專利名稱：蝶酸及其綴合物的合成和純化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蝶酸和蝶酸衍生物的純化，以及涉及與其它化合物 綴合的i茱酸和蝶酸的類似物和衍生物的純化。本發(fā)明還涉及制備與 其它化合物綴合的蝶酸和蝶酸的類似物和衍生物的方法。本發(fā)明還 涉及用與其它化合物綴合的蝶酸和蝶酸的類似物和衍生物治療患者 的方法。
背景
蝶酸是制備葉酸酯衍生物的 一 種常規(guī)原料，可將其與藥物結(jié)合 以用作治療上的綴合物(conjugates),所述綴合物包括以維生素受體為 基礎(chǔ)的耙標(biāo)作用綴合物。維生素-藥物綴合物可被靶向作用于例如獨(dú) 特表達(dá)、過(guò)度表達(dá)或優(yōu)先表達(dá)維生素受體的癌細(xì)胞。例如， 一直使 用蝶酸作為制備一種綴合物的原料，所述綴合物包含一種通過(guò)丫羧基 連接的亞乙基二胺橋連接于熒光素的葉酸衍生物。這種綴合物在美 國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)09/822，379中描迷，該專利公開(kāi)內(nèi)容結(jié)合到本發(fā) 明中作為參考。所述綴合物被用于以熒光素標(biāo)記病原性細(xì)胞(如癌細(xì) 胞)，使癌細(xì)胞為抗原性的，以使其能被宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別和清除。
蝶酸可通過(guò)各種常規(guī)方法制備，所述方法包括合成、葉酸的凝: 生物降解、葉酸的酶降解、葉酸的水解以及其它常規(guī)方法。 一般來(lái)
說(shuō)，通過(guò)這些方法制備的蝶酸通?？杀幌喈?dāng)量的葉酸污染。例如，
經(jīng)酶降解制備的蝶酸可含有25%的葉酸。因此，需要有效的方法除 去葉酸污染物以及源于蝶酸制備的其它雜質(zhì)。
可使用合成方法制備維生素-藥物綴合物，包括蝶酸的綴合物。 在某些情況下，那些合成方法還可以導(dǎo)致副產(chǎn)物、雜質(zhì)或其它污染 物的形成。因此，需要合成和/或純化方法來(lái)避免形成這些副產(chǎn)物、 雜質(zhì)或其它污染物，或者除去這些副產(chǎn)物、雜質(zhì)或源于維生素-藥物 綴合物的其它污染物。
發(fā)明概述
本發(fā)明描述純化蝶酸、蝶酸衍生物及其組合的方法。在通過(guò)層 析法純化蝶酸、蝶酸衍生物及其組合的一個(gè)示例性實(shí)施方案中，本 發(fā)明所述的方法包括以下步驟(a)使包含蝶酸、蝶酸衍生物或其組 合的溶液與離子交換層析載體(s叩port)接觸；(b)用pH約為10或10 以上的流動(dòng)相洗脫包含蝶酸、蝶酸衍生物或其組合的第 一 種流分 (fraction); (c)將第一種流分的pH降低至約3或3以下；以及(d)沉 淀蝶酸、蝶酸衍生物或其組合。
在通過(guò)層析法純化蝶酸、蝶酸衍生物及其組合的另 一 示例性實(shí) 施方案中，本發(fā)明所述的方法包括以下步驟(a)使包含蝶酸、蝶酸 衍生物或其組合的溶液與陰離子交換層析載體接觸；和(b)洗脫包含 蝶酸、蝶酸衍生物或其組合的笫一種流分。
本發(fā)明所述的方法還可任選包括洗脫包含葉酸、葉酸衍生物或 其組合的第二種流分的步驟(e)，其中第 一種流分和第二種流分基本 分離。實(shí)際的分離包括通過(guò)時(shí)間、通過(guò)預(yù)定的流分?jǐn)?shù)目或者其它定 量或定性的判定而確定的分離，其表明在第一和第二種流分洗脫期 間，笫一和笫二種流分基本上不重疊。
脂、陰離子交換樹(shù)脂、糖基樹(shù)脂、糖基離子交換樹(shù)脂、糖基陰離子 交換樹(shù)脂等。本發(fā)明所述層析方法中的流動(dòng)相包括^(旦不限于具有pH約為10或10以上、約11或11以上或者具有pH范圍為約11-13的 水相。在一示例性變化方面，流動(dòng)相不含或基本不含氨或其鹽。本 發(fā)明所述層析方法中的流動(dòng)相還可任選包括有機(jī)共溶劑，如丙酮、 四氫呋喃、乙腈、醇類(包括MeOH、 EtOH等)以及其它溶劑等。
在另 一示例性實(shí)施方案中，描述純化包含蝶酸或其衍生物和焚 光素或其衍生物的綴合物的方法。在一方面，那些方法包括以下步 驟(a)使包含所述綴合物的溶液與第一種反相層析載體接觸；(b)用 流動(dòng)相洗脫包含所述綴合物的磷酸鹽復(fù)合物(compex)的笫 一 種流 分，該流動(dòng)相包含磷酸鹽，且pH范圍約為6-8; (c)使笫一種流分與 第二種反相層析載體接觸；以及(d)用含水的流動(dòng)相洗脫包含所述 綴合物的第二種流分，其中所述笫二種流分基本上無(wú)磷酸鹽。
C8樹(shù)脂、C18樹(shù)脂、其封端變體(capped versions)等。本發(fā)明所述層 析方法中的流動(dòng)相包括但不限于水相，其具有的pH為近中性或者稍 孩i中性以上，包括pH范圍約7.1-7.7，如pH約為7.4。在一示例性 的變化方面，流動(dòng)相包括一或多種磷酸鹽。在另一示例性的變化方 面，流動(dòng)相不含或基本不含磷酸鹽。本發(fā)明所述層析方法中的流動(dòng) 相還可任選包括有機(jī)共溶劑，如MeOH、 EtOH、丙酮、四氫p夫喃、 乙腈等。
在另 一示例性實(shí)施方案中，進(jìn)行本發(fā)明所述方法得到純化的化 合物和組合物，包括蝶酸、蝶酸衍生物及其組合、以及包括具有預(yù) 定純度的包含蝶酸或其衍生物和熒光素或其衍生物的綴合物，其純 度包括約95%或以上、98%或以上以及99%或以上的純度。本發(fā)明 中所用的純度測(cè)定可以基于重量百分比、摩爾百分比等計(jì)算。另外，
熒光素成分、雙熒光素成分等。還應(yīng)清楚的是純度測(cè)定適用于根據(jù) 本發(fā)明所述方法純化的化合物和組合物的溶液。在那些情況下，包 括重量百分比和摩爾百分比量度的純度測(cè)定涉及不計(jì)溶劑的溶液的
組分。
在另一示例性實(shí)施方案中，描述制備蝶酸或其衍生物和熒光素 或其衍生物的綴合物的方法。
在另一示例性實(shí)施方案中，描述具有某些預(yù)定純度要求的化合 物和組合物。在一方面，所述化合物和/或組合物包括蝶酸、蝶酸衍 生物及其組合。在另一方面，所述化合物和/或組合物包括蝶酸或其 衍生物與焚光素或其衍生物的綴合物。在一變化中，本發(fā)明所述的 示例性化合物和/或組合物的純度要求包括約95%或以上、98%或以 上以及99%或以上的純度，并可以基于重量百分?jǐn)?shù)、摩爾百分?jǐn)?shù)等 計(jì)。在另一變化中，本發(fā)明所述的示例性化合物和/或組合物的純度
成分、雙熒光素成分等)下的純度測(cè)定。
在另一示例性實(shí)施方案中，描述治療需要解除對(duì)調(diào)節(jié)或清除病 原性細(xì)胞感應(yīng)的疾病的患者、哺乳動(dòng)物或動(dòng)物的方法。在一方面， 描述在患者、哺乳動(dòng)物或動(dòng)物中增強(qiáng)病原性細(xì)胞群的內(nèi)源性免疫應(yīng) 答介導(dǎo)的清除的方法。本發(fā)明所述示例性的方法包括給予需要解除 病情的患者、哺乳動(dòng)物或動(dòng)物有效量的包含配體-熒光素綴合物的組 合物的步驟。在另一示例性方面，本發(fā)明描述各種方法，其中當(dāng)給 予需要解除病情的患者、哺乳動(dòng)物或動(dòng)物所述組合物時(shí)，所述組合 物包括預(yù)定最高水平的一或多種雙熒光素組分(如不超過(guò)0.1%或 0.05。/。)或者無(wú)或基本上無(wú)一或多種雙焚光素組分。
用于提供維生素-藥物綴合物所迷的純化方法聯(lián)合使用。
圖的簡(jiǎn)述


圖1A表明在純化蝶酸中，從DEAE纖維素柱(DE32)上洗脫的 流分在280 nm處的UV吸收。
圖1B表明在純化蝶酸中，從DEAE纖維素柱(DE32)上洗脫的
流分38的CI8反相HPLC圖語(yǔ)(trace)。
圖2表明分離的葉酸酯-焚光素綴合物對(duì)固體腫瘤生長(zhǎng)的影響。
發(fā)明詳述
本發(fā)明描述純化蝶酸、蝶酸的衍生物和類似物和/或其組合的方 法。在一實(shí)施方案中，所述方法包括以下步驟(a)使包含蝶酸、蝶 酸的衍生物或類似物和/或其組合的溶液與離子交換層析載體接觸；(b) 用pH約為10或10以上的流動(dòng)相洗脫包含蝶酸、蝶酸的衍生物或類 似物和/或其組合的第一種流分；(c)將第一種流分的pH降低至約3 或3以下；以及(d)沉淀蝶酸、蝶酸的衍生物或類似物和/或其組合。
在一變化中，本發(fā)明所述的方法還可包括洗脫包含葉酸、葉酸 衍生物或其組合的第二種流分的步驟(e)，其中第 一種流分和第二種 流分基本分離?；镜姆蛛x可通過(guò)任何數(shù)目的客觀定量或定性的標(biāo) 準(zhǔn)確定，包括但不限于經(jīng)過(guò)時(shí)間、流分?jǐn)?shù)目、基線評(píng)估或者其它評(píng) 估洗脫流分之間重疊度，由此評(píng)估第 一和/或第二種流分的可能交叉 污染的可能性和程度的方法。已觀察到對(duì)于某些糖基層析載體或樹(shù) 脂，葉酸流分在時(shí)間上先于蝶酸流分洗脫，后者在較晚時(shí)被洗脫。 例如，對(duì)于DEAE纖維素層析載體，已觀察到葉酸流分在時(shí)間上先 于蝶酸流分洗脫，后者在較晚時(shí)被洗脫。然而，應(yīng)清楚對(duì)于不同的 層析載體，包括不同的糖基層析栽體，應(yīng)考慮到本發(fā)明所述的第一 種和笫二種流分的洗脫順序可以改變。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明所迷的方法包括以下步驟(a)使包 含蝶酸、蝶酸衍生物或其組合的溶液與陰離子交換層析載體接觸； 和(b)洗脫包含蝶酸、蝶酸衍生物或其組合的第一種流分。
在一種變化中，洗脫步驟包括具有pH約為11或以上或者pH 約為11.5或以上的流動(dòng)相。在另一種變化中，pH范圍約為11-13。 流動(dòng)相的pH可通過(guò)加入各種堿來(lái)調(diào)節(jié)或獲得，所迷44包括但不限于 NaOH、 K0H、 Na2C03、 NaHC03、 KHC03、 K2C03、順4011等。
在一方面，本發(fā)明所述層析方法中的層析載體包括但不限于離
子交換樹(shù)脂、陰離子.交換樹(shù)脂、糖基樹(shù)脂(sacchaiide-based resins)、 糖基離子交換樹(shù)脂、糖基陰離子交換樹(shù)脂等。糖基層析載體包括一 或多種纖維素、直鏈淀粉、瓊脂糖、瓊脂糖凝膠、交聯(lián)葡聚糖凝膠 (sephadex)樹(shù)脂及其組合。在另一方面，糖基層析載體包括離子交換 樹(shù)脂，如陰離子交換樹(shù)脂和陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。示例性糖基離子交換 樹(shù)脂包括二乙基氨基乙基(DEAE)纖維素或者季胺(QA)纖維素固體載 體，如DE23、 DE32、 DE51、 DE52、 DE53和QA52,其均由Whatman 和/或Sigma獲得。在一示例性變化中，層析載體是一種預(yù)溶脹的微 粒型DE52陰離子交換劑(Whatman類目號(hào)4057-200)。在另一示例性 變化中，層析載體是一種預(yù)溶脹的艱t粒型DE32陰離子交換劑。其它 固體載體包括DEAE交聯(lián)葡聚糖凝膠、CM交聯(lián)葡聚糖凝膠、交聯(lián) 葡聚糖凝膠QA、瓊脂糖凝膠QA等。
在另一實(shí)施方案中，流動(dòng)相是包含水的反相流動(dòng)相。在另一實(shí) 施方案中，流動(dòng)相是包含水和鹽的反相流動(dòng)相。在另一實(shí)施方案中， 流動(dòng)相是包含水和有才幾溶劑的反相流動(dòng)相。在另一實(shí)施方案中，流 動(dòng)相是包含水、鹽和有^^溶劑的反相流動(dòng)相。在另一方面，流動(dòng)相 基本上不含或者完全不含氨或其鹽。
在另一實(shí)施方案中，流動(dòng)相是包含水的在特定pH下(包括中性 或近中性的pH)的反相流動(dòng)相。在一變化中，pH為稍高于中性，如 pH范圍約為7.1-7.7。在一方面，流動(dòng)相的pH的范圍為約7.3-7.5, 或者pH在約7.4。在另一實(shí)施方案中，流動(dòng)相是含水和鹽的反相流 動(dòng)相。在另一實(shí)施方案中，流動(dòng)相是包含水和有機(jī)溶劑的反相流動(dòng) 相。在另一實(shí)施方案中，流動(dòng)相是包含水、鹽和有機(jī)溶劑的反相流 動(dòng)相。在另一方面，流動(dòng)相基本上不含或者完全不含氨或其鹽。
層析特性可利用相對(duì)固定組成或者相對(duì)變化組成的流動(dòng)相，包 括但不限于無(wú)梯度模式(profiles)、階躍函數(shù)、筒單梯度、復(fù)雜梯度、 線性梯度、對(duì)數(shù)梯度及其這些模式的組合等。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明所迷方法中使用的流動(dòng)相還可任選 包括作為組分的有機(jī)溶劑，如丙酮、四氫呋喃、乙腈、醇類(包括
MeOH、 EtOH等)以及其它溶劑等。當(dāng)流動(dòng)相包括兩種組分時(shí)，如具 有堿性pH的水性組分和有機(jī)溶劑組分，可以以無(wú)梯度方式或者以梯 度方式，通過(guò)層析載體洗脫流動(dòng)相。應(yīng)清楚的是梯度方式可遵循各 種模式，包括線性、對(duì)數(shù)、雙曲線、拋物線、指數(shù)、階梯及其組合。
在另一實(shí)施方案中，柱層析中的洗脫液可通過(guò)包括但不限于下 列的任何常規(guī)技術(shù)監(jiān)測(cè)，紫外(UV)吸收、熒光、折光率(RI)、液相層 析質(zhì)譜(LCMS)、串聯(lián)質(zhì)譜法(MS/MS)等。例如，根據(jù)監(jiān)測(cè)，將洗脫 液分成一或多個(gè)流分，混合含有所要求產(chǎn)物且具有指定閾值或閾值 以上的純度的流分。所混合的流分包括在沉淀步驟中。
在沉淀步驟的另一實(shí)施方案中，可通過(guò)將溶液的pH降低至約3.5 或以下、約3或以下、約2.5或以下或者約2或以下，將包含在洗脫 液的流分或混合流分中的蝶酸或其類似物或衍生物沉淀出來(lái)?？赏?過(guò)加入能夠?qū)H降低至約3.5或以下、約3或以下、約2.5或以下 或者約2或以下的任何種類的酸或任何酸的組合降低pH。示例性的 酸包括但不限于鹽酸、氫溴酸、硫酸及其鹽、磷酸及其鹽、硝酸等。
在一方面，將沉淀和/或純化的蝶酸或其類似物或衍生物純化至 約95%純度或以上、約96%純度或以上、約97%純度或以上、約98% 或純度以上、約99%純度或以上或者約100%的純度。在另一方面， 所沉淀的蝶酸或其類似物或衍生物基本上不含葉酸。所沉淀的蝶酸
層析或光譜技術(shù)，如高壓或高效液相層析(HPLC)、核f茲共振光譜、 TLC、 UV吸收光鐠、焚光光譜等。
在另一方面，所沉淀或純化的蝶酸、蝶酸類似物和/或4萊酸衍生 物具有理解為基本純的純度，或者從一或多種不希望有的或不需要 的組分、雜質(zhì)或污染物中基本提純出來(lái)。例如，可將這些化合物的 純度理解為具有小于某一百分率的一或多種組分，如約5%或以下的
雜質(zhì)、約4°/?；蛞韵碌碾s質(zhì)、約3%或以下的雜質(zhì)、約2%或以下的雜 質(zhì)或者約1%或以下的雜質(zhì)。類似地，可將這些化合物的純度理解為 具有小于某一百分率的特定組分，如約5%或以下、約4%或以下、 約3%或以下、約2%或以下，或者約1%或以下的葉酸。
在另一實(shí)施方案中，蝶酸、蝶酸類似物以及蝶酸衍生物通過(guò)本 發(fā)明所述的合成方法制備。這些合成方法生成具有高的總百分純度 的化合物，如約95%純度或以上、約96%純度或以上、約97%純度 或以上、約98%純度或以上、約99%純度或以上或者約100%的純度。 類似地，作為使用的合成方法的結(jié)果，無(wú)論單獨(dú)使用或者與本發(fā)明 所述的純化方法結(jié)合使用時(shí)，可將通過(guò)本發(fā)明所述合成方法制備的 這些蝶酸、蝶酸類似物以及蝶酸衍生物的純度理解為具有小于某一 百分率的特定組分，如約5%或以下、約4%或以下、約3%或以下、 約2%或以下，或者約1 %或以下的葉酸。
應(yīng)理解可以避免或除去所得到的蝶酸、蝶酸類似物、蝶酸書(shū)亍生 物或其組合中的特定組分。那些組分可通過(guò)使用本發(fā)明所述的合成
純化方法組合獲得的物質(zhì)。
在一實(shí)施方案中，蝶酸或蝶酸的衍生物源于降解過(guò)程，如葉酸 或葉酸的衍生物的降解。在一方面，蝶酸或蝶酸的衍生物源于酶降 解過(guò)程，如葉酸或葉酸的衍生物的酶降解。在另一方面，蟲(chóng)萊酸或蝶 酸的衍生物源于纟鼓生物降解過(guò)程，如葉酸或葉酸的衍生物的樣t生物 降解。在另一方面，蝶酸或蝶酸的衍生物源于化學(xué)降解過(guò)程，如葉 酸或葉酸的衍生物的化學(xué)降解。在另一實(shí)施方案中，蝶酸或蝶酸的 衍生物源于化學(xué)合成。
在微生物降解過(guò)程的一實(shí)施方案中，通過(guò)將葉酸或其衍生物的 樣本與糞產(chǎn)堿桿菌、假單胞菌(Psuedomonad)、假單胞ATCC 25301 、
產(chǎn)黃菌屬、漿果產(chǎn)黃桿菌(flavobacterium baccalis)接觸，可將葉酸或其書(shū)亍 生物水解為蝶酸。進(jìn)行葉酸微生物降解的示例性條件在以下文獻(xiàn)中 描述，Houlihan等，Anal. Biochem., 46: 1-6 (1972); Pratt et al., J Biol.Chem., 243:6367 (1968); Levy et al., J Biol, Chem., 242:2933 (1967); Scott, Methods in Enzymology, 66:657-60 (1980); Lemon et al., "Conversion of pterolyglutamic acid to pteroic acid by bacterial degradation" Archives of Biochemistry 19:311-16 (1948);這些/〉開(kāi)內(nèi)
容結(jié)合到本發(fā)明中作為參考。
在酶降解過(guò)程的 一 實(shí)施方案中，通過(guò)將葉酸或其衍生物的樣本 與一或多種酶諸如羧肽酶(包括羧肽酶G、羧肽酶A)、酰胺酶、脂肪 酶、酯酶和蛋白酶及其組合接觸，可將葉酸或其衍生物水解為蝶酸。 在羧肽酶G情況下，可在稍^喊性pH下，例如pH約7.3, ^使葉酸與 酶接觸。進(jìn)行葉酸酶降解的示例性條件在以下文獻(xiàn)中描述，Harvison & Kalman, J. Med. Chem. 35:1227-33 (1992); Nomura et al., J. Org. Chem., 65:5016-21 (2000);美國(guó)專利No. 4,337,339，這些公開(kāi)內(nèi)容結(jié)合到本
發(fā)明中作為參考。
在化學(xué)降解過(guò)程的一實(shí)施方案中，通過(guò)在酸或堿性水解或者在
急化條件下，通常在水性介質(zhì)，任選添加可溶混的有機(jī)共溶劑中， 通過(guò)接觸葉酸或其衍生物的樣本，可將葉酸或其衍生物水解為蝶酸。
在另一實(shí)施方案中，使用本發(fā)明所述方法純化的蝶酸或蝶酸的 類似物或衍生物得自于常規(guī)降解或合成過(guò)程，并且受到葉酸或其類 似物或衍生物的污染。例如，將葉酸或其類似物或衍生物轉(zhuǎn)化為蟲(chóng)萊 酸或其對(duì)應(yīng)的類似物或衍生物的酶降解過(guò)程不可能發(fā)生完全轉(zhuǎn)化。 因此，所得到的混合物可包括蝶酸或其衍生物、葉酸或其衍生物和/ 或酶降解過(guò)程或水解過(guò)程中形成的 一或多種部分降解或水解的中間 體產(chǎn)物或副產(chǎn)物。例如，葉酸或其衍生物的相對(duì)量在約1%-50%或者 約1%-25%的范圍。
在蝶酸或i某酸衍生物的化學(xué)合成的一實(shí)施方案中，可使蝶酸或
說(shuō)明書(shū)第10/41頁(yè)
蝶酸的衍生物或類似物與另一分子偶合，形成維生素-藥物綴合物。
在一方面，所述維生素-藥物綴合物是美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)10/765,336 中描述的綴合物。在另一方面，所述維生素-藥物綴合物例如是蝶酸 或蝶酸的類似物或衍生物與一種抗原成分的綴合物，并且包括在美 國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)09/822,379中描述的綴合物，該專利結(jié)合到本發(fā) 明中作為參考。
在另一方面，所述維生素-藥物綴合物是根據(jù)下式描述<formula>formula see original document page 23</formula>
其中V是維生素或其類似物或衍生物，L是具有約1-100個(gè)原子長(zhǎng)度 的任選二價(jià)連接基團(tuán)(linker)。所述原子選自碳、氮、氧、硅、磷、 硫等。這些原子各自任選被氫、卣素和/或一或多個(gè)官能團(tuán)取代。示 例性官能團(tuán)包括但不限于羥基、氰基、硝基、氧代、硫代、任選取 代的亞氨基、任選取代的羥基亞氨基、任選取代的肼基、疊氮基、 任選取代的烷基、任選取代的鏈烯基、任選取代的炔基、任選取代 的烷氧基、任選取代的烷硫基、任選取代的烷基磺酰基、任選取代 的烷基磺酰氧基、任選取代的烷基磺?；被?、任選取代的氨基、 任選取代的眵及其衍生物、任選取代的酮及其衍生物、羧酸及其衍 生物、任選取代的芳基、氨基酸的側(cè)鏈、肽、其組合等。這些官能 團(tuán)可結(jié)合在一起形成連接于所述原子的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。這些官能團(tuán)還可 與原子結(jié)合在一起形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
在另一方面，所述維生素-藥物綴合物是蝶酸或其類似物或衍生 物與熒光素或其類似物或衍生物的綴合物。在另一方面，所述維生 素-藥物綴合物是式I化合物<formula>formula see original document page 24</formula> (I)
其中R1、 R2、 113和114各自獨(dú)立是氫、烷基、?；蜻m當(dāng)選擇的氮保 護(hù)基，或者W和W—起形成氮保護(hù)基；W是氫、烷基，或適當(dāng)選 擇的羧基保護(hù)基；m是0-4的整數(shù)；n是1-4的整數(shù)。在另一方面， 所述維生素-藥物綴合物是化合物8a (式I化合物，其中R1、 R2、 R3、 R4和R5是氫，m是l,和n是l)。
流程1中表明蝶酸及其衍生物的熒光素綴合物的一示例性化學(xué) 合成法。
流程1
(a)酰胺偶合劑；(b) a-羧基的選擇性脫保護(hù)；(c) H2NCH2(CH2)nNH2， n=l-4 (5); (d) 1. FITC (7); 2.任何RLR5的任選 脫保護(hù)。
其中R1、 R2、 113和114各自獨(dú)立是氫、烷基、?；蜻m當(dāng)選擇的氮保 護(hù)基，或者W和W—起形成氮保護(hù)基；W是氬、烷基，或適當(dāng)選 擇的羧基保護(hù)基；m是0-4的整數(shù)；和n是l-4的整數(shù)。
使保護(hù)的蝶酸類似物1與保護(hù)的氨基酸類似物2反應(yīng)，形成酰 胺3。蝶酸1的R1、 R2、 113和114的適合保護(hù)基包括酰胺保護(hù)基(如乙 ?；?、三氟乙?；?、氨基甲酸酯保護(hù)基(如tert-Boc、 Teoc、 Cbz、 Fmoc等)及其它。氨基酸類似物2的適合的保護(hù)基R5包括酯保護(hù)基(如 甲基、三甲基曱硅烷基乙基、叔丁基等)及其它。在一方面，當(dāng)W是 叔丁基時(shí)，將得到的酰胺3用酸選擇性保護(hù)，得到酰胺4。應(yīng)清楚在 該方面，適當(dāng)選擇蝶酸類似物1和氨基類似物2上存在的保護(hù)基， 使得在Y-羧酸酯保護(hù)基存在下將a-羧酸酯保護(hù)基選擇性脫去保護(hù)。
將酰胺3或?qū)?yīng)的脫保護(hù)類似物4用式H2NCH2(CH2)nNH2 (其中 11=1-4)的亞烷基二胺處理，得到胺6。將該末端曱基酯移位，形成酰 胺鍵。將胺6用熒光素異硫氰酸酯(FITC, 7)處理，形成維生素-藥物 綴合物8。
廣泛的各種酰胺偶合劑和條件均可用于本發(fā)明所迷的合成中， 包括但不限于羧酸衍生物，如酰氯等；活性酯，如五氟苯基酯、雍 基苯并三唑酯等；偶合劑，如(苯并三唑-l-基氧基)三吡咯烷子基憐六 氟磷酸鹽(PyBOP)、 BOP、 BOPCl、 DCC、 EDC、 HBTU、 TBTU、 PyBrOP 等。此處所述的酰胺偶合步驟的適合溶劑包括但不限于N,N-二曱基 甲酰胺(DMF)、 二曱亞砜(DMSO)、氯仿、二氯曱烷(DCM)、 N-曱基 吡咯烷酮(NMP)等。此處所述的酰胺偶合步驟可在多種溫度下進(jìn)行， 如約0。C-約50。C的溫度范圍，例如在室溫下。
此處所述的脫保護(hù)步驟可按任何常規(guī)的方式進(jìn)行，如使用Greene & Wuts "Protective Groups in Organic Synthesis," 2d Ed., John Wiley & Sons, New York, 1"1(結(jié)合到本發(fā)明中作為參考)中所述的試劑和反應(yīng) 條件。應(yīng)理解的是對(duì)去保護(hù)試劑和條件進(jìn)行選擇以使得可進(jìn)行脫保 護(hù)步驟，同時(shí)不會(huì)無(wú)意識(shí)地影響被保護(hù)的化合物上存在的其它官能團(tuán)，包括其它的保護(hù)基。例如，在流程1中，保護(hù)基RS是在保護(hù)基 W存在下且不影響W下除去的。在一示例性實(shí)施方案中，保護(hù)基R5 是叔丁基酯，而保護(hù)基R4是三氟乙?；０?。示例性脫去酸敏感性 保護(hù)基的脫保護(hù)劑包括但不限于三氟乙酸(TFA)、 HC1、 HBr、 AcOH、 HC02H等。脫保護(hù)反應(yīng)可在各種溶劑中進(jìn)行，所述溶劑包括但不限 于水、DCM、 EtOAc、 AcOH等。應(yīng)理解的是在反應(yīng)條件中還可包括 陽(yáng)離子清除劑以改善脫保護(hù)反應(yīng)的速率和/或總收率，包括使用AcOH 作為溶劑。此處所述的脫保護(hù)反應(yīng)可在多種溫度下進(jìn)行，如約0°C-約50。C的溫度范圍，例如在室溫下。
流程1的步驟(c)可在各種溶劑中進(jìn)行，包括但不限于THF、乙 醚、DMF、 DMSO、氯仿、DCM、 NMP等，并可在多種溫度下進(jìn)行， 如約0。C-約50°C的溫度范圍，例如室溫。類似地，流程l的步驟(d) 可在各種溶劑中進(jìn)行，包括但不限于THF、 DMF、 DMSO、氯仿、 CH2C12、 NMP、水等，并可在多種溫度如約0。C-約50。C的溫度范圍， 例如室溫下進(jìn)行?？上虿襟E(d)所示反應(yīng)中加入另外的堿，包括但不 限于通常由R'R2R3N代表的胺堿、Et3N、 N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)、 吡啶、二曱基吡啶、三曱基吡啶、4-二曱氨基吡啶(DMAP)等。
應(yīng)理解在與二胺H2NCH2(CH2)nNH2反應(yīng)的步驟(c)中，可同時(shí)且 方便地除去某些保護(hù)基。例如，當(dāng)W是酰胺保護(hù)基(如三氟乙?；? 時(shí)，可置換甲酯而形成y-谷氨酰胺的酰胺，并在N(10)上除去酰胺保 護(hù)基。在一變化中，選擇RM吏在與二胺H2NCH2(CH2)nNH2的反應(yīng)中 為穩(wěn)定的。
在另一變化中，通過(guò)將i皮保護(hù)的蝶酸類似物1轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的具 有離去基團(tuán)的羧酸衍生物，實(shí)現(xiàn)蝶酸類似物1與氨基酸類似物2的 反應(yīng)?？赏ㄟ^(guò)氨基酸類似物2的胺置換離去基團(tuán)，形成酰胺3。應(yīng)理 解的是可使用流程1中所示的合成法及其變化制備此處所述的蝶酸 類似物和蝶酸類似物的衍生物的焚光素綴合物。
流程2中顯示另一種示例性化學(xué)合成蝶酸及其衍生物的綴合物的方法。
流程2
<formula>formula see original document page 27</formula>
(a)酰胺偶合劑；(b)氨基酸氨基的選擇性保護(hù)；(c)酰胺偶合劑；(d) 亞烷基二胺的選擇性脫保護(hù)；(e) 1. FITC (7); 2. R'-R5中任一個(gè)的任 選脫保護(hù)。
其中R1、 R2、 113和114各自獨(dú)立是氫、烷基、酰基或適當(dāng)選擇的氮保 護(hù)基；W是氫、烷基或適當(dāng)選擇的羧基保護(hù)基；m是0-4的整數(shù)；n 是l-4的整數(shù)；和R6、 W和RS各自獨(dú)立是氫或適當(dāng)選擇的氮保護(hù)基。 使被保護(hù)的氨基酸類似物9與被保護(hù)的亞烷基二胺10反應(yīng)，形 成酰胺11。氨基酸類似物7的示例性保護(hù)基R6包括Fmoc、Cbz、tert-Boc 等。亞烷基二胺10的示例性保護(hù)基R 包括tert-Boc、 Fmoc、 Cbz等。 應(yīng)清楚的是所選擇的保護(hù)基能選擇性除去一或多個(gè)存在的保留的保 護(hù)基，同時(shí)不改變被保護(hù)分子上保留的其它官能團(tuán)的性質(zhì)。將得到 的酰胺11脫保護(hù)，得到氨基酸胺12,使其與被保護(hù)的蝶酸類似物1 偶合，其中蝶酸類似物1的示例性保護(hù)基R"如本文所述，形成酰胺 13。將得到的酰胺13脫保護(hù)，得到亞烷基二胺胺6。在某些變化中， 根據(jù)羧基保護(hù)基R5性質(zhì)不同，用于除去末端胺保護(hù)基R7和R8的條 件也可除去羧基保護(hù)基R5。例如，當(dāng)RS是叔丁基時(shí)，R7是tert-Boc
保護(hù)基，RS是氫時(shí)，在偶極性溶劑中用酸處理可除去兩種保護(hù)基。
將胺6用FITC處理，得到蝶酸-連接的FITC綴合物8。
如本文所述，廣泛的各種酰胺偶合劑和條件也適用于流程2中 所述的合成中，包括但不限于羧酸衍生物，如酰氯等；活化的酯， 如五氟苯基酯、幾基苯并三唑酯等；偶合劑，如PyBOP、 BOP、 B0PC1、 DCC、 EDC、 HBTU、 TBTU、 PyBrOP等。此處所述的酰胺偶合步 驟的適合溶劑包括但不限于DMF、 DMSO、氯仿、CH2C12、 NMP等。 此處所述的酰胺偶合步驟可在多種溫度下進(jìn)行，如約0。C-約50°C的 溫度范圍，例如在室溫下。
此處所述的脫保護(hù)步驟可按任何常規(guī)的方式進(jìn)行，如使用Greene & Wuts所述的試劑和反應(yīng)條件。應(yīng)理解的是對(duì)去保護(hù)試劑和條件進(jìn) 行選擇以使得可進(jìn)行脫保護(hù)步驟，同時(shí)不會(huì)無(wú)意識(shí)地影響被保護(hù)的 化合物上存在的其它官能團(tuán)，包括其它的保護(hù)基。例如，在流程2 中，保護(hù)基W是在保護(hù)基R5、 F7和RS存在下且不影響R5、 W和R8 下除去。在一示例性實(shí)施方案中，保護(hù)基W是Fmoc，保護(hù)基RS是 tert-Bu酯，保護(hù)基W是tert-Boc,而R8是氫。示例性脫去石咸敏感性 保護(hù)基的脫保護(hù)劑包括但不限于DBU、哌啶、嗎啉、TBAF等。脫 保護(hù)反應(yīng)可在各種溶劑中進(jìn)行，所述溶劑包括但不限于水、THF、乙 醚、DMF、 NMP、 CH2C12、 EtOAc等。此處所述的脫保護(hù)反應(yīng)可在 多種溫度下進(jìn)行，如約0。C-約50。C的溫度范圍，例如在室溫下。
流程2的步驟(c)可類似于步驟(a),用偶合劑和此處所述的反應(yīng) 條件進(jìn)行。該步驟可各種溶劑中進(jìn)行，包括但不限于THF、乙醚、 DMF、 DMSO、氯仿、CH2C12、 NMP等，并可在多種溫度下進(jìn)行， 如約0。C-約50°C的溫度范圍，例如在室溫下。類似地，流程1的步 驟(d)可在各種溶劑中進(jìn)行，包括但不限于THF、 DMF、 DMSO、氯 仿、CH2C12、 NMP、水等，并可在多種溫度下進(jìn)行，如約0。C-約50。C 的溫度范圍，例如在室溫下?？上虿襟E(d)所示的反應(yīng)中加入另外的 堿，包括但不限于通常由R'R211 代表的胺堿、Et3N、 DIPEA、吡
啶、二曱基吡啶、三曱基吡啶、DMAP等。
脫保護(hù)步驟(d)可按任何常規(guī)方式進(jìn)行。在一示例性實(shí)施方案中， 保護(hù)基R7是tert-Boc基，該基團(tuán)在化學(xué)上對(duì)酸敏感，而其它保護(hù)基 對(duì)酸并不敏感，如作為三氟乙酰基酰胺的W或者作為曱酯的R5。在 另一示例性實(shí)施方案中，保護(hù)基RS是叔丁酯，保護(hù)基R7是tert-Boc 基團(tuán)，這兩個(gè)基團(tuán)在化學(xué)上都對(duì)酸敏感，而其它保護(hù)基并不如此。 脫去這類酸敏感保護(hù)基的示例性脫保護(hù)劑包括但不限于TFA、 HC1、 HBr、 AcOH、 HC02H等。該脫保護(hù)反應(yīng)可在各種溶劑中進(jìn)行，包括 但不限于水、CH2C12、 EtOAc、 AcOH等。應(yīng)理解的是在反應(yīng)條件中 還可包括陽(yáng)離子清除劑以改善脫保護(hù)反應(yīng)的速率和/或總收率，包括 使用AcOH作為溶劑。此處所述的脫保護(hù)反應(yīng)可在多種溫度下進(jìn)行， 如約0。C-約50。C的溫度范圍，例如在室溫下。
流程2中所述的合成法中可包括任選的脫保護(hù)步驟(e)，用以除 去化合物8上的任何保留的保護(hù)基。例如，當(dāng)W是酰胺保護(hù)基而R5 是羧酸保護(hù)基時(shí)，可除去這些基團(tuán)以制備化合物8所示的游離氨基 酸衍生物。在一示例性實(shí)施方案中，流程2中的偶合步驟(e)得到化 合物8的被保護(hù)形式，其中R1、 R2、 113和115是氫，W是三氟乙酰基。 通過(guò)在各種溶劑中，包括但不限于水、醇類、雙相THF/水等，使被 保護(hù)的化合物8與堿包括但不限于NH40H(包括0.5M NH4OH)、 LiOH、 NaOH、 KOH、 K2C03、 NaHC03等接觸，可同時(shí)除去基團(tuán)R5。 例如，除去這些磁^丈感基團(tuán)的反應(yīng)條件的pH大于9。所述反應(yīng)例如 在室溫下進(jìn)^f亍。
流程3中顯示另一種示例性化學(xué)合成蝶酸及其衍生物的熒光素 綴合物的方法。
流程3<formula>formula see original document page 30</formula>
(a) FITC (7); (b)熒光素-麗2 (15); (c)氨基的脫保護(hù)；(d)酰胺偶合 劑；(e)羧酸基團(tuán)的選擇性脫保護(hù)；(f) 1.酰胺偶合劑；2. RLrs中任 一個(gè)的任選脫保護(hù)。
其中R1、 R2、 113和114各自獨(dú)立是氫、烷基、?；蜻m當(dāng)選擇的氮保 護(hù)基；W是氫、烷基或適當(dāng)選擇的羧基保護(hù)基；W是氫、烷基或適 當(dāng)選擇的羧基保護(hù)基；m是0-4的整數(shù)；n是l-4的整數(shù)；和R6、 R7 和R8各自獨(dú)立是氫或適當(dāng)選擇的氮保護(hù)基。
被保護(hù)的亞烷基二胺16可通過(guò)以下任一方法制備(i)使亞烷 基二胺5與FITC (7)反應(yīng)；(ii)使被保護(hù)的亞烷基二胺10與FITC (7) 反應(yīng)；或者(iii)使被保護(hù)的氨基烷基異硫氰酸酯14與焚光素胺(15) 反應(yīng)。將胺脫保護(hù)得到17。使碟酸衍生物1與三.重'(trlply)保護(hù)的氨 基酸18偶合，得到葉酸衍生物19。選擇保護(hù)基rs和rs以使得各自
在不依賴于彼此的情況下被化學(xué)性地除去。除去保護(hù)基RM尋到羧酸 20，使其與胺17偶合，得到綴合物8。
如在流程3中對(duì)化合物5、 10、 14與化合物7和15反應(yīng)所示的 那樣，異硫氰酸酯與胺的反應(yīng)(如果適合)可在各種溶劑中進(jìn)行，包括 但不限于EtOH、 MeOH、 THF、 CH2C12、 DMF、 CHC13等。所述反 應(yīng)可在多種溫度下進(jìn)行，如約0。C-約100。C的溫度范圍，例如在反
應(yīng)中所用的溶劑的回流下進(jìn)行。
類似于此處所述的脫保護(hù)反應(yīng)，可按任何常規(guī)方式進(jìn)行脫保護(hù)
步驟(c)。在一示例性實(shí)施方案中，保護(hù)基R7是tert-Boc基團(tuán)，其在 化學(xué)上對(duì)酸敏感。脫保護(hù)這類酸敏感保護(hù)基的示例性脫保護(hù)劑包括 但不限于TFA、 HC1、 HBr、 AcOH、 HC02H等。該脫保護(hù)反應(yīng)可在 各種溶劑中進(jìn)行，包括但不限于水、CH2C12、 EtOAc、 AcOH等。應(yīng) 理解的是在反應(yīng)條件中還可包括陽(yáng)離子清除劑以改善脫保護(hù)反應(yīng)的 速率和/或總收率，包括使用AcOH作為溶劑。此處所述脫保護(hù)反應(yīng) 可在多種溫度下進(jìn)行，如約0。C-約50°C的溫度范圍，例如在室溫下。
流程3的偶合步驟(d)和(f)可按類似于本發(fā)明所述步驟，用常規(guī) 偶合劑和反應(yīng)條件進(jìn)行。所述步驟可在各種溶劑中進(jìn)行，包括但不 限于THF、乙醚、DMF、 DMSO、氯仿、CH2C12、 NMP等，并可在 多種溫度下進(jìn)行，如約0。C-約50。C的溫度范圍，例如在室溫下。
類似于此處所述的脫保護(hù)反應(yīng)，可按任何常規(guī)方式進(jìn)行脫保護(hù) 步驟(e)。在一示例性實(shí)施方案中，保護(hù)基RS是tert-Bu酯，其在化學(xué)
限于TFA、 HC1、 HBr、 AcOH、 HC02H等。該脫保護(hù)反應(yīng)可在各種 溶劑中進(jìn)行，包括但不限于水、CH2C12、 EtOAc、 AcOH等。應(yīng)理解 的是在反應(yīng)條件中還可包括陽(yáng)離子清除劑以改善脫保護(hù)反應(yīng)的速率 和/或總收率，包括使用AcOH作為溶劑。此處所述的脫保護(hù)反應(yīng)可 在多種溫度下進(jìn)行，如約0。C-約50°C的溫度范圍，例如在室溫下。
流程3中所述的合成法中可包括任選的脫保護(hù)步驟(f),用以除 去化合物8上的任何保留的保護(hù)基。例如，當(dāng)R"是酰胺保護(hù)基而R5 是羧酸保護(hù)基時(shí)，可除去這些基團(tuán)以制備化合物8所示的游離氨基
酸衍生物。在一示例性實(shí)施方案中，流程3中的偶合步驟(f)得到化
合物8的被保護(hù)形式，其中R1、 112和113是氫，W是三氟乙?；?，R5 是曱基。通過(guò)在各種溶劑中，包括但不限于水、醇類、雙相THF/水 等，使被保護(hù)的化合物8與包括但不限于NH40H(包括0.5MNH4OH)、 LiOH、 NaOH、 KOH、 &。03等的堿接觸，可同時(shí)除去基團(tuán)R4和R5。 例如，除去這些堿敏感的保護(hù)基團(tuán)的反應(yīng)條件的pH大于約9。所述 反應(yīng)例如在室溫下進(jìn)行。
另外，流程3a中顯示蝶酸及其衍生物的熒光素綴合物的示例性 化學(xué)合成方法。
流程3 a
(a)酰胺偶合劑；(b)氨基酸氨基的選擇性保護(hù)；(c)酰胺偶合劑。
如上所示，使胺17與被保護(hù)的氨基酸類似物9偶合，形成酰胺 21。將酰胺21脫保護(hù)，得到胺22,使其與被保護(hù)的蝶酸類似物1偶 合，得到維生素-熒光素綴合物8。
應(yīng)理解的是在流程1、 2和3及其變化中所示的合成還可用于制 備本文所述的蝶酸類似物以及蝶酸類似物的衍生物的熒光素綴合 物。i萊酸類似物以及蝶酸類似物的4汙生物包括但不限于亞葉酸、蝶 酰聚谷氨酸(pteropolyglutamic acid)、四氫口果呤、二氬葉酸酯、四氫葉 酸酯、氨基喋呤、曱氨喋呤、N化曱基葉酸酯、2-脫氨基羥基葉酸酯、
3，，5，-二氯-4-氨基-4-脫氧-N^曱基蝶?；劝彼岬?，以及這些化合物 的脫氮雜和二脫氮雜類似物，如l-脫氮雜甲基葉酸、3-脫氮雜曱基葉 酸以及其它脫氮雜和二脫氮雜類似物，如l-脫氮雜、3-脫氮雜、5-脫 氮雜、8-脫氮雜和10-脫氮雜類似物，以及1,5-二脫氮雜、5,10-二脫 氮雜、8,10-二脫氮雜和5,8-二脫氮雜類似物。例如，根據(jù)此處所述的 過(guò)程和步驟，可制備包括除谷氨酸酯外，還包括一或多種氨基酸的 其它葉酸酯的類似物，或者代替谷氨酸酯的一或多種氨基酸的其它 葉酸酯的類似物。例如，在流程1、 2和3中，可將酪氨酸、半胱氨 酸、磺基丙氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸以及很多其它的天然和非天然 氨基酸的被保護(hù)形式取代這些流程中特別描述的被保護(hù)的谷氨酸酯 化合物。因此，本發(fā)明還包括葉酸類似物，其不同在于其作為不是 谷氨酸酯而是氨基酸的蝶?；０返娜~酸酯。另外，應(yīng)清楚的是還 可使用本文所述的合成法和過(guò)程，用蝶酸類似物和衍生物制備這些 酰胺。
還應(yīng)清楚的是副產(chǎn)物、污染物、雜質(zhì)和/或其它成分可在制備蝶 酸、葉酸、蝶酸和葉酸的類似物和書(shū)t生物以及4壬何這些化合物的綴 合物的過(guò)程中產(chǎn)生。這些副產(chǎn)物、污染物、雜質(zhì)和/或其它成分可通 過(guò)本發(fā)明所述的純化方法除去。在一實(shí)施方案中，所述其它成分是 葉酸。在另一實(shí)施方案中，所述其它成分是雙熒光素衍生物，如所 述雙熒光素衍生物。 一種示例性雙熒光素衍生物是式II化合物
另一種示例性雙熒光素衍生物是式m化合物 <formula>formula see original document page 34</formula>
其中n是l-4的整數(shù)。
還應(yīng)清楚的是通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)暮铣陕肪€或修飾合成路線，可避 免副產(chǎn)物、污染物或雜質(zhì)。在一示例性方面，通過(guò)小心清除本發(fā)明 所述的各種合成方法和過(guò)程中的水，可基本或完全避免式II化合物。 在另一示例性方面，通過(guò)使用精確或稍小于l摩爾當(dāng)量的FITC試劑， 可避免式H化合物。
在另一示例性方面，可按流程1中所示，通過(guò)使用精確1摩爾 當(dāng)量或者稍小于1摩爾當(dāng)量所述亞烷基二胺試劑5,可基本上或完全 避免式III化合物。在另一示例性方面，通過(guò)在加入FITC之前，在 引入所述亞烷基二胺試劑5之后，純化反應(yīng)產(chǎn)物使得基本除去任何 保留的所述亞烷基二胺試劑5，如純化流程1中所示的中間體胺6以 基本上或完全除去所述亞烷基二胺試劑5，可避免式III化合物。
在另一示例性方面，可通過(guò)使用流程2中所示的合成當(dāng)量的所 述亞烷基二胺(如單保護(hù)的亞烷基二胺10)，避免式III化合物。在另 一示例性方面，通過(guò)在與蝶酸、葉酸或者蝶酸或葉酸的類似物或衍 生物結(jié)合之前，按流程3所示制備FITC中間體16,可避免式III化 合物。在這個(gè)后一方面，應(yīng)理解的是可通過(guò)使用精確的至少稍過(guò)量 或者例如基本超過(guò)1摩爾當(dāng)量以上的所述亞烷基三胺試劑(如化合物 5),可避免式III化合物。還應(yīng)理解的是在這個(gè)后一方面中，當(dāng)用亞 烷基二胺試劑5制備時(shí)，可將所述產(chǎn)物化合物16或后來(lái)的產(chǎn)物(如17、 21或22)純化，使得基本上或完全除去式III化合物。
例如，嬡酸成4U汙生物的綴A物可i甬過(guò)太勞曰；
合成，并結(jié)合本發(fā)明所述的任何方法通過(guò)，使用諸如本文所述的離 子交換層析載體來(lái)純化。
在另一實(shí)施方案中，提供純化包含蝶酸或其衍生物以及焚光素
或其衍生物的綴合物的方法。在一方面中，該方法包括以下步驟(a) 使包含所述綴合物的溶液與第一種反相層析載體接觸；(b)用流動(dòng)相 洗脫包含所述綴合物的磷酸鹽復(fù)合物的第 一種流分，該流動(dòng)相包括 預(yù)定pH的水；(c)使第一種流分與第二種反相層析載體接觸；以及(d) 用含水的流動(dòng)相洗脫包含所述綴合物的笫二種流分，其中所述第二 種流分基本上無(wú)或完全不含磷酸鹽。洗脫步驟(b)可用由水和一或多 種磷酸鹽制備的水性流動(dòng)相進(jìn)行。預(yù)定的pH范圍可以為約6-8;約 7-8的范圍；或者約7.1-7.5的范圍，或者例如pH約為7.4。應(yīng)理解 的是洗脫步驟(d)包括的流動(dòng)相以基本上或完全不含磷酸鹽為有利。
在一方面中，反相層析載體是一種修飾的硅膠(silica)載體，包括 但不限于C8硅膠、C18硅膠和修飾的C8和/或C18硅膠，包括覆蓋 或失活的硅膠等，及其組合物。
生，然后再用于純化或分離其它蝶酸或其類似物或衍生物的混合物。 再生包括用具有比用于分離的流動(dòng)相較高的洗脫指數(shù)或洗脫力的溶 劑洗滌所述層析固體載體。例如，純化可包括反相固體載體和包含 水(如純水)或無(wú)機(jī)鹽的水溶液的流動(dòng)相。流動(dòng)相還可包括有機(jī)溶劑， 如乙腈(ACN)、甲醇、四氫呋喃(THF)等。在這種示例性層析分離中， 流動(dòng)相可以是水和乙腈的固定比例或可變比例的混合物，如90:10水 /乙腈、線性梯度的99:1至90:10水/乙腈等。然后，例如可通過(guò)用具 有較高洗脫指數(shù)的流動(dòng)相沖洗，可將柱再生，所述流動(dòng)相包括相對(duì) 于水的百分率4交高百分率的有機(jī)溶劑，如60:40或50:50水/乙腈。這 些示例性的實(shí)施方案并不起限制作用，可使用用于層析分離的任何 適合的流動(dòng)相和用于柱再生的任何適合方法。
在另 一示例性實(shí)施方案中，本文描述可通過(guò)與多價(jià)陽(yáng)離子(如石咸
土金屬陽(yáng)離子)絡(luò)合，將包含蝶酸或其類似物或衍生物和焚光素或其 衍生物的綴合物純化的方法。示例性陽(yáng)離子包括但不限于鎂、鉤、 鈹、鍶、鋇等。
可使用常規(guī)方法制備所述綴合物的鹽，如鈉和/或鉀鹽。例如， 通過(guò)在極性溶劑(如水)中，將所述鈉或鉀鹽形式與多價(jià)陽(yáng)離子鹽溶液 混合，可進(jìn)行陽(yáng)離子交換。多價(jià)陽(yáng)離子鹽溶液可用常規(guī)鹽制備，如 氯化鎂、氯化4丐等。從該極性溶劑中，將得到的復(fù)合物沉淀或結(jié)晶。 應(yīng)理解的是還可向該極性溶劑中加入共溶劑以促進(jìn)綴合物的多價(jià)陽(yáng) 離子鹽的沉淀。
通過(guò)在適合的常規(guī)樹(shù)脂上的離子交換層析法，可將綴合物的多 價(jià)陽(yáng)離子鹽再轉(zhuǎn)化回中性形式或其它鹽形式，如鈉和鉀鹽。
在另 一 示例性實(shí)施方案中，提供一種治療具有病原性細(xì)胞群(如 癌細(xì)胞)的宿主或病原性有機(jī)體的方法。例如，該方法使用分離的配 體-焚光素綴合物，其能夠與癌細(xì)胞或其它病原因子高親和性結(jié)合。 該方法通過(guò)病原性細(xì)胞表現(xiàn)的抗原性，致使宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別和清 除它們，引起病原性細(xì)胞群的免疫應(yīng)答-介導(dǎo)的清除的增強(qiáng)。在該方 法中，可按本文所述合成所述配體-熒光素綴合物，以避免至少一種
雙熒光素衍生物的形成，和/或可按以上所述純化以除去至少 一種雙 熒光素書(shū)1"生物。
根據(jù)此處所述的方法和組合物，術(shù)語(yǔ)"分離的配體-熒光素綴合 物"指已被純化或處理除去至少一種雙熒光素衍生物的配體-熒光素 綴合物，或者指已被合成避免形成至少 一種雙熒光素衍生物的配體-焚光素綴合物，或者指通過(guò)這兩種方法得到的配體_熒光素綴合物。
在另 一示例性實(shí)施方案中，該方法通過(guò)使用分離的配體-熒光素 綴合物以及能夠刺激內(nèi)源性免疫應(yīng)答的另外的治療因子、殺細(xì)胞劑、 化療劑、肺瘤滲透增強(qiáng)劑、細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞或者抗菌劑，可利用 聯(lián)合療法增強(qiáng)病原性細(xì)胞群的免疫應(yīng)答-介導(dǎo)的清除。
例如，可利用所述方法在具有病原性細(xì)胞群的宿主動(dòng)物中增強(qiáng)
病原性細(xì)胞群的內(nèi)源性免疫應(yīng)答-介導(dǎo)的清除。該方法可用于能引起 各種病變(如癌和感染性疾病)的病原性細(xì)胞群。因此，病原性細(xì)胞群 可以是致瘤的癌細(xì)胞群，包括良性和惡性腫瘤，或者其可以是非致 瘤性的。癌細(xì)胞群可以自發(fā)產(chǎn)生或者通過(guò)例如宿主動(dòng)物種系或體細(xì) 胞突變中存在的突變的此類過(guò)程產(chǎn)生，或者其可通過(guò)化學(xué)性-、病毒
性-或放射性誘發(fā)產(chǎn)生。可利用所述方法治療諸如下列的癌癌、肉 瘤、淋巴瘤、何杰金氏病、黑素瘤、間皮瘤、伯基特氏淋巴瘤、鼻 咽癌、白血球過(guò)多癥和骨髓瘤。癌細(xì)胞群可包括但不限于口腔、曱 狀腺、內(nèi)分泌、皮膚、胃、食管、喉、胰臟、結(jié)腸、膀胱、骨、印 巢、子宮頸、子宮、乳房、睪丸、前列腺、直腸、腎、肝和肺癌。
例如，病原性細(xì)胞群還可以是一種外源性病原體或含外源性病 原體的細(xì)胞群，如病毒。該方法還可用于諸如細(xì)菌、真菌、病毒、 支原體和寄生蟲(chóng)類外源性病原體上?？捎迷摲椒ㄖ委煹母腥疽蜃邮?br> 為革蘭氏陰性或革蘭氏陽(yáng)性球菌或桿菌的細(xì)菌的有機(jī)體，DNA和 RNA病毒，包括但不限于DNA病毒，如乳頭瘤病毒、細(xì)小病毒、 &裝病毒、皰滲病毒和痘苗病毒，以及RNA病毒，如沙粒病毒、冠形 病毒、鼻病毒、呼吸合胞體病毒、流感病毒、小RNA病毒、副粘病 毒、呼腸病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和桿狀病毒。先前已在細(xì)菌性細(xì)胞上鑒 定出葉酸酯體(Kumar等，J. Biol. Chem.. 262， 7171-79 (1987))。
關(guān)鍵是對(duì)抗生素產(chǎn)生抗性的細(xì)菌，如抗生素抗性的鏈球菌種和 葡萄球菌種，或者是對(duì)抗生素敏感，但用抗生素治療易引起復(fù)發(fā)的感 染，從而最終產(chǎn)生抗性有機(jī)體的細(xì)菌?？捎盟蛛x的配體-焚光素綴 合物結(jié)合比正常給予患者較低劑量的抗生素治療這些有機(jī)體，以避 免這些抗生素抗性菌林的發(fā)展。該方法還適用于能引起動(dòng)物疾病的 任何真菌、支原體、寄生蟲(chóng)或其它感染性有機(jī)體。可用本發(fā)明方法 治療的真菌的實(shí)例包括如霉或酵母菌樣生長(zhǎng)的真菌，包括例如能引 起例如下列疾病的真菌褲菌病、組織胞漿菌病、酵母菌病、曲霉
病、隱球菌病、孢子絲菌病、球孢子菌病、巴西芽生菌病
(paracoccidio畫(huà)idomycosis)和念;朱菌病。
還可利用該方法治療寄生蟲(chóng)感染，包括但不限于軀體內(nèi)絳蟲(chóng)、 血吸蟲(chóng)、組織蟲(chóng)回蟲(chóng)、變形蟲(chóng)和疰原蟲(chóng)屬(尸/a;ymo(i/ww)、錐蟲(chóng)屬 (Tyypafwasoma)、 利4十曼原、蟲(chóng)屬(丄e/s/2wam'a)和弓，艮蟲(chóng)屬(roxo/ /oswa) 引起的感染。涉及的寄生蟲(chóng)是那些表達(dá)葉酸受體并結(jié)合葉酸酯或蝶 酸或者葉酸酯或蝶酸的衍生物的寄生蟲(chóng)。
還可使用已知其抗生素活性并且對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁前體特異性結(jié)合 的青霉素類和頭孢菌素類作為制備本方法使用的分離的配體-熒光素 綴合物的配體。所分離的配體-焚光素綴合物可直接作用于包含內(nèi)源 性病原體的細(xì)胞群，其中病原體特異性抗原被優(yōu)先地表達(dá)在包含病 原體的細(xì)胞表面，并起作為帶有與抗原特異性結(jié)合的配體的配體受 體的作用。
例如，該方法可用于人臨床醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)應(yīng)用。因此，包含病原 性生物種群以及用所分離的配體-熒光素綴合物治療的宿主動(dòng)物可以 是人，或者在獸醫(yī)應(yīng)用情況下，可以是實(shí)驗(yàn)室、農(nóng)業(yè)、馴養(yǎng)或野生 動(dòng)物。該方法可適用于宿主動(dòng)物，包括但不限于人、實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物， 如嚙齒類動(dòng)物(例如小鼠、大鼠、侖鼠等)、兔、猴、猩猩、馴養(yǎng)動(dòng)物 (如狗、貓和兔)、農(nóng)業(yè)用動(dòng)物(如牛、馬、豬、羊、山羊)以及被關(guān)養(yǎng) 的野生動(dòng)物(如熊、熊貓、獅、虎、豹、象、斑馬、長(zhǎng)頸鹿、大猩猩、 海豚和鯨)。
例如，可將所述分離的配體-熒光素綴合物非腸道給予宿主動(dòng) 物，例如皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)注射給予。在另一實(shí) 施方案中，可將所迷綴合物通過(guò)其它醫(yī)學(xué)上可用的過(guò)程給予宿主動(dòng) 物，并可使用任何有效劑量和適合的治療劑型，包括延長(zhǎng)釋放的劑 型?？蓪⒃摲椒ㄅc以下療法聯(lián)合使用手術(shù)除瘤法、放射療法、化 療法或生物學(xué)療法，如其它免疫療法，包括但不限于單克隆抗體療 法、用免疫調(diào)節(jié)劑治療、免疫效應(yīng)細(xì)胞的過(guò)繼轉(zhuǎn)移療法、用造血生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和疫苗治療。
例如，適合的配體包括葉酸、葉酸的類似物和彩f生物以及其它 的結(jié)合葉酸受體的分子，包括蝶酸及其衍生物和其它維生素。葉酸 酯和蝶酸衍生物包括結(jié)合葉酸受體的喋啶，如四氬蝶呤、二氬葉酸 酯、四氫葉酸酯及其脫氮雜和二脫氮雜類似物。術(shù)語(yǔ)"脫氮雜，，和 "二脫氮雜"類似物指本領(lǐng)域認(rèn)可的具有代替天然存在的葉酸結(jié)構(gòu)
中的1或2個(gè)氮原子的碳原子的類似物。例如，脫氮雜類似物包括l-脫氮雜、3-脫氮雜、5-脫氮雜、8-脫氮雜和10-脫氮雜類似物。二脫 氮雜類似物包括例如1,5-二脫氮雜、5,10-二脫氮雜、8,10-二脫氮雜 和5,8-二脫氮雜類似物。上述類似物結(jié)合葉酸受體?？稍诒景l(fā)明所述 方法中使用的其它衍生物是結(jié)合葉酸受體的類似物氨基喋呤、氨曱 蝶呤(曱氨喋呤)、N^曱基葉酸酯、2-去氨基-羥基葉酸酯、去氮雜類 似物，如1-去氮雜甲基葉酸或3-去氮雜曱基葉酸和3',5'-二氯-4-氨基 -4-脫氧-N^甲基蝶?；劝彼?二氯曱氨喋呤)。
可用作配體的其它適合的維生素包括煙酸、泛酸、核黃素、碌u
胺素、生物素、維生素Bu以及脂溶性維生素A、 D、 E和K(參見(jiàn)美 國(guó)專利Nos. 5,108,921、 5，416,016、 5,635,382和5,688,488，結(jié)合到本
發(fā)明中作為參考)。這些維生素以及結(jié)合其配體的類似物和衍生物構(gòu) 成可與本發(fā)明所述步驟中的焚光素偶合的配體。
其它適合的配體包括從庫(kù)篩選中鑒定的肽配體、腫瘤特異性肽、 腫瘤特異性適體、腫瘤特異性碳水化合物、腫瘤特異性單克隆或多 克隆抗體、抗體的Fab或scFv(即單鏈可變區(qū)域)片段，例如指向EphA2 或其它特定表達(dá)或者獨(dú)特地易進(jìn)入轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞上的蛋白質(zhì)的抗體 的Fab片段、源于組成化合物庫(kù)(combinatorial libraries)的小有機(jī)分 子、成長(zhǎng)因子，如EGF、 FGF、胰島素和胰島素樣生長(zhǎng)因子，和同 源多肽、生長(zhǎng)激素抑制素及其類似物、轉(zhuǎn)鐵蛋白、脂蛋白復(fù)合物、 膽汁酸鹽、選擇蛋白、類固醇激素、含Arg-Gly-Asp的肽、類碎見(jiàn)黃醇、 各種半乳凝素、Y-阿片受體配體、縮膽嚢素A受體配體、血管緊縮素ati或AT2受體的特異性配體、過(guò)氧化物酶體增生物激活受體y 配體、(3-內(nèi)酰胺抗生素、小有機(jī)分子，包括抗微生物藥和其它特異性 與優(yōu)先表達(dá)在腫瘤細(xì)胞表面上或感染的有機(jī)體表面上的受體結(jié)合的 分子，或者任何這些分子的片段。
對(duì)于與感染性有機(jī)體結(jié)合的配體，其關(guān)鍵是本領(lǐng)域已知能優(yōu)先 結(jié)合微生物的任何分子，如抗生素或其它藥物。所述方法還適用于 作為諸如抗微生物藥物的分子的配體、設(shè)計(jì)以適于特定受體的結(jié)合 "袋"的配體、以受體的晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的配體或者作為其它細(xì)胞 表面蛋白的受體的配體，并且其中這些受體優(yōu)先表達(dá)在腫瘤、細(xì)菌、 病毒、支原體、真菌、寄生蟲(chóng)或其它病原菌的表面上。還應(yīng)考慮的 是可利用與任何腫瘤抗原或優(yōu)先表達(dá)在腫瘤細(xì)胞表面上的其它分子 結(jié)合的配體。由于在病原性細(xì)胞上受體對(duì)配體的優(yōu)先表達(dá)、易于與 配體結(jié)合，所述配體應(yīng)具有特異性清除宿主動(dòng)物中病原性細(xì)胞群的
能力。本發(fā)明還包括組合使用各分離的配體-熒光素綴合物以最大限 度地清除病原性細(xì)胞。
素及其衍生物應(yīng)該能夠誘發(fā)宿主動(dòng)物中抗體的產(chǎn)生，并應(yīng)能夠與被 動(dòng)給予的抗體結(jié)合。在一示例性實(shí)施方案中，宿主動(dòng)物能通過(guò)對(duì)非 天然抗原(即焚光素)的免疫產(chǎn)生一種新的免疫性。自動(dòng)免疫接種包括 在正常的接種疫苗安排之外，多次注射非天然抗原，以誘發(fā)這種新 的免疫性。因此，可用所述分離的配體-熒光素綴合物針對(duì)宿主動(dòng)物 中的病原性細(xì)胞群先前已獲得體液或細(xì)胞免疫性，以清除外來(lái)細(xì)胞 或病原性生物。
在其中宿主動(dòng)物對(duì)非天然抗原(即熒光素)通過(guò)免疫接種產(chǎn)生一種 新的免疫性的實(shí)施方案中，可將宿主動(dòng)物用連接有能提供熒光素、 半抗原、致免疫的載體的熒光素預(yù)先免疫，以建立所述新的免疫性。 也可將技術(shù)熟練人員已知的任何輔助劑，如弗氏佐劑、皂草苷佐劑、 Alum (Pierce Chemical Co.)等，與所述載體-焚光素綴合物一起給
予，以增強(qiáng)對(duì)熒光素的新的免疫。例如，可使用的載體包括匙孔蟲(chóng)
(keyhole limpet)血藍(lán)蛋白(KLH)、鮑屬軟體動(dòng)物瘤狀(haliotis tuberculata) 血藍(lán)蛋白(HtH)、失活的白喉毒素、失活的破傷風(fēng)毒素、結(jié)核分支桿 菌(Myco^"enww fwZ ercw/ow力的純蛋白衍生物(PPD)、牛血清白蛋白 (BSA)、卵清蛋白(OVA)、 g-球蛋白、曱狀腺球蛋白、肽抗原和合成 載體，如聚-L-賴氨酸、樹(shù)狀聚合物和脂質(zhì)體。
通過(guò)使用任何本領(lǐng)域認(rèn)可的形成復(fù)合物的方法，可將載體(如 KLH或BSA)與熒光素結(jié)合。這可包括載體與綴合物的共價(jià)、離子或 氫鍵結(jié)合，即或者直接或者間接通過(guò)一連接基團(tuán)，如二價(jià)連接基團(tuán) 連接。例如，所述熒光素-載體綴合物可以通過(guò)在所迷綴合物的各成 分上的酸、醛、羥基、氨基或肼基(hydrazo)之間形成酰胺、酯或亞胺 基鍵而通過(guò)共價(jià)鍵形成。在其中使用連接基團(tuán)的實(shí)施方案中，所述 連接基團(tuán)可含有約1-30個(gè)碳原子或者約2-20個(gè)碳原子?？墒褂玫头?子量連接劑(即那些具有大約分子量為約20-500的連接劑)。連接劑 還可包括將載體與熒光素間接連接的方法，如通過(guò)中間連接劑、間 隔臂或橋接分子連接。
可通過(guò)熟練技術(shù)人員已知的任何方法，將載體-熒光素綴合物純 化，以除去至少一種雙熒光素污染物。例如，可使用超濾步驟除去 載體-熒光素綴合物中的熒光素污染物或雜質(zhì)。本發(fā)明還包括包含這 些從雙焚光素污染物中純化的載體-熒光素綴合物的藥用組合物。
在另一示例性實(shí)施方案中，可將直接對(duì)抗熒光素的抗體給予宿 主動(dòng)物，以建立一種被動(dòng)免疫力。所述抗體可以是從血清中收集的 天然抗體或者是單克隆抗體，其可以是或不可以是基因工程抗體，
包括人源化抗體。利用特定量的抗體試劑產(chǎn)生一種被動(dòng)免疫力以及 使用其中被動(dòng)性給予的抗體作用于熒光素的所分離的配體-熒光素綴 合物，為用于當(dāng)患者誘發(fā)的抗體滴度不在臨床上有效時(shí)提供一套標(biāo) 準(zhǔn)試劑的益處?？蓪⑺霰粍?dòng)給予的抗體與所述分離的配體-熒光素 綴合物"共同給予"，共同給予被定義為在給予所分離的配體-熒光
素綴合物之前、同時(shí)或之后給予抗體。
所述分離的配體-熒光素綴合物增強(qiáng)病原性細(xì)胞群的內(nèi)源性免疫 應(yīng)答介導(dǎo)的清除。所述內(nèi)源性免疫應(yīng)答可包括體液應(yīng)答、細(xì)胞介導(dǎo) 的免疫應(yīng)答和任何其它對(duì)宿主動(dòng)物的內(nèi)源性免疫應(yīng)答，包括補(bǔ)體介
導(dǎo)的細(xì)胞溶解、抗體依賴性細(xì)胞-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)、 導(dǎo)致吞 噬的抗體調(diào)理素作用、導(dǎo)致編程性細(xì)胞死亡、抗增殖或分化的信號(hào) 對(duì)結(jié)合抗體的受體群集(clustering)、以及所傳遞半抗原的直接免疫細(xì) 胞的識(shí)別。還應(yīng)考慮到該內(nèi)源性免疫應(yīng)答可使用調(diào)節(jié)諸如免疫細(xì)胞 繁殖和遷移此類過(guò)程的細(xì)胞因子的分泌作用。所述內(nèi)源性免疫應(yīng)答 可包括諸如以下此類免疫細(xì)胞類型的參與，如B細(xì)胞、T細(xì)胞(包括 輔助細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞)、巨噬細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞、中性粒細(xì) 胞、LAK細(xì)胞等。
應(yīng)注意到的是所誘發(fā)的抗體或者被動(dòng)給予的抗體通過(guò)使所述分 離的配體-熒光素綴合物，優(yōu)先結(jié)合這些侵襲的細(xì)胞或有機(jī)體而再作 用于腫瘤細(xì)胞或感染的有機(jī)體，并且病原性細(xì)胞將被補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì) 胞溶解、ADCC、抗體依賴性吞噬或者受體的抗體聚集殺死。該細(xì)胞 毒性過(guò)程還可包括其它類型的免疫應(yīng)答，如細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性，以 及當(dāng)所吸引的存在抗原的細(xì)胞吞噬所述有害細(xì)胞，并且對(duì)清除帶有 抗原的細(xì)胞或有機(jī)體的免疫系統(tǒng)呈現(xiàn)天然肺瘤抗原或外來(lái)病原體的 抗原時(shí)出現(xiàn)的次級(jí)應(yīng)答。
可將至少 一種包含治療因子的另 一種組合物與以上詳述的方法 聯(lián)合給予宿主，以增強(qiáng)病原性細(xì)胞群的內(nèi)源性免疫應(yīng)答介導(dǎo)的清除， 或者可給予一種以上的另外的治療因子。所述治療因子選自能夠刺 激內(nèi)源性免疫應(yīng)答的化合物、化學(xué)治療劑、抗微生物劑或者其它能 夠補(bǔ)充所給予的分離的配體-熒光素綴合物的效能的治療因子。此處 所述的方法可通過(guò)給予宿主除上述的綴合物外能夠刺激內(nèi)源性免疫 應(yīng)答的選自下列的化合物或組合物進(jìn)行，包括但不限于細(xì)胞因子或 免疫細(xì)胞生長(zhǎng)因子，如白介素1-18、干細(xì)胞因子、基本的FGF、 EGF、
G-CSF、 GM-CSF、 FLK-2配體、HILDA、 MIP-la、 TGF畫(huà)a、 TGF-卩、 M-CSF、 IFN-a、 IFN-j3、 IFN-y、可溶性CD23、 LIF及其組合。
在一示例性實(shí)施方案中，可4吏用治療有效的這些細(xì)胞因子的組 合。還可使用治療有效的這些細(xì)胞因子的組合。在一實(shí)施方案中， 例如，IL-2的治療有效量在每日多劑量給藥方案中，可使用的劑量 范圍為約0.1 MHJ/mV劑量/日-60 MlU/n^/劑量/日，而IFN-a例如在 每日多劑量給藥方案中，可使用的劑量范圍為約0.1 MlU/m2/劑量/日 -10 MlU/m2/劑量/日(MIU =百萬(wàn)國(guó)際單位；m2 -人均大約體表面積)。 在另一實(shí)施方案中，使用臨床有效量的IL-12和IFN-a,而在另一實(shí) 施方案中，使用臨床有效量的IL-15和IFN-a。在另一實(shí)施方案中， 聯(lián)合使用IL-2、 IFN-a或IFN-y和GM-CSF。所使用的治療因子，如 IL-2、 IL-12、 IL-15、 IFN-a、 IFN-y和GM-CSF(包括其組合)，可以 是活性的天然殺傷細(xì)胞和/或T細(xì)胞。另外，所述治療因子或其組合， 包括與干擾素和GM-CSF聯(lián)合使用的白介素，可以是活性的其它免 疫效應(yīng)細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT細(xì) 胞、T細(xì)胞、LAK細(xì)胞等。還可包括使用任何其它有效的細(xì)胞因子 組合，包括其它白介素和干擾素以及集落刺激因子的組合。
適于本發(fā)明方法使用的本身具有細(xì)胞毒性且能增強(qiáng)腫瘤穿透性 的化學(xué)治療劑包括腎上腺類皮質(zhì)激素、烷化劑、抗雄激素藥、抗雌 激素藥、雄激素、雌激素、抗代謝劑(如阿糖胞苷、噤呤類似物、嘧 啶類似物和曱氨喋呤)、白消安、卡鉑、苯丁酸氮芥、順鉑和其它鉑 化合物，他莫昔芬、紫杉酚、環(huán)磚酰胺、植物生物堿、潑尼松、羥 基脲、替尼泊苷、抗生素(如絲裂霉素C和博來(lái)霉素)、氮芥、硝基脲、 長(zhǎng)春新》威、長(zhǎng)春石威、炎癥和促炎癥反應(yīng)劑以及j壬何其它本領(lǐng)域^人定 的化療劑?？膳c此處所述的綴合物給藥輔助性給予的其它治療劑包 括青霉素類、頭孢菌素類、萬(wàn)古霉素、紅霉素、克林霉素、利福平、 氯霉素、氨基糖苷類、慶大霉素、兩性霉素B、阿昔洛韋、三氟尿苷、 更昔洛韋、齊多夫定、金剛烷胺、利巴韋#木和任何其它本領(lǐng)域7>認(rèn)
的抗菌化合物。
在一示例性實(shí)施方案中，病原性細(xì)胞群的清除包括減少或清除 病原性有機(jī)體的腫瘤基質(zhì)，從而產(chǎn)生治療反應(yīng)。在腫瘤情況下，所 述清除可以是清除原發(fā)性腫瘤細(xì)胞或者已轉(zhuǎn)移或者處于從原發(fā)性腫 瘤中分離的過(guò)程中的細(xì)胞。本發(fā)明還包括一種預(yù)防療法，即在通過(guò) 包括手術(shù)除瘤法、放射療法、化療法或生物學(xué)療法的任何治療途徑 除去肺瘤后，防止腫瘤復(fù)發(fā)的方法。該預(yù)防性療法可以用所述分離 的配體-焚光素綴合物初期治療，如以每日多劑量方案治療，和/或在 初期治療之后的數(shù)日或數(shù)月后再進(jìn)行另外的治療或一 系列的治療。
在另一示例性實(shí)施方案中，提供藥用組合物，其包含一定量的 能有效"標(biāo)記"宿主動(dòng)物中病原性細(xì)胞群，并通過(guò)內(nèi)源性免疫反應(yīng) 或者通過(guò)共同給予的抗體來(lái)特異性地清除該細(xì)胞群的一種分離的配 體-熒光素綴合物。在另一實(shí)施方案中，所述組合物還包括一定量的 有效增強(qiáng)病原性細(xì)胞清除的其它因子，其選自殺細(xì)胞劑、腫瘤滲透 促進(jìn)劑、化學(xué)治療劑、抗微生物劑、細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞和能夠刺激 內(nèi)源性免疫應(yīng)答的化合物。藥用組合物包含治療有效量的分離的配
體-熒光素綴合物和治療因子，所述因子可包含細(xì)胞因子，如IL-2、 IL-12或IL-15或細(xì)胞因子的組合(包括IL-2、 IL-12或IL-15)，和干
擾素，如IFN-a或IFN-Y以及干擾素、白介素，以及集落刺激因子， 如GM-CSF的組合。
所分離的配體-熒光素綴合物的單一 日劑量可依據(jù)宿主條件、所 治療的疾病狀態(tài)、其給藥途徑及其組織分布以及其它療法(如放射性 治療)的聯(lián)合使用的可能性等明顯變化。所給予患者的有效量取決于 患者的體表面積、體重及醫(yī)生對(duì)患者病情的判斷。有效的劑量范圍 為約1 ng/kg-l mg/kg,約1昭/kg-500 pg/kg,或約1昭/kg-100嗎/kg。
可使用任何有效的給予所述分離的配體-熒光素綴合物和所述治 療因子的方案，使得再直接誘發(fā)對(duì)所述腫瘤細(xì)胞或感染的有機(jī)體的 抗體或者誘發(fā)對(duì)熒光素的體液應(yīng)答。例如，可將所述分離的配體-熒
光素綴合物和治療因子以單劑量給藥，或者可將它們以多劑量的每 日給藥方案分開(kāi)給藥。另外，可使用交錯(cuò)給藥方案(例如每周1-3日) 作為每日治療的 一種備選方案，現(xiàn)認(rèn)為這種間斷性或交錯(cuò)性的每曰 給藥方案視為等同于每日的治療。在一實(shí)施方案中，用多次注射分 離的配體-熒光素綴合物和所述治療因子治療宿主，以清除病原性細(xì)
胞群。在另一實(shí)施方案中，給宿主多次(優(yōu)選約2至最多50次)注射 所述分離的配體-熒光素綴合物，例如以12-72小時(shí)的間隔或者以48-72小時(shí)的間隔?？稍诔醮巫⑸浜螅詳?shù)日或數(shù)月的間隔給患者另外 注射分離的配體-熒光素綴合物，這種另外注射可預(yù)防疾病的復(fù)發(fā)。 或者，初始注射的所述分離的配體-熒光素綴合物可預(yù)防疾病的復(fù)發(fā)。
例如，可在給予所分離的配體-焚光素綴合物之前、之后或同時(shí)， 給予宿主動(dòng)物治療因子，可將治療因子作為包含所述綴合物的相同 組合物的一部分給予，或者可作為所分離的配體-焚光素綴合物之外 的不同組合物的部分給予。本方法中可使用含有包含治療有效劑量 的治療因子的任何這類治療組合物。另外，可使用一種類型以上的 分離的配體-熒光素綴合物。例如，可聯(lián)合使用蝶酸-焚光素綴合物和 核黃素-熒光素綴合物。在化療劑和抗菌劑情況下，可將次最適量 (suboptimal dose)的治療因子隨同分離的配體焚光素綴合物以聯(lián)合療 法的方式給予，以避免宿主動(dòng)物對(duì)化療劑或抗微生物劑抗性的發(fā)展。
例如，可將分離的配體-熒光素綴合物和治療因子經(jīng)非腸道注 射，這種注射可以是腹膜內(nèi)注射、皮下注射、肌內(nèi)注射、靜脈注射 或鞘內(nèi)注射。還可用緩慢泵傳遞所分離的配體-焚光素綴合物和治療 因子。非腸道劑型的實(shí)例包括在等滲鹽水、5%葡萄糖或其它熟知的 藥學(xué)上可接受的液體載體(如液體醇類、二醇類、酯類或酰胺類)中的 活性劑的水性溶液。非腸道劑型可以是能重新配制的凍干劑型，其 包括 一 定劑量的分離的配體-熒光素綴合物和治療因子。在本發(fā)明實(shí) 施方案的一個(gè)方面中，可以給予任何許多本領(lǐng)域已知的延長(zhǎng)釋放劑 型，例如，如美國(guó)專利Nos. 4,713，249; 5,266,333和5,417,982中所
述的可生物降解的碳水化合物基質(zhì)，所述專利結(jié)合到本發(fā)明中作為 參考。
在另一示例性實(shí)施方案中，提供包含一定量的分離的載體-熒光 素綴合物的藥用組合物，當(dāng)用所述載體-熒光素綴合物預(yù)先免疫宿主 動(dòng)物時(shí)，其能有效建立一種對(duì)綴合物中熒光素部分的新免疫性。可 使用任何上述劑量或劑量形式的所述載體-熒光素綴合物，并可根據(jù) 任何上述給藥方案給予。
實(shí)施例
除另外指明外，所有反應(yīng)均在室溫下進(jìn)行；所有蒸發(fā)均在減壓 或真空下進(jìn)行；如果適合，各實(shí)施例化合物均通過(guò)NMR、 13C NMR、元素分析、分析性HPLC、 UV吸收和/或熒光進(jìn)行分析。
實(shí)施例1.由蝶酰谷氨酸酯合成化合物8a<formula>formula see original document page 46</formula>流程4
步驟(a).將N"-保護(hù)的蝶酸la (119 g, 0.25 mol)和谷氨酸ot-叔丁 基酯,"曱基二酯(2a, 76g, 0.30mol)在DMF (4L)中的溶液用PyBop
(171g, 0.325 mol)和DIPEA (109mL, 0.60mol)處理。18 h后，將混合 物蒸發(fā)，得到二酯3a，為一種從1:1 ACN/曱基叔丁基醚(MTBE)中得 到的沉淀物。
步驟(b).在聚(4-乙烯基吡啶)存在下，用1:1 TFA/無(wú)水DCM化 學(xué)選擇性除去二酯3a的叔丁基保護(hù)基，得到a-酸,？甲基酯類似物4a, 為一種從1:1石油醚/MTBE中得到的沉淀物。
步驟(c).將a-酸j-曱基酯類似物4a和乙二胺(5a)的混合物攪拌 2小時(shí)，形成EDA-葉酸酯類似物6a。 N"-三氟乙酰胺保護(hù)基在反應(yīng) 過(guò)程中同時(shí)被除去。使用DEAE-纖維素固體載體，如DE52 (Whatman 批號(hào)4057-200),通過(guò)柱層析，可任選純化化合物6a以除去殘留的乙 二胺(5a)。
步驟(d).在DIPEA和1,1,3,3-四曱基胍(TMG)存在下，在DMSO 中，使EDA-葉酸酯類似物6a與焚光素異硫氰酸酯(FITC， 7)縮合， 得到8a (218 g)，其作為得自1:1 ACN/MTBE中的沉淀物被收集。葉 酸酯-FITC 8a經(jīng)反相柱層析純化(Biotage C18柱，100 mM磷酸鈉緩 沖液/乙腈為流動(dòng)相)。經(jīng)UV吸收(280nm)檢測(cè)含有8a的流分，混合。 蒸發(fā)揮發(fā)性溶劑，將殘留物經(jīng)反相柱層析脫鹽(Biotage C18柱，水/乙 腈為流動(dòng)相)。蒸發(fā)揮發(fā)性溶劑，冷凍干燥殘留物，得到47g(22。/?？?收率)的8a。 HPLC (Nova-Pak C18柱，10 mM乙酸銨/乙腈為流動(dòng)相) 表明該物質(zhì)純度大于98。/。，經(jīng)UV或熒光未檢測(cè)到雙熒光素衍生物IIIa (n=l)。
實(shí)施例2.由谷氨一?；叶泛铣?a
流程5
步驟(a).將被保護(hù)的谷氨酸9a和被保護(hù)的乙二胺10a在THF中 的混合物用PyBOP和二異丙基乙胺(DIPEA)處理。通過(guò)用EtOAc提 取反應(yīng)混合物分離酰胺lla。蒸發(fā)合并的有機(jī)相，得到酰胺lla。
步驟(b).在室溫下，在二氯甲烷中，將酰胺lla用二氮雜雙環(huán) 十一烷(DBU)處理，除去Fmoc保護(hù)基。蒸發(fā)混合物得到胺12a,可 任選將其純化。另外按以下所示，可按一鍋法，不經(jīng)純化以單一操 作進(jìn)行步驟(b)-(d)。
步驟(c).將步驟(b)中的殘留物或者任選含胺12a的純化形式溶 解于DMF中，使用PyBOP和DIPEA使其與N氣三氟乙酰基蝶酸(la) 偶合。蒸發(fā)反應(yīng)混合物得到葉酸酯類似物13a,可任選將其純化。另 外按以下所示，可按一鍋法，不經(jīng)純化以單一操作進(jìn)行步驟(c)-(d)。
步驟(d).將步驟(c)中的殘留物或者任選含葉酸酯類似物13a的 純化形式溶解于二氯曱烷中，然后用三氟乙酸(TFA)和作為陽(yáng)離子清 除劑的聚(4-乙烯基吡啶)處理，同時(shí)除去Boc和叔丁基保護(hù)基。雙沉 淀(Doubleprecipitation)(丁基叔丁基醚，然后1:1曱基叔'丁基醚/CH3CN) 得到為淺黃色固體的胺6b。
步驟(e).將胺6b與熒光素異硫氰酸酯(7)縮合，得到對(duì)應(yīng)的8a 的N化三氟乙酰胺保護(hù)的類似物，收集沉淀。將沉淀溶解于水中，將
pH升高至約10或以上，使得W。-三氟乙?；Ｗo(hù)基水解，得到8a。 葉酸酯-FITC 8a經(jīng)反相HPLC純化(XTerra柱，90:10 10 mM磷 酸鈉緩沖液/乙腈為流動(dòng)相)。將含8a的各流分經(jīng)UV吸收(280nm)檢 測(cè)并混合。蒸發(fā)揮發(fā)性溶劑。殘留物經(jīng)反相HPLC脫鹽(XTerra柱， 50:50水/乙腈為流動(dòng)相)。蒸發(fā)揮發(fā)性溶劑，將殘留物冷凍干燥，得 到為橙色固體的8a。
實(shí)施例3.由乙二胺異硫氰酸酯合成8a
流程6
<formula>formula see original document page 49</formula>
步驟(a).將Boc-保護(hù)的氨基乙基異硫氰酸酯(14a, 1.5 mmol)和熒 光素胺(fluoresceinamine)(15,異構(gòu)體-I, 0.3 mmol)在EtOH中的混合物 加熱回流24 h。蒸發(fā)EtOH溶劑，將殘留物溶解于水中，得到pH約 為10。將水層用EtOAc洗滌，通過(guò)加入酸，將水溶液的pH調(diào)節(jié)至 4.0，得到沉淀物Boc-保護(hù)的胺16a,冷凍干燥(70%收率)。
步驟(b).將Boc-保護(hù)的胺16a懸浮于無(wú)水CH2C12中，加入聚-(4-乙烯基吡啶)，然后慢慢加入三氟乙酸。將得到的澄清黃色溶液攪拌 3小時(shí)。將反應(yīng)混合物過(guò)濾，用1:1曱基叔丁基醚(MTBE)/CH2Cl2沉
淀。將沉淀用MTBE洗滌，在高真空下干燥，定量收率得到胺17a。
步驟(c).將PyBop (1.01 mmol)和谷氨酸(O-t-Bu)OMe (1.01 mmol) 順序加入到N"-TFA-蝶酸(0.84 mmol)在DMF中的懸浮液中。將得到 的澄清溶液用二異丙基乙胺(DIPEA, 2.02 rmolM)處理，攪拌3 h。減 壓除去DMF，將不純的19a用1:1 CH3CN/MTBE沉淀。將沉淀用1:1 CH3CN/MTBE洗滌，高真空下干燥，定量收率得到19a。
步驟(d).將化合物19a混懸于無(wú)水CH2C12中，順次加入聚-(4-乙 烯基吡啶)和三氟乙酸。將得到的澄清黃色溶液攪拌2小時(shí)，過(guò)濾， 將不純的20a用1:1 MTBE/CH2Cl2沉淀。將沉淀物用MTBE洗滌， 高真空下干燥，得到20a(66。/。收率)。
步驟(e).將PyBop (0.052 mmol)和DIPEA (0.20 mmol)同時(shí)加入 到葉酸類似物20a (0.05 mmol)和EDA-熒光素17a (0.05 mmol)在無(wú)水 DMF的溶液中。將得到的溶液攪拌2h,將不純的23a用MTBE沉淀。 將沉淀用MTBE洗滌，高真空下干燥，定量收率得到23a。
步驟(f).將化合物23a (0.05 mmol)用0.5 M N^CC^ (pH-10.6)的 水冷溶液處理。將得到的亮橙黃色溶液攪拌4 h，然后通過(guò)加入1 M HC1將反應(yīng)混合物pH調(diào)節(jié)至約7.6-7.8。經(jīng)制備HPLC柱純化(洗脫 液5.0 mM磷酸鈉/ACN),得到含化合物8a的純流分。減壓除去 ACN，將濃縮液冷凍干燥，得到為橙色粉末的8a(60。/。收率)。
實(shí)施例4. DEAE纖維素陰離子交換固體載體的預(yù)處理
在將DEAE纖維素陰離子交換固體載體(例如DE32)裝載于柱中 之前，將該固體栽體用0.5 M HC1溶液漿化為15體積。約0.5小時(shí) 后，傾出上清液，將該固體載體用水洗滌至洗液約為pH 4。將該固 體載體用0.5 M NaOH溶液漿化為15體積。約0.5小時(shí)后，傾出上 清液，將該固體載體用水洗滌至洗液約為pH8。
實(shí)施例5.用DE32從葉酸中純化蝶酸
將干的微粒型DE32陰離子交換樹(shù)脂(DEAE纖維素，Whatman 目錄號(hào)6055-010)按實(shí)施例4中所迷預(yù)處理。真空下，將在去離子水
中的預(yù)處理的樹(shù)脂的漿狀液脫氣至少1小時(shí)，均勻的裝載于一玻璃
柱(25 X 900 mm)中，然后檢查該柱使得捕集的氣泡降到最低。將柱 用流動(dòng)相(l.O M NaC1/0.01 M NaOH, pH 11.5)平衡。將含有蝶酸和葉 酸(l.O g)的混合物部分溶解于pH約為6的1.0 M NaCl (1 mL)中。將 pH調(diào)節(jié)至11.5之后，該混合物完全溶解。將得到的溶液裝載于柱上， 用流動(dòng)相(l.O M NaC1/0.01 M NaOH)洗脫。參見(jiàn)圖1A,經(jīng)UV吸收 (280nm)監(jiān)測(cè)洗脫液。確定洗脫的葉酸在流分13-31中，而洗脫的蝶 酸在流分35-81中。參見(jiàn)圖1B,通過(guò)反相HPLC測(cè)定，即在Nova-Pak C18, 3.9 X 150 mm柱上，以1 mL/min的流速用99:1至1:1 A/B梯度 洗脫(其中A是0.1% TFA-H20溶液，B是0.1% TFA-CH3CN溶液)， 在280 nm處檢測(cè)，流分35-75中各含有蝶酸(純度大于99%)。合并 流分35-75，通過(guò)加入1.0MHC1，將合并的流分的pH調(diào)節(jié)至約為2。 將得到的沉淀漿狀物離心，傾出上清液。將殘留物在懸浮于水中， 離心，傾出上清液(3次)。將殘留物冷凍干燥，得到0.40g蝶酸。 實(shí)施例6.用DE52從葉酸中純化蝶酸
將預(yù)溶脹的微粒性DE52陰離子交換樹(shù)脂(DEAE纖維素， Whatman目錄號(hào)4057-200， 6 kg)與去離子水(12 L)混合。真空下，將 得到的漿狀液脫氣至少1小時(shí)，均勻地裝栽于一玻璃柱(IOO X 1200 mm)中，然后檢查該柱使得捕集的氣泡降到最低。將柱用流動(dòng)相(l.O M NaCl， 0.01 M NaOH, pH 11.5)平衡。將含有約25%葉酸的粗品蝶酸的 樣本(40 g)溶解于水(500 mL)中，然后通過(guò)加入NaOH溶液將pH調(diào) 節(jié)至11.5。將該溶液過(guò)濾，裝載于柱上，用流動(dòng)相洗脫。通過(guò)反相 HPLC監(jiān)測(cè)各流分。合并含純度大于約95%的蝶酸的各流分，通過(guò)加 入1.0 M HC1溶液調(diào)節(jié)pH約為3，而將蝶酸從合并的各流分中沉淀。 冷凍干燥沉淀得到蝶酸(20g,經(jīng)分析型反相HPLC測(cè)定，純度〉98%)。
將柱通過(guò)用2個(gè)柱床體積的流動(dòng)相洗脫再生。將卡者存約一周或 一周以上的柱用防腐劑處理，如0.2%苯扎氯銨溶液處理。
實(shí)施例7.從熒光素中純化葉酸酯-熒光素綴合物
按實(shí)施例6中所述，將預(yù)溶脹的孩^立性DE52陰離子樹(shù)脂(DEAE 纖維素，Whatman目錄號(hào)4057-200, 1.8 kg)預(yù)處理。真空下，將在 去離子水(4 L)中的預(yù)處理的樹(shù)脂的漿狀液脫氣至少1小時(shí)，均勻地 裝載于一玻璃柱(75 X 600 mm)中，然后檢查該柱使得捕集的氣泡降 到最低。將柱用流動(dòng)相(l.O M NaCl， NaOH, pH 9.0)平衡。將含有約 10%熒光素和其它雜質(zhì)的粗品葉酸酯-熒光素綴合物(47.9 g)的樣本溶 解于水(600 mL)中，然后通過(guò)加入1.0 M NaOH溶液將pH調(diào)節(jié)至9.0。 將該溶液過(guò)濾，裝載于柱上，用流動(dòng)相洗脫。通過(guò)反相HPLC監(jiān)測(cè) 各流分。合并含純度大于約95%的葉酸酯-焚光素綴合物的各流分， 通過(guò)加入1.0 M HC1溶液調(diào)節(jié)pH約為3，而將葉酸酯-熒光素綴合物 從合并的流分中沉淀。冷凍干燥沉淀得到8 a (41.8 g)。
實(shí)施例8.經(jīng)HPLC純化8a
按實(shí)施例1中所述制備不純的8a (4g)的樣本，經(jīng)制備HPLC純 化，使用XTEREA RP18, 30 x 300 mm 10 pm柱(Waters),以35 ml/min 流速，用100:0至91:9 A/B(其中A是100 mM磷酸鈉(pH 7.4)溶液， B是ACN)梯度洗脫30 min進(jìn)行。洗脫化合物8a，收集流分，同時(shí) 在這些條件下雙熒光素-衍生物沒(méi)有洗脫，因而未被檢測(cè)到。通過(guò)同 時(shí)帶有UV檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器的分析型反相HPLC監(jiān)測(cè)各洗脫的 流分。經(jīng)UV檢測(cè)純度大于98%的流分不含有任何經(jīng)UV或熒光檢 測(cè)的EDA-雙焚光素或雙熒光素雜質(zhì)(閾值小于0.1%)，合并各流分。 在低于35"C的溫度下蒸發(fā)ACN。通過(guò)用1:1 A/B洗脫2個(gè)或2個(gè)以 上的柱床體積再生柱。
將得到的含磷酸鹽的8a的溶液在用100y。注射用水(WFI)平衡的 柱上經(jīng)反相HPLC純化，先通過(guò)用WFI洗脫30 min洗去磷酸鹽，接 著以35 mL/min的流速用100:0至91:9 WFI/ACN梯度洗脫30 min洗 脫8a。也通過(guò)同時(shí)帶有UV檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器的分析型反相HPLC 監(jiān)測(cè)各流分。收集經(jīng)UV檢測(cè)純度大于98%并且經(jīng)熒光檢測(cè)含有小 于0.05% EDA-雙熒光素或雙焚光素雜質(zhì)的各流分，冷凍干燥得到粉
末拷的8a。
實(shí)施例9.分離的葉酸酯-熒光素綴合物對(duì)實(shí)體瘤生長(zhǎng)的的影響 使用市售的皂草苷佐劑(GPI-0100; Galenica),將6-8周齡(約20-22 克)雌性Balb/c小鼠(8只/組)在帶有熒光素-標(biāo)記的匙孔蟲(chóng)血藍(lán)蛋白 (KLH)的多個(gè)位點(diǎn)皮下免疫。在確信所有小鼠中抗熒光素抗體滴度很 高后(通過(guò)小鼠血清樣本的ELISA測(cè)定結(jié)果證實(shí))，在用KLH-熒光素 先前免疫之后，在各動(dòng)物肩處皮下注射l x 106 M 109細(xì)胞(一種同 系基因型(syngeneic)肺癌細(xì)胞系，表達(dá)高水平的葉酸受體；第0曰)。 腫瘤細(xì)胞植入后用葉酸酯-熒光素的免疫接種由500、 2000或5000 nmol/kg的葉酸酯-熒光素(通過(guò)y羧基-連接的乙二胺橋綴合)組成，以 24小時(shí)間隔給予19個(gè)腹膜內(nèi)劑量(第1-19日)完成。給予對(duì)照組動(dòng)物 注射磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。為刺激免疫系統(tǒng)，給予所有小鼠三周的 一系列5日注射(一周5次)的20,000 IU/日的重組人IL-2。還給予所 有小鼠三周的一系列3次注射的25,000 U/日的重組人IFN-a。然后通 過(guò)使用測(cè)徑器監(jiān)測(cè)肺瘤體積(mm"來(lái)評(píng)估該免疫的有效性。圖2中所 示的腫瘤生長(zhǎng)曲線表明當(dāng)將動(dòng)物用IL-2和IFN-ot組合的葉酸酯-熒光 素處理時(shí)，實(shí)體瘤的生長(zhǎng)明顯受到抑制。
實(shí)施例10.用DE52純化EDA-葉酸酯(6a)
將預(yù)溶脹的孩么粒性DE52陰離子交換樹(shù)脂(DEAE纖維素，SIGMA) 與去離子水(12 L)混合。真空下，將該漿狀液脫氣至少1小時(shí)，均勻 地裝載于一玻璃柱(IOO X 1200 mm)中，然后檢查該柱使得捕集的氣 泡降到最低。將柱用pH 10.5的NaOH溶液平衡。將污染有乙二胺5a 的EDA-葉酸酯6a的樣本部分溶解于中性pH水中，然后通過(guò)加入 NaOH溶液將該溶液的pH調(diào)節(jié)至10.5之后完全溶解。裝載該pH調(diào) 節(jié)的溶液后，將柱先用3個(gè)柱床體積的pH 10.5的NaOH溶液洗脫， 然后用2個(gè)柱床體積的1.0 M NaCl/NaOH溶液(pH 10.5)洗脫。收集 和合并用1.0 M NaCl/NaOH (pH 10.5)溶液洗脫時(shí)得到的黃色流分。 通過(guò)加入HC1溶液將pH調(diào)節(jié)至約為7,從合并的流分中沉淀EDA-
葉酸酯6a。冷凍干燥后，將小部分的6a與熒光素偶合，然后用帶有 焚光檢測(cè)器的HPLC分析。未檢測(cè)到式II和III的EDA-雙焚光素化合物。
實(shí)施例11.化合物8a的鉤或鎂鹽的純化
將8a的鈉鹽(84%純度)用10-50摩爾當(dāng)量的氯化鎂或氯化4丐在 水中處理，得到沉淀。將混合物在90-100°C下加熱后，將沉淀溶解， 得到黃色溶液，將其過(guò)濾，慢慢冷卻至室溫。將得到的黃色固體過(guò) 濾，用水洗滌，冷凍干燥，得到純度為93-97%的8a?？赏ㄟ^(guò)離子交 換，將所述鈣或鎂鹽轉(zhuǎn)化為鈉鹽。
權(quán)利要求
1.一種純化蝶酸、蝶酸衍生物、蝶酸類似物或其組合的方法，該方法包括以下步驟(a)使包含蝶酸、蝶酸衍生物、蝶酸類似物或其組合的溶液與離子交換層析載體接觸；(b)用pH約為10或10以上的流動(dòng)相洗脫包含蝶酸、蝶酸衍生物或蝶酸類似物的第一種流分；(c)將第一種流分的pH降低至約3或3以下；和(d)沉淀蝶酸、蝶酸衍生物或蝶酸類似物。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述接觸步驟包括使該溶液與包含 糖基離子交換樹(shù)脂的離子交換層析載體接觸。
3. 權(quán)利要求1的方法，其中所述接觸步驟包括使該溶液與包含 糖基離子交換樹(shù)脂的離子交換層析載體接觸，所述糖基離子交換樹(shù) 脂選自纖維素、直鏈淀粉、瓊脂糖、瓊脂糖凝膠、交聯(lián)葡聚糖凝膠 及其組合。
4. 權(quán)利要求1的方法，其中所述接觸步驟包括使該溶液與包含 糖基離子交換樹(shù)脂的離子交換層析載體接觸，所述糖基離子交換樹(shù) 脂包含纖維素、直鏈淀粉或其組合。
5. 權(quán)利要求1的方法，其中所述接觸步驟包括使該溶液與包含 糖基陰離子交換樹(shù)脂的離子交換層析載體接觸。
6. 權(quán)利要求1的方法，其中所述接觸步驟包括使該溶液與包含 糖基陰離子交換樹(shù)脂的離子交換層析載體接觸，所述糖基陰離子交 換樹(shù)脂包括纖維素、直鏈淀粉或其組合。
7. 權(quán)利要求1的方法，其中所述接觸步驟包括使該溶液與包含 糖基陰離子交換樹(shù)脂的離子交換層析載體接觸，所述糖基陰離子交 換樹(shù)脂選自交聯(lián)葡聚糖凝膠DEAE、交聯(lián)葡聚糖凝膠QA、 PEI纖維 素、QA纖維素、DEAE纖維素及其組合。
8. 權(quán)利要求l的方法，其中所迷接觸步驟包括接觸還包含葉酸、 葉酸衍生物或其組合的溶液。
9. 權(quán)利要求8的方法，其還包括洗脫包含葉酸或葉酸衍生物的 第二種流分的步驟(e),其中第一種流分和第二種流分被基本分離。
10. 權(quán)利要求8或9的方法，其中所述接觸步驟包括使該溶液與 包含糖基陰離子交換樹(shù)脂的離子交換層析載體接觸，所述糖基陰離 子交換樹(shù)脂選自交聯(lián)葡聚糖凝膠DEAE、交聯(lián)葡聚糖凝膠QA、 PEI 纖維素、QA纖維素、DEAE纖維素及其組合。
11. 權(quán)利要求1-9的任一項(xiàng)的方法，其中所述洗脫步驟包括用pH 約為11或11以上的流動(dòng)相洗脫包含蝶酸、蝶酸衍生物或蝶酸類似 物的第一種流分。
12. 權(quán)利要求1-9的任一項(xiàng)的方法，其中所述洗脫步驟包括用pH 范圍約為11-13的流動(dòng)相洗脫包含蝶酸、蝶酸衍生物或蝶酸類似物的 第一種流分。
13. 權(quán)利要求1-9的任一項(xiàng)的方法，其中所述洗脫步驟包括用基 本上無(wú)氨或其鹽的流動(dòng)相洗脫。
14. 權(quán)利要求1-9的任一項(xiàng)的方法，其中所述沉淀步驟包括沉淀 蝶酸、蝶酸衍生物或蝶酸類似物，沉淀物的純度約為95%重量或以 上。
15. 權(quán)利要求1-9的任一項(xiàng)的方法，其中所述沉淀步驟包括沉淀 蝶酸、蝶酸衍生物或蝶酸類似物，沉淀物的純度約為98%重量或以 上。
16. 權(quán)利要求1-9的任一項(xiàng)的方法，其中所述沉淀步驟包括沉淀 蝶酸、蝶酸衍生物或蝶酸類似物，沉淀物的純度約為99%重量或以 上。
17. 權(quán)利要求1-9的任一項(xiàng)的方法，其中所述沉淀步每聚包括沉淀 蝶酸、蝶酸衍生物或蝶酸類似物，沉淀物基本上不含葉酸。
18. 權(quán)利要求1-9的任一項(xiàng)的方法，其中所述接觸步驟包括使包含蝶酸的溶液與離子交換層析載體接觸。
19.權(quán)利要求1-9的任一項(xiàng)的方法，其中所述接觸步驟包括使下 式的蝶酸衍生物 <formula>see original document page 4</formula>與離子交換層析載體接觸。
20.權(quán)利要求1-9的任一項(xiàng)的方法，其中所述接觸步驟包括使下 式的蝶酸衍生物 <formula>see original document page 4</formula>與離子交換層析載體接觸。
21. —種純化蝶酸、蝶酸衍生物、蝶酸類似物或其組合的方法， 該方法包括以下步驟(a) 使包含蝶酸、蝶酸衍生物、蝶酸類似物或其組合的溶液與陰 離子交換層析載體接觸；和(b) 洗脫包含蝶酸、蝶酸衍生物或蝶酸類似物的第一種流分。
22. 權(quán)利要求21的方法，其中所述接觸步驟包括使蝶酸、蝶酸 衍生物或蝶酸類似物與選自下列的陰離子交換層析載體接觸交聯(lián) 葡聚糖凝膠DEAE、交聯(lián)葡聚糖凝膠QA、 PEI纖維素、QA纖維素、 DEAE纖維素及其組合。
23. —種純化包含蝶酸、其衍生物或蝶酸類似物和熒光素或熒光 素^f汙生物的綴合物的方法，該方法包括以下步驟(a)使包含所述綴合物的溶液與笫 一種反相層析載體接觸；(b) 用流動(dòng)相洗脫包含所述綴合物的磷酸鹽復(fù)合物的笫 一種流分，所述流動(dòng)相包含-粦酸鹽，且pH范圍約為6-8;(c) 使所述綴合物的磷酸鹽復(fù)合物的溶液與第二種反相層析載體接觸；和(d) 用含水的流動(dòng)相洗脫包含所述綴合物的第二種流分，其中所述笫二種流分基本上無(wú)磷酸鹽。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述綴合物為下式的化合物
25. 權(quán)利要求23或24的方法，其中洗脫步驟(b)包括使用pH約 為7.4的流動(dòng)相。
26. 權(quán)利要求23或24的方法，其中接觸步驟(a)包括使所述綴合物與包含C18硅膠載體的笫一種反相層析載體接觸。
27. 權(quán)利要求23或24的方法，其中洗脫步驟(b)和洗脫步驟(d)各自包括用還包含獨(dú)立選自下列的所選有機(jī)溶劑的流動(dòng)相洗脫乙腈、甲醇、四氳呋喃及其組合。
28. 權(quán)利要求23或24的方法，其中洗脫步驟(b)和洗脫步驟(d)各自包括用還包含乙腈的流動(dòng)相洗脫。
29. 權(quán)利要求28的方法，其中洗脫步驟(b)包括用包含磷酸鹽和乙腈的流動(dòng)相按梯度進(jìn)行洗脫，其中在預(yù)定時(shí)間段內(nèi)，乙腈的相對(duì) 百分比增加，而磷酸鹽的相對(duì)百分比降低。
30. 權(quán)利要求28的方法，其中洗脫步驟(d)包括用包含水和乙腈的流動(dòng)相4耍梯度進(jìn)行洗脫，其中在預(yù)定時(shí)間段內(nèi)，乙腈的相對(duì)百分 比增加，而水的相對(duì)百分比降4氐。
31. —種制備下式化合物的方法，<formula>see original document page 6</formula>該方法包括以下步驟:使下式化合物<formula>see original document page 6</formula>與下式化合物反應(yīng)<formula>see original document page 6</formula>其中R和R2各自獨(dú)立選自氫和氮保護(hù)基，或者R和I^一起形成氮 保護(hù)基；113和114各自獨(dú)立選自氫和氮保護(hù)基；W是氬或羧酸保護(hù)基; n是選自0、 1、 2、 3和4的整數(shù)；m是選自1、 2、 3和4的整數(shù)； 以及RS和W各自獨(dú)立選自氬和氮保護(hù)基，或者116和R —起形成氮 保護(hù)基。
32. 權(quán)利要求31的方法，其中RS和R7的至少一個(gè)是氮保護(hù)基。
33. 權(quán)利要求31或32的方法，其中R"是氮保護(hù)基。
34. —種制備下式化合物的方法，<formula>see original document page 7</formula>與下式化合物反應(yīng)<formula>see original document page 7</formula>其中R1和R2各自獨(dú)立選自氫和氮保護(hù)基，或者R1和R2—起形成氮保護(hù)基；R3和R4各自獨(dú)立選自氫和氮保護(hù)基；R5是氬或羧酸保護(hù)基; n是選自0、 1、 2、 3和4的整數(shù)；m是選自1、 2、 3和4的整數(shù)；R6 和R7各自獨(dú)立選自氪和氮保護(hù)基，或者R6和R7 —起形成氮保護(hù)基; 以及R9是烷基。
35. 權(quán)利要求34的方法，其中R5是氬，及R9是曱基。
36. 權(quán)利要求34的方法，其中R6和R17的至少一個(gè)是氮保護(hù)基。
37. —種制備下式化合物的方法，<formula>see original document page 7</formula>該方法包括以下步驟 (a)使下式化合物:<formula>see original document page 8</formula>與下式化合物反應(yīng)<formula>see original document page 8</formula>其中Ri和W各自獨(dú)立選自氫和氮保護(hù)基，或者W和RS—起形成氮 保護(hù)基；113和114各自獨(dú)立選自氫和氮保護(hù)基；W是氬或羧酸保護(hù)基; n是選自0、 1、 2、 3和4的整數(shù)；以及m是選自1、 2、 3和4的整數(shù)。
38. 權(quán)利要求37的方法，其中RS是烷基。
39. —種下式化合物<formula>see original document page 8</formula>及其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物和溶劑化物，其中分離出來(lái)的該化 合物形式具有至少約95%摩爾或至少約95%重量的純度。
40.權(quán)利要求39的化合物，其中所述純度為至少約98%摩爾或 至少約98%重量。
41. 權(quán)利要求39的化合物，其中所述純度為至少約99%摩爾或 至少約99%重量。
42. 權(quán)利要求39的化合物，其以具有不超過(guò)約0.1%摩爾或不超 過(guò)約0.1%重量的一或多種雙熒光素組分的形式被進(jìn)一步分離。
43. 權(quán)利要求39的化合物，其以具有不超過(guò)約0.05%摩爾或不 超過(guò)約0.05%重量的一或多種雙焚光素組分的形式被進(jìn)一步分離。
44. 權(quán)利要求39-43中任一項(xiàng)的化合物，其以基本上不含一或多 種雙熒光素組分的形式被進(jìn)一步分離。
45. 權(quán)利要求39-43中任一項(xiàng)的化合物，其以基本不含有下式的 組分的形式被進(jìn)一步分離
46.權(quán)利要求39-43中任一項(xiàng)的化合物，其以基本不含有下式的 組分的形式被進(jìn)一 步分離
47. —種組合物，其包含下式化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物和溶劑化物，其中該化合物相當(dāng)于 至少約95%摩爾的組合物或至少約95%重量的組合物。
48.權(quán)利要求47的組合物，其中所述化合物相當(dāng)于至少約98%摩爾的組合物或至少約98%重量的組合物。
49. 權(quán)利要求47的組合物，其中所述化合物相當(dāng)于至少約99% 摩爾的組合物或至少約99%重量的組合物。
50. 權(quán)利要求47的組合物，其中所述組合物基本不含葉酸。
51. 權(quán)利要求47-50中任一項(xiàng)的組合物，其中所述化合物通過(guò)包 括使包含所述化合物的溶液與DEAE纖維素接觸的步驟的方法制備。
52. —種組合物，其包含下式化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物和溶劑化物，其中該化合物相當(dāng)于 至少約90%摩爾的組合物或至少約95%重量的組合物。
53. 權(quán)利要求52的組合物，其中所述化合物相當(dāng)于至少約95% 摩爾的組合物或至少約98%重量的組合物。
54. 權(quán)利要求52的組合物，其中所述化合物相當(dāng)于至少約99% 摩爾的組合物或至少約99%重量的組合物。
55. 權(quán)利要求52的組合物，其中所述組合物包括不超過(guò)約0.1%重量的一或多種雙熒光素組分。
56. 權(quán)利要求52的組合物，其中所迷組合物包括不超過(guò)約0.05%重量的一或多種雙焚光素組分。
57. 權(quán)利要求52的組合物，其中所述組合物基本上不含一或多種雙熒光素組分。
58. 權(quán)利要求52-56中任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物基本上不含下式的組分<formula>see original document page 11</formula>
59.權(quán)利要求52-56中任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物基本上 不含下式的組分<formula>see original document page 11</formula>
60. —種組合物，其包含下式化合物<formula>see original document page 11</formula>其中所述組合物包含不超過(guò)0.1%重量的一或多種雙熒光素組分。
61. 權(quán)利要求60的組合物，其中所迷組合物包含不超過(guò)約0.05% 重量的一或多種雙熒光素組分。
62. 權(quán)利要求60或61的組合物，其基本上不含有一或多種雙熒 光素組分。
63. 權(quán)利要求60或61的組合物，.其基本上不含下式的組分ii<formula>see original document page 12</formula>
64.權(quán)利要求60或61的組合物，其基本上不含下式的組分
65. —種在哺乳動(dòng)物中增強(qiáng)內(nèi)源性免疫應(yīng)答介導(dǎo)的清除病原性細(xì)胞群的方法，該方法包括給予所述哺乳動(dòng)物有效量的組合物的步驟，所述組合物包含配體-熒光素綴合物以及不超過(guò)約0.1%重量的一或多 種雙熒光素組分。
66. 權(quán)利要求65的方法，其中所述給予步驟包括給予包含配體-熒光素綴合物以及不超過(guò)約0.05%重量的一或多種雙熒光素組分的組合物。
67. 權(quán)利要求65的方法，其中所述給予步驟包括給予包含配體-熒光素綴合物并且基本不含一或多種雙熒光素組分的組合物。
68. 權(quán)利要求65或66的方法，其中所述給予步驟包括給予包含配體-熒光素綴合物并且基本不含下式化合物的組合物
69.權(quán)利要求65或66的方法，其中所述給予步驟包括給予包含 配體，熒光素綴合物并且基本不含下式化合物的組合物<formula>see original document page 13</formula>
70. —種在宿主動(dòng)物中增強(qiáng)內(nèi)源性免疫應(yīng)答介導(dǎo)的清除病原性細(xì) 胞群的方法，該方法包括給予所述宿主動(dòng)物有效量的權(quán)利要求43-50 中任一項(xiàng)的化合物的步驟。
71. —種在宿主動(dòng)物中增強(qiáng)內(nèi)源性免疫應(yīng)答介導(dǎo)的清除病原性細(xì) 胞群的方法，該方法包括給予所述宿主動(dòng)物有效量的權(quán)利要求56-68 中任一項(xiàng)的組合物的步驟。
72. —種在宿主動(dòng)物中增強(qiáng)內(nèi)源性免疫應(yīng)答介導(dǎo)的清除病原性細(xì) 胞群的方法，該方法包括給予所述宿主動(dòng)物有效量的配體-熒光素綴 合物的步驟，其中所述綴合物根據(jù)權(quán)利要求1-9或39-43中任一項(xiàng)制 備。
73. —種藥用組合物，其包含有效量的權(quán)利要求39-43中任一項(xiàng) 的化合物以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
74. —種藥用組合物，其包含有效量的權(quán)利要求47-50或52-57 中任一項(xiàng)的組合物以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明描述純化蝶酸、蝶酸類似物及蝶酸衍生物的方法。本發(fā)明還描述合成和純化維生素綴合物的方法，包括葉酸FITC綴合物、葉酸類似物以及葉酸和葉酸類似物的衍生物。本發(fā)明還描述蝶酸、蝶酸衍生物和類似物及其綴合物的純化形式。
文檔編號(hào)C07D475/08GK101175757SQ200680016287
公開(kāi)日2008年5月7日 申請(qǐng)日期2006年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月16日
發(fā)明者C·P·利蒙, H·K·桑塔普拉姆, I·R·弗拉霍夫, 李春紅, 許樂(lè)村 申請(qǐng)人:恩多塞特公司