用于調(diào)節(jié)β-連環(huán)蛋白表達(dá)的化合物及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及寡聚化合物(寡聚物)，其靶向細(xì)胞中的β-連環(huán)蛋白mRNA，并降低β-連環(huán)蛋白的表達(dá)。降低減少β-連環(huán)蛋白的表達(dá)，有利于一系列醫(yī)學(xué)病癥，包括高增生性病癥，如癌癥。本發(fā)明提供了包含所述寡聚物的治療性組合物，以及用所述寡聚物調(diào)節(jié)β-連環(huán)蛋白表達(dá)的方法，包括治療過(guò)度增生性病癥，包括癌癥如多發(fā)性骨髓瘤的方法。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于調(diào)節(jié)β-連環(huán)蛋白表達(dá)的化合物及其應(yīng)用 相關(guān)申請(qǐng)案的交互參照
[0001] 本申請(qǐng)要求申請(qǐng)日為2011年11月11日的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 61/558, 870的 優(yōu)先權(quán)；所述美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 61/558 870與申請(qǐng)日為2011年9月14日的美國(guó)申請(qǐng) No. 13/232, 123相關(guān)；所述美國(guó)申請(qǐng)No. 13/232, 123是申請(qǐng)日為2010年9月2日的美 國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No. 12/874, 668 (現(xiàn)為美國(guó)專(zhuān)利8039446)的分案申請(qǐng)；所述美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng) No. 12/874,668是申請(qǐng)日為2009年1月21日的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No. 12/356 923 (現(xiàn)為美 國(guó)專(zhuān)利7915401)的分案申請(qǐng)；所述美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No. 12/356 923是申請(qǐng)日為2008年4 月30日的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No. 12/113, 031(現(xiàn)已放棄）的后續(xù)申請(qǐng)；所述美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng) No. 12/113,031要求了申請(qǐng)日為2008年1月24日的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 61/023, 244和申請(qǐng) 日為2007年5月1日的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)N〇.60/915,371的優(yōu)先權(quán)。所述各申請(qǐng)案以其全部 公開(kāi)內(nèi)容引入本文作為參考。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及用于靶向細(xì)胞中β -連環(huán)蛋白mRNA的寡聚化合物（寡聚 物，oligomer),目的是降低β -連環(huán)蛋白的表達(dá)。降低β -連環(huán)蛋白的表達(dá),有利于一系列 醫(yī)學(xué)病癥的改善，如過(guò)度增生性疾病，包括癌癥。本發(fā)明提供了包含寡聚物的治療性藥物組 合物，以及用所述寡聚物調(diào)節(jié)β -連環(huán)蛋白表達(dá)的方法，包括治療方法。

【背景技術(shù)】
[0003] β -連環(huán)蛋白（beta-catenin，也稱(chēng)為|丐粘素相關(guān)蛋白和β -聯(lián)蛋白）是細(xì)胞質(zhì)蛋 白中連環(huán)蛋白家族的成員，在由fct蛋白啟動(dòng)的信號(hào)通路中是關(guān)鍵物質(zhì)，在多個(gè)發(fā)育過(guò)程 中起到介導(dǎo)作用。受到生長(zhǎng)因子影響時(shí)，β_連環(huán)蛋白會(huì)發(fā)生磷酰化反應(yīng)，從而降低細(xì)胞黏 附。
[0004] 業(yè)已證明，在癌癥的發(fā)展中，β-連環(huán)蛋白所起的作用，受APC(腺瘤性結(jié)腸息肉 ?。┗虮磉_(dá)產(chǎn)物的調(diào)節(jié)，APC腫瘤抑制蛋白與β-連環(huán)蛋白結(jié)合，而β-連環(huán)蛋白與Tcf和 Lef 轉(zhuǎn)錄因子相互作用。Morin 等（Morin 等，Science，1997, 275,1787-1790)報(bào)導(dǎo)，在 β-連 環(huán)蛋白和Tcf-4的介導(dǎo)作用下，APC蛋白會(huì)降低結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)錄活化，其結(jié)果表明，β-連環(huán)蛋 白的調(diào)節(jié)對(duì)APC腫瘤抑制效果起關(guān)鍵作用，而通過(guò)APC或β -連環(huán)蛋白的突變可規(guī)避這種 調(diào)節(jié)。
[0005] Morin等的研究結(jié)果表明，β -連環(huán)蛋白突變影響了磷?；奈恢茫瑥亩沟眉?xì)胞 對(duì)由APC介導(dǎo)的β-連環(huán)蛋白向下調(diào)節(jié)作用不敏感，該機(jī)理是結(jié)腸腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵（Morin 等，Science,1997, 275,1787-1790)。
[0006] -些研究對(duì)多種腫瘤細(xì)胞系中β-連環(huán)蛋白的突變進(jìn)行了檢測(cè)，在黑色素瘤細(xì)胞 系中發(fā)現(xiàn)了極大數(shù)量的β_連環(huán)蛋白。
[0007] Bennett等的美國(guó)專(zhuān)利6066500給出了多種反義化合物/組合物，以及調(diào)節(jié)β-連 環(huán)蛋白表達(dá)的方法。
[0008] 考慮到β_連環(huán)蛋白在癌癥發(fā)展中所起的作用，需要研發(fā)能夠有效抑制β_連環(huán) 蛋白功能的試劑。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明提供一種具有10-50個(gè)連續(xù)相鄰單體的寡聚物，其序列至少有80%與編碼 哺乳動(dòng)物β-連環(huán)蛋白的核酸靶區(qū)段的序列反向互補(bǔ)。
[0010] 本發(fā)明提供一種具有10-50個(gè)連續(xù)相鄰單體的寡聚物，包括第一區(qū)段，所述第一 區(qū)段的序列至少有80%與SEQ ID NO :173靶區(qū)段的反向互補(bǔ)序列相同，或至少有80%與選 自于SEQIDN0s:l-132、SEQIDN0s :174-192、SEQIDN0:193中的任一靶區(qū)段的序列相 同。
[0011] 本發(fā)明進(jìn)一步提供一種具有所述寡聚物配體的結(jié)合物，其中，所述寡聚物通過(guò)共 價(jià)鍵連接到一個(gè)或多個(gè)其本身不是核酸或單體的配體（結(jié)合物配體）。在一些方案中，所述 結(jié)合物配體中含有一個(gè)固醇基團(tuán)如膽固醇，或其它易于進(jìn)入細(xì)胞的配體，或由它們組成。
[0012] 本發(fā)明提供了一種具有所述寡聚物配體的結(jié)合物，其中，所述寡聚物通過(guò)共價(jià)鍵 連接到一個(gè)具有帶正電荷配體的聚合物，如聚乙烯醇（PEG)，即可選地，將寡聚物進(jìn)行聚乙 烯醇化。
[0013] 本發(fā)明提供了多種藥物組合物，包含本發(fā)明中所述寡聚物或所述結(jié)合物，以及藥 學(xué)上可接受的稀釋劑，載體，鹽或佐劑。
[0014] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種醫(yī)藥用的寡聚物或結(jié)合物。
[0015] 本發(fā)明還提供了本發(fā)明寡聚物或結(jié)合物在藥物制備中的應(yīng)用，所述藥物用于治療 本文所提及的一種或多種疾病，包括過(guò)度增生性疾病，如癌癥。
[0016] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種用于本文所提及的一種或多種疾病如癌癥治療的寡聚 物或結(jié)合物。
[0017] 本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明寡聚物或結(jié)合物的具有醫(yī)藥應(yīng)用和其它應(yīng)用的組合 物。還提供了使用有效劑量的一種或多種本發(fā)明寡聚物、結(jié)合物或組合物，降低體外或體內(nèi) 細(xì)胞或組織中β -連環(huán)蛋白表達(dá)的方法，還包括接觸過(guò)所述細(xì)胞或組織的細(xì)胞或組織。
[0018] 還公開(kāi)了一種治療疑似患有或易患有與β-連環(huán)蛋白表達(dá)或過(guò)表達(dá)有關(guān)的疾病 或癥狀的動(dòng)物的方法，比如哺乳動(dòng)物，如人，通過(guò)給所述動(dòng)物或人施以治療或預(yù)防所需的有 效劑量的一種或多種本發(fā)明寡聚物、結(jié)合物或組合物。
[0019] 此外，還提供了使用寡聚物抑制β-連環(huán)蛋白表達(dá)的方法，以及治療與β-連環(huán)蛋 白活性相關(guān)的疾病的方法。
[0020] 本發(fā)明一個(gè)方案提供了治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物如人的漿細(xì)胞癌癥的方法，比如骨髓 瘤，如多發(fā)性骨髓瘤，該方法包括給所述哺乳動(dòng)物施用有效劑量的本文所述寡聚物或結(jié)合 物，用以有效降低β -連環(huán)蛋白的表達(dá)，比如選用含以下序列之一的一種寡聚物或結(jié)合物： 5'-MeCsMeCsAst scststsgstsg sastscsMeCsA sT-3'（SEQ ID Ν0:168);以及 5'-GsTsGststsc stsascsascsc sasTsTsA_3'（SEQ ID Ν0:171)， 其中，大寫(xiě)字母表示β -D-氧-LNA單體，小寫(xiě)字母表示DNA單體，下標(biāo)"s"表示一個(gè)硫 磷酰連結(jié)，表示含有一個(gè)5-甲基胞嘧啶堿基的β -D-氧-LNA單體。
[0021] 本發(fā)明的一個(gè)相關(guān)方案提供了本文所述寡聚物或結(jié)合物在制備可有效降低 β -連環(huán)蛋白表達(dá)的藥物中的應(yīng)用，比如選用含以下序列之一的一種寡聚物或結(jié)合物： 5'-MeCsMeCsAst scststsgstsg sastscsMeCsA sT-3'（SEQ ID Ν0:168);以及 5'-GsTsGstst scstsascsasc scsasTsTsA_3'（SEQ ID Ν0:171)， 其中，大寫(xiě)字母表示β -D-氧-LNA單體，小寫(xiě)字母表示DNA單體，下標(biāo)"s"表示一個(gè)硫 磷酰連結(jié)表示含有一個(gè)5-甲基胞嘧啶堿基的β-D-氧-LNA單體。該藥物用于哺乳動(dòng) 物如人的漿細(xì)胞癌的治療或預(yù)防，包括骨髓瘤，如多發(fā)性骨髓瘤。
[0022] 進(jìn)一步的相關(guān)方案提供了一種治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物如人的漿細(xì)胞癌的藥物組 合物，比如骨髓瘤，如多發(fā)性骨髓瘤，其中所述藥物組合物含有本發(fā)明所述可有效地降低 β -連環(huán)蛋白表達(dá)的寡聚物或結(jié)合物，比如選用含以下序列之一的一種寡聚物或結(jié)合物： 5'-MeCsMeCsAst scststsgstsg sastscsMeCsA sT-3'（SEQ ID Ν0:168);以及 5'-GsTsGststsc stsascsascsc sasTsTsA_3'（SEQ ID Ν0:171)， 其中，大寫(xiě)字母表示β -D-氧-LNA單體，小寫(xiě)字母表示DNA單體，下標(biāo)"s"表示一個(gè)硫 磷酰連結(jié)表示含有一個(gè)5-甲基胞嘧啶堿基的β-D-氧-LNA單體。該藥物用于哺乳動(dòng) 物如人的漿細(xì)胞癌的治療或預(yù)防，比如骨髓瘤，如多發(fā)性骨髓瘤。該藥物組合物可任選地進(jìn) 一步包括藥學(xué)上可接受的一種或多種賦形劑。
[0023] 本發(fā)明提供了抑制或降低細(xì)胞或組織中β_連環(huán)蛋白表達(dá)的方法，包括將所述細(xì) 胞或組織與有效劑量的寡聚物、結(jié)合物或藥物組合物接觸的步驟，以抑制或降低β -連環(huán) 蛋白的表達(dá)。
[0024] 本發(fā)明提供了用于觸發(fā)細(xì)胞如癌細(xì)胞凋亡的方法，包括使所述細(xì)胞或組織與有效 劑量本發(fā)明寡聚物、結(jié)合物或藥物組合物接觸的步驟，以抑制或降低β_連環(huán)蛋白的表達(dá)， 和/或觸發(fā)細(xì)胞凋亡。
[0025] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種寡聚物，具有連續(xù)相鄰的共價(jià)連接的單體或由這些單體 組成，所述寡聚物包括第一區(qū)段，所述第一區(qū)段的序列中至少有80%與選自于SEQ ID NOs: 1-132、SEQ ID NOs :174-193中的任一靶區(qū)段的序列相同。在一些方案中，選用了包含SEQ ID NOs :189,192,58 和 103。
[0026] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種寡聚物，包括第一區(qū)段或由其組成，所述第一區(qū)段的序 列與 SEQ ID NOs :174-193 區(qū)段相同，如 SEQ ID NOs : 189 或 192 區(qū)段。
[0027] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種寡聚物，包含與SEQ ID NOs :133-174完全相同的的序列 或由其組成，如與SEQ ID NO :168或171序列完全相同。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0028] 圖1 :寡聚物靶向的β-連環(huán)蛋白序列，具有SEQ ID NOs :1，16，17，18,33,34,49， 50, 51，52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 73,88,103和118,分別以粗體顯示并具有下劃線，標(biāo)明了 其在β-連環(huán)蛋白的譜圖（GenBank登錄號(hào)NM_001904-SEQ ID N0:173)中的位置。
[0029] 圖2 :SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染24小時(shí)后標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH的β -連環(huán)蛋白表達(dá)。
[0030] 圖3:用1和5 ηΜ濃度寡聚核苷酸轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞中，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法 (Western blot法）檢測(cè)的β-連環(huán)蛋白的蛋白含量，用微管蛋白染色作為上樣對(duì)照，用SEQ ID Ν0 :194作為加擾對(duì)照寡聚核苷酸。
[0031] 圖4:轉(zhuǎn)染25 ηΜ濃度寡聚核苷酸的HCT116細(xì)胞中，利用MTS法測(cè)得的轉(zhuǎn)染后不 同時(shí)間點(diǎn)0D490細(xì)胞增殖。以模擬轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和轉(zhuǎn)染SEQID NO :194的細(xì)胞作為對(duì)照（加 擾對(duì)照）。
[0032] 圖5 :用3X25mg/kg劑量的寡聚核苷酸靜脈滴注處理后，QPCR法測(cè)定的小鼠肝臟 中β -連環(huán)蛋白mRNA表達(dá)，相對(duì)于生理鹽水處理對(duì)照。β -連環(huán)蛋白表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH， 相對(duì)于生理鹽水處理對(duì)照繪制結(jié)果。
[0033] 圖6 :登錄號(hào)為NM_001904. 3(SEQ ID NO :195)的人β -連環(huán)蛋白mRNA的核苷酸 序列。
[0034] 圖7 :未轉(zhuǎn)染（gymnotically)時(shí)，有些多發(fā)性骨髓瘤（MM)細(xì)胞系對(duì)β -連環(huán)蛋白 反義LNA寡聚物ΕΖΝ-3892敏感。
[0035] 圖8 :在多種多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系中，ΕΖΝ-3892降低了 β -連環(huán)蛋白mRNA和蛋白 的水平。
[0036] 圖9 :EZN-3892強(qiáng)勁抑制體內(nèi)0PM-2多發(fā)性骨髓移植瘤的生長(zhǎng)。
[0037] 圖10 :小鼠肝臟、腫瘤和腫瘤基質(zhì)中，EZN-3892對(duì)β -連環(huán)蛋白mRNA的降低作用 是顯而易見(jiàn)的。
[0038] 圖11 :0PM-2腫瘤的H&E評(píng)估表明，EZN-3892處理后，0PM-2腫瘤的腫瘤細(xì)胞大量 死亡。
[0039] 圖12 :在2-D增殖試驗(yàn)中，對(duì)EZN-3892不敏感的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系，沒(méi)有顯示 出體內(nèi)抗腫瘤作用。

【具體實(shí)施方式】 寡聚物
[0040] 在第一方面，本發(fā)明提供的寡聚化合物（本文稱(chēng)為寡聚物）可用于，例如，調(diào)節(jié)編 碼哺乳動(dòng)物β-連環(huán)蛋白的核酸分子的功能，如SEQ ID NO :173所示的β-連環(huán)蛋白核酸， 和天然存在的編碼哺乳動(dòng)物β_連環(huán)蛋白的這類(lèi)核酸分子的等位基因變體。本發(fā)明寡聚物 由共價(jià)連接的單體構(gòu)成。
[0041] 術(shù)語(yǔ)"單體"包括核苷、脫氧核苷（統(tǒng)稱(chēng)二者為"核苷"）以及"核苷類(lèi)似物"。所 述核苷天然存在于核酸中，不包含任何經(jīng)改性的糖或經(jīng)改性的核堿基，即其中的核糖或脫 氧核糖共價(jià)結(jié)合到天然存在的、未經(jīng)改性的核堿基（堿基）配體（即，嘌呤和嘧啶雜環(huán)腺嘌 呤，鳥(niǎo)嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶或尿嘧啶）上。所述"核苷類(lèi)似物"，是天然或非天然存在于核 酸中的核苷，其糖基不是核糖或脫氧核糖（如雙環(huán)糖或2'位改性的糖，如2'位取代的糖）， 或核堿基配體經(jīng)過(guò)了改性（例如，5-甲基胞嘧啶），或這兩種情況者兼而有之。
[0042] "RNA單體"為包含一個(gè)核糖和一個(gè)未改性的核堿基的核苷。
[0043] "DNA單體"為包含一個(gè)脫氧核糖和一個(gè)未改性的核堿基的核苷。
[0044] "鎖核酸單體"，"鎖單體"或"LNA單體"為如下文進(jìn)一步描述的具有雙環(huán)糖的核苷 類(lèi)似物。
[0045] "相應(yīng)核苷類(lèi)似物"和"相應(yīng)核苷"中，核苷類(lèi)似物的堿基部分和核苷的堿基部分是 相同的。例如，包含一個(gè)連接腺嘌呤的2-脫氧核糖的"核苷"，其"相應(yīng)核苷類(lèi)似物"包含， 例如，一個(gè)連接腺嘌呤堿基的經(jīng)改性的糖。
[0046] 在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)"寡聚物"，"寡聚化合物"和"寡聚核苷酸"可互換使用， 指由兩個(gè)或多個(gè)連續(xù)相鄰單體通過(guò)共價(jià)連接形成的分子，所述共價(jià)連接包括磷酸基（形成 核苷之間的磷酸二酯連接）或硫代磷酸基（形成核苷之間的硫代磷酸酯連接）。該寡聚物 包含10-50單體或由其組成。
[0047] 在一些方案中，寡聚物包含如本發(fā)明所述的核苷，或核苷類(lèi)似物，或其混合物。 "LNA寡聚物"或"LNA寡聚核苷酸"指包含一個(gè)或多個(gè)LNA單體的寡聚核苷酸。
[0048] 寡聚物中可包含的核苷類(lèi)似物，可具有與所相應(yīng)的核苷相似的功能，或具有特定 的更好的功能。通常優(yōu)選部分單體或全部單體為核苷類(lèi)似物的寡聚物，因?yàn)檫@樣的寡聚物 具有幾種較好的性質(zhì)，如穿透細(xì)胞膜的能力，對(duì)細(xì)胞外和/或細(xì)胞內(nèi)核酸酶良好的抗性，對(duì) 核酸靶的高親和力及高定向性。特別優(yōu)選LNA單體，可使寡聚物具有如上所述的多種優(yōu)良 性質(zhì)。
[0049] 在多個(gè)方案中，寡聚物中所包含的一種或多種核苷類(lèi)似物，和相應(yīng)的天然核苷在 功能上"沒(méi)有區(qū)別"或"等效"，即對(duì)寡聚物抑制靶基因表達(dá)的效果沒(méi)有影響。這種"等效" 的核苷類(lèi)似物然而是有用的，例如，它們更容易或更便宜地制造，或者在儲(chǔ)存或生產(chǎn)條件下 更穩(wěn)定，或能夠加上標(biāo)記。但通常，該類(lèi)似物會(huì)對(duì)寡聚物抑制表達(dá)的效果起到促進(jìn)作用，例 如通過(guò)提高與靶向核酸靶區(qū)段的結(jié)合親和力，和/或增加對(duì)細(xì)胞內(nèi)核酸酶的抗性，和/或易 進(jìn)入細(xì)胞中。
[0050] 因此，在多個(gè)方案中，根據(jù)本發(fā)明寡聚物包括核苷單體和至少一個(gè)核苷類(lèi)似物單 體，如LNA單體，或其它核苷類(lèi)似物單體。
[0051] 術(shù)語(yǔ)"至少一個(gè)"包括大于或等于1的整數(shù)，如1，2, 3,4, 5,6, 7,8,9,10,11，12,13， 14,15,16,17,18,19, 20等。在多個(gè)方案中，比如提到本發(fā)明化合物的核酸或蛋白質(zhì)靶時(shí)，術(shù) 語(yǔ)"至少一個(gè)"包括術(shù)語(yǔ)"至少兩個(gè)"、"至少三個(gè)"和"至少四個(gè)"；同樣地，術(shù)語(yǔ)"至少兩個(gè)" 可包括術(shù)語(yǔ)"至少三個(gè)"和"至少四個(gè)"。
[0052] 在多個(gè)方案中，所述寡聚物包含10-50個(gè)單體，優(yōu)選10-25個(gè)單體，更優(yōu)選10-16 個(gè)單體，甚至更優(yōu)選12-16的單體。
[0053] 在多個(gè)方案中，本發(fā)明寡聚物不包含RNA單體。
[0054] 用于指本發(fā)明寡聚物時(shí)，術(shù)語(yǔ)"區(qū)段"指寡聚物中的多個(gè)連續(xù)相鄰單體，"區(qū)段"中 單體的個(gè)數(shù)小于寡聚物中的單體總數(shù)。
[0055] 優(yōu)選地，本發(fā)明寡聚物是直鏈分子，或是合成的直鏈。在有些方案中，寡聚物是一 個(gè)單鏈分子，通常不包含這種短區(qū)段：該短區(qū)段如至少含3,個(gè)或5個(gè)連續(xù)相鄰單體但又和 寡聚物內(nèi)的其它區(qū)段互補(bǔ)，并在寡聚物形成了一個(gè)內(nèi)復(fù)式結(jié)構(gòu)。在多個(gè)方案中，該寡聚物基 本上不是雙鏈結(jié)構(gòu)的，即不是siRNA。
[0056] 在一些方案中，本發(fā)明寡聚物由多個(gè)單體連續(xù)相鄰伸展構(gòu)成，其序列與本文所公 開(kāi)的某一個(gè)具體序列號(hào)相同（參見(jiàn)，如表1-4)。在其它方案中，該寡聚物包含由多個(gè)單體連 續(xù)相鄰延伸構(gòu)成的第一區(qū)段，以及包含至少一種其它單體的一個(gè)或多個(gè)其它區(qū)段。在一些 方案中，第一區(qū)段的序列與本文所公開(kāi)的某一個(gè)序列號(hào)相同。 靶核酸
[0057] 術(shù)語(yǔ)"核酸"和"多核苷酸"在本發(fā)明中可互換使用，定義為兩個(gè)或兩個(gè)以上的單 體共價(jià)連接形成的分子，如上文所述。包括2個(gè)以上的單體，"核酸"可以是任意長(zhǎng)度，一般 是指具有本文所述長(zhǎng)度的"寡聚物"。術(shù)語(yǔ)"核酸"和"多核苷酸"包括單鏈，雙鏈結(jié)構(gòu)，部分 雙鏈結(jié)構(gòu)，和環(huán)狀分子。
[0058] 術(shù)語(yǔ)"靶核酸"，如本發(fā)明所用，指的是編碼哺乳動(dòng)物β -連環(huán)蛋白多肽的核酸（如 0嫩），如人的@-連環(huán)蛋白（如登錄號(hào)為乂 89579489593，乂89592489591，乂89588489585， Χ89584和Χ89578的人類(lèi)基因外顯子），或哺乳動(dòng)物β-連環(huán)蛋白的mRNA，如SEQ ID Ν0: 173。其它哺乳動(dòng)物β-連環(huán)蛋白mRNA的實(shí)例包括，但不限于，那些具有登錄號(hào) NM_001098203, NM_0010987210(人 β-連環(huán)蛋白 mRNA) ;NM_007614(小鼠 β-連環(huán)蛋 白 mRNA) ;ΝΜ_053357(大鼠 β-連環(huán)蛋白 mRNA) ;NM-001122762，DQ267491(馬 β-連環(huán)蛋白 mRNA) ;ΝΜ_214367(豬 β-連環(huán)蛋白 mRNA) ;BC119949, ΒΤ030683(牛 β-連環(huán)蛋白 mRNA)。 "靶核酸"還包括編碼β -連環(huán)蛋白的核酸或天然存在的變體，以及由此衍生的RNA核酸，優(yōu) 選mRNA，如mRNA前體，盡管優(yōu)選成熟的mRNA。在多個(gè)方案中，例如在研究或診斷中使用時(shí)， 該"靶核酸"可為cDNA或從上述DNA或RNA核酸靶衍生的合成寡聚核苷酸。本發(fā)明優(yōu)選能 夠雜交到靶核酸的寡聚物。
[0059] 術(shù)語(yǔ)"天然存在的變種"是指所定義的分類(lèi)群中天然存在的β-連環(huán)蛋白多肽或 核酸序列的變體，所述分類(lèi)群如哺乳動(dòng)物，如小鼠，猴，優(yōu)選人。通常情況下，多核苷酸"天然 存在的變種"還可以指編碼β -連環(huán)蛋白的基因組DNA，以及RNA和由其所衍生出mRNA的 任何等位基因變異，所述編碼β -連環(huán)蛋白的基因組DNA存在于染色體易位或復(fù)制時(shí)的染 色體CHR3 :41. 22-41. 26 MB之中。當(dāng)用于說(shuō)明一個(gè)特定的多肽序列時(shí)，該術(shù)語(yǔ)還包括天然 存在的蛋白形態(tài)，所述蛋白可通過(guò)翻譯改性或翻譯后改性等方法進(jìn)行處理，如信號(hào)肽切割， 蛋白水解切割，糖基化等。
[0060] 本發(fā)明寡聚物，通過(guò)在寡聚物單體和靶核酸單體間形成的沃森-克里克 (Watson-Crick)堿基配對(duì)，或Hoogsteen氫鍵鍵合，或反向Hoogsteen氫鍵鍵合，結(jié)合至 靶核酸的一個(gè)區(qū)段（"靶區(qū)段"）上。除非另有說(shuō)明，本發(fā)明中所述結(jié)合是通過(guò)互補(bǔ)堿基的 Watson-Crick配對(duì)，并且寡聚物結(jié)合靶核酸是因?yàn)楣丫畚锏男蛄械韧?，或部分等同于?區(qū)段的反向互補(bǔ)序列；為本發(fā)明目的考慮，該寡聚物被描述成是"互補(bǔ)"或"部分互補(bǔ)"于靶 區(qū)段的，且寡聚物序列相對(duì)于靶區(qū)段的"互補(bǔ)"百分比是靶區(qū)段反向互補(bǔ)序列相同部分的百 分比。
[0061] 除非另有上下文清楚說(shuō)明，"靶區(qū)段"是指，用下文所述的匹配程序和參數(shù)進(jìn)行匹 配時(shí)，具有與所指明寡聚物（或其部分區(qū)段）序列的反向互補(bǔ)序列最為匹配一致的靶區(qū)段。
[0062] 在確定本發(fā)明寡聚物（或其部分區(qū)段）和如本文公開(kāi)的那些編碼哺乳動(dòng)物的 連環(huán)蛋白核酸的靶區(qū)段間"互補(bǔ)性"的程度時(shí)，"互補(bǔ)性"的程度（也稱(chēng)"同源性"）表示 為寡聚物（或其部分區(qū)段）的序列和所述靶區(qū)段在最為匹配一致時(shí)的反向互補(bǔ)序列之間的 相同部分百分比。該百分比是這兩個(gè)匹配一致序列間相同堿基的數(shù)量，除以寡聚物中連續(xù) 相鄰單體的總數(shù)，并乘以100計(jì)算出的。在進(jìn)行本發(fā)明寡聚物和靶區(qū)段間的序列比較時(shí)，如 果存在間隙，優(yōu)選那些僅是因?yàn)椴黄ヅ涠纬傻拈g隙，而不是那些因間隙內(nèi)單體的數(shù)量不 同而形成的間隙。
[0063] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，氨基酸和多核苷酸的匹配，相同序列的百分比，以及互補(bǔ)的程度， 可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置的ClustalW算法確定。具體方法包括，EMBOSS:水（當(dāng)?shù)兀喝笨诖蜷_(kāi) =10.0,缺口延伸=0. 5,使用BL0SUM 62(蛋白質(zhì)）或DNAfull核苷酸/核苷堿基序列。 (Method:EMBOSS::water (local):Gap Open = 10. 0, Gap extend = 0. 5, using Blosum 62 (protein), or DNAfull for nucleotide/nucleobase sequences.)
[0064] 正如將要理解的，根據(jù)上下文，"不匹配"是指序列間的非一致性（例如，一個(gè)寡聚 物的核堿基序列和與之結(jié)合的靶區(qū)段的反向互補(bǔ)序列之間的非一致性；再例如，兩個(gè)對(duì)齊 的編碼β_連環(huán)蛋白的核酸的堿基序列之間的非一致性），或者是指序列間的非互補(bǔ)性（例 如，寡聚物和與之結(jié)合的靶區(qū)段之間的非互補(bǔ)性）。
[0065] 合適地，該寡聚物（或結(jié)合物，如下文進(jìn)一步所述）能夠抑制（例如，通過(guò)降低） 連環(huán)蛋白基因的表達(dá)。
[0066] 在多個(gè)方案中，本發(fā)明寡聚物抑制了 β-連環(huán)蛋白的mRNA表達(dá)，使其比正常表達(dá) 水平至少低10%，至少低20%，優(yōu)選比正常表達(dá)水平至少低30%，40%，50%，60%，70%， 80^,90%或95%。在多個(gè)方案中，本發(fā)明寡聚物抑制了 β-連環(huán)蛋白的蛋白表達(dá)，使其 比正常表達(dá)水平至少低10%，至少低20%，優(yōu)選比正常表達(dá)水平至少低30%，40%，50%， 60 %，70 %，80 %，90 %或95 %。在一些方案中，使用InM本發(fā)明寡聚物或結(jié)合物時(shí)即可觀察 到這種抑制。在多個(gè)方案中，使用25nM本發(fā)明寡聚物或結(jié)合物時(shí)皆可觀察到這種抑制。
[0067] 在多個(gè)方案中，對(duì)mRNA表達(dá)的抑制率低于100% (即低于表達(dá)的完全抑制），如抑 制率低于98 %，抑制率低于95 %，抑制率低于90 %，抑制率低于80 %，抑制率低于70 %。在 多個(gè)方案中，對(duì)蛋白表達(dá)的抑制低于100% (即低于表達(dá)的完全抑制），如抑制率低于98%， 抑制率低于95%，抑制率低于90%，抑制率低于80%，抑制率低于70%。
[0068] 通過(guò)測(cè)量蛋白水平可確定表達(dá)水平的調(diào)節(jié)（即，抑制或增加）程度，具體方法如先 用SDS-PAGE，再用針對(duì)祀蛋白的合適抗體的western blot法?；蛘咄ㄟ^(guò)測(cè)量mRNA表達(dá)來(lái) 確定表達(dá)水平的調(diào)節(jié)程度，具體方法如northern blot法或定量RT-PCR。當(dāng)通過(guò)mRNA水平 測(cè)量時(shí)，使用適當(dāng)劑量如1和25nM的抑制劑，相應(yīng)方案中的抑制水平通常是正常水平即不 使用本發(fā)明化合物時(shí)的10-20%。
[0069] 由此，本發(fā)明提供了一種抑制（如通過(guò)降低）存在β-連環(huán)蛋白和/或mRNA表達(dá) 的細(xì)胞中β -連環(huán)蛋白和/或mRNA表達(dá)的方法，該方法包括使所述細(xì)胞與足以有效抑制 (如降低）細(xì)胞中β_連環(huán)蛋白和/或mRNA表達(dá)的一定量的本發(fā)明寡聚物或結(jié)合物相接 觸。所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如人細(xì)胞。在某些方案中，所述接觸發(fā)生在活體外。在其它 方案中，所述接觸在活體內(nèi)進(jìn)行，通過(guò)將本發(fā)明的化合物或結(jié)合物施予哺乳動(dòng)物。
[0070] 本發(fā)明寡聚物通常能夠與人β -連環(huán)蛋白mRNA中的一個(gè)靶區(qū)段相結(jié)合，并且同樣 地，包含或由具有與如SEQ ID NO :173靶區(qū)段堿基序列相互補(bǔ)或部分互補(bǔ)的堿基序列。本 發(fā)明寡聚物的序列，和最佳排列的SEQ IDN0 :173靶區(qū)段的序列相比，可包含1，2,3,4個(gè)或 更多的堿基不匹配。
[0071] 在一些方案中，本發(fā)明寡聚物與表1中SEQ ID NOs :1-132所構(gòu)成群組中的某一序 列相同。在其它方案中，本發(fā)明寡聚物和SEQ ID NOs :1-132所構(gòu)成群組中的某一序列相比， 僅具有一個(gè)，兩個(gè)或三個(gè)不同的堿基。在一些方案中，寡聚物含有或包括10-16個(gè)連續(xù)相鄰 單體。由16個(gè)連續(xù)相鄰單體所構(gòu)成寡聚物的例子是SEQ ID N0s:l，16，17，18,33,34,49， 50, 51，52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 73,88,103和118。較短的序列可以由其衍生得到，例如，較 短寡聚物的序列可以存在于SEQ ID NOs :1-132的某一相同區(qū)段。更長(zhǎng)的寡聚物可以包含 一個(gè)含有10個(gè)以上連續(xù)相鄰單體的區(qū)段，所述區(qū)段與SEQ ID NOs :1-132中某一序列相同。

【權(quán)利要求】
1. 一種治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物骨髓瘤的方法，包括給所述哺乳動(dòng)物施用有效劑量的寡聚 物，所述寡聚物選自： 5，-MeCsMeCsAst scststsgstsg sastscsMeCsA sT-3,（SEQ ID N0:168)和 5'-GsTsGststsc stsascsascsc sasTsTsA_3'（SEQ ID N0:171)， 其中，大寫(xiě)字母表示β -D-氧-LNA單體，小寫(xiě)字母表示DNA單體，下標(biāo)"s"指硫磷酰連 接，表示含有5-甲基胞嘧啶堿基的β -D-氧-LNA單體或所述寡聚物的結(jié)合物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述骨髓瘤是多發(fā)性骨髓瘤。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
5. -種寡聚物在哺乳動(dòng)物骨髓瘤治療或預(yù)防用藥物制備中的應(yīng)用，所述寡聚物選自： 5，- MeCsMeCsAstsc ststsgstsgsa stscsMeCsAsT-3,（SEQ ID Ν0:168)和 5'-GsTsGstst scstsascsasc scsasTsTsA_3'（SEQ ID Ν0:171)， 其中，大寫(xiě)字母表示β -D-氧-LNA單體，小寫(xiě)字母表示DNA單體，下標(biāo)"s"指硫磷酰連 接，表示含有5-甲基胞嘧啶堿基的β -D-氧-LNA單體或所述寡聚物的結(jié)合物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其中所述骨髓瘤是多發(fā)性骨髓瘤。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的應(yīng)用，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
8. -種治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物骨髓瘤的藥物組合物，包含一種寡聚物，所述寡聚物選 自： 5，-MeCsMeCsAst scststsgstsg sastscsMeCsA sT-3,（SEQ ID Ν0:168)和 5'-GsTsGststsc stsascsascsc sasTsTsA_3'（SEQ ID Ν0:171)， 其中，大寫(xiě)字母表示β -D-氧-LNA單體，小寫(xiě)字母表示DNA單體，下標(biāo)"s"指硫磷酰連 接，表示含有5-甲基胞嘧啶堿基的β -D-氧-LNA單體或所述寡聚物的結(jié)合物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其特征在于所述的骨髓瘤是多發(fā)性骨髓瘤。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的藥物組合物，還包含藥學(xué)上可接受的賦形劑。
11. 根據(jù)權(quán)利要求8-10中任一所述的藥物組合物，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
【文檔編號(hào)】C07H21/04GK104093839SQ201280065745
【公開(kāi)日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2012年11月9日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月11日
【發(fā)明者】梅利莎·鄧布爾, 張易賢 申請(qǐng)人:桑塔里斯制藥公司