專利名稱：：酪氨酸酶衍生的分離肽及其應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及衍生自酪氨酸酶的分離肽及其應用，所說肽是由HLA-A2和HLA-B44分子呈遞的。另外，本發(fā)明涉及鑒別被診斷患有細胞異常狀態(tài)的個體之能力，其中細胞異常狀態(tài)的異常細胞呈遞這些肽和HLA-A2和HLA-B44的復合物，還涉及呈遞的肽及其衍生物。背景和現(xiàn)有技術哺乳動物免疫系統(tǒng)識別外源和外來材料并發(fā)生反應的過程是一個復雜的過程，該系統(tǒng)的一個重要的方面是T細胞應答。這種應答要求T細胞識別稱作為人白細胞抗原(“HLA”)或者主要組織相容性復合物(“HMCs”)的細胞表面分子和肽形成的復合物并與之發(fā)生作用。這些肽來源于被也能呈遞HLA/MHC分子的細胞加工的較大分子。參見例如Maleetal.，AdvancedImmunology(J.P.LipincottCompany，1987)，特別是第6-10章。由于要求T細胞特異于HLA分子和一種肽的特定結合，所以T細胞和HLA/肽的復合物的相互作用受到限制。如果不存在特定的T細胞，即使存在其配體復合物也沒有T細胞應答。同樣，如果沒有特定的復合物但存在T細胞，也不發(fā)生應答。其機理涉及免疫系統(tǒng)的外來材料的應答，自身免疫病理學，和對細胞異常的應答。最近，更多的研究集中于將蛋白質加工為HLA結合肽的原理，在這方面，參見Barinaga，Science257880(1992)；Fremontelal.，Science257919(1992)Matsumuraetal.，Science257927(1992)；Latronetal.，Science257964(1992)。在癌癥中也涉及T細胞識別細胞異常的機理，例如PCT申請PCT/US92/04354，1992年5月22申請，1992年11月26日公開，作為本文的參考，其中公開了一個基因族，它被加工為肽，該肽依次在細胞表面表達，從而導致由特異性CTLs裂解腫瘤細胞。據(jù)說這些基因編碼“腫瘤排斥抗原前體”或“TRAP”分子，并且將由此產生的肽稱作為“腫瘤排斥抗原”或“TRAs”。有關該基因族的其它信息參見Traversarietal.，Immunogenetics35145(1992；vanderBruggenetal.，Science2541643(1991)。在美國專利申請系列號938,334(作為本文的參考)中，公開了與HLA-A1分子結合的九肽。該參考文獻告訴我們，如果已知特定肽與特定HLA分子的特異性，應該可以預期該特定肽與一種HLA分子結合，但不與另一種結合。這是重要的，因為不同的個體具有不同的HLA表型。因此盡管對作為特定的HLA分子的配體的特定肽的鑒別具有診斷和治療意義，但他們僅與有特定HLA分子表型的個體相關。在該領域內還需要作進一步的研究，因為細胞異常狀態(tài)并不局限于一個特定的HLA表型，進行有目的治療需要一些已經(jīng)公開的異常細胞表型知識。酪氨酸酶催化將酪氨酸轉化為脫羥基苯基丙氨酸或者“DOPA”的反應并且顯示選擇性的在黑素細胞上表達(Mullerelal.，EMBOJ72715(1988))，在Kwon，U.S.PatentNO.4,898,814最早報道有關人的該酶的cDNA。由Bouchardetal.，J.Exp.Med.1692029(1989)的最近報道提供了稍微有差異的序列。對于鑒別該酶的抑制劑已經(jīng)花費了大量的精力，因為它與色素沉著疾病有關。該文獻的一些例子包括Jinbow，wo9116302；Mishimaetal.，U.S.PatentNO.5，077,059，和Nazzaropor，U.S.PatentNo.4,818,768，技術人員對其它公開類似物質的文獻是熟知的。美國專利申請08/081,673(1993年6月23日申請，作為參考文獻)公開了可以將酪氨酸以類似于外源抗原或TRAP分子的方式處理，即，發(fā)現(xiàn)對于特定的細胞異常狀態(tài)，例如黑素瘤，在異常細胞中酪氨酸酶被加工并且由此產生的一種肽與HLA分子形成一種復合物。發(fā)現(xiàn)這些復合物可被胞溶性T細胞(“CTLs”)識別，裂解此異常細胞。對這種令人驚奇的和出入意料的現(xiàn)象的細節(jié)已進行了討論。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)另外的肽也可作為由HLA/AR分子呈遞的腫瘤排斥抗原。這些內容在申請?zhí)朜O.08/203,054,1994年2月28日申請的申請中描述，該申請作為本文參考文獻。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)來源于酪氨酸酶的另外的肽是腫瘤排斥抗原，他們是由MHC分子HLA/B44呈遞的，并且被胞溶性T細胞溶解。附圖簡述圖1集合性的描述了細胞溶解研究結果，具體是圖1A顯示細胞系LB24/MEL的裂解；圖1B顯示細胞系SK29/MEL的裂解；圖1C顯示細胞系LB4/MEL的裂解；圖1D顯示細胞系SK23/MEL的裂解；圖1E顯示細胞系LE516/MEL的裂解；圖1F顯示細胞系SK29/MEL.1.22的裂解；該細胞系已經(jīng)失去了HLA-A2表達能力；圖1G顯示MZ2-MEL失去溶解能力；圖1H顯示對NK靶K562進行研究的溶解情況；圖1I顯示在用編碼HLA-A2的基因轉染之后，圖1F變異體失去溶解能力；圖1J顯示來自患者SK29的自體EBV轉化的B細胞的溶解情況。圖2顯示對CTLIVSB的TNF釋放情況進行的研究。圖3描述了CTL210/9的TNF釋放情況的研究。圖4描述肽YMNGTMSQV被胞溶性T細胞克隆CTL-IVSB識別但不被胞溶性T細胞克隆CTL2/9識別。圖5顯示肽YMNGTMSQV不被胞溶性T細胞克隆CTL210/9識別。圖6顯示在各種細胞，包括那些在其表面呈遞HLA-B44的細胞進行的TNF釋放試驗的結果。圖7集合性的顯示利用本申請中描述的肽在三個不同細胞系上進行的一系列鉻釋放試驗。圖7A顯示使用SEQIDNo4肽進行的試驗。圖7B顯示使用SEQIDNo5肽的結果。圖7C顯示使用SEQIDNo2肽進行的試驗獲得的結果。在圖7中，利用標記“○”表示細胞系T2，用“□”表示不能呈遞HLA-A2的MZ2-MEL，以及用“●”表示已經(jīng)被轉染能呈遞HLA-A2的MZ2-MEL。實施例12描述了這些檢測試驗。圖8A和8B顯示利用能呈遞MHC分子HLA-B44的細胞系和胞溶性T細胞克隆22/31(下文中稱為“CTL22/31”)進行的研究。在圖8A中，用單克隆抗體W6/32預培養(yǎng)細胞系(“RosiEBV”)，而圖8B中沒有進行預培養(yǎng)。優(yōu)選實施例的詳細描述實施例1在下面的試驗中使用黑素瘤細胞系SK29-MEL(在文獻中也稱作為SKMEL-29)和LB24-MEL，這兩種細胞系已經(jīng)被研究者使用了許多年。從患者SK29(AV)和LB2(這些患者也分別是SKMEL-29和LB24-MEL的來源)獲得含有單核血細胞的樣品。將黑素瘤細胞系與含有單核血細胞的樣品接觸。觀察該混合物中黑素瘤細胞系的溶解情況，這種溶解作用表明在樣品中存在特異于由黑素瘤細胞呈遞的肽和HLA分子的復合物的胞溶性T細胞(“CTLs”)。所使用的溶解試驗是由Herinetal.，Int.J.Cancer39390-396(1987)，作為本文參考文獻，呈遞的鉻釋放試驗。但是下文中描述了該檢測法，體外培養(yǎng)靶黑素瘤細胞，然后以107細胞/ml的濃度重懸于補充了10mMHEPES和30％FCS的DMEM中，并在37℃用200μCi/ml的Na(51Cr)O4培養(yǎng)45分鐘。被標記的細胞用補充了10mMHEPES的DMEM洗滌3次。然后重懸于補充了10mMHEPES和30％FCS的DMEM中，之后將含有103細胞的100μl的樣品分布到96孔微滴板。在100μl的相同培養(yǎng)基中加入PBLs樣品，設置兩個相同的試驗組。將平板以100g離心4分鐘，在37℃，5.5％CO2中培養(yǎng)4小時。將平板再次離心，收集100μl的上清液并且計數(shù)。按下列公式計算51Cr的釋放百分數(shù)51Cr的釋放百分數(shù)＝(ER－SR)/(MR－SR)×100其中ER是觀察到的試驗51Cr的釋放量，SR是通過將103標記細胞在200μl的培養(yǎng)基中單獨培養(yǎng)檢測到的自發(fā)釋放量，MR是通過向靶細胞中加入100μl0.3％TritonX-100獲得的最大釋放量。通過有限稀釋將顯示強CTL活性的單核血樣品擴增和克隆，利用相同的方法進行再次篩選。用相同的方法檢測靶K562細胞。如果使用EBV轉化的B細胞(EBV-B細胞)，唯一的變化是用補充了5％的Hank’s培養(yǎng)基替代DMEM培養(yǎng)基。利用這些試驗可從患者SK29(AV)中分離出CTL克隆“IVSB”以及從患者LB24分離出CTL克隆210/9。在圖1A，B，G和I中提供了試驗結果，具體地說，可以看到兩種CTLs可以裂解兩種黑素瘤細胞系，K562和EBVB細胞系沒有發(fā)生溶解。實施例2對所描述的CTLs抗其它黑素瘤細胞系的能力進行檢測，以確定這些靶是否是其它黑素瘤細胞系共有的。對于LB4.MEL，SK23.MEL(也稱為SKMEL-23)和LE516.MEL按實施例1中描述的溶解試驗進行研究。圖1C，D和E組顯示克隆溶解這些細胞系。已知所檢測的細胞系是HLA-A2型，結果暗示CTLs特異于肽和HLA-A2形成的復合物，通過對失去了HLA-A2表達能力的SK29-MEL變異體進行檢測可以證明這種暗示。圖1F組顯示這些結果，沒有克隆能溶解失去HLA的變異體。然而，當用SK29-MEL的HLA-A2基因轉染變異體，而且重新檢測時，觀察到溶解。因此可以總結出呈遞的分子是HLA-A2。實施例3一旦鑒別出呈遞的HLA分子，就可完成鑒別該分子的研究，下文中稱該分子為“腫瘤排斥抗原前體”或“TRAP”分子，該分子是所呈遞的肽的來源。為此，從細胞系SK29-MEL.1中分離總RNA，該細胞是SK29-MEL的亞克隆。利用寡聚-dT結合試劑盒，和熟知的技術分離該RNA。一旦獲得總RNA，再用標準方法將其轉錄為cDNA。然后根據(jù)制造商說明，將該cDNA連接到EcoRI銜接頭上并克隆到pcDNA-I/Amp質粒的EcoRI位點。然后將重組質粒電穿孔到大腸桿菌JM101(電穿孔條件在25μfarads，2500v1個脈沖)。用氨芐青霉素(50μg/ml)選擇被轉染的細菌，然后劃分到各200個克隆的700個集合中，每個集合代表約100個不同cDNA，如分析結果所示約50％質粒含有一個插入片段。使每個集合擴增到飽和，根據(jù)Maniatis等人在MolecularCloningALaboratoryManual(ColdSpringHarbor，N.Y.，1992)描述的堿裂解，乙酸鉀沉淀和酚提取法分離質粒DNA。不使用銫梯度離心。實施例4然后將經(jīng)擴增的質粒轉染到真核細胞中。以15,000個細胞/孔的濃度將COS-7細胞樣品接種到含有添加了10％胎牛血清的Dulbeco’s改良的Eagles培養(yǎng)基(“DMEM”)的組織培養(yǎng)平底微孔中。在37℃將細胞培養(yǎng)過夜，除去培養(yǎng)基，然后用30μl/孔的DMEM培養(yǎng)基替代，所述DMEM培養(yǎng)基含有10％Nu血清，400μg/mlDEAE-葡聚糖，100μM氯喹，100ng質粒pcDNA-I/Amp-A2和100ng的上文中描述的一個集合中的cDNA文庫DNA。質粒pcDNA-I/Amp-A2含有來自SK29-MEL的HLA-A2基因。在37℃培養(yǎng)4小時之后，除去培養(yǎng)基，并用含有10％DMSO的PBS50μl替代。2分鐘后除去該培養(yǎng)基，并用補充了10％FCS的200μl的DMEM替代。在培養(yǎng)基進行這種變更之后，將COS細胞在37℃培養(yǎng)48小時。然后潷去培養(yǎng)基，并將上面描述的CTL克隆各200個細胞加入到100μl的Iscove培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含有10％庫存人血清。如果使用克隆210/9，則使用補充了25U/mlIL-2的培養(yǎng)基。24小時之后，除去上清液，然后按Traversaroetal.，Immunogenetics35145-152(1992)的描述，在WEHI細胞進行檢測以確定TNF的含量，所述文獻引入本文作參考。用IVSB檢測700個孔，696個顯示1ml中含有0.6至4pg之間的TNF，其余的四個孔含有10和20pg/ml之間的TNF。用CTL210/9檢測的同源孔顯示相似的，明顯更高的值。圖2和3呈遞了這些資料。實施例5進一步的實驗中對鑒別為高生產者的四個集合中的三個(編號“123”，“181”和“384”)進行選擇。具體地說，將細菌克隆，并且對于每個集合對570細菌進行檢測。從其中提取質粒DNA，并以類似于上文中的方式轉染到COS細胞的一個新樣品中，再次檢測細胞對CTL210/9和CTLIVSB的刺激作用。在123號集合中發(fā)現(xiàn)陽性克隆(“p123.B2”)，并在384號集合中發(fā)現(xiàn)一個陽性克隆(“p384.C6”)。通過實施用cDNA和HLA-A2基因轉染的COS細胞和僅用HLA-A2轉染的COS細胞進行的比較試驗獲得了由CTLs識別的轉染細胞的可信證據(jù)。通過在WEHI細胞中檢測而測出CTL上清液中TNF釋放量。利用MTT檢測存活的WEHI細胞的光密度值。結果列于表1中。表1cDNA(123.B2)沒有cDNA+試驗10.0870.502試驗20.1080.562對于cDNA和HLA-A其WEHIOD的值相當于24Pg/ml，而對于對照相應值為2.3Pg/ml。從陽性克隆中提取出質粒，并按本領域已知技術進行測序。序列研究結果顯示該質粒插入物幾乎相同于酪氨酸酶的cDNA，如由Bouchardetal.，J.Exp.Med.1692029(1989)描述，引入本文作參考。因此，一種天然存在的分子(即酪氨酸酶)具有腫瘤排斥抗原前體的作用并可被加工形成一種腫瘤排斥抗原，該抗原存在于細胞的表面，并與HLA-A2形成一種復合物，從而刺激CTL克隆的溶解。被鑒別分子的核酸序列顯示于SEQIDNO1中。實施例6由Chomezetal.，Immunogenetics35241(1992)報道的以前的工作已經(jīng)證明含有編碼一個抗原肽的序列的小基因片段導致該肽的表達。該項研究(其全文引入本文作參考)表明對上文中描述的和SEQIDNO1中描述的人酪氨酸酶cDNA的小部分序列進行了克隆。利用實施例1-5中描述的方法，將該cDNA的各個片段和編碼HLA-A2的基因一起共轉染到COS-7細胞中，并檢測TNF的釋放量。這些試驗可對約400個堿基對片段進行檢測，當在其轉染試驗中使用時，該片段可促進TNF從上文中討論的胞溶性T細胞克隆CTLIVSB中釋放，顯示出對呈遞HLA-A2的細胞具有特異性。所使用的400個堿基片段對應于SEQIDNO1的堿基711-1152。從該片段密碼子推導出氨基酸序列，然后將該序列與由Hunt等人，Science2551261(1992)，和Falk等人，Nature351290(1991)提供的資料進行比較，兩篇文獻引入本文作為參考。這種參考文獻討論了呈遞HLA-A2的肽的一致序列。具體地說，Hunt討論了九肽，其中在第二位上總發(fā)現(xiàn)Leu或Ile，Leu是“占優(yōu)勢的殘基”。所描述的第9個殘基是具有脂肪族烴側鏈的一個殘基，Val是該位置上占優(yōu)勢的殘基。Hunt討論了第二位為Leu時的強信號，以及為Met時的中等強度信號，在第6位為Val，Len，Ile或Thr之一，第9位為Val或Leu，具有Val時是特別強的?；诒容^結果，合成九肽，然后檢測其對呈遞HLA-A2的細胞是否敏感。為此，使用喪失酪氨酸酶的變異細胞系SK29-MEL1.218和T202LB。將需檢測的不同濃度的肽與胞溶性T細胞克隆CTLIVSB或胞溶性T細胞克隆CTL2/9一起加入到細胞系中。上文中討論的以前的研究工作已經(jīng)確定前一克隆裂解呈遞HLA-A2的表達酪氨酸酶細胞，后一克隆沒有此作用。在37℃，含有51Cr的溶液中，用或不用抗HLA-A2抗體MA2.1培養(yǎng)失去酪氨酸酶的變異體一小時，所述抗體使游離HLA-A2分子變得穩(wěn)定。在該試驗中，將細胞洗四次，然后用濃度從100μM降到0.01μM的不同稀釋度的肽進行保溫。30分鐘之后，以E/T比例為40/1的濃度加入效應細胞，四個小時之后，收集100λ上清液，并檢測放射活性。圖4顯示由九肽TyrMetAsnGlyThrMetSerGlnVal(SEQIDNO2)獲得的結果。下文中稱作為SEQIDNO2的該肽相應于列于SEQIDNO1中的酪氨酸酶的cDNA序列的第1129-1155殘基。由CTL克隆IVSB識別出HLA-A2和該肽的復合物。在一個平行試驗中，已經(jīng)證明來自于LB24患者的CTL克隆CTL210/9并不識別HLA-A2和SEQIDNO2的肽形成的復合物，雖然它識別HLA-A2和酪氨酸酶衍生的肽形成的復合物。因此，將酪氨酸酶加工為至少一種其他的肽，如果由HLA-A2分子呈遞該肽，則可被CTL克隆識別。實施例7在下面實驗中，使用不是編碼SEQIDNO2肽的第二個基因片段，該片段起始于SEQIDNO1的第一位堿基并結束于1101位堿基(即EcoRI-SphI片段)。按上文中描述的方式對胞溶性T細胞克隆CTL210/9(上文中討論)抗轉染了該片段的COS-7細胞的抗性進行檢測。也對CTLIVSB進行檢測。這些結果顯示LB24-CTL210/9識別用該片段轉染的表達HLA-A2的細胞的表面上的抗原，但CTLIVSB并不識別。因此，第二個腫瘤排斥抗原肽來源于酪氨酸酶。實施例8為了進一步定義由LB24-CTL210/9識別的腫瘤排斥抗原，完成下列實驗。將對應于SEQIDNO1的堿基451-1158的第二個片段與編碼HLA-A2的基因一起轉染到COS細胞中，并對TNF釋放進行檢測。該序列可刺激TNF從克隆SK29-CTLIVSB(20pg/ml)中釋放，但不能刺激從LB24-CTL210/9(3.8pg/ml)釋放。這些結果證實兩個CTL克隆識別不同的肽，并且由LB24-CTL210/識別的肽是由1-451區(qū)編碼。實施例9對由cDNA片段1-451編碼的酪氨酸酶衍生的肽進行分析，分析其中已知與HLA-A2結合的共有序列。合成對應于這些共有序列的肽，并檢測其使呈遞HLA-A2的細胞致敏的能力。為此，使用兩個酪氨酸酶陰性黑素瘤細胞系(即，NA8-MEL和MZ2-MEL2.2，已用HLA-A2轉染)，以及細胞系T2，如由Salter等人，Immunogenetics21235-246(1985)描述的細胞系T2。用51Cr，和特異于HLA-A2的單克隆抗體MA.2，1，于37℃將細胞培養(yǎng)50分鐘，隨后進行洗滌(參見Bodmeretal.，Nature342443-446(1989)，引入本文作參考)。將靶細胞用不同濃度的肽，和用LB24-CTL克隆210/5或210/9進行培養(yǎng)，培養(yǎng)4小時之后檢測鉻釋放百分數(shù)。發(fā)現(xiàn)肽MetLeuLeuAlaValLeuTyrCysLeuLeu(SEQIDNO3)是具活性的。在此概述的其他實驗中，前面已證明可識別YMNGTMSQV的CTL-結果概述于下列表2-4中表2肽YMNGTMSQVMLLAVLYCLL(1120-1155)(25-54)SK29-CTL-IVSB+-LB24-CTL-210/5-+LB24-CTL-210/9-+表3由LB24-CTL210/5和210/9和SK29-CTLIVSB介導的由酪氨酸酶肽致敏的MZ2-2.2-A2的3/93裂解效應細胞肽劑量MZ2.2.2-A2抗-A2*LB24-CTLMLLAVLYCLL10μM18210/5(LAUS17-5)317(44∶1)116YMNGTMSQV30M1(MAINZ)10131LB24-CTLMLLAVLYCLL10μM18210/9(LAUS17-5)317(30∶1)115YMNGTMSQV30M1(MAINZ)10131SK29-CTLMLLAVLYCLL10μM1IVSB(LAUS17-5)31(40∶1)11YMNGTMSQV30μM68(MAINZ)1068362*靶細胞用Cr51和單抗MA2.1(抗-HLA-A2)培養(yǎng)50分鐘，然后洗3次。它們用各種不同濃度的肽培養(yǎng)30分鐘。按所指定(E∶T)比例加入CTL細胞。培養(yǎng)4小時之后檢測特定的Cr51釋放百分數(shù)。表4由LB24-CTL210/5和210/9或SK29-CTLIVSB識別的酪氨酸酶肽的檢測(Cr51特異性釋放的百分數(shù))效應細胞肽劑量NA8-MEL*MZ2-2.2∶A2T2LB24-CTL.MLLAVLYCLL10μM303136210/5(LAUS17-5)32327351172026(41∶1)300nM61716100285303520000LB24-CTL.MLLAVLYCLL10μM141921210/9(LAUS17-5)3131720191413(26∶1)300nM395100111300100010SK29-CTL.YMNGTMSQV10μM303136IVSB(MAINZ)33844521274046(42∶1)300nM1422341003132130191010133303410100040特異性釋放339259198最大釋放269416931206％111314實施例10利用CTL克隆22/31完成其他實驗。前面已經(jīng)證明該克隆可溶解自體黑素瘤細胞系MZ2-MEL中的亞細胞系MZ2-MEL.43，但不溶解其他亞細胞系，例如MZ2-MEL3.0和MZ2-MEL61.2，也不溶解自體EBV轉化的B細胞，或者殺傷細胞系K562(參見VandenEyndeetal.，Int.J.Cancer44634-640(1989)。由MZ2-MEL.43呈遞的抗原稱作為抗原C。在包括本申請的母申請中報道的研究工作中，發(fā)現(xiàn)酪氨酸酶基因編碼一種由大多數(shù)表達HLA-A2黑素瘤的自體CTLs識別的一種抗原。通過PCR擴增可檢測細胞MZ2-MEL的亞系中該基因的表達。發(fā)現(xiàn)MZ2-MEL.43克隆是陽性的，而其他MZ2-MEL克隆，例如MZ2-MEL.3.0是陰性。酪氨酸酶基因的表達與抗原MZ2-C的相關性表明MZ2-C可能是一種腫瘤排斥抗原，它來源于酪氨酸酶，并且是被由MZ2-MEL表達的HLA分子呈遞的。該細胞系并不表達HLA-A2，這表明如果所呈遞的酪氨酸酶衍生的肽一種TRA，則涉及第二種HLA分子。進行鑒別那一種HLA分子給CTL22/31呈遞了抗原C的研究。為此，從MZ2-MEL.43cDNA文庫中分離已知位于細胞表面上的HLA分子的cDNA克隆即HLA-A29，HLA-B37，HLA-B44.02和HLA-C克隆10，然后克隆到表達載體pcDNAI/Amp.中。然后用這些構建體之一或含有HLA-A1，以及編碼酪氨酸酶(SEQIDNO1)的cDNA的構建體轉染受體COS7細胞。共轉染按上文中列出的方法進行。一天之后加入CTL22/31，并且24小時之后，通過按照Traversari等人(見上文)的方法用對WEHI-164-13的胞溶性的檢測結果確定TNF釋放。圖6顯示僅在由HLA-B44和酪氨酸酶轉染的細胞存在的條件下由CTL22/31釋放TNF。由此得出結論HLA-B44呈遞了酪氨酸酶衍生的腫瘤排斥抗源。實施例11上文中描述的實驗特別顯示了十聚體MLLAVLYCLL有效地誘導呈遞HLA-A2細胞的溶解。已公認MHC分子呈遞九肽。為此，完成對兩個九聚體進行檢測的試驗，其中實驗是以得到陽性結果的十肽為基礎的。具體地說，刪除了第一或第十個氨基酸以制備兩個肽，即MetLeuLeuAlaValLeuTyrCysLeu(SEQIDNO4)LeuLeuAlaValLeuTyrCysLeuLeu(SEQIDNO5)按照前面實施例中給出的對濃度為10μM-1nM范圍內的十肽進行檢測的方法對這些肽進行檢測。使用三個現(xiàn)存細胞，概述于下列表5中，“T2”是一種突變的人細胞系，“CEMX721.174T2”由Salter，Immunogenetics21235(1985)描述，該細胞系呈遞HLA-A2，“G2.2”是細胞系MZ2-MEL變異體，已用編碼HLA-A2的基因轉染該變異體。縮寫“G2.2.5”代表了一種并不表達HLA-A2的變異體。在與胞溶性T細胞克隆接觸之前將所有細胞與單克隆抗體MA2.1一起培養(yǎng)。該步驟使所謂“自由”MHC分子穩(wěn)定，盡管其出現(xiàn)的機理并不是熟知的，并利用了效應細胞CTLs210/5和210/9。結果列于下文表5中，結果顯示在10μM濃度時，與CTL克隆210/5一起使用時SEQIDNO4的九聚體效率為2倍，但用210/9克隆時其效率高4倍，而SEQIDNO5的九聚體在誘導裂解方面是無效的。實施例12在進一步的實驗中，利用肽SEQIDNO4和5，以及SEQIDNO2完成鉻釋放試驗。靶細胞是先前已用HLA-A2轉染的異體黑素瘤細胞即MZ2-MEL和呈遞HLA-A2的、但具有抗原加工缺陷而導致呈遞外源肽能力增加的細胞系T2(Cerundoloetal.Nature345-449(1990))。所有細胞用單克隆抗體MA2.1預滴定50分鐘。用各種濃度的肽培養(yǎng)細胞30分鐘，然后，以效應細胞靶細胞的比例為60加入CTL克隆210/9和ISVB之一。按上文中描述的方法，四小時之后測量釋放的鉻。結果列于圖7，即圖7A-7C中。SEQIDNO4肽使細胞對CTL210/9致敏，而DEQIDNO5不能。在前面實施例中已注意到SEQIDNO6使細胞對CTLIVSB致敏。表5表5(續(xù))表5(續(xù))實施例13然后完成緊接著實施例10中列出的實驗之后的研究，以便對由HLA-B44呈遞的抗原肽進行定義。為此，將對應于酪氨酸酶cDNA序列的片段的cDNA序列與編碼HLA-B44的基因一起共轉染到COS-7細胞中?；旧习瓷衔膶嵤├?中描述的方案實施。使用上文中討論的胞溶性T細胞克隆22/31確定TNF釋放量。兩個片段，即堿基片段1-611和427-1134誘導TNF釋放，該結果表明所呈遞的肽是位于重疊區(qū)。根據(jù)該結果，對更短的片段進行檢測。從385位，442位，514位和574位起始的片段也能誘導TNF的釋放，而從579和585位起始的片段卻不能。這些結果又暗示按照標準方法合成的13個氨基酸的肽起始于第574位。然后將該肽用于試驗中以確定其是否被CTL22/31誘導溶解，下文表6顯示13聚體提供了兩個EBV轉染的細胞系，它們表達對溶解敏感的HLA-B44。表610F94類型13聚體surEBV-1</tables>下文中將對更短的肽進行檢測。對應于核苷酸堿基574-604位的十聚體肽，即SerGluIleTrpArgAspIleAspPheAla(SEQIDNO7)可以刺激溶解，正如肽SerGluIleTrpArgAspIleAspPhe(SEQIDNO8)一樣。相反沒有識別出九聚體GluIleTrpArgAspIleAspPheAla(SEQIDNO9)肽。下面表7中概括了這些結果，也描述于附圖8中。由Burrows等人，J.Virol643974(1990)報道的唯一一種與HLA-B44結合的其他肽是GluGluAsnLeuLeuAspPheValArgPhe(SEQIDNO10)。上文中描述的資料表明第二位的Glu和第9位的Phe可以給HLA-B44提供“錨著”殘基。表7在B44上的10M94肽酪氨酸酶</tables>以前的實驗證明將酪氨酸酶加工為腫瘤排斥抗原前體，導致得到的腫瘤排斥抗原與至少某些異常細胞例如具HLA-A2或HLA-B44表型的黑素瘤細胞上的分子形成一個復合物。該復合物被CTLs識別后，使呈遞該復合物的細胞被裂解。該觀察結果具有治療和診斷意義，這也是本發(fā)明的特點。就治療方法而言，產生特異于呈遞上述復合物的異常細胞的CTLs的觀察結果預示了各種治療途徑，一種這樣的途徑是給患有所述表現(xiàn)型的異常細胞的患者施用特異于該復合物的CTLs。體外研制這樣的CTLs是本領域內技術人員熟知的。具體地說，將細胞樣品(例如血細胞)與呈遞該復合物的細胞相接觸，并且能夠刺激特定的CTL進行增殖。該靶細胞可以是一種轉染子，例如上文中描述類型的COS細胞。這些轉染子在其表面上呈遞了所需復合物，并且當與所需CTL結合時，刺激其增殖。為了使本領域內技術人員能夠制備這些CTLs，已經(jīng)按照布達佩斯條約規(guī)定將含有所需基因的載體即pcDNA-1/Amp1(HLA-A2)和p123.B2(人酪氨酸酶)寄存于巴斯德學院，寄存號分別為NO.I1275和I1276。COS細胞，例如本領域內廣泛使用的那些，也是另外的合適的宿主細胞。對于詳細的治療方法，稱為過繼性轉移(Greenberg，J.Immunol.136(5)1917(1986)；Reddeletal.，Science257238(7-10-92)；Lynchetal.，Eur.J.Immunol.211403-1410(1991)；Kastetal.，Cell59603-614(11-17-89))，將呈遞所需復合物的細胞與CTLs結合，從而導致特異于CTLs的細胞增殖。然后將增生的CTLs施用給患有細胞異常的患者，所述細胞異常的特征在于異常細胞呈遞特定的復合物。然后CTLs溶解異常細胞，從而達到預期治療目的。上述治療方法假設至少一些患者的異常細胞呈遞了一種或多種HLA/酪氨酸酶衍生的肽的復合物。這可以非常容易地確定，例如利用上文中討論的轉染子可識別CTLs，并且一旦分離，就可與患者的異常細胞樣品一起用于確定體外溶解情況。如果觀察到溶解，然后可使用在該治療方法中的特異性CTLs來減輕與異常細胞相關的癥狀。利用標準檢測方法，用簡單的步驟就可檢測異常細胞的HLA表現(xiàn)型，并且利用例如PCR技術通過擴增可確定酪氨酸酶的表達。許多不同的HLA分子呈遞來自于酪氨酸酶的TRAs這一事實增加了適合作為本文中討論的治療法的患者的個體數(shù)目。過斷性轉移不是本發(fā)明可用的唯一治療形式。利用許多方法也可以體外激發(fā)CTLs。上文中闡明了一種途徑，即利用表達該復合物的非增殖性細胞，在該方法中使用的細胞是那些通常表達所述復合物的細胞，例如被輻射的黑素瘤細胞或者用呈遞該復合物所需的一或二種基因轉染的細胞。Chen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88110-114(1991年1月)列舉了這些途徑，顯示了在一種治療方式中表達HPVE7肽的轉染細胞的應用。可使用各種細胞類型，同樣，可以使用攜帶一或兩種所需基因的載體。病毒或細菌載體是特別優(yōu)選的。在這些系統(tǒng)中，由例如一種痘苗病毒或細菌BCG攜帶所需基因，得到的材料稱為“感染”宿主細胞。從而導致細胞呈遞所需復合物，并由自體CTLs識別，然后增殖。通過將酪氨酸酶本身與一種促進其摻入到呈遞HLA-A2細胞中的佐劑結合可達到相似效果。然后將酶加工以產生HLA分子的肽配體。前面討論中涉及“異常細胞”和“細胞異?！?，這些術語具有最廣泛意義上的含意，并且是指其中所指細胞至少顯示一種特性的情形，該特性指明它們不同于其特異性類型的正常細胞。異常特性的例子包括形態(tài)和生化改變，例如細胞異常包括腫瘤，例如黑素瘤，自身免疫紊亂等等。本發(fā)明還呈遞了用于鑒別針對CTL靶的前體的方法。當靶細胞是腫瘤時，這些前體是指腫瘤排斥抗原，但必須指出異常細胞不是腫瘤時，不能將該分子稱為腫瘤排斥抗原。實質上，本方法涉及鑒別一種作為上面討論的類型的胞溶性T細胞的靶的細胞。一旦鑒別出這樣一種細胞，就可將總RNA轉化為一種cDNA文庫，然后將其轉染到能呈遞一種抗原的細胞樣品中，所述抗原與有關的HLA分子形成復合物。將該轉染子與上文中討論的CTL接觸，再者，觀察到CTL的靶擊作用(溶解和/或TNF生產)。然后對被裂解的這些轉染子進行處理，以去除cDNA，并進行測序，并且按照該方式可鑒別出異常狀態(tài)的前體例如腫瘤排斥抗原前體。本發(fā)明的其他方面對本領域技術人員而言是顯而易見的，并在此不再重復。已經(jīng)使用的術語和表示方式是用作為描述的術語。不是為了限制發(fā)明，并不打算使用這樣的術語和表達方式而排除具有相同特性的等價體或其部分，因為應認識到各種可能的修改都在本發(fā)明范圍內。序列表(1)一般信息(i)申請人Wolfel，Thomas；VanPel，Aline；Brichard，Vincent；Boon-Falleur，Thierry(ii)發(fā)明名稱酪氨酸酶衍生的分離肽及其應用(iii)序列數(shù)10(iv)聯(lián)系地址(A)聯(lián)系人Felfe&amp;Lvnch(B)街道805ThirdAvenue(C)城市紐約市(D)州紐約(F)郵編10022(v)計算機可讀形式(A)媒介類型5.25寸磁盤，360kb存儲(B)計算機IBM(C)操作系統(tǒng)PC-DOS(D)軟件Wordperfect(vi)本申請資料(A)申請?zhí)?8/233,305(B)申請日1994年4月26日(C)分類514(vi)本申請資料(A)申請?zhí)?8/203,054(B)申請日1994年2月28日(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)?8/081,673(B)申請日1993年6月23日(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)?8/054,714(B)申請日1993年4月28日(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)?7/994,928(B)申請日1992年12月22日(xiii)律師/代理人信息(A)姓名Hanson，NormanD(B)注冊號30，946(C)文檔號LUD5360.1(ix)通訊信息(A)電話(212)688-9200(B)傳真(212)838-3884(2)SEQIDNO1的信息(i)序列特征(A)長度1894bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQIDNO1GGAAGAATGCTCCTGGCTGTTTTGTACTGCCTGCTGTGGAGTTTCCAG48GlyArgMetLeuLeuAlaValLeuTyrCysLeuLeuTrpSerPheGln-15-10-5ACCTCCGCTGGCCATTTCCCTAGAGCCTGTGTCTCCTCTAAGAACCTG96ThrSerAlaGlyHisPheProArgAlaCysValSerSerLysAsnLeu1510ATGGAGAAGGAATGCTGTCCACCGTGGAGCGGGGACAGGAGTCCCTGT144MetGlyLysGluCysCysProProTrpSerGlyAspArgSerProCys15202530GGCCAGCTTTCAGGCAGAGGTTCCTGTCAGAATATCCTTCTGTCCAAT192GlyGlnLeuSerGlyArgGlySerCysGlnAsnIleLeuLeuSerAsn354045GCACCACTTGGGCCTCAATTTCCCTTCACAGGGGTGGATGACCGGGAG240AlaProLeuGlyProGlnPheProPheThrGlyValAspAspArgGlu505560TCGTGGCCTTCCGTCTTTTATAATAGGACCTGCCAGTGCTCTGGCAAC288SerTrpProSerValPheTyrAsnArgThrCysGlnCysSerGlyAsn657075TTCATGGGATTCAACTGTGGAAACTGCAAGTTTGGCTTTTGGGGACCA336PheMetGlyPheAsnCysGlyAsnCysLysPheGlyPheTrpGlyPro808590AACTGCACAGAGAGACGACTCTTGGTGAGAAGAAACATCTTCGATTTG384AsnCysThrGluArgArgLeuLeuValArgArgAsnIlePheAspLeu95100105110AGTGCCCCAGAGAAGGACAAATTTTTTGCCTACCTCACTTTAGCAAAG432SerAlaProGluLysAspLysPhePheAlaTyrLeuThrLeuAlaLys115120125CATACCATCAGCTCAGACTATGTCATCCCCATAGGGACCTATGGCCAA480HisThrIleSerSerAspTyrValIleProIleGlyThrTyrGlyGln130135140ATGAAAAATGGATCAACACCCATGTTTAACGACATCAATATTTATGAC528MetLysAsnGlySerThrProMetPheAsnAspIleAsnIleTyrAsp145150155CTCTTTGTCTGGATGCATTATTATGTGTCAATGGATGCACTGCTTGGG576LeuPheValTrpIleHisTyrTyrValSerMetAspAlaLeuLeuGly160165170GGATCTGAAATCTGGAGAGACATTGATTTTGCCCATGAAGCACCAGCT624GlyTyrGluIleTrpArgAspIleAspPheAlaHisGluAlaProAla175180185190TTTCTGCCTTGGCATAGACTCTTCTTGTTGCGGTGGGAACAAGAAATC672PheLeuProTrpHisArgLeuPheLeuLeuArgTrpGluGlnGlyIle195200205CAGAAGCTGACAGGAGATGAAAACTTCACTATTCCATATTGGGACTGG720GlnLysLeuThrGlyAspGlyAsnPheThrIleProTyrTrpAspTrp210215220CGGGATGCAGAAAAGTGTGACATTTGCACAGATGAGTACATGGGAGGT768ArgAspAlaGluLysCysAspIleCysThrAspGlyTyrMetGlyGly225230235CAGCACCCCACAAATCCTAACTTACTCAGCCCAGCATCATTCTTCTCC816GlnHisProThrAsnProAsnLeuLeuSerProAlaSerPhePheSer240245250TCTTGGCAGATTGTCTGTAGCCGATTGGAGGAGTACAACAGCCATCAG864SerTrpGlnIleValCysSerArgLeuGluGluTyrAsnSerHisGln255260265270TCTTTATGCAATGGAACGCCCGAGGGACCTTTACGGCGTAATCCTGGA912SerLeuCysAsnGlyThrProGluGlyProLeuArgArgAsnProGly275280285AACCATGACAAATCCAGAACCCCAAGGCTCCCCTCTTCAGCTGATGTA960AsnHisAspLysSerArgThrProArgLeuProSerSerAlaAspVal290295300GAATTTTGCCTGAGTTTGACCCAATATGAATCTGGTTCCATGGATAAA1008GluPheCysLeuSerLeuThrGlnTyrGluSerGlySerMetAspLys305310315GCTGCCAATTTCAGCTTTAGAAATACACTGGAAGGATTTGCTAGTCCA1056AlaAlaAsnPheSerPheArgAsnThrLeuGluGlyPheAlsSerPro320325330CTTACTGGGATAGCGGATGCCTCTCAAAGCAGCATGCACAATGCCTTG1104LeuThrGlyIleAlaAspAlaSerGlnSerSerMetHisAsnAlaLeu335340345350CACATCTATATGAATGGAACAATGTCCCAGGTACAGGGATCTGCCAAC1152HisIleTyrMetAsnGlyThrMetSerGlnMetGlnGlySerAlaAsn355360365GATCCTATCTTCCTTCTTCACCATGCATTTGlTGACAGTATTTTTGAG1200AspProIlePheLeuLeuHisHisAlaPheValAspSerIlePheGlu370375380CAGTGGCTCCAAAGGCACCGTCCTCTTCAAGAAGTTTATCCAGAAGCC1248GlnTrpLeuArgArgHisArgProLeuGlnGluValTyrProGluAla385390395AATGCACCCATTGGACATAACCGGGAATCCTACATGGTTCCTTTTATA1296AsnAlaProIleGlyHisAsnArgGluSerTyrMetValProPheIle400405410CCACTGTACAGAAATGGTGATTTCTTTATTTCATCCAAAGATCTGGGC1344ProLeuTyrArgAsnGlyAspPhePheIleSerSerLysAspLeuGly415420425430TATGACTATAGCTATCTACAAGATTCAGACCCAGACTCTTTTCAAGAC1392TyrAspTyrSerTyrLeuGlnAspSerAspProAspSerPheGlnAsp435440445TACATTAAGTCCTATTTGGAACAAGCGAGTCGGATCTGGTCATGGCTC1440TyrIleLysSerTyrLeuGlyGlnAlaSerArgIleTrpSerTrpLeu450455460CTTGGGGCGGCGATGGTAGGGGCCGTCCTCACTGCCCTGCTGGCAGGG1488LeuGlyAlaAlaMetValGlyAlaValLeuThrAlaLeuLeuAlaGly465470475CTTGTGAGCTTGCTGTGTCGTCACAAGAGAAAGCAGCTTCCTGAAGAA1536LeuValSerLeuLeuCysArgHisLysArgLysGlnLeuProGluGlu480485490AAGCAGCCACTCCTCATGGAGAAAGAGGATTACCACAGCTTGTATCAG1584LysGlnProLeuLeuMetGluLysGluAspTyrHisSerLeuTyrGln495500505510AGCCATTTA1593SerHisLeu513TAAAAGGCTTAGGCAATAGAGTAGGGCCAAAAAGCCTGACCTCACTCTAACTCAAAGTAA1653TGTCCAGGTTCCCAGAGAATATCTGCTGGTATTTTTCTGTAAAGACCATTTGCAAAATTG1713TAACCTAATACAAAGTGTAGCCTTCTTCCAACTCAGGTAGAACACACCTGTCTTTGTCTT1773GCTGTTTTCACTCAGCCCTTTTAACATTTTCCCCTAAGCCCATATGTCTAAGGAAAGGAT1833GCTATTTGGTAATGAGGAACTGTTATTTGTATGTGAATTAAAGTGCTCTTATTTTAAAAA1893A1894(2)SEQIDNO2的信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸殘基(B)類型氨基酸(D)拓撲結構單鏈(xi)序列描述SEQIDNO2TyrMetAsnGlyThrMetSerGlnVal5(2)SEQIDNO3的信息(i)序列特征(A)長度10個氨基酸殘基(B)類型氨基酸(D)拓撲結構單鏈(xi)序列描述SEQIDNO3MetLeuLeuAlaValLeuTyrCysLeuLeu510(2)SEQIDNO4的信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸殘基(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQIDNO4MetLeuLeuAlaValLeuTyrCysLeu5(2)SEQIDNO5的信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸殘基(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQIDNO5LeuLeuAlaValLeuTyrCysLeuLeu5(2)SEQIDNO6的信息(i)序列特征(A)長度13個氨基酸殘基(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQIDNO6SerGluIleTrpArgAspIleAspPheAlaHisGluAla5l0(2)SEQIDNO7的信息(i)序列特征(A)長度10個氨基酸殘基(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQIDNO7SerGluIleTrpArgAspIleAspPheAla510(2)SEQIDNO8的信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸殘基(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQIDNO8SerGluIleTrpArgAspIleAspPhe5(2)SEQIDNO9的信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸殘基(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQIDNO9GluIleTrpArgAspIleAspPheAla5(2)SEQIDNO10的信息(i)序列特征(A)長度10個氨基酸殘基(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQIDNO10GluGluAsnLeuLeuAspPheValArgPhe510權利要求1.用于鑒別一種候選患者的方法，該候選患者適用于用特異于MHC分子和酪氨酸酶衍生的肽形成的復合物的治療劑進給治療，復合物中的肽選自于下列組SEQIDNO4，SEQIDNO7和SEQIDNO8，該方法包括(i)將來自患者的異常細胞樣品與特異于所說復合物的胞溶性T細胞接觸，并且(ii)確定至少部分所述異常細胞樣品發(fā)生的溶解，指明該候選患者適用于所述治療。2.根據(jù)權利要求1所述方法，其中所述MHC分子是HLA-A2。3.根據(jù)權利要求1所述方法，其中所述MHC分子是HLA-B44。4.用于治療患有細胞異常的患者的方法，包括給所述患者施用一定量的藥劑，該藥劑促進一種胞溶性T細胞對在其表面呈遞MHC分子和一種酪氨酸酶衍生物肽形成的復合物的細胞進行應答，所述肽選自于SEQIDNO4，SEQIDNO7和SEQIDNO8的組，該藥劑量足以刺激對其表面呈遞所述復合物的異常細胞產生應答。5.根據(jù)權利要求3的方法，其中所述MHC分子是HLA-A2。6.根據(jù)權利要求4所述方法，其中所述MHC分子是HLA-B44。7.根據(jù)權利要求4所述方法，其中所述藥劑包括一種編碼人酪氨酸酶的載體。8.根據(jù)權利要求7所述方法，其中所述藥劑進一步包括編碼HLA-A2的第二載體。9.根據(jù)權利要求7所述方法，其中所述藥劑進一步包括編碼HLA-B44的第二載體。10.根據(jù)權利要求7所述方法，其中所述載體還編碼HLA-A2。11.根據(jù)權利要求7所述方法，其中所述載體還編碼HLA-B44。12.根據(jù)權利要求4所述方法，其中所述藥劑是一種在其表面呈遞所述復合物的非增殖細胞的樣品。13.治療細胞異常的方法，該方法包括給患有細胞異常的患者施用一定量的足以使所述異常細胞溶解的特異于所述復合物的胞溶性T細胞，所述細胞異常的特征在于在異常細胞表面呈遞一種MHC分子和酪氨酸酶衍生的肽的復合物，所述肽選自于下列組SEQIDNO4，SEQIDNO7和SEQIDNO8。14.根據(jù)權利要求13所述方法，其中所述MHC分子是HLA-A2。15.根據(jù)權利要求13所述方法，其中所述MHC分子是HLA-B44。16.根據(jù)權利要求13所述方法，其中所述胞溶性T細胞是自體的。17.離體的胞溶性T細胞，特異于選自于HLA-A2組的一種MHC分子和選自于SEQIDNO4，SEQIDNO7和SEQIDNO8組的酪氨酸酶衍生肽形成的復合物。18.根據(jù)權利要求17所述的離體的胞溶性T細胞，特異于HLA-A2和SEQIDNO4形成的復合物。19.根據(jù)權利要求17所述的離體的胞溶性T細胞，特異于HLA-B44和SEQIDNO7形成的復合物。20.根據(jù)權利要求17所述的離體的胞溶性T細胞，特異于HLA-B44和SEQIDNO8形成的復合物。21.鑒別一種異常細胞的方法，其中異常細胞在其表面呈遞MHC分子和選自于SEQIDNO4，SEQIDNO7和SEQIDNO8組成的組的酪氨酸酶衍生的肽的復合物，該方法包括將異常細胞樣品與特異于所述復合物的胞溶性T細胞接觸，并確定所述異常細胞的溶解，以確定呈遞所述復合物的細胞。22.根據(jù)權利要求21所述方法，其中所述MHC分子是HLA-A2。23.根據(jù)權利要求21所述方法，其中所述MHC分子是HLA-B44。24.離體的肽，選自于由SEQIDNO4，SEQIDNO7和SEQIDNO8組成的組。全文摘要本發(fā)明涉及對異常細胞表面上存在的人白細胞抗原分子和酪氨酸酶衍生的肽的復合物進行鑒別。本發(fā)明還涉及對上述觀察到的異常狀態(tài)進行治療和診斷的方法。文檔編號A61K38/00GK1154144SQ95191855公開日1997年7月9日申請日期1995年2月16日優(yōu)先權日1994年2月28日發(fā)明者托馬斯·沃爾費爾,阿蘭·范佩爾,文森特·布里查德,蒂爾瑞·布恩-法勒爾申請人:路德維格癌癥研究所