專利名稱：殺菌肽－x純化工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于藥物化學技術領域。具體涉及一種殺菌肽-X純化工藝。
背景技術：
殺菌肽因為具有殺傷抗生素耐藥菌，病毒和腫瘤細胞等作用，以及其極低的毒副作用，正在農業(yè)、畜牧業(yè)、醫(yī)藥及食品工業(yè)中顯示出越來越廣闊的應用前景。
通常早期研制和應用的殺菌肽均是從昆蟲體液等天然物質中提取的，來源途徑廣泛，但含量極低，提取步驟繁雜，很難獲得大量高純度的殺菌肽。隨著分子生物學技術的廣泛應用，人們開始采用酵母體系及昆蟲或昆蟲細胞體系進行基因表達，如中科院上海生物工程研究中心楊勝利，屈賢銘等完成了抗菌肽Magainin基因的克隆及其在Pichia pastoris中的表達(2002年18卷4期中國生物化學與分子生物學報)；南京農業(yè)大學的張素芳等完成了重組magainin抗菌肽表達條件的優(yōu)化及其對抑菌活性的影響(2004年24卷11期中國生物工程雜志)；南京師范大學張杰等完成了抗菌肽CM4基因克隆及其在畢赤酵母中的表達鑒定(2005年45卷5期微生物學報)；第二軍醫(yī)大學仲燕等完成了東海貽貝抗菌肽Myticin A基因的克隆表達及其生物學活性(第二軍醫(yī)大學學報2005年26卷1期)；中國熱帶農業(yè)科學院吳代飛等完成了抗菌肽B基因的點突變及在昆蟲細胞中的表達(1999年20卷3期熱帶作物學報)；南京軍區(qū)軍事醫(yī)學研究所張林元和南京師范大學趙東紅等完成了中國家蠶抗菌肽人工合成類CMIV基因在甜菜夜蛾蟲體內的表達(2001年41卷6期微生物學報)。但對殺菌肽這類小肽而言，從工業(yè)化生產的角度考慮，以具有成本低、周期短、表達水平高、易于操作等優(yōu)點的大腸桿菌作為表達體系較為理想。因此，相關研究單位對在大腸桿菌中表達抗菌肽進行了各種嘗試，如北京化工大學吳衛(wèi)華等對重組陽離子抗菌肽的初步研究(2003年30卷2期北京化工大學學報)；四川大學馮云等進行的人抗菌肽FALL-39在大腸桿菌中高效表達(2003年20卷4期生物醫(yī)學工程學雜志)；第三軍醫(yī)大學許波等進行的抗菌肽葛佬素在大腸桿菌BL21中的表達(2003年1卷1期中華醫(yī)藥衛(wèi)生)；華東理工大學周宇荀等進行的抗菌肽Adenoregulin基因工程菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化及分批發(fā)酵研究(2005年21卷4期生物工程學報)等。因而進一步探索合適的分離純化工藝以制備高純度的殺菌肽引起了研究者的關注。本發(fā)明人在完成殺菌肽-X的基因設計和在大腸桿菌中的高效表達后，成功地建立了一整套適合于大規(guī)模制備高純度殺菌肽-X的分離純化工藝，使用這一工藝可制備“克”級(重量)水平的殺菌肽-X應用于臨床前試驗。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題在于應用由大腸桿菌發(fā)酵得到的包涵體制備有生物活性的殺菌肽-X。
本發(fā)明提供了一種殺菌肽-X的純化工藝。
本發(fā)明的工藝是對殺菌肽-X發(fā)酵工藝制得的發(fā)酵產物進行純化。本發(fā)明人曾對殺菌肽-X發(fā)酵工藝進行了改進并提交中國專利申請200610026829.4。該發(fā)酵工藝包括下列步驟(1)發(fā)酵種子菌體OD600在0.48～1.0菌種種齡的種子；(2)發(fā)酵培養(yǎng)基改良的TB培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基中含細菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨12g，細菌培養(yǎng)用酵母提取物24g，甘油4ml，KH2PO4 2.31g，K2HPO4·3H2O含量在1.64g/L～16.4g/L；(3)發(fā)酵工藝在發(fā)酵罐中加入培養(yǎng)基，接種OD600在0.48～1.0的菌種，在通氣量160l/h，罐壓0.02～0.04MPa，溫度37℃，攪拌轉速150r/min的條件下，發(fā)酵12小時。
本發(fā)明的殺菌肽-X純化工藝的主要步驟如下
(1)菌體OD600在0.48～1.0菌種種齡的種子，經改良的TB培養(yǎng)基發(fā)酵，發(fā)酵結束后，5000r/min離心發(fā)酵液10min收集菌體，懸浮于0.02mol/L磷酸緩沖液中，均質機破碎細胞，壓力為8×107Pa～9×107pa，10000r/min離心破碎細胞15min收集沉淀，依次用0.02mol/L磷酸緩沖液，0.5％NaCl/Triton，PH 8.0 TE(10mM Tris/0.5mMEDTA)溶液，2％脫氧膽酸鈉，2mol/L尿素洗滌沉淀，得到包涵體，其中主要成分為融合蛋白，即腫瘤壞死因子b-殺菌肽-X；(2)將溶解在0.2Mol/L鹽酸中的6mol/L的鹽酸胍作為包涵體的變性劑，包涵體在變性劑中溶解充分，加入CNBr適量，于18～25℃避光反應24h；(3)將第(2)步得到的反應液裝入相應的透析袋中，對20～25倍體積的0.05mol/L磷酸緩沖液透析，其中緩沖液pH選擇6.00，透析時間48h，換透析液4次，整個期間透析液溫度為0～4℃；(4)透析結束后，12000r/min 4℃離心20min后，收集上清液，用RP-HPLC檢測純度，同時將上清和沉淀進行SDS-PAGE檢測CNBr切割效率；(5)取第(4)步得到的上清液上CM-52纖維素柱，用0.05-0.70Mol/L的磷酸緩沖液pH6.00梯度洗脫，收集洗脫峰，各取5μl點E.coli K12D31的測活板，37℃培養(yǎng)過夜，次日觀察抑菌圈，再取有抑菌活力的洗脫峰用RP-HPLC檢測純度。
(6)取第(5)步得到的主峰對超純水透析去鹽后，測定蛋白濃度并凍干，最后置于4℃長期保存。
本發(fā)明工藝在包涵體洗滌過程中，每種溶液均洗至離心上清澄清為止，由此得到的包涵體中融合蛋白的含量可達60％～80％，去除了大部分菌體蛋白。
在包涵體變性劑的選擇中，本發(fā)明試用了6mol/L的尿素、8mol/L的尿素和6mol/L的鹽酸胍(此時酸濃度都為1.0mol/L)。在溶解包涵體的過程中，6mol/L的鹽酸胍表現(xiàn)出最好的溶解度?？紤]到包涵體變性過程中二硫鍵的影響，本發(fā)明人又嘗試在6mol/L和8mol/L的尿素溶解包涵體時加入終濃度為30mM的還原型谷胱甘肽(GSH)。經過相同的切割和透析過程，最終得到離心產物的沉淀和上清分別用SDS-PAGE和RP-HPLC檢查，結果顯示用鹽酸胍做變性劑能達到最好的切割效率，并且上清中的可溶性殺菌肽-X含量最高；8mol/L的尿素溶解能力略高于6mol/L的尿素，而加入GSH對提高尿素的溶解能力影響不大，反而在透析過程中幫助了某些雜蛋白的復性而使透析上清的組分變得更為復雜影響了下一步的分離純化。根據(jù)上述結果本發(fā)明選擇6mol/L的鹽酸胍為包涵體變性劑。.
考慮到溶液pH值對蛋白質穩(wěn)定性的影響，本發(fā)明試驗了變性劑酸濃度的變化。本發(fā)明選擇了0.1Mol/L，0.2Mol/L，0.5Mol/L和1.0Mol/L鹽酸溶解鹽酸胍，其它條件不變，將第(4)步得到的離心產物用SDS-PAGE檢測，結果顯示0.1Mol/L鹽酸體系內包涵體切割較少，產物上層為乳濁狀；0.2Mol/L，0.5Mol/L和1.0Mol/L鹽酸體系則切割較充分，都能達到75％左右，且都得到澄清溶液。因此，本發(fā)明選擇0.2Mol/L的鹽酸—6Mol/L的鹽酸胍體系作為包涵體變性劑。
切割結束后，進行透析液和透析溫度的選擇，以透析上清中目的蛋白殺菌肽-X含量和穩(wěn)定性為標準。
實驗證明，對透析液種類而言，相對于甲酸銨緩沖液、醋酸銨緩沖液和檸檬酸緩沖液，利用磷酸緩沖液得到的第(4)步上清純度高且穩(wěn)定。同時考慮到緩沖液pH對蛋白質的影響，我們選擇pH為5.30、6.00和6.30磷酸緩沖液進行比較。將由第(2)步得到的反應液均分成3份，分別對pH5.30，6.00和6.30的0.05mol/L磷酸緩沖液透析，得到的透析產物離心上清用RP-HPLC檢測殺菌肽-X的含量，結果證明由pH6.00的磷酸緩沖液得到的上清中殺菌肽-X含量高，且穩(wěn)定性好，在4℃放置兩周，目的蛋白含量下降不超過10％。因此最終選擇pH6.00的磷酸緩沖液為第(2)步中的透析緩沖液。
考慮到第(2)步中透析時間較長，因此在以pH6.00的磷酸緩沖液為透析緩沖液時進行了溫度對透析液中殺菌肽-X穩(wěn)定性的考察，結果發(fā)現(xiàn)0～4℃明顯優(yōu)于10℃和常溫25℃，有效的防止了目的蛋白的降解。
總結以上試驗，選定保持0～4℃的pH6.00的磷酸緩沖液為第3步中的透析體系。
通過本發(fā)明工藝可制得穩(wěn)定高純度的水溶性殺菌肽-X。將此殺菌肽-X應用于初期抗惡性腫瘤的體外細胞實驗和體內的動物實驗，證明殺菌肽-X療效明顯，且重復性極好。
本發(fā)明工藝主要解決了發(fā)酵后包涵體純化；融合蛋白變性劑種類及酸濃度的選擇；透析緩沖液種類及pH選擇；透析溫度的選擇。用以上得出的最佳條件分離純化殺菌肽-X，經紫外光吸收法測定活力峰蛋白含量后可知，1g包涵體可穩(wěn)定得到10mg純度在95％以上的殺菌肽-X。以每罐20L發(fā)酵液得到100g包涵體計算，最終每罐發(fā)酵液就可得到1g的純度＞95％的殺菌肽-X。
具體實施例方式實施例11、將已純化的包涵體20克用200mL 0.2Mol/L的鹽酸——6Mol/L的鹽酸胍充分溶解，加入CNBr，22℃避光反應24h。
2、將上述反應液裝入透析袋中，對20倍體積的常溫PH6.00的0.05mol/L磷酸緩沖液透析，透析共用48h，其間換透析液4次。
3、透析結束后，12000r/min 4℃離心20min后，收集上清液，放置4℃冰箱，分別在第1天，第3天，第7天和第14天用HPLC檢測殺菌肽-X的含量。具體結果見表一表一透析產物中殺菌肽-X的穩(wěn)定性時間(天) RP-HPLC檢測得到的透析液上清中殺菌肽-X的含量(％)1 61.73 62.17 62.21456.1實施例21、將已純化的包涵體20克用200mL 0.2Mol/L的鹽酸——6Mol/L的鹽酸胍充分溶解，加入CNBr，22℃避光反應24h。
2、將上述反應液均分后裝入等容積的透析袋中，分別置等體積0～4℃、10℃和常溫(25℃左右)的pH6.00的磷酸緩沖液中，透析48h，其間換透析液4次，且在透析期間保持溫度恒定。
3、透析結束后，12000r/min 4℃離心20min后，收集上清液，分別用HPLC檢測殺菌肽-X的含量。具體結果見表二。
表二透析溫度對殺菌肽-X穩(wěn)定性的影響溫度(℃)RP-HPLC檢測得到的透析液上清中殺菌肽-X的含量(％)0-4 79.710 70.325 62.34、取上述上清上CM-52纖維素柱，用0.05-0.70Mol/L的磷酸緩沖液(pH6.00)梯度洗脫。收集活力峰用RP-HPLC檢測。由0～4℃透析得到的上清經CM-52纖維素柱分離，活力峰純度可保證在95％～98％，進行SDS-PAGE檢測，呈銀染一條帶。
實施例31、將已純化的包涵體20克用200mL 0.2Mol/L的鹽酸——6Mol/L的鹽酸胍充分溶解，加入CNBr，22℃避光反應24h。
2、將上述反應液裝入透析袋中，對20倍體積0～4℃的pH6.00的0.05mol/L磷酸緩沖液透析，透析共用48h，其間換透析液4次，且在透析期間保持溫度恒定。
3、透析結束后，12000r/min 4℃離心20min后，收集上清液。由RP-HPLC檢測上清液中殺菌肽-X的含量為82.3％。
4、取上清液上CM-52纖維素柱，用0.05-0.70Mol/L的磷酸緩沖液pH6.00梯度洗脫。RP-HPLC檢測收集的活力主峰，其中殺菌肽-X的含量達到98.8％；SDS-PAGE檢測，呈銀染一條帶。
5、取上述活力主峰對超純水透析去鹽后，測定蛋白濃度，計算得到殺菌肽-X232mg。凍干后置于4℃長期保存。
權利要求
1.一種殺菌肽-X純化工藝，其特征在于該工藝包括下列步驟(1)菌體OD600在0.48～1.0菌種種齡的種子，經改良的TB培養(yǎng)基發(fā)酵，發(fā)酵結束后，5000r/min離心發(fā)酵液10min收集菌體，懸浮于0.02mol/L磷酸緩沖液中，均質機破碎細胞，壓力為8×107Pa～9×107Pa，10000r/min離心破碎細胞15min收集沉淀，依次用0.02mol/L磷酸緩沖液，0.5％NaCl/Triton，pH 8.0 10mMTris/0.5mM EDTA溶液，2％脫氧膽酸鈉，2mol/L尿素洗滌沉淀，得到包涵體，其中主要成分為融合蛋白，即腫瘤壞死因子b-殺菌肽-X；(2)將溶解在0.2Mol/L鹽酸中的6mol/L的鹽酸胍作為包涵體的變性劑，包涵體在變性劑中溶解充分，加入CNBr適量，于18～25℃避光反應24h；(3)將第(2)步得到的反應液裝入相應的透析袋中，對20～25倍體積的0.05mol/L磷酸緩沖液透析，其中緩沖液pH選擇6.00，透析時間48h，換透析液4次，整個期間透析液溫度為0～4℃；(4)透析結束后，12000r/min 4℃離心20min后，收集上清液，用RP-HPLC檢測純度，同時將上清和沉淀進行SDS-PAGE，檢測CNBr切割效率；(5)取第(4)步得到的上清液上CM-52纖維素柱，用0.05-0.70Mol/L的磷酸緩沖液pH6.00梯度洗脫，收集洗脫峰，各取5μl點E.coli K12D31的測活板，37℃培養(yǎng)過夜，次日觀察抑菌圈，再取有抑菌活力的洗脫峰用RP-HPLC檢測純度。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種殺菌肽-X純化工藝，其特征在于其中所述步驟(1)得到的包涵體中融合蛋白，即腫瘤壞死因子b-殺菌肽-X含量為60％～80％。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種殺菌肽-X純化工藝，其特征在于其中所述步驟(2)包涵體的變性劑為溶解在0.2Mol/L鹽酸中的6mol/L的鹽酸胍。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種殺菌肽-X純化工藝，其特征在于其中所述步驟(3)切割產物的透析條件為0～4℃，pH6.00的磷酸緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種殺菌肽－X純化工藝，通過本發(fā)明工藝可制得穩(wěn)定高純度的水溶性殺菌肽－X。將此殺菌肽－X應用于初期抗惡性腫瘤的體外細胞實驗和體內的動物實驗，證明殺菌肽－X療效明顯，且重復性極好。本工藝主要解決了發(fā)酵后包涵體純化；融合蛋白變性劑種類及酸濃度的選擇；透析緩沖液種類及pH選擇和透析溫度的選擇。利用所選定的條件，1g包涵體可穩(wěn)定得到10mg純度在95％以上的殺菌肽－X。
文檔編號C07K1/00GK101089188SQ20061002765
公開日2007年12月19日 申請日期2006年6月13日 優(yōu)先權日2006年6月13日
發(fā)明者沈益, 勞學剛, 張洪祖, 徐賢秀 申請人:浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠, 南京大學