)胞或其級(jí)分(如膜級(jí)分)的組合物與可結(jié)合EphB4或其受體部分的抗體在適于抗體與之結(jié)合的條件下相接觸，并監(jiān)測(cè)抗體的結(jié)合。檢測(cè)到抗體，即指示在抗體和EphB4或其受體部分之間形成了復(fù)合物，表明存在受體?？梢酝ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定抗體與細(xì)胞之間的結(jié)合，例如那些描述于實(shí)施例中的方法。該方法可用于檢測(cè)EphB4在個(gè)體細(xì)胞中的表達(dá)。任選地，可通過(guò)如流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估EphB4在內(nèi)皮細(xì)胞表面的定量表達(dá)，染色強(qiáng)度可與疾病的易感性、進(jìn)程或風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)。
本發(fā)明也涉及檢測(cè)哺乳動(dòng)物對(duì)于某些疾病易感性的方法。用作說(shuō)明，該方法可用于檢測(cè)哺乳動(dòng)物對(duì)某些疾病的易感性，所述疾病的進(jìn)程取決于細(xì)胞中EphB4的量和/或該哺乳動(dòng)物中EphB4陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及檢測(cè)哺乳動(dòng)物對(duì)于腫瘤的易感性。在該實(shí)施方案中，將待測(cè)樣品與結(jié)合EphB4或其部分的抗體在適于所述抗體結(jié)合的條件下相接觸，其中該樣品含有在正常個(gè)體中表達(dá)EphB4的細(xì)胞。檢測(cè)到抗體的結(jié)合和/或檢測(cè)到結(jié)合量，提示該個(gè)體對(duì)腫瘤有易感性，其中受體水平越高，個(gè)體對(duì)腫瘤的易感性就越高。申請(qǐng)人以及其他團(tuán)體已經(jīng)發(fā)現(xiàn)EphB4的表達(dá)與腫瘤的生長(zhǎng)和進(jìn)展相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明的抗體也可用于進(jìn)一步揭示個(gè)體中EphB4表達(dá)與血管發(fā)生相關(guān)性疾病之間的關(guān)系。
IV.治療性應(yīng)用在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抑制血管發(fā)生以及治療血管發(fā)生相關(guān)性疾病(或紊亂)的組合物和方法。在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抑制或降低腫瘤生長(zhǎng)的方法以及治療患有癌癥個(gè)體的方法。這些方法包括如上所述向個(gè)體施用治療有效量的一種或多種EphB4抗體。這些方法特別針對(duì)于動(dòng)物，尤其是針對(duì)人的治療性和預(yù)防性治療。
如上所述，血管發(fā)生相關(guān)性疾病包括但不僅限于血管發(fā)生依賴性腫瘤，包括如實(shí)體腫瘤、血液產(chǎn)生的腫瘤(如白血病)、以及腫瘤轉(zhuǎn)移；良性腫瘤，如血管瘤、聽(tīng)神經(jīng)瘤、神經(jīng)纖維瘤、沙眼和化膿性肉芽腫；炎性紊亂，如免疫或非免疫性炎癥；慢性關(guān)節(jié)型風(fēng)濕病和銀屑??；眼血管新生性疾病，如糖尿病視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、黃斑變性、角膜移植物排斥反應(yīng)、新生血管性青光眼、晶體后纖維組織增生；虹膜紅變；Osler-Webber綜合征；心肌血管發(fā)生；斑塊新血管發(fā)生；毛細(xì)血管擴(kuò)張癥；血友病性關(guān)節(jié)；血管纖維瘤；以及傷口肉芽腫和傷口愈合；毛細(xì)血管擴(kuò)張銀屑硬皮病(telangiectasia psoriasis scleroderma)、化膿性肉芽腫、冠脈側(cè)支、缺血性肢體血管發(fā)生；角膜疾病、虹膜紅變、關(guān)節(jié)炎、糖尿病性新血管發(fā)生、骨折、脈管形成、造血。
應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的方法和組合物也可用于治療非血管發(fā)生依賴性癌癥(腫瘤)。此處所用的術(shù)語(yǔ)“非血管發(fā)生依賴性癌癥”，是指腫瘤組織中沒(méi)有或有很少新生血管的癌癥(腫瘤)。
具體而言，本發(fā)明的抗體可用于治療或預(yù)防癌癥(腫瘤)，包括但不僅限于，結(jié)腸癌、乳腺癌、間皮腫瘤、前列腺癌、膀胱癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC)、卡波西肉瘤以及白血病。
在此類方法的某些實(shí)施方案中，可以一起(同時(shí))或在不同時(shí)間(順序)施用一種或多種EphB4抗體。此外，抗體可以與另一種治療癌癥或抑制血管發(fā)生的試劑聯(lián)合施用。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的受試抗體也可以與其他抗體治療劑(單克隆或多克隆)一起使用。
在某些實(shí)施方案中，可單獨(dú)使用本發(fā)明的受試抗體?；蛘呤茉嚳贵w可與其他常規(guī)抗癌療法聯(lián)合使用，這些療法用于治療或預(yù)防增殖性紊亂(如腫瘤)。例如，此類方法可用于預(yù)防性癌癥預(yù)防、預(yù)防手術(shù)后的癌癥復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，以及作為其他常規(guī)癌癥療法的輔助療法。本發(fā)明認(rèn)為通過(guò)使用一種或多種本發(fā)明的EphB4抗體，能夠增強(qiáng)常規(guī)癌癥療法的有效性(如化學(xué)治療、放射性治療、光療、免疫療法以及手術(shù))。
大批常規(guī)化合物具有抗腫瘤活性。這些化合物已用作藥劑，在化療中縮小實(shí)體腫瘤、防止轉(zhuǎn)移和進(jìn)一步生長(zhǎng)，或減少白血病或骨髓惡性疾病中惡性細(xì)胞的數(shù)量。盡管化療在治療多種類型腫瘤中都很有效，許多抗腫瘤化合物會(huì)引發(fā)非期望的副作用。已知當(dāng)聯(lián)合兩種或更多不同治療方法時(shí)，這些治療方法可協(xié)同作用而減少各治療的劑量，進(jìn)而減少各化合物在較高劑量時(shí)帶來(lái)的有害副作用。另一些情況下，對(duì)某一治療反應(yīng)不佳的腫瘤可能會(huì)對(duì)兩種或多種不同治療的聯(lián)合療法產(chǎn)生反應(yīng)。
當(dāng)本發(fā)明的主要EphB4抗體與其他常規(guī)抗腫瘤劑聯(lián)合施用時(shí)，不管是同時(shí)施用還是順序施用，此類抗體都能夠增強(qiáng)抗腫瘤試劑的療效或克服對(duì)此類抗腫瘤劑的細(xì)胞耐受。這使得抗癌劑的劑量減少，從而降低了非期望副作用，或在耐受細(xì)胞中重建了抗腫瘤劑的有效性。
可用于聯(lián)合抗腫瘤療法的藥物化合物包括(僅為說(shuō)明)氨苯哌酮、安吖啶(amsacrine)、阿那曲唑(anastrozole)、門冬酰胺酶、卡介苗、比卡魯胺(bicalutamide)、博來(lái)霉素、布舍瑞林(buserelin)、白消安、喜樹堿、卡培他濱(capecitabine)、卡鉑、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥、順鉑、克拉屈濱(cladribine)、氯屈膦酸(clodronate)、秋水仙堿、環(huán)磷酰胺、去乙酰環(huán)丙氯地孕酮、阿糖胞苷、達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)、放線菌素D、柔紅霉素、雙烯雌酚、已烯雌酚、多西他賽(docetaxel)、多柔比星、表柔比星、雌二醇、雌莫司汀(estramustine)、依托泊苷、依西美坦(exemestane)、非格司亭(filgrastim)、氟達(dá)拉濱(fludarabine)、氟氫可的松、氟尿嘧啶、氟羚甲基睪丸素、氟他胺(flutamide)、吉西他濱(gemcitabine)、染料木黃酮、戈舍瑞林(goserelin)、羥基脲、去甲氧基柔紅霉素、異環(huán)磷酰胺、伊馬替尼(imatinib)、干擾素、伊利替康(irinotecan)、伊立替康(ironotecan)、來(lái)曲唑、甲酰四氫葉酸、亮丙瑞林(leuprolide)、左旋咪唑、洛莫司汀(lomustine)、氮芥、甲孕酮、甲地孕酮、馬法蘭(苯丙酸氮芥)、巰嘌呤、巰乙磺酸鈉、甲氨蝶呤、絲裂霉素、米托坦(mitotane)、米托蒽醌、尼魯米特(nilutamide)、諾考達(dá)唑(nocodazole)、奧曲肽、奧沙利鉑(oxaliplatin)、紫杉醇、帕米磷酸鹽(pamidronate)、戊糖苷、普卡霉素、卟吩姆鹽(porfimer)、甲基芐肼、雷替曲塞(raltitrexed)、美羅華(rituximab)、鏈脲佐菌素、蘇拉明、三苯氧胺、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊苷、睪丸酮、硫鳥嘌呤、三胺硫磷、二氯鈦烯、拓?fù)涮婵?topotecan)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、維生素A酸、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春地辛和長(zhǎng)春瑞濱。
可以根據(jù)其作用機(jī)制，將這些化學(xué)治療的抗腫瘤化合物分為以下類別，例如抗代謝/抗癌試劑，如嘧啶類似物(5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、卡培他濱、吉西他濱以及阿糖胞苷)和嘌呤類似物、葉酸拮抗劑及相關(guān)抑制劑(巰嘌呤、硫鳥嘌呤、戊糖苷和2-氯脫氧腺苷(克拉屈濱)；抗增殖/抗有絲分裂試劑，包括天然產(chǎn)物，如長(zhǎng)春花生物堿類(長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春瑞濱)；微管破壞劑，如紫杉?jí)A(紫杉醇、紫杉萜)、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、諾考達(dá)唑、埃博霉素和諾維本(navelbine)；鬼臼毒素(依托泊苷、替尼泊苷)；DNA破壞試劑(放線菌素、安吖啶、蒽環(huán)霉素(anthracycline)、博來(lái)霉素、白消安、喜樹堿、卡鉑、苯丁酸氮芥、順鉑、環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺cytoxan、放線菌素D、柔紅霉素、多柔比星、表柔比星、六甲嘧胺奧沙利鉑、異環(huán)磷酰胺、馬法蘭(苯丙酸氮芥)、merchlorehtamine、絲裂霉素、米托蒽醌、亞硝脲、普卡霉素、甲基芐肼、紫杉醇、紫杉特爾、替尼泊苷、三亞乙基硫代磷酸胺和依托泊苷(VP16))；抗生素如放線菌素(放線菌素D)、柔紅霉素、多柔比星(阿霉素)、去甲氧基柔紅霉素、蒽環(huán)霉素、米托蒽醌、博來(lái)霉素、普卡霉素(光輝霉素)和絲裂霉素；酶(L-天門冬氨酸酶，可系統(tǒng)代謝L-天門冬氨酸并除去不能合成自身L-天門冬氨酸的細(xì)胞中的L-天門冬氨酸)；抗血小板制劑；抗增殖/抗有絲分裂烷化劑如氮芥(氮芥、環(huán)磷酰胺及其類似物、馬法蘭、苯丁酸氮芥)、次乙亞胺和甲基三聚氰胺(六甲嘧胺和噻替派)、烷基磺酸鹽-白消安、亞硝脲(卡莫司汀(BCNU)及其類似物、鏈脲佐菌素)、trazenes-darcarbazinine(DTIC)；抗增殖/抗有絲分裂抗代謝劑如葉酸類似物(甲氨蝶呤)；鉑配位復(fù)合物(順鉑、卡鉑)、甲基芐肼、羥基脲、米托坦、氨苯哌酮；激素、激素類似物(雌激素、三苯氧胺、戈舍瑞林、比卡魯胺、尼魯米特)和芳化酶抑制劑(來(lái)曲唑、阿那曲唑)；抗凝劑(肝素、合成肝素鹽以及其他凝血酶抑制劑)；纖維溶解劑(如組織血纖維蛋白溶酶原激活物、鏈激酶和尿激酶)、阿司匹林、雙嘧達(dá)莫、噻氯匹定(ticlopidine)、氯吡格雷(clopidogrel)、阿昔單抗(abciximab)；抗遷移劑；抗分泌劑(breveldin)；免疫抑制劑(環(huán)孢菌素、他克莫司(tacrolimus)(FK-506)、西羅莫司(雷帕霉素)、咪唑硫嘌呤、霉酚酸酯)；抗血管發(fā)生化合物(TNP-470、染料木黃酮)以及生長(zhǎng)因子抑制劑(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)抑制劑、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)抑制劑)；血管緊張素受體阻斷劑；一氧化氮供體；反義寡核苷酸；抗體(曲妥珠單抗)；細(xì)胞周期抑制劑和分化誘導(dǎo)物(維A酸)；mTOR抑制劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑(阿霉素、安吖啶、喜樹堿、柔紅霉素、放線菌素D、eniposide、表阿霉素、依托泊苷、去甲氧基柔紅霉素和米托蒽醌、拓?fù)涮婵怠⒁晾婵?、皮質(zhì)類固醇(可的松、地塞米松、氫化可的松、甲基強(qiáng)的松龍、強(qiáng)的松和強(qiáng)的松龍)；生長(zhǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激酶抑制劑；線粒體功能失調(diào)誘導(dǎo)劑和級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活劑；以及染色質(zhì)斷裂劑。
在某些實(shí)施方案中，可用于聯(lián)合抗血管發(fā)生療法的藥物化合物包括(1)“生血管分子”釋放抑制劑，如bFGF(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)；(2)血管發(fā)生分子中和劑，如抗βbFGF抗體；以及(3)內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)血管發(fā)生刺激的應(yīng)答抑制劑，包括膠原酶抑制劑、基膜更新抑制劑、血管張力類固醇、來(lái)自真菌的血管發(fā)生抑制劑、血小板因子4、血小板反應(yīng)蛋白、關(guān)節(jié)炎藥物(如D-青霉胺和硫代蘋果酸金)、維生素D3類似物、α干擾素等等。其他提及的血管發(fā)生抑制劑，參見(jiàn)Blood等人.，Bioch.Biophys.Acta.，103289-118(1990)，Moses等人.，Science，2481408-1410(1990)，Ingber等人.，Lab.Invest.，5944-51(1988)，以及美國(guó)專利No.5,092,885、5,112,946、5,192,744、5,202,352和6573256。此外，還有很多種化合物可用于抑制血管發(fā)生，例如肽或阻斷VEGF介導(dǎo)血管發(fā)生途徑的試劑、內(nèi)皮素蛋白質(zhì)或衍生物、血管張力素的賴氨酸結(jié)合片段、黑色素或促黑色素化合物、血纖維蛋白溶酶原片段(如血纖維蛋白溶酶原的Kringles 1-3)、肌鈣蛋白亞基、玻連蛋白αvβ3拮抗劑、來(lái)自皂化蛋白B的肽、抗生素或類似物(如四環(huán)素或新霉素)、含地諾孕素組合物、含耦聯(lián)于肽的MetAP-2抑制核的化合物、化合物EM-138、查耳酮及其類似物，以及naaladase抑制劑。見(jiàn)如美國(guó)專利No.6,395,718、6,462,075、6,465,431、6,475,784、6,482,802、6,482,810、6,500,431、6,500,924、6,518,298、6,521,439、6,525,019、6,538,103、6,544,758、6,544,947、6,548,477、6,559,126以及6,569,845。
根據(jù)聯(lián)合治療的性質(zhì)，當(dāng)施用其他治療時(shí)和/或施用其他治療后，仍可繼續(xù)施用本發(fā)明的抗體。可以單劑或多劑形式施用本發(fā)明抗體。在某些情況下，于常規(guī)療法之前的至少若干天開(kāi)始施用抗體；而另一些情況下，則在施用常規(guī)療法前即刻或同時(shí)開(kāi)始施用抗體。
V.藥物組合物和施用模式在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的受試抗體與可藥用載體一起配制?？梢詥为?dú)施用此類抗體或作為藥物制劑(組合物)的成分之一施用。這些化合物可以任何便于施用的方式配制，以在人或獸醫(yī)藥物中使用。組合物中也可含有潤(rùn)濕劑、乳化劑以及潤(rùn)滑劑(例如十二烷基硫酸鈉和硬脂酸鎂)，還可含有著色劑、釋放劑、包被劑、甜味劑、調(diào)味劑和芳香劑、防腐劑以及抗氧化劑。
受試抗體的制劑形式包括適于經(jīng)口、膳食、局部、胃腸外(如經(jīng)靜脈、經(jīng)動(dòng)脈、肌內(nèi)、皮下注射)、吸入(如經(jīng)氣管、經(jīng)鼻或口吸入、經(jīng)鼻滴入)、經(jīng)直腸和/或經(jīng)陰道施用形式。其他適于施用的方法中也可含有可再裝料或可生物降解的裝置以及緩釋聚合裝置。本發(fā)明的藥物組合物也可以作為聯(lián)合治療的一部分與其他試劑共同施用(在同一制劑中或在獨(dú)立制劑中)。
制劑可以方便地為單劑形式，并可通過(guò)任何制藥領(lǐng)域公知的方法來(lái)制備?？膳c載體材料結(jié)合以產(chǎn)生單劑形式的活性成分量，取決于即將治療的宿主和具體的施用方式。一般而言，可與載體材料結(jié)合以產(chǎn)生單劑形式的活性成分的量為能夠產(chǎn)生治療效果的化合物量。
在某些實(shí)施方案中，制備這些制劑或組合物的方法包括，與另一類型的抗腫瘤或抗血管發(fā)生劑和載體以及任選一種或多種輔助成分相組合。一般而言，可以利用液相載體或精細(xì)分割的固相載體或兩者來(lái)制備制劑，其后如有必要進(jìn)行產(chǎn)品成型。
用于經(jīng)口施用的制劑形式可以為膠囊劑、扁囊劑、丸劑、片劑、錠劑(使用可口基質(zhì)，通常為蔗糖和阿拉伯膠或黃芪膠)、粉劑、顆粒劑，或者為水或非水液體中的溶液或懸液劑、或?yàn)樗突蛴桶橐簞?、或?yàn)轸齽┗蛱菨{劑、或?yàn)檐涘V劑(使用惰性基質(zhì)，如凝膠和甘油、或蔗糖和阿拉伯膠)和/或漱口液等，其中每種劑型中均含有預(yù)定量的一種或兩種受試抗體作為活性成分。
在經(jīng)口施用的固體劑型中(膠囊、片劑、丸劑、糖衣丸劑、粉劑、顆粒劑等)，可將一種或多種本發(fā)明的受試抗體與一種或多種可藥用載體混合，所述載體如檸檬酸鈉、或磷酸二鈣，和/或以下任一種(1)填充劑或增量劑，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合劑，例如羧甲基纖維素、藻酸鹽、凝膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯膠；(3)保濕劑，如甘油；(4)分解劑，如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸鹽，以及碳酸鈉；(5)溶液延遲試劑，如石蠟；(6)吸收增速劑，如季銨化合物；(7)潤(rùn)濕劑，例如十六醇和單硬脂酸甘油酯；(8)吸收劑，例如高嶺土和班脫粘土；(9)潤(rùn)滑劑，如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、十二烷硫酸鈉及其混合物；以及(10)著色劑。對(duì)于膠囊、片劑和丸劑而言，藥物組合物還可含有緩沖劑。也可以乳糖或奶糖，以及高分子量聚乙二醇等為賦形劑，使用相似類型的固體組合物作為軟及硬填充凝膠膠囊的填充劑。
經(jīng)口施用的液體劑型包括可藥用的乳化劑、微乳化劑、溶液、懸浮液、糖漿以及酏劑。除了活性成分以外，液體劑型還可含有本領(lǐng)域常用的惰性稀釋劑，例如水或其他溶劑、增溶劑和乳化劑如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、醋酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油(特別是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油、芝麻油)、甘油、四氫呋喃甲醇、聚乙二醇以及山梨糖的脂肪酸酯，及其混合物。除惰性稀釋劑外，口服組合物也可含有佐劑，如潤(rùn)濕劑、乳化和懸浮劑、甜味劑、調(diào)味劑、著色劑、芳香劑以及防腐劑。
懸浮液中除了活性化合物之外，可含有懸浮劑，如乙氧基異十八醇、聚氧乙烯山梨醇和山梨酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁、斑脫土、瓊脂和黃芪膠及其混合物。
本發(fā)明方法可以局部施用于皮膚或粘膜(如子宮頸和陰道粘膜)。這使得直接向腫瘤輸送的機(jī)會(huì)最大，而誘發(fā)副作用的機(jī)會(huì)最小。局部制劑還可含有很多種已知有效的皮膚或角質(zhì)層穿透增強(qiáng)劑中的一種或多種。此類增強(qiáng)劑的實(shí)例為2-吡咯烷酮、N-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、丙二醇、甲醇或異丙醇、二甲基亞砜和月桂氮卓酮。還可含有使制劑可用于化妝品的其他試劑。此類試劑的實(shí)例為脂肪、蠟、油、染料、芳香劑、防腐劑、穩(wěn)定劑以及表面活性試劑。也可含有本領(lǐng)域已知的角質(zhì)離解劑。實(shí)例為水楊酸和硫磺。
局部或經(jīng)皮施用的劑型包括粉劑、噴霧劑、膏劑、糊劑、霜?jiǎng)?、洗液、凝膠、溶液、貼劑以及吸入劑?？梢栽跓o(wú)菌條件下將受試抗體與可藥用載體以及任何可能需要的防腐劑、緩沖液或推進(jìn)劑混合。膏劑、糊劑、霜?jiǎng)┘澳z中除抗體外還可含有賦形劑，例如動(dòng)物和植物脂肪、油、蠟質(zhì)、石蠟、淀粉、黃芪膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、硅樹脂、斑脫土、硅酸、滑石和氧化鋅，或其混合物。
粉劑和噴霧劑中除了抗體外還可含有賦形劑，如乳糖、滑石、硅酸、氫氧化鋁、硅酸鈣以及聚酰胺粉劑，或這些物質(zhì)的混合物。此外，噴霧劑中還常規(guī)含有推進(jìn)劑，例如含氯氟烴和揮發(fā)性非取代烴，如丁烷和丙烷。
適于胃腸外施用的藥物組合物可能含有一種或多種抗體組合一種或多種可藥用的無(wú)菌等張水性或非性水溶液、分散液、懸浮液或乳化液，或者在臨近使用前可以重建為無(wú)菌注射溶液或分散體系的無(wú)菌粉劑，其中可含有抗氧化劑、緩沖物、抑菌劑、使制劑與欲施用的受者血液等張力的溶質(zhì)，或懸浮劑或增稠劑?？捎糜诒景l(fā)明藥物組合物的合適水性或非水性載體包括，水、乙醇、多羥基化合物(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其適當(dāng)混合物、植物油(如橄欖油)、可注射有機(jī)酯(如油酸乙酯)。通過(guò)如使用包被材料(如卵磷脂)、保持分散體系中的所需顆粒大小以及使用表面活性劑，可以保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。
這些組合物中也可含有佐劑，例如防腐劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑和分散劑?？梢酝ㄟ^(guò)加入多種抗細(xì)菌和抗真菌劑來(lái)阻止微生物的作用，例如對(duì)羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸酯(phenol sorbic acid)等。組合物中也可以含有等張劑，如糖、氯化鈉等。此外，通過(guò)加入可延遲吸收的試劑(如單硬脂酸鋁及凝膠)，能夠延長(zhǎng)可注射藥物劑型的吸收。
通過(guò)在可生物降解的聚合物(如聚交酯-聚乙醇酸交酯)中形成一種或多種抗體的微膠囊基質(zhì)，來(lái)制備可注射的貯存劑型。根據(jù)藥物與聚合物之間的比例以及所用具體聚合物的性質(zhì)，可以控制藥物的釋放速率。其他可生物降解的聚合物的實(shí)例包括，聚(正酯類)(poly(orthoesters))和聚(酐)。也可將藥物包于與機(jī)體組織相容的脂質(zhì)體或微乳狀液中，從而制備貯存的可注射制劑。
用于陰道內(nèi)或直腸施用的制劑可以為栓劑，其可通過(guò)將一種或多種本發(fā)明的化合物與一種或多種合適的非刺激性賦形劑或載體混合制備，所述賦形劑或載體包括如可可脂、聚乙二醇、栓劑蠟或水楊酸鹽，且所述賦形劑或載體在室溫下為固體，而在體溫下為液體，因此會(huì)溶解在直腸或陰道腔內(nèi)而釋放出活性化合物。
實(shí)施例至此已經(jīng)對(duì)本發(fā)明做了一般性描述，參照以下實(shí)施例可以更好地理解本發(fā)明，所述實(shí)施例在此處僅為說(shuō)明本發(fā)明的某些方面及實(shí)施方案，而不在于限制本發(fā)明。
實(shí)施例1 肝配蛋白B2和FphB4多克隆抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響從Santa CruzBiotech(Santa Cruz，CA)購(gòu)得兩種EphB4多克隆抗體(H-200和N-19)。H-200抗體(也稱為sc-5536)具有相應(yīng)于人EphB4胞外結(jié)構(gòu)域中氨基酸201-400的表位區(qū)域，而N-19抗體(也稱為sc-7285)具有人EphB4胞外結(jié)構(gòu)域N-末端內(nèi)的表位區(qū)域。此外，從R&D Systems(Minneapolis，MN)購(gòu)得肝配蛋白B2多克隆。
從ATCC(Manassas，VA)獲取三種間皮瘤細(xì)胞系(H28、H2052和H2373)，用于測(cè)試這些EphB4和肝配蛋白B2多克隆抗體的抗腫瘤活性。將這些細(xì)胞(約5,000細(xì)胞/孔)置于48孔平板中，并在第二天用不同濃度的各種抗體處理。在第4天進(jìn)行細(xì)胞存活測(cè)定(MTT)。EphB4和肝配蛋白B2多克隆抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖6。
實(shí)施例2.EphB4單克隆抗體對(duì)血管發(fā)生和腫瘤生長(zhǎng)的影響A.EphB4抗體的產(chǎn)生和功能性分析在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)EphB4胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)的抗EphB4單克隆抗體。將EphB4 ECD(見(jiàn)如圖5)克隆入表達(dá)載體(例如pGEX)中，以產(chǎn)生EphB4 ECD融合蛋白(如GST-ECD)。通過(guò)親和層析法純化表達(dá)于大腸桿菌BL21內(nèi)的EphB4 ECD融合蛋白。在GST融合蛋白的情況下，用凝血酶裂解GST結(jié)構(gòu)域。利用A蛋白層析法從雜交瘤上清液中純化單克隆抗體。
這些單克隆抗體包括EphB4抗體號(hào)1、23、35、47、57、79、85L、85H、91、98、121、131和138(圖5)?？贵w作圖研究顯示了這些抗體各自的表位結(jié)構(gòu)域(圖5)。分析每一EphB4抗體的結(jié)合親和力并顯示于圖7。
進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)以分析這些抗體的功能活性，包括它們與其結(jié)合配偶體(如肝配蛋白B2)的競(jìng)爭(zhēng)能力、活化EphB4酪氨酸磷酸化的能力、抑制HUAEC中體外脈管形成的能力、通過(guò)基質(zhì)膠栓測(cè)定其抑制體內(nèi)血管發(fā)生的能力、激活SCC15腫瘤細(xì)胞凋亡或壞死的能力，以及抑制SCC15異種移植物生長(zhǎng)的能力。結(jié)果總結(jié)于下表1。
表1.EphB4抗體活性概述


Nd＝未確定(無(wú)數(shù)據(jù)提供)--＝無(wú)明顯效果+＝效果明顯A＝凋亡N＝壞死A，N＝同時(shí)發(fā)生凋亡和壞死在小鼠角膜微囊測(cè)定中進(jìn)一步分析這些抗體對(duì)血管發(fā)生的影響。例如，圖8顯示EphB4抗體138可顯著抑制血管發(fā)生。
圖9中顯示可說(shuō)明表1總結(jié)的EphB4抗體抗腫瘤活性的代表性實(shí)驗(yàn)。向BaLbC裸鼠皮下注射2.5×106活腫瘤細(xì)胞(SCC15，一種頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系)。通過(guò)皮下注射2.5-5×106與基質(zhì)膠和生長(zhǎng)因子預(yù)混合好的細(xì)胞和抗體以誘導(dǎo)出腫瘤異種移植物，在nu/nu小鼠中誘導(dǎo)出腫瘤。于注射14天后剖開(kāi)小鼠。SCC15為頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系，B16為黑素瘤細(xì)胞系，而MCF-7為乳腺癌細(xì)胞系。將腫瘤對(duì)這些處理的應(yīng)答與接受PBS注射的對(duì)照處理小鼠進(jìn)行比較。每天觀察動(dòng)物中的腫瘤生長(zhǎng)，并利用測(cè)徑器每?jī)商鞙y(cè)量一次皮下腫瘤。相對(duì)于對(duì)照，抗體#1和#23顯示了SCC 15腫瘤大小的顯著消退，尤其是不加生長(zhǎng)因子時(shí)更為突出，指示EphB4抗體抑制了體內(nèi)SCC15細(xì)胞的腫瘤生長(zhǎng)。
圖10顯示了另一個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)，以說(shuō)明表1總結(jié)的EphB4抗體的抗腫瘤和抗血管發(fā)生活性。通過(guò)CD-31免疫組織化學(xué)方法評(píng)估血管發(fā)生。用CD-31染色經(jīng)處理和未處理小鼠的腫瘤組織切片。通過(guò)免疫組織化學(xué)TUNNEL評(píng)估凋亡，并通過(guò)BrdU測(cè)定評(píng)估增殖。手術(shù)取出后，立即將腫瘤切成2mm連續(xù)切片并使用標(biāo)準(zhǔn)方法包埋進(jìn)石蠟。將石蠟包埋的組織切成5μm切片，除去石蠟并將組織再水合。于抗原回收(retreival)溶液中用微波照射再水合組織。用PBS洗滌切片，并在完全避光的潮濕小室內(nèi)加入TUNNEL反應(yīng)混合物(末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶和熒光素標(biāo)記的核苷酸溶液)和BrdU。然后去除TUNNEL和BrdU反應(yīng)混合物，洗滌切片，并加入綴合辣根過(guò)氧化物酶的抗熒光素抗體。經(jīng)孵育和洗滌后，加入3，3′-二氨基聯(lián)苯胺。也可用Masson三色、蘇木精和伊紅染片進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。Masson三色染色可觀察到壞死和纖維化。腫瘤從腫瘤/皮膚、肌肉邊界獲取血供。隨著腫瘤的生長(zhǎng)，其內(nèi)部區(qū)域養(yǎng)分耗竭。從而導(dǎo)致壞死(細(xì)胞死亡)，優(yōu)選發(fā)生于腫瘤中心。細(xì)胞死亡后，成纖維組織取代了(腫瘤)組織。在20倍放大下觀察切片得到數(shù)字圖像。施用各種抗體的SCC腫瘤呈現(xiàn)出不同的形態(tài)?？贵w#1中壞死和纖維化增強(qiáng)，而凋亡則無(wú)?？贵w#23中凋亡、壞死和纖維化增強(qiáng)，而血管浸潤(rùn)有所減少?？贵w#35中壞死和纖維化增強(qiáng)，凋亡稍有增強(qiáng)，而血管浸潤(rùn)有所減少?？贵w#79凋亡、壞死和纖維化均有大幅度增強(qiáng)?？贵w#91在凋亡上沒(méi)有變化，但增殖增強(qiáng)。而抗體#138中凋亡、壞死和纖維化增強(qiáng)，增殖及血管浸潤(rùn)減少。用對(duì)照PBS處理的腫瘤中腫瘤細(xì)胞密度高、血管發(fā)生反應(yīng)強(qiáng)烈。而用EphB4抗體處理的腫瘤則表現(xiàn)出腫瘤細(xì)胞密度的降低和存活腫瘤細(xì)胞區(qū)內(nèi)腫瘤血管發(fā)生的顯著抑制，以及腫瘤壞死和凋亡。這些結(jié)果顯示，EphB4抗體誘發(fā)了頭頸癌腫瘤類型SCC15中的凋亡、壞死和血管發(fā)生減少。
圖11顯示了可說(shuō)明表1總結(jié)的EphB4抗體的抗腫瘤活性的另一代表性實(shí)驗(yàn)。在第4天、腫瘤建立后開(kāi)始，每隔一天用EphB4單克隆抗體或等量的PBS作為對(duì)照處理，并持續(xù)14天。通過(guò)IP或SC進(jìn)行全身性施用，并且無(wú)顯著差異。所有的實(shí)驗(yàn)都是在雙盲方式下進(jìn)行，以消除研究者的偏見(jiàn)。兩周處理結(jié)束后處死小鼠。死后立即收獲腫瘤，并固定和處理以進(jìn)行免疫組織化學(xué)。每kg體重施用40mg EphB4抗體。EphB4抗體處理小鼠相對(duì)于對(duì)照處理小鼠顯著抑制了人SCC腫瘤的生長(zhǎng)(p＜0.05)。EphB4抗體處理小鼠相對(duì)于對(duì)照處理小鼠顯著抑制了腫瘤的重量(p＜0.05)。這些結(jié)果表明，對(duì)異種移植物全身性施用抗體導(dǎo)致了SCC15腫瘤異種移植物中的腫瘤消退。
實(shí)施例3.材料和方法1)免疫組織化學(xué)將福爾馬林固定的組織切片去石蠟包埋，并于--70℃在10％山羊血清中孵育10分鐘，然后與EphB4單克隆抗體在4℃下孵育過(guò)夜。使用同種型特異的兔IgG作為對(duì)照。利用Vector Laboratories的抗生物素蛋白-生物素試劑盒揭示對(duì)這些受體的免疫反應(yīng)活性。通過(guò)二氨基聯(lián)苯胺(Sigma)細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)揭示過(guò)氧化物酶活性。然后用0.12％亞甲基藍(lán)或H&E對(duì)切片復(fù)染色。對(duì)于冰凍切片而言，OCT包埋的組織切成5μm切片，并在磷酸鹽緩沖的4％多聚甲醛中固定。在PBS中洗滌切片3×5分鐘，并在室溫下0.3％H2O2PBS中孵育10分鐘封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。在室溫下將切片與Eph4(C-16)抗體(1∶50)孵育1小時(shí)，然后在PBS中洗滌三次，并與驢抗山羊第二抗體(Santa Cruz Biotech.)室溫下共同孵育1小時(shí)。在PBS中洗滌三次后，室溫下在DAB底物溶液(Vector Laboratories，Inc.BurlingameCA)中孵育10分鐘，定位過(guò)氧化物酶活性。將切片用蘇木精復(fù)染色20秒，脫水并封固。染色的陰性對(duì)照是以正常山羊血清代替第一抗體。
2)Western印跡除非另有說(shuō)明，利用細(xì)胞裂解緩沖液(GeneHunter，BasgvukkeTN)加以蛋白酶抑制劑混合物(Pierce，Rockford IL)，制備全細(xì)胞裂解物。利用DC反應(yīng)系統(tǒng)(Bio-Rad，Hercules CA)測(cè)定總蛋白質(zhì)。一般而言，將20μg全細(xì)胞裂解物在4-20％Tris-甘氨酸梯度凝膠上電泳。將樣品電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，且在含有5％脫脂乳的TBST緩沖液(0.5mM Tris-HCl、45mM NaCl、0.05％Tween-20，pH 7.4)中封閉非特異性結(jié)合。先以第一抗體為探針處理膜過(guò)夜，用RestoreTMWestern印跡剝離緩沖液(Pierce，Rockford IL)剝離膜，再用β肌動(dòng)蛋白為探針處理，以確認(rèn)蛋白質(zhì)的等量上樣和轉(zhuǎn)移。使用SuperSignal West Femto最大靈敏度底物(Pierce)檢測(cè)信號(hào)。
3)酪氨酸激酶磷酸化分析生長(zhǎng)在60mm盤中的細(xì)胞為乏血清(加入RPMI 1640的1％FBS，24小時(shí))，或是培養(yǎng)于正常條件下(10％FBS)的，然后用或不用1μg/ml小鼠肝配蛋白B2/Fc處理10分鐘以活化EphB4受體。將純細(xì)胞裂解物與EphB4單克隆抗體于4℃下孵育過(guò)夜。加入含100μlG蛋白-瓊脂糖凝膠的20mM磷酸鈉(pH 7.0)，于4℃下孵育過(guò)夜，以免疫沉淀抗原-抗體復(fù)合物。利用1∶1000稀釋的磷酸化酪氨酸(pTyr)特異性抗體(Upstate，clone4G10)進(jìn)行Western印跡，然后與1∶5000稀釋的G蛋白-HRP(Bio-Rad)孵育，來(lái)分析免疫沉淀物。用EphB4特異性單克隆抗體探針雜交完全相同的膜，以監(jiān)測(cè)免疫沉淀的效率。
4)細(xì)胞培養(yǎng)從Cambrex (BioWhittaker)獲取正常HUVEC，并保持在EBM2培養(yǎng)基中，其中含有0.1mg/ml內(nèi)皮生長(zhǎng)添加劑(牛腦粗提取物)、青霉素(50U/ml)、鏈霉素(50U/ml)、2mmol/l谷氨酸鹽以及0.1mg/ml肝素鈉。冷凍保存?zhèn)鞔?-3次的細(xì)胞等分試樣。對(duì)于所有實(shí)驗(yàn)，使用傳代4次或以下的HUVEC，從匯合的盤中收集。
從ATCC(Manassas，VA)處獲取NCI H28和NCI H2373間皮瘤細(xì)胞系。將細(xì)胞保持在含有10％熱滅活的胎牛血清(FBS；Life Technologies，Gaithersburg，MD)和抗生素的RPMI 1640培養(yǎng)基中。原代細(xì)胞來(lái)自于間皮瘤患者的胸膜滲出液。
5)內(nèi)皮細(xì)胞脈管形成測(cè)定將基質(zhì)膠(10mg/ml，60μl；Collaborative Lab，Cat.No.35423)置于冰凍96孔平板的每一孔內(nèi)。將平板留置室溫15分鐘，然后在37℃下孵育30分鐘使基質(zhì)膠發(fā)生聚合。同時(shí)，在EGM-2(Clonetic，Cat.No.CC3162)中制備濃度為2×105細(xì)胞/ml的人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。將細(xì)胞(500μl)與測(cè)試EphB4抗體混合，以一試兩份將200μl該懸浮液置于聚合基質(zhì)膠上。經(jīng)24小時(shí)孵育后，利用Bioquant圖像分析系統(tǒng)對(duì)每一濃度采集3幅照片。測(cè)量形成脈管的長(zhǎng)度和連接的數(shù)目，以次評(píng)估相對(duì)于未處理對(duì)照樣品的蛋白質(zhì)加成效應(yīng)(IC50)。
6)細(xì)胞遷移測(cè)定利用改良的Boyden盒，穿孔濾膜嵌入24孔平板，直徑6.5mm、孔徑8μm、10μm厚的基質(zhì)膠包被聚碳酸酯膜(BD Biosciences)，來(lái)評(píng)估HVVEC對(duì)VEGF的趨化性。將含于200μlEBM中的HUVEC細(xì)胞懸浮液(2×105cells/ml)接種于上層隔室內(nèi)，而向下層隔室腔內(nèi)同時(shí)加入測(cè)試EphB4抗體及刺激物(VEGF或bFGF)，并研究其響應(yīng)含或不含100nM-1μM測(cè)試混合物的10-20ng/ml VEGF作用而發(fā)生的跨聚碳酸酯濾膜遷移。在37℃孵育4-24小時(shí)后，用拭子刮下濾膜的上表面，并用Diff Quick固定染色濾膜。在200×放大倍數(shù)下計(jì)數(shù)10個(gè)隨機(jī)視野，結(jié)果用每視野平均個(gè)數(shù)表示。從刺激對(duì)照和蛋白質(zhì)處理樣品值中減去陰性未刺激對(duì)照值，將所得數(shù)據(jù)標(biāo)示為平均遷移細(xì)胞±S.D.。從標(biāo)示的數(shù)據(jù)中計(jì)算IC50。
7)生長(zhǎng)抑制測(cè)定將HUVEC(1.5×103細(xì)胞)置于96孔平板中的100μl EBM-2(Clonetic，Cat.No.CC3162)中。24小時(shí)后(第0天)，向每孔內(nèi)的EBM-2培養(yǎng)基加入所需濃度的測(cè)試EphB4抗體。在第0天，用含0.5％結(jié)晶紫的20％甲醇染色一塊板10分鐘，水洗后空氣中干燥。其他平板在37℃下孵育72小時(shí)。72小時(shí)后用含0.5％結(jié)晶紫的20％甲醇染色，并水洗后空氣中干燥。用1∶1的乙醇0.1M檸檬酸鈉溶液洗脫染色(包括第0天的板)，并用ELISA讀取儀(Dynatech Laboratories)于540nm下測(cè)量其吸光度。從72小時(shí)板值中減去第0天的吸光度，數(shù)據(jù)標(biāo)示為對(duì)照增殖(用對(duì)照處理的細(xì)胞)的百分比。從標(biāo)示的數(shù)據(jù)中計(jì)算IC50值。
8)鼠基質(zhì)膠栓血管發(fā)生測(cè)定測(cè)定血管從皮下組織向含有基質(zhì)膠栓的測(cè)試樣品的生長(zhǎng)，作為小鼠體內(nèi)血管發(fā)生的測(cè)定?；|(zhì)膠在體溫下可迅速形成固體凝膠，從而捕獲因子，使其緩慢釋放并延長(zhǎng)其暴露于周圍組織的時(shí)間。將4℃下液體形式的基質(zhì)膠(8.13mg/ml，0.5ml)與內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑(ECGS)、或測(cè)試EphB4抗體加ECGS混合，或者基質(zhì)膠僅與賦形劑混合(含0.25％BSA的PBS)。沿腹膜中線向雌性nu/nu小鼠(6周大)的腹部皮下組織中注射基質(zhì)膠(0.5ml)。每組中有3只小鼠。根據(jù)慣例和NIH綱要飼養(yǎng)這些動(dòng)物。在第6天，處死小鼠并回收栓劑，處理以進(jìn)行組織學(xué)分析。一般而言，移去表面皮膚，并保留腹膜內(nèi)層作為支撐割下凝膠，用含10％緩沖福爾馬林的PBS固定，并包埋于石蠟內(nèi)。切成3μm切片，并用H&E或Masson三色染色，在光學(xué)顯微鏡下檢查。
9)小鼠角膜微囊測(cè)定根據(jù)Kenyon等人，1996的詳述進(jìn)行小鼠角膜微囊測(cè)定。簡(jiǎn)言之，制備含有90ng bFGF(R&D)或180ng VEGF(R&D Systems，Minneapolis，MN，U.S.A.)、以及40μg蔗糖硫酸鋁(Sigma)的hydron小丸(聚羥乙基異丁烯酸[polyHEMA]，Interferon Sciences，New Brunswick，NJ，U.S.A.)。利用手術(shù)顯微鏡，在麻醉動(dòng)物上用手術(shù)刀片(Bard-Parker no.15)做平行于外直肌走行的基質(zhì)線性角膜切開(kāi)術(shù)。用改良的yon Graefe刀(2″30mm)剖開(kāi)基質(zhì)內(nèi)微囊。植入單個(gè)小球，并移向顳側(cè)角膜緣(對(duì)于bFGF小球，范圍為0±7±1±0mm，而VEGF小球?yàn)?±5mm)。由于該模型中VEGF的血管發(fā)生刺激作用相對(duì)較弱，有必要使每一生長(zhǎng)因子小球處于不同位置。然后向手術(shù)眼敷上抗生素軟膏(紅霉素)，以防止感染并減少表面刺激。測(cè)量隨后從角膜緣血管網(wǎng)延伸至小球及鄰近新生血管的圓周區(qū)的血管應(yīng)答。此處顯示的數(shù)據(jù)和臨床照片獲自小球植入后的第6天，也即顯示發(fā)生最大血管發(fā)生應(yīng)答的一天。
10)體外侵襲測(cè)定將用“基質(zhì)膠”基質(zhì)包被的9mm細(xì)胞培養(yǎng)嵌入物(孔徑8μm；BectonDickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)置于24孔平板上。將HUVEC細(xì)胞以每孔5×103細(xì)胞的密度接種在嵌入培養(yǎng)基的上層，并在測(cè)試EphB4抗體存在時(shí)用無(wú)血清的EBM培養(yǎng)24小時(shí)。在不含EphB4抗體的相同培養(yǎng)基中培養(yǎng)對(duì)照組。然后向嵌入培養(yǎng)基下層中填入0.5ml人SCC15細(xì)胞系和條件培養(yǎng)基作為化學(xué)引誘劑。孵育細(xì)胞24小時(shí)，然后用棉花刮取上層中的殘留細(xì)胞，穿入下層的細(xì)胞以5％戊二醛固定并以Diff Quick染色。利用光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)穿過(guò)基質(zhì)膠培養(yǎng)基及每個(gè)8μm孔嵌入培養(yǎng)基的細(xì)胞總數(shù)，定為侵襲指數(shù)(細(xì)胞數(shù)/面積)。
11)小鼠中的SCC15腫瘤生長(zhǎng)以5×106的細(xì)胞密度向無(wú)胸腺Balb/c裸鼠皮下注射呈對(duì)數(shù)級(jí)增長(zhǎng)的SCC15頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系；其中在存在或不存在人bFGF的情況下含或不含測(cè)試EphB4抗體，且含有基質(zhì)膠(BD Bioscience)合成基膜(1∶1v/v)，并于兩周內(nèi)檢查腫瘤。移植后測(cè)試EphB4抗體組的腫瘤體積(含或不含生長(zhǎng)因子)比對(duì)照組小三倍。組間體重?zé)o差異。除去石蠟、再水合并封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性后，用蛋白酶K滲透10分鐘，隨后進(jìn)行切除腫瘤橫切片，及TUNEL-陽(yáng)性凋亡或壞死的免疫組織化學(xué)檢查、CD34免疫染色和BrdU增殖率測(cè)定。也進(jìn)行血管密度的定量評(píng)估。同時(shí)每周兩次局部腫瘤內(nèi)遞送或經(jīng)靜脈遞送測(cè)試EphB4抗體。
向30只無(wú)胸腺裸鼠BALB/c(nu/nu)中每只注射1×106B16黑素瘤細(xì)胞，其中含有混入0.1ml基質(zhì)膠的0.1ml PBS，或注射重懸浮于200μl無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基內(nèi)的1.5×106SCC15細(xì)胞；于第0天在小鼠的右肩區(qū)域注入皮下。從第1天開(kāi)始，經(jīng)靜脈或腫瘤周圍皮下注射測(cè)試EphB4抗體，起始劑量為4μg/mg，每周及接種后2周時(shí)注射2μg/mg(10μg/g，50μg/kg/天)。于第14天處死小鼠。對(duì)照組小鼠每天接受PBS 50μl。
12)裸鼠中腫瘤形成所有動(dòng)物的處理都遵循由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)(institutional animalcare committees)通過(guò)的條款進(jìn)行。將癌細(xì)胞(5×106)皮下接種于裸鼠的背部皮膚。當(dāng)腫瘤生長(zhǎng)到約100mm3大小時(shí)(通常需要12天)，每日腹膜內(nèi)或皮下注射測(cè)試EphB4抗體一次，并監(jiān)測(cè)腫瘤生成2周。根據(jù)公式a2×b計(jì)算腫瘤的體積，其中a和b分別為最小和最大直徑。使用學(xué)生t檢驗(yàn)比較腫瘤體積，P＜0.05視為差異顯著。
13)微血管密度的定量用4％甲醛固定腫瘤，石蠟包埋，切成5μm切片，并用蘇木精伊紅染色。利用基于計(jì)算機(jī)的圖像分析工具對(duì)血管密度進(jìn)行半定量(每張切片5個(gè)視野，來(lái)自每組3只小鼠)。
引用參考此處提及的所有出版物及專利均在此處以其整體引用作為參考，就如同每一單個(gè)出版物和專利被單獨(dú)引用作為參考一樣。
盡管已經(jīng)探討了本發(fā)明的具體實(shí)施方案，上述說(shuō)明是說(shuō)明性而不是限制性的。在回顧該詳述及以下權(quán)利要求書后，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)的是，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行多種改變。本發(fā)明的全部范圍如權(quán)利要求書所確定，包括其完整范圍內(nèi)的等同物、說(shuō)明書以及此類改變。
權(quán)利要求
1.分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，所述抗體或其抗原結(jié)合部分可結(jié)合EphB4胞外部分的表位相并抑制EphB4活性。
2.權(quán)利要求1的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合位于圖1的EphB4序列中氨基酸16-198的表位。
3.權(quán)利要求2的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分抑制EphB4與肝配蛋白B2胞外部分的結(jié)合。
4.權(quán)利要求1的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合位于圖1的EphB4序列中氨基酸324-429或430-537的表位。
5.權(quán)利要求4的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分抑制EphB4二聚體或多聚體的形成。
6.權(quán)利要求3的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合EphB4的第一纖連蛋白樣結(jié)構(gòu)域(FND1)。
7.權(quán)利要求3的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合EphB4的第二纖連蛋白樣結(jié)構(gòu)域(FND2)。
8.權(quán)利要求1的分離抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分抑制肝配蛋白B2刺激的EphB4自磷酸化。
9.權(quán)利要求1的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分抑制培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞形成脈管。
10.權(quán)利要求1的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分抑制體內(nèi)組織的血管形成。
11.權(quán)利要求10的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分抑制植入動(dòng)物角膜的組織的血管形成。
12.權(quán)利要求10的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分抑制植入動(dòng)物體內(nèi)的基質(zhì)膠組織栓的血管形成。
13.權(quán)利要求1的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分減少小鼠中人腫瘤異種移植物的生長(zhǎng)。
14.權(quán)利要求2的分離的抗體，其中所述抗體選自此處以No.001、No.023、No.035和No.079表示的抗體。
15.權(quán)利要求2的分離的抗體，其中所述抗體為選自此處以No.001、No.023、No.035和No.079表示抗體的人源化形式。
1 6.權(quán)利要求2的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分含有至少一個(gè)選自此處以No.001、No.023、No.035和No.079表示抗體的CDR部分。
17.權(quán)利要求4的分離的抗體，其中所述抗體選自此處以No.047、No.057、No.85H、No.098和No.138表示的抗體。
18.權(quán)利要求4的分離的抗體，其中所述抗體為選自此處以No.001、No.023、No.035和No.079表示抗體的人源化形式。
19.權(quán)利要求4的分離抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分含有至少一個(gè)選自此處以No.001、No.023、No.035和No.079表示抗體的CDR部分。
20.權(quán)利要求1的抗體，其中抗體為單克隆抗體。
21.權(quán)利要求20的抗體，其中的單克隆抗體可臨床施用于人。
22.產(chǎn)生權(quán)利要求1抗體的雜交瘤。
23.可產(chǎn)生此處以No.001、No.023、No.035、No.079、No.047、No.057、No.85H、No.098和No.138表示的抗體的雜交瘤。
24.治療癌癥的方法，包括向所需患者施用有效量的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，所述抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合位于EphB4胞外部分的表位并抑制EphB4活性。
25.權(quán)利要求24的方法，其中的患者被診斷為患有選自結(jié)腸癌、乳腺腫瘤、間皮瘤、前列腺腫瘤、鱗狀細(xì)胞癌、卡波西肉瘤和白血病的癌癥。
26.權(quán)利要求24的方法，其中全身性施用分離的抗體或其抗原結(jié)合部分。
27.權(quán)利要求24的方法，其中局部施用分離的抗體或其抗原結(jié)合部分。
28.抑制患者血管發(fā)生的方法，包括向所需患者施用有效量的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，所述抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合位于EphB4胞外部分的表位并抑制EphB4活性。
29.權(quán)利要求28的方法，其中患者被診斷為黃斑變性。
30.含有權(quán)利要求1的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分的藥物制品。
31.權(quán)利要求1的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分在制造治療癌癥的藥物制品中的用途。
32.權(quán)利要求31的用途，其中癌癥選自結(jié)腸癌、乳腺腫瘤、間皮瘤、前列腺腫瘤、鱗狀細(xì)胞癌、卡波西肉瘤和白血病。
33.分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其結(jié)合圖1 EphB4序列中氨基酸324-429或430-537的表位并刺激EphB4激酶活性。
34.權(quán)利要求33的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體結(jié)合EphB4的第一纖連蛋白樣結(jié)構(gòu)域(FND1)。
35.權(quán)利要求34的分離的抗體，其中所述抗體結(jié)合EphB4的第二纖連蛋白樣結(jié)構(gòu)域(FND2)。
36.權(quán)利要求33的分離的抗體，其中所述抗體選自此處以No.85L、No.091、No.121和No.131表示的抗體。
37.權(quán)利要求33的分離的抗體，其中所述抗體為選自此處以No.85L、No.091、No.121和No.131表示抗體的人源化形式。
38.權(quán)利要求33的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分含有至少一個(gè)選自此處以No.85L、No.091、No.121和No.131表示抗體的CDR部分。
39.權(quán)利要求33的抗體，其中的單克隆抗體可臨床施用于人。
40.產(chǎn)生權(quán)利要求33的抗體的雜交瘤。
41.可產(chǎn)生以No.001、No.023、No.035、No.079、No.047、No.057、No.85H、No.098和No.138表示的抗體的雜交瘤。
42.治療癌癥的方法，包括向所需患者施用有效量的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，所述抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合位于EphB4胞外部分的表位并刺激EphB4激酶活性。
43.權(quán)利要求42的方法，其中的患者被診斷為患有選自結(jié)腸癌、乳腺腫瘤、間皮瘤、前列腺腫瘤、鱗狀細(xì)胞癌、卡波西肉瘤和白血病的癌癥。
44.權(quán)利要求42的方法，其中全身性施用分離的抗體或其抗原結(jié)合部分。
45.如權(quán)利要求42的方法，其中局部施用分離的抗體或其抗原結(jié)合部分。
46.抑制患者血管發(fā)生的方法，包括向所需患者施用有效劑量的分離抗體或其抗原結(jié)合部分，所述抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合位于EphB4胞外部分的表位相結(jié)合并刺激EphB4激酶活性。
47.權(quán)利要求46的方法，其中患者被診斷為黃斑變性。
48.含有權(quán)利要求33的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分的藥物制品。
49.權(quán)利要求33的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分在制造治療癌癥的藥物制品中的用途。
50.權(quán)利要求49的用途，其中癌癥選自結(jié)腸癌、乳腺腫瘤、間皮瘤、前列腺腫瘤、鱗狀細(xì)胞癌、卡波西肉瘤和白血病。
51.可特異結(jié)合EphB4胞外部分表位的抗體，其中該抗體選自編號(hào)為1、23、35、47、57、79、85L、85H、91、98、121、131和138的抗體。
52.權(quán)利要求1或權(quán)利要求33的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分共價(jià)連接于額外的功能部分。
53.權(quán)利要求52的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中額外的功能部分為標(biāo)記。
54.權(quán)利要求53的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中的標(biāo)記為適于用選自熒光檢測(cè)法、正電子成像術(shù)檢測(cè)法以及核磁共振檢測(cè)法的方法檢測(cè)的標(biāo)記。
55.權(quán)利要求53的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中的標(biāo)記選自熒光標(biāo)記、放射活性標(biāo)記以及具有特征性核磁共振信號(hào)的標(biāo)記。
56.權(quán)利要求52的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中的額外的功能部分能夠提高抗體或其抗原結(jié)合部分的血清半衰期。
57.權(quán)利要求56的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中額外的功能部分包括聚乙二醇(PEG)部分。
58.權(quán)利要求1或權(quán)利要求33的分離抗體，其中所述分離的抗體由具有選自ATCC保藏識(shí)別號(hào)PTA-6208、PTA-6209、PTA-6210、PTA-6211和PTA-6214的宿主細(xì)胞表達(dá)。
59.具有選自ATCC保藏識(shí)別號(hào)PTA-6208、PTA-6209、PTA-6210、PTA-6211和PTA-6214的宿主細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供了多肽組合物(如可與EphB4結(jié)合的抗體及其抗原結(jié)合部分)，以及抑制EphB4活性的方法。本發(fā)明的另一些實(shí)施方案則提供了治療腫瘤或治療血管發(fā)生相關(guān)疾病的方法和組合物。
文檔編號(hào)C07K16/30GK101072797SQ200580015376
公開(kāi)日2007年11月14日 申請(qǐng)日期2005年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月12日
發(fā)明者V·卡拉斯諾佩洛夫, S·佐祖爾亞, N·科爾苔茲, R·雷迪, P·吉爾 申請(qǐng)人:瓦斯基因治療公司