專利名稱：制備純化脂肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及脂肽的結(jié)晶性與結(jié)晶狀形式，包括達(dá)托霉素，它是一種脂肽抗生素，對革蘭氏陽性細(xì)菌具有有力的殺菌活性，包括常規(guī)抗生素耐藥性菌株。本發(fā)明還涉及制備脂肽的結(jié)晶性與晶體狀形式的方法和純化脂肽的方法，脂肽包括達(dá)托霉素。本發(fā)明還涉及包含脂肽的純化形式的藥物組合物和使用這些組合物的方法。
發(fā)明的背景革蘭氏陽性感染——包括由抗生素耐藥性細(xì)菌導(dǎo)致的那些——發(fā)病率的迅速增加已經(jīng)重新引起人們對開發(fā)新型抗生素的興趣。其中一類是脂肽抗生素，它包括達(dá)托霉素。達(dá)托霉素對臨床上有關(guān)的革蘭氏陽性細(xì)菌具有有力的體外與體內(nèi)殺菌活性，這些細(xì)菌導(dǎo)致嚴(yán)重的和危及生命的疾病。這些細(xì)菌包括但不限于耐藥性病原體，例如萬古霉素耐藥性腸球菌(VRE)、甲氧西林耐藥性金黃色葡萄球菌(MRSA)、糖肽中間體易感性金黃色葡萄球菌(GISA)、凝固酶陰性葡萄球菌(CNS)和青霉素耐藥性肺炎鏈球菌(PRSP)，對它們很少有可供替代的治療劑。例如參見Tally等，1999，Exp.Opin.Invest.Drugs 81223-1238。達(dá)托霉素的抑制作用是一種迅速的、濃度依賴性體外與體內(nèi)殺菌作用，和一種相對長效的、濃度依賴性體內(nèi)抗生素后作用。
達(dá)托霉素被Baltz描述在Biotechnology of Antibiotics，2nd Ed.，ed.W.R.Strohl(New YorkMarcel Dekker，Inc.)，1997，pp.415-435中。達(dá)托霉素也已知為LY 146032，是一種環(huán)狀脂肽抗生素，它可以得自玫瑰孢鏈霉菌的發(fā)酵作用。達(dá)托霉素是玫瑰孢鏈霉菌的因子A-21978C0型抗生素的成員，由癸?；鶄?cè)鏈連接于環(huán)狀13-氨基酸肽的N-末端色氨酸而成(

圖1)。達(dá)托霉素具有優(yōu)異的活性，因為它對大多數(shù)革蘭氏陽性細(xì)菌是非常有效的；它的殺菌性高，起效迅速；它的耐藥性比率低，對抗生素耐藥性生物是有效的。該化合物目前正被開發(fā)為多種制劑，治療由細(xì)菌導(dǎo)致的嚴(yán)重感染，包括但不限于甲氧西林耐藥性金黃色葡萄球菌(MRSA)和萬古霉素耐藥性腸球菌(VRE)。
大量美國專利描述了A-21978C0抗生素和達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽，包括達(dá)托霉素(LY 146032)。這些專利還描述生產(chǎn)和分離A-21978C0抗生素和達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽的方法。
美國專利RE32,333、RE32,455、4,800,157、4,874,843和4,885,243描述了從玫瑰孢鏈霉菌的發(fā)酵培養(yǎng)物合成和分離達(dá)托霉素的方法。美國專利RE32,310、RE32,311、4,537,717、4,482,487和4,524,135描述了A-21978C0抗生素和脫?；疉-21978C0抗生素與再?；暮说姆椒?，和由這種方法制成的抗生素衍生物。美國專利5,912,226(以下稱為’226專利)描述了在達(dá)托霉素的制造期間生成的兩種雜質(zhì)的鑒別和分離，它們是脫水達(dá)托霉素和達(dá)托霉素的β-異構(gòu)體形式。這些美國專利都沒有公開以一定方式使脂肽沉淀或結(jié)晶的方法，以增加脂肽的純度。
美國專利4,439,425(以下稱為’425專利)公開了結(jié)晶性脂肽和使該脂肽結(jié)晶的方法。公開在’425專利中的脂肽在結(jié)構(gòu)上不同于達(dá)托霉素和達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽。美國專利5,336,756(以下稱為’756專利)也公開了包含六肽的結(jié)晶性環(huán)狀脂肽。公開在’756專利中的結(jié)晶性環(huán)狀脂肽也在結(jié)構(gòu)上不同于達(dá)托霉素和達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽。’756專利公開了脂肽是一種棘白菌素型化合物，當(dāng)采用含水正丙醇作為結(jié)晶溶劑時可以得到之。例如參見’756專利第1-2欄。’425專利和’756專利既沒有公開使達(dá)托霉素或達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽結(jié)晶或沉淀的方法，也沒有公開使由鏈霉菌產(chǎn)生的脂肽結(jié)晶或沉淀的方法。
開發(fā)一種使達(dá)托霉素和達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽結(jié)晶或沉淀的方法將是有利的，以提供這些脂肽的改進(jìn)純化方法。另外，達(dá)托霉素或其他達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽的結(jié)晶形式或高度純化的沉淀形式將可用于配制治療細(xì)菌感染的藥物組合物。進(jìn)而，達(dá)托霉素或達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽的結(jié)晶形式或高度純化的沉淀形式將可用在制備無菌產(chǎn)品、特別是大量無菌產(chǎn)品的方法中。因而，存在對生產(chǎn)結(jié)晶性或沉淀的達(dá)托霉素和達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽的方法和由此生產(chǎn)的脂肽的結(jié)晶或沉淀形式的需要。不過，尚不存在簡單和穩(wěn)健的方法有效使達(dá)托霉素或達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽結(jié)晶或沉淀，生成在結(jié)晶或沉淀后比以前更純的脂肽。
發(fā)明概述本發(fā)明為解決這些問題，提供脂肽、特別是達(dá)托霉素和達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽的結(jié)晶性與結(jié)晶狀形式，和生產(chǎn)它們的方法。在一種實施方式中，本發(fā)明提供使脂肽結(jié)晶的方法。在另一種實施方式中，這些方法提供在結(jié)晶或沉淀后比以前的結(jié)晶或沉淀更純的脂肽。
本發(fā)明還提供穩(wěn)健的生產(chǎn)和純化脂肽的方法，尤其包含使脂肽結(jié)晶或沉淀。在一種實施方式中，這些方法的結(jié)晶或沉淀步驟用于純化脂肽。在另一種實施方式中，這些方法用于脂肽、優(yōu)選達(dá)托霉素的大規(guī)模和/或商業(yè)生產(chǎn)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供高度純化的達(dá)托霉素和達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽的結(jié)晶性或晶體狀形式。在一種實施方式中，脂肽的結(jié)晶性或晶體狀形式可以用在藥物組合物中。在另一種實施方式中，本發(fā)明包含使用這些藥物組合物的方法。
附圖的簡要說明圖1顯示達(dá)托霉素的結(jié)構(gòu)。
圖2顯示由實施例12所述方法生產(chǎn)的達(dá)托霉素的urchin狀晶體或晶體狀粒子的顯微照片。
圖3顯示達(dá)托霉素的針狀晶體的顯微照片。
圖4顯示達(dá)托霉素的棒狀晶體的顯微照片。
圖5顯示達(dá)托霉素樣本在100X放大率下的顯微照片。無定形達(dá)托霉素的顯微照片是用平面透射光(A)和正交偏振光(B)顯示的。達(dá)托霉素晶體的顯微照片是用平面透射光(C和E)和正交偏振光(D和F)顯示的。達(dá)托霉素晶體是由實施例7所公開的方案生產(chǎn)的。
圖6顯示無定形達(dá)托霉素的X-射線粉末衍射圖樣。
圖7顯示由實施例7所述方案生產(chǎn)的達(dá)托霉素晶體的X-射線粉末衍射圖樣。
圖8顯示由實施例7所述方案生產(chǎn)的第二份達(dá)托霉素晶體狀本的X-射線粉末衍射圖樣。
圖9顯示達(dá)托霉素的晶體狀粒子在曝露于偏振光時的雙折射。晶體狀粒子是由實施例12所述方法生產(chǎn)的。
圖10顯示示范性結(jié)晶方法的流程圖。
圖11顯示不采用結(jié)晶或沉淀的示范性制造方法的流程圖。該制造方法采用細(xì)菌發(fā)酵，生成含有達(dá)托霉素的發(fā)酵培養(yǎng)物，然后利用微過濾、陰離子交換色譜、尺寸排阻超濾、疏水作用色譜、用于溶劑除去的陰離子交換色譜、用于熱原除去的超濾、反滲透來純化達(dá)托霉素，再將達(dá)托霉素裝瓶。例如參見2001年6月21日公布的國際PCT公報WO 01/44274，引用在此作為這種方法的詳細(xì)說明參考。
圖12顯示脂肽化合物的示范性制造方法的流程圖，該方法包含發(fā)酵、微過濾、陰離子交換色譜、尺寸排阻超濾、結(jié)晶或沉淀、晶體或沉淀的干燥和化合物的無水裝瓶等步驟。例如參見實施例13。
圖13顯示脂肽化合物的示范性制造方法的流程圖，該方法包含發(fā)酵、微過濾、陰離子交換色譜、結(jié)晶或沉淀、晶體或沉淀的干燥和化合物的無水裝瓶等步驟。例如參見實施例14。
圖14顯示脂肽化合物的示范性制造方法的流程圖，該方法包含發(fā)酵、微過濾、尺寸排阻超濾、結(jié)晶或沉淀、晶體或沉淀的干燥和化合物的無水裝瓶等步驟。例如參見實施例15。
圖15顯示脂肽化合物的示范性制造方法的流程圖，該方法包含發(fā)酵、微過濾、結(jié)晶或沉淀、晶體或沉淀的干燥和化合物的無水裝瓶等步驟。例如參見實施例16。
圖16描繪CB-131547的結(jié)構(gòu)，它是達(dá)托霉素的環(huán)狀脂肽類似物。
發(fā)明的詳細(xì)說明發(fā)明目的本發(fā)明的一個目的是提供使脂肽結(jié)晶或沉淀的方法。在一種實施方式中，這些方法用于使達(dá)托霉素或達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽結(jié)晶或沉淀。在另一種實施方式中，與結(jié)晶或沉淀之前的脂肽純度相比，這些方法增加脂肽的純度。這些方法包含提供脂肽的無定形制備物和使脂肽在一定條件下結(jié)晶或沉淀的步驟，其中結(jié)晶性或沉淀的晶體狀脂肽比脂肽的無定形制備物更純。在一種實施方式中，無定形制備物的純度不大于92％，由此純化的結(jié)晶性或晶體狀脂肽的純度是至少95％，并且可以是至少96％、97％或98％或者更純。在另一種實施方式中，無定形制備物的純度不大于80％，由此純化的結(jié)晶性或晶體狀脂肽的純度是至少95％，并且可以是至少96％、97％或98％或者更純。在另一種實施方式中，無定形制備物的純度不大于60％，由此純化的結(jié)晶性或晶體狀脂肽的純度是至少95％，并且可以是至少96％、97％或98％或者更純。在另一種實施方式中，無定形制備物的純度不大于40％，由此純化的結(jié)晶性或晶體狀脂肽的純度是至少95％，并且可以是至少96％、97％或98％或者更純。在另一種實施方式中，無定形制備物的純度不大于20％，由此純化的結(jié)晶性或晶體狀脂肽的純度是至少95％，并且可以是至少96％、97％或98％或者更純。在另一種實施方式中，無定形制備物的純度不大于10％，由此純化的結(jié)晶性或晶體狀脂肽的純度是至少95％，并且可以是至少96％、97％或98％或者更純。
本發(fā)明的另一個目的是提供制備和純化脂肽的方法，尤其包含使脂肽結(jié)晶或沉淀。在一種實施方式中，結(jié)晶或沉淀步驟用于純化脂肽。在優(yōu)選的實施方式中，結(jié)晶或沉淀是通過成批結(jié)晶或沉淀進(jìn)行的。在另一種實施方式中，該方法是用于一種脂肽商業(yè)生產(chǎn)的大規(guī)模方法，該脂肽優(yōu)選為達(dá)托霉素或達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽。在一種實施方式中，脂肽是由發(fā)酵作用產(chǎn)生的。發(fā)酵產(chǎn)物然后經(jīng)過各種純化技術(shù)純化，包括結(jié)晶或沉淀。在一種實施方式中，結(jié)晶或沉淀步驟可以與其他純化技術(shù)聯(lián)合使用，包括微過濾、尺寸排阻超濾和/或陰離子交換色譜。在一種實施方式中，結(jié)晶或沉淀步驟用于代替一種或多種用在不采用結(jié)晶或沉淀的純化方法中的純化技術(shù)。在另一種實施方式中，與沒有結(jié)晶或沉淀步驟的其他步驟相比，結(jié)晶或沉淀步驟用于增加純化作用。在優(yōu)選的實施方式中，該方法包含在結(jié)晶或沉淀后收集結(jié)晶性或晶體狀脂肽的步驟。
本發(fā)明的另一個目的是提供高度純化的、例如無菌的脂肽的結(jié)晶性或晶體狀形式。在一種實施方式中，這些脂肽是達(dá)托霉素或達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽。脂肽的結(jié)晶性或晶體狀形式可以具有任意結(jié)晶性或晶體狀形狀，包括urchin狀(連接在一起的針簇，視覺上類似于sea urchin(sea urchin))(見圖2)、針狀(見圖3)、棒狀(見圖4)、板狀或片狀。在一種實施方式中，結(jié)晶性或晶體狀脂肽的純度是至少80％，可以是至少85％、90％。在另一種實施方式中，脂肽的結(jié)晶性或晶體狀形式的純度是至少95％，可以是至少96％、97％、98％或更高。
本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供包含脂肽的結(jié)晶性或晶體狀形式的藥物組合物。在一種實施方式中，這些脂肽是達(dá)托霉素或達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽。在一種實施方式中，藥物組合物被包以腸溶衣，用于口服給藥，或者被配制成微粒或微球的形式。在其他實施方式中，本發(fā)明提供對需要的受治療者給以藥物組合物的方法。
定義除非另有定義，本文所用的全部技術(shù)與科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所普遍理解的含義。除非另有指示，本發(fā)明的實施采用化學(xué)、生物化學(xué)、生物物理學(xué)和微生物學(xué)的常規(guī)技術(shù)和其中所用的基本術(shù)語。
術(shù)語“脂肽”指的是包含與肽部分共價連接的脂質(zhì)樣部分的分子，以及它們的鹽、酯、酰胺和醚。術(shù)語“脂肽”還涵蓋脂肽的被保護(hù)形式，其中一個或多個氨基、羧基或羥基被保護(hù)起來。例如參見“ Protective Groups in Organic Synthesis”by Theodora W.Greene，John Wiley and Sons，New York，1981關(guān)于保護(hù)基團(tuán)的實例。在一種實施方式中，脂肽是一種抗生素。在另一種實施方式中，脂肽是LY 303366、棘白菌素、pneumocandin、棘孢曲菌素、粘液菌素、枯草菌表面活性劑、制磷脂菌素B1、安福霉素或公開在美國專利5,629,288中的脂肽衍生物。這些脂肽是本領(lǐng)域已知的。例如參見美國專利5,202,309和國際PCT申請WO 00/08197。在另一種實施方式中，脂肽是一種達(dá)托霉素相關(guān)性分子。在另一種實施方式中，脂肽是達(dá)托霉素。
“達(dá)托霉素相關(guān)性分子”尤其包括達(dá)托霉素、A54145或其他在結(jié)構(gòu)上與達(dá)托霉素有關(guān)的脂肽，例如達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽，包括關(guān)于這些分子中的任意手性中心而存在的所有立體異構(gòu)體。
“達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽”非限制性地包括公開在美國專利4,537,717、4,482,487、RE32,311、RE32,310和5,912,226中的脂肽，目前被重新發(fā)行為美國申請No.09/547,357。達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽還包括公開在2001年6月21日公布的國際PCT公報WO01/44272、2001年6月21日公布的國際PCT公報WO 01/44274和2001年6月21日公布的國際PCT公報WO 01/44271中的那些，所有這些申請都具體結(jié)合在此作為參考。公開在上述申請中的達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽涉及合成和半合成的脂肽，其中達(dá)托霉素的鳥氨酸和/或犬尿堿殘基、和/或脂肪酸側(cè)鏈被修飾了。達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽進(jìn)一步包括A-21978C0抗生素，其中達(dá)托霉素的正癸?；舅醾?cè)鏈被正辛?；?、正壬酰基、正十一碳?；?、正十二碳?；?、正十三碳?；蛘奶减；舅醾?cè)鏈所代替。
術(shù)語“達(dá)托霉素”指的是含有α-天冬氨?；囊蜃覣-21978C0型抗生素的正癸酰基衍生物?！斑_(dá)托霉素”與LY 146032是同義的。
術(shù)語“脫水達(dá)托霉素”指的是這樣一種達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽，其中達(dá)托霉素的α-天冬氨?；画h(huán)化為琥珀酰亞氨基。例如參見’226專利關(guān)于脫水達(dá)托霉素的結(jié)構(gòu)。
術(shù)語“β-異構(gòu)體”或“達(dá)托霉素的β-異構(gòu)體”指的是含有β-天冬氨?；姒?天冬氨?；倪_(dá)托霉素相關(guān)性脂肽。例如參見’226專利關(guān)于達(dá)托霉素β-異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)。
術(shù)語“分離的”指的是這樣一種化合物或產(chǎn)物，該化合物在混合物中至少占5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。將不言而喻的是術(shù)語“分離的”還指的是這樣一種化合物，它在混合物中至少占5-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％或80-90％。化合物在混合物中的百分比可以借助本領(lǐng)域已知的任意手段測量，如下關(guān)于測量化合物的純度所述。
“基本上純的”指的是具有至少95％所需化合物的樣本。優(yōu)選地，當(dāng)至少95％至至少97％的樣本是達(dá)托霉素時，達(dá)托霉素是“基本上純的”。類似地，當(dāng)至少95％至至少97％的樣本是達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽時，達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽是“基本上純的”。
當(dāng)至少98％至至少99％的樣本分別是達(dá)托霉素或達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽時，達(dá)托霉素或達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽是“本質(zhì)上純的”。
當(dāng)其他化合物的含量分別不超過達(dá)托霉素或達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽制備物量的1％時，達(dá)托霉素或達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽是“基本上不含”另一種化合物的。
當(dāng)其他化合物的含量分別不超過達(dá)托霉素或達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽制備物量的0.5％時，達(dá)托霉素或達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽是“本質(zhì)上不含”另一種化合物的。
當(dāng)其他化合物的含量分別不超過達(dá)托霉素或達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽制備物量的0.1％時，達(dá)托霉素或達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽是“不含”另一種化合物的。作為替代選擇，當(dāng)其他化合物在最大靈敏度條件下不能被HPLC檢測時，其中檢測限分別是達(dá)托霉素或達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽制備物量的大約0.05％或以下，達(dá)托霉素或達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽是“不含”另一種化合物的。
“純化的”達(dá)托霉素指的是基本上純的達(dá)托霉素、本質(zhì)上純的達(dá)托霉素、或它們的鹽，或者指的是基本上不含、本質(zhì)上不含或不含另一種化合物的達(dá)托霉素或其鹽。類似地，“純化的”達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽指的是基本上純的達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽、本質(zhì)上純的達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽、或它們的鹽，或者指的是基本上不含、本質(zhì)上不含或不含另一種化合物的達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽或其鹽。
“粗的”達(dá)托霉素指的是純度小于90％的達(dá)托霉素或其鹽。類似地，“粗的”達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽指的是純度小于90％的達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽或其鹽。
“半純化的”達(dá)托霉素指的是純度至少90％而小于95％的達(dá)托霉素或其鹽。類似地，“半純化的”達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽指的是純度至少90％而小于95％的達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽或其鹽。
達(dá)托霉素、達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽或另一種脂肽的純度指的是在其配制成藥物組合物之前的脂肽。脂肽的純度用“百分比純度”表示。純度的量度不是結(jié)晶性制備物的結(jié)晶度的量度。純度可以借助任意手段測量，包括核磁共振(NMR)、氣相色譜/質(zhì)譜(GC/MS)、液相色譜/質(zhì)譜(LC/MS)或微生物學(xué)測定。一種優(yōu)選的測量達(dá)托霉素純度的手段是分析型高效液相色譜(HPLC)。分析型HPLC的兩種方法描述在2001年7月26日公布的國際PCT公報WO 01/53330中，具體結(jié)合在此作為參考。
“脂肽晶體”指的是脂肽或脂肽鹽的一種或多種晶體。脂肽是否為晶體可以借助任意手段測定，尤其包括光學(xué)顯微鏡檢查、電子顯微鏡檢查、X-射線粉末衍射、固態(tài)核磁共振(NMR)或偏振光顯微鏡檢查。顯微鏡檢查可以用于測定晶體的長度、直徑、寬度、大小和形狀，以及該晶體是否以單一粒子存在或者是否是多晶的。
如果當(dāng)借助一種手段測定時，例如肉眼觀察或光學(xué)或偏振光顯微鏡檢查，具有結(jié)晶特征，但是當(dāng)借助另一種手段測定時，例如X-射線粉末衍射，不具有結(jié)晶特征，那么脂肽或脂肽粒子是“晶體狀”的。是“晶體狀”的脂肽可以在某些條件下是結(jié)晶性的，但是在處于其他條件下時可能變?yōu)榉墙Y(jié)晶性的。
“結(jié)晶性脂肽”或“脂肽的結(jié)晶形式”指的是包含脂肽晶體的脂肽或其鹽的制備物。在一種實施方式中，結(jié)晶性脂肽可以包含一定量的無定形脂肽。在一種實施方式中，結(jié)晶性脂肽包含超過50重量％的脂肽晶體。在另一種實施方式中，結(jié)晶性脂肽包含超過60％、70％、80％、90％或95％的脂肽晶體。結(jié)晶性脂肽可以包含50-60％、60-70％、70-80％、80-90％或90-95％的脂肽晶體。在另一種實施方式中，結(jié)晶性脂肽包含超過95％的脂肽晶體，例如至少96％、97％、98％或99％的脂肽晶體或100％的脂肽晶體。結(jié)晶性脂肽還可以包含任意95-100％的脂肽晶體。脂肽晶體的重量百分比指的是在其配制成藥物組合物之前的脂肽制備物。
脂肽的“無定形”形式指的是這樣一種脂肽制備物，它包含很少或者沒有如本文所定義的脂肽晶體或晶體狀脂肽(或晶體狀粒子)。在一種實施方式中，無定形脂肽包含小于20重量％的脂肽晶體或晶體狀脂肽。在另一種實施方式中，無定形脂肽包含小于10重量％的脂肽晶體或晶體狀脂肽。在另一種實施方式中，無定形脂肽包含小于5重量％的脂肽晶體或晶體狀脂肽。在另一種實施方式中，無定形脂肽包含小于1重量％的脂肽晶體或晶體狀脂肽。
“成批結(jié)晶”指的是這樣一種方法，其中將有關(guān)脂肽與結(jié)晶試劑混合在溶液中，允許脂肽在溶液中結(jié)晶。“成批沉淀”指的是這樣一種方法，其中將有關(guān)脂肽與沉淀試劑混合在溶液中，允許脂肽在溶液中沉淀。在一種實施方式中，從溶液中收集結(jié)晶性或沉淀的制備物。在另一種實施方式中，借助過濾或離心收集結(jié)晶性或沉淀的制備物。
“有機沉淀劑”指的是聚乙二醇(PEG)或聚乙二醇一甲醚(PEG-MME)或化學(xué)上相似的化合物。
“鹽”指的是離子化合物。這些離子化合物可以充當(dāng)沉淀劑。
“小分子醇”是含有至少一個醇官能團(tuán)和八個碳原子或以下的有機化合物。例如，小分子醇非限制性地包括甲醇、異丙醇和叔丁醇。
“多元醇”指的是含有多于一個醇基和少于八個碳原子的化合物。多元醇例如非限制性地包括1，6-己二醇、乙二醇、丙二醇、甘油、1，2-丙二醇、2-甲基-2，4-戊二醇和1，4-丁二醇。
“容器”指的是容納物品的接受器。例如，容器可以非限制性地包括安瓿、小瓶、試管、瓶子或圓筒。
生產(chǎn)純化脂肽的方法本發(fā)明的一個目的是提供純化脂肽的方法，包含提供脂肽的無定形制備物和使該脂肽結(jié)晶或沉淀的步驟。在一種實施方式中，脂肽的純度在結(jié)晶或沉淀后高于結(jié)晶或沉淀之前?？梢赃@樣使脂肽結(jié)晶，懸滴、sitting drop或sandwich drop蒸汽擴散、液-液或自由界面擴散、微量透析或透析、緩慢溶劑蒸發(fā)、升華、微量成批或成批結(jié)晶。一般而言，可以按相似方式使脂肽沉淀，優(yōu)選地借助成批沉淀使脂肽沉淀。在優(yōu)選的實施方式中，所結(jié)晶或沉淀的脂肽是達(dá)托霉素或達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽。在更優(yōu)選的實施方式中，所結(jié)晶或沉淀的脂肽是達(dá)托霉素。
可以遵照本說明書的教導(dǎo)使脂肽結(jié)晶或沉淀。在一種實施方式中，可以這樣使脂肽結(jié)晶或沉淀，提供一種溶液，包含脂肽和小分子或多元醇、pH緩沖劑和包含一價或二價陽離子的鹽，允許沉淀或結(jié)晶發(fā)生，進(jìn)一步討論在下。在另一種實施方式中，鹽具有緩沖能力，以便額外的pH緩沖劑不必存在于溶液中。在另一種實施方式中，鹽包含二價陽離子。在優(yōu)選的實施方式中，所提供的溶液不包括PEG或PEG-MME或化學(xué)上相似的化合物。在一種實施方式中，使脂肽沉淀或結(jié)晶的方法一般包含下列步驟a)將脂肽與包含一價或二價陽離子的鹽、可選的pH緩沖劑和小分子或多元醇混合；b)允許脂肽在適當(dāng)?shù)臏囟葪l件下從溶液中沉淀或結(jié)晶出來。
尤其可以借助顯微鏡檢查監(jiān)測樣本的晶體或沉淀生成，并且可以按照分光光度法測定收率。在優(yōu)選的實施方式中，所結(jié)晶或沉淀的脂肽是達(dá)托霉素或達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽。
在另一種實施方式中，可以這樣使脂肽結(jié)晶，提供一種溶液，包含小分子或多元醇、鹽和有機沉淀劑，進(jìn)一步討論在下。在更優(yōu)選的實施方式中，所結(jié)晶的脂肽是達(dá)托霉素。一般而言，關(guān)于成批結(jié)晶，將脂肽溶于溶液，向該溶液加入小分子醇、鹽、緩沖劑和/或有機沉淀劑。然后在適當(dāng)?shù)臏囟葪l件下使樣本結(jié)晶，并攪拌或不攪拌。尤其可以借助顯微鏡檢查監(jiān)測樣本的晶體生成，并且可以按照分光光度法測定收率。
如上所述，在一種或多種醇的存在下使脂肽、優(yōu)選達(dá)托霉素或達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽結(jié)晶或沉淀。在優(yōu)選的實施方式中，醇是小分子或多元醇。小分子或多元醇的實例非限制性地包括甲醇、異丙醇、叔丁醇、1，6-己二醇、乙二醇、丙二醇、甘油、1，2-丙二醇、2-甲基-2，4-戊二醇和1，4-丁二醇。在優(yōu)選的實施方式中，醇是異丙醇、叔丁醇、甘油、1，6-己二醇、1，2-丙二醇、1，4-丁二醇、丙二醇和/或乙二醇。在更優(yōu)選的實施方式中，醇是異丙醇。
鹽尤其包括鎂或鈉的甲酸鹽、硫酸銨、磷酸二氫銨、乙酸鈣、乙酸鋅、檸檬酸三鈉二水合物、乙酸鎂、乙酸鈉、氯化鎂、氯化鈣、乙酸銨、氯化鈉和硫酸鋰。在一種實施方式中，鹽包含一價陽離子，例如鈉。在優(yōu)選的實施方式中，鹽包含二價陽離子。在進(jìn)而更優(yōu)選的實施方式中，鹽包含鈣陽離子、鎂陽離子或錳陽離子。在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方式中，鹽包含鈣的二價陽離子。在一種實施方式中，鹽是氯化鈣、乙酸鈣、乙酸鋅、檸檬酸鈉、檸檬酸三鈉二水合物、氯化鎂、硫酸鋰、氯化鈉、乙酸鎂、乙酸鈉或一種錳鹽，例如乙酸錳或氯化錳。在優(yōu)選的實施方式中，鹽是乙酸鈣。其他包含二價陽離子、例如鈣陽離子的鹽的實例是本領(lǐng)域已知的，尤其包括列在2000Sigma目錄中的那些，結(jié)合在此作為參考。不希望拘泥于任何理論地認(rèn)為，鹽陽離子可以中和脂肽上的負(fù)電荷，例如達(dá)托霉素的四羧酸。尤其沉淀劑尤其包括聚乙二醇(PEG)，平均分子量可以在300與10,000之間變化，或聚乙二醇一甲醚(PEG-MME)。在優(yōu)選的實施方式中，有機沉淀劑是PEG 300、PEG 600、PEG 2000、PEG 4000、PEG 8000或PEG 10,000。
使脂肽從被緩沖至pH5.0至9.5的溶液中沉淀或結(jié)晶出來。在一種實施方式中，在被緩沖之前，溶液的pH約為1.5、2.0或3.0。在一種實施方式中，使達(dá)托霉素或達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽從大約pH5.5至大約pH7.5的溶液中沉淀或結(jié)晶出來。在另一種實施方式中，緩沖液的pH為大約5.9至大約6.3。在一種實施方式中，使用pH緩沖劑可以得到被緩沖的溶液。pH緩沖劑的實例非限制性地包括Tris、磷酸鹽、檸檬酸鹽、HEPES、CHES、乙酸鈉或2-嗎啉代乙磺酸(MES)、硼酸鈉、二甲胂酸鈉、咪唑和檸檬酸三鈉二水合物。在優(yōu)選的實施方式中，鹽是二甲胂酸鈉、乙酸鈉、檸檬酸三鈉二水合物、HEPES、MES、CHES、咪唑、乙酸鈣和Tris-HCl。在更優(yōu)選的實施方式中，pH緩沖劑是乙酸鈣pH6.1、乙酸鈉pH6.1、二甲胂酸鈉pH6.5、檸檬酸三鈉二水合物pH5.6、HEPES pH7.5、咪唑pH8、MES pH6.0、乙酸鈣pH6和Tris-HCl pH8.5。在另一種實施方式中，可以使用也具有緩沖能力的鹽使溶液緩沖。在優(yōu)選的實施方式中，pH緩沖劑是乙酸鈣pH6.1。
利用懸滴蒸汽擴散使脂肽從溶液中沉淀或結(jié)晶出來，該溶液含有2至40％小分子或多元醇、0.001至0.5M鹽和0.005至0.2M pH緩沖劑。在優(yōu)選的實施方式中，使脂肽從含有3至30％小分子或多元醇、0.01至0.3M鹽和0.01至0.1M pH緩沖劑的溶液中沉淀或結(jié)晶出來。在更優(yōu)選的實施方式中，使脂肽從含有5至20％小分子或多元醇、0.02至0.1M鹽和0.02至0.07M pH緩沖劑的溶液中沉淀或結(jié)晶出來。所提供的溶液可以包括或者可以不包括聚乙二醇(PEG)或聚乙二醇一甲醚(PEG-MME)。
利用成批結(jié)晶使脂肽從溶液中沉淀或結(jié)晶出來，該溶液含有65至95％小分子或多元醇、0.001至0.5M鹽和0.001至0.2M pH緩沖劑。在優(yōu)選的實施方式中，使脂肽從含有70至90％小分子或多元醇、0.005至0.04M鹽和0.005至0.04M pH緩沖劑的溶液中沉淀或結(jié)晶出來。在有些實施方式中，使脂肽從還包含3-8％有機沉淀劑的溶液中結(jié)晶出來。在更優(yōu)選的實施方式中，使脂肽從含有80至85％小分子或多元醇、0.01至0.03M鹽和0.01至0.03M pH緩沖劑的溶液中沉淀或結(jié)晶出來。在有些實施方式中，溶液進(jìn)一步包含4-5％有機沉淀劑，例如PEG或PEG-MME。在其他實施方式中，所提供的溶液不包括聚乙二醇(PEG)或聚乙二醇一甲醚(PEG-MME)。
使脂肽在大約0℃至大約30℃的溫度下沉淀或結(jié)晶，分別得到沉淀或晶體。在優(yōu)選的實施方式中，使脂肽在大約20-30℃的溫度下結(jié)晶或沉淀。在更優(yōu)選的實施方式中，使混合物在大約23-28℃的溫度下結(jié)晶或沉淀。在進(jìn)而更優(yōu)選的實施方式中，使混合物在大約27℃的溫度下結(jié)晶或沉淀?？梢允够旌衔锝Y(jié)晶或沉淀達(dá)導(dǎo)致結(jié)晶或沉淀的任意時間，優(yōu)選大約一小時至大約兩周。在優(yōu)選的實施方式中，將混合物貯存大約3小時至大約24小時，更優(yōu)選大約8-18小時。
脂肽晶體或晶體狀粒子可以具有一定形狀，非限制性地有針狀、棒狀、urchin狀、片狀、板狀或其簇。在一種實施方式中，脂肽晶體或晶體狀粒子是urchin狀、棒狀或針狀的。晶體或晶體狀粒子的形狀尤其可以借助光學(xué)或電子顯微鏡檢查加以測定。在另一種實施方式中，脂肽晶體或晶體狀粒子可以是任意大小的，在任意一維上的直徑至少大約0.5μm。在更優(yōu)選的實施方式中，脂肽晶體或晶體狀粒子有至少5μm，更優(yōu)選至少10μm。在進(jìn)而更優(yōu)選的實施方式中，脂肽晶體或晶體狀粒子有至少50μm，更優(yōu)選至少100μm。晶體的大小可以借助本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任意方法加以測定。例如參見美國藥典(USP)pp.1965-67。
結(jié)晶性或晶體狀脂肽的性質(zhì)可以借助本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任意方法加以測定?？梢詼y定的性質(zhì)包括結(jié)晶性或晶體狀脂肽的大小、形狀、雙折射性質(zhì)、粉末X-射線衍射性質(zhì)、固態(tài)NMR性質(zhì)、熔點和對熱、光、潮濕與降解作用的穩(wěn)定性。在優(yōu)選的實施方式中，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以借助粉末X-射線衍射測定脂肽是否為結(jié)晶性。粉末X-射線衍射非常適用于測定當(dāng)樣本是小晶體的隨機取向集合體時，制備物是否為結(jié)晶性。隨機取向的微晶物的衍射作用產(chǎn)生一系列所研究分子及其結(jié)構(gòu)所特有的線或環(huán)(因檢測器而異)。在優(yōu)選的實施方式中，為了測定脂肽是否為結(jié)晶性，用自動粉末衍射儀測量粉末衍射。例如參見Atkins等，Physical Chemistry，pp.710-716(1978)，結(jié)合在此作為參考關(guān)于Debye-Scherrer法粉末衍射的討論。配有本領(lǐng)域已知的任意粉末衍射檢測器的、本領(lǐng)域已知的任意粉末衍射測定儀都可以用于測量衍射圖樣。
在優(yōu)選的發(fā)明實施方式中，在大約24-28℃的溫度下，使用大約pH5.0與9.5之間的緩沖劑、鹽和醇，使脂肽結(jié)晶或沉淀大約3至24小時。在優(yōu)選的實施方式中，鹽是緩沖劑，包含二價陽離子，醇是小分子醇，pH在大約5.5與7.5之間。在進(jìn)而更優(yōu)選的實施方式中，鹽是鈣鹽，醇是異丙醇，pH在大約5.9與6.3之間。在實施方式中，溶液包括有機沉淀劑，優(yōu)選地有機沉淀劑是PEG 4000或PEG8000。在另一種實施方式中，使脂肽從含有12至18％甘油、0.3至0.8m鹽、0.03至0.08m pH緩沖劑和12-18％PEG 600的溶液中沉淀或結(jié)晶出來。在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方式中，脂肽是達(dá)托霉素或達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽。實施例2-3提供了使非常純的晶體狀達(dá)托霉素沉淀的方法。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員遵照本說明書的教導(dǎo)，可以調(diào)整實施例所提供的結(jié)晶/沉淀條件，以使達(dá)托霉素、達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽或其他有關(guān)脂肽結(jié)晶或沉淀。進(jìn)而，盡管本說明書的教導(dǎo)描述了在純化脂肽的方法中使用單一的結(jié)晶或沉淀步驟，不過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員遵照本說明書的教導(dǎo)可以在純化脂肽的方法中使用多個結(jié)晶或沉淀步驟。為了進(jìn)一步增加脂肽的純度，采用多個如本文所公開的結(jié)晶或沉淀循環(huán)可能是有利的。
結(jié)晶或沉淀后，可以借助本領(lǐng)域已知的任意方法收集結(jié)晶物或晶體狀沉淀。在優(yōu)選的實施方式中，借助離心或過濾收集結(jié)晶物或晶體狀沉淀。在進(jìn)而更優(yōu)選的實施方式中，借助過濾收集結(jié)晶物或晶體狀沉淀，因為過濾容易結(jié)合在生產(chǎn)脂肽的大規(guī)模方法中。收集結(jié)晶物或晶體狀沉淀后，洗滌除去過量結(jié)晶試劑或沉淀試劑?？梢赃x擇本領(lǐng)域已知的任意洗滌溶劑，只要它不明顯溶解結(jié)晶物或晶體狀沉淀即可。實施例12提供了洗滌溶劑的實例。洗滌結(jié)晶物或晶體狀沉淀后，可以借助本領(lǐng)域已知的任意方法干燥。干燥方法的實例包括風(fēng)干、凍干(冷凍干燥)或干燥(desiccation)。在優(yōu)選的方法中，將結(jié)晶物或晶體狀沉淀干燥(desiccate)。例如參見實施例12。在另一種實施方式中，結(jié)晶性脂肽的穩(wěn)定性可以借助它的殘留抗生活性或它的降解作用加以測定?？股钚钥梢栽卺槍Ω鞣N菌株的標(biāo)準(zhǔn)瓊脂擴散測定法中測量。例如參見美國專利4,537,717實施例32，具體結(jié)合在此作為參考。降解量尤其可以借助HPLC分析測量，例如2001年7月26日公布的國際PCT公報WO 01/53330所述。在優(yōu)選的實施方式中，結(jié)晶性脂肽的穩(wěn)定性大于脂肽的無定形形式。結(jié)晶性脂肽的穩(wěn)定性可以這樣測定，使結(jié)晶性脂肽和其無定形形式曝露于熱、光、潮濕之下，測量結(jié)晶形式和無定形形式的降解程度。
脂肽的降解作用可以借助測定脂肽的生物活性或任意適用的物理參數(shù)加以測量。在一種實施方式中，降解作用可以這樣測量，測定脂肽在經(jīng)受熱、光、潮濕、pH改變或極端pH后的特定生物活性，并與脂肽在任意穩(wěn)定性試驗之前的相同生物活性進(jìn)行比較。降解量例如可以借助測定穩(wěn)定性試驗后剩余的生物活性百分比加以測定。可以將剩余生物活性的百分比與經(jīng)受相同試驗的脂肽的無定形形式進(jìn)行比較。在一種實施方式中，如果脂肽是抗生素，可以在穩(wěn)定性試驗之前和之后測試結(jié)晶性脂肽的抗生活性，再與降解試驗前后的無定形形式進(jìn)行比較。在優(yōu)選的實施方式中，脂肽是達(dá)托霉素或達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽，生物活性試驗測定脂肽對革蘭氏陽性細(xì)菌的抗生活性量。
脂肽的降解作用還可以借助物理測定法測量。在一種實施方式中，降解作用可以借助測定穩(wěn)定性試驗后保留的完整結(jié)晶性脂肽的百分比加以測量?？梢詫⒈Ａ舻耐暾牡陌俜直扰c經(jīng)受相同穩(wěn)定性試驗的脂肽的無定形形式進(jìn)行比較。在優(yōu)選的實施方式中，脂肽的降解作用可以借助HPLC、紫外分光術(shù)、紅外分光術(shù)、NMR或質(zhì)譜加以測量。在進(jìn)而更優(yōu)選的實施方式中，使用HPLC測定在脂肽結(jié)晶形式經(jīng)受穩(wěn)定性試驗后保留的完整脂肽百分比。
不希望拘泥于任何理論的是，申請人相信利用上述方法使達(dá)托霉素結(jié)晶。不過，據(jù)認(rèn)為洗滌和/或干燥達(dá)托霉素晶體導(dǎo)致達(dá)托霉素結(jié)晶物恢復(fù)非結(jié)晶性，但是仍然為晶體狀形式。雖然如此，即使上述方法僅僅使達(dá)托霉素或其他脂肽沉淀而非結(jié)晶，這些方法仍然是有利的，因為這些方法純化了脂肽。
本發(fā)明還提供由上述方法生產(chǎn)的結(jié)晶性或晶體狀脂肽。在一種實施方式中，與結(jié)晶或沉淀前的脂肽相比，結(jié)晶性或晶體狀脂肽包含更少量的一種或多種雜質(zhì)。在一種實施方式中，結(jié)晶性或晶體狀脂肽是達(dá)托霉素，它與結(jié)晶或沉淀前的達(dá)托霉素相比，包含更低水平的脫水達(dá)托霉素和/或達(dá)托霉素β-異構(gòu)體。在另一種實施方式中，與無定形達(dá)托霉素相比，結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素包含更低水平的所有雜質(zhì)。類似地，在另一種實施方式中，結(jié)晶性或晶體狀脂肽是達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽，如上所述，它與達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽的無定形形式相比，包含更低水平的一種或多種雜質(zhì)。在另一種實施方式中，與達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽的無定形形式相比，結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽包含更低水平的所有雜質(zhì)。
由上述方法生產(chǎn)的結(jié)晶性或晶體狀脂肽同樣包含一價或二價陽離子和水。在優(yōu)選的實施方式中，結(jié)晶性或晶體狀脂肽是包含二價陽離子的達(dá)托霉素或達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽。在更優(yōu)選的實施方式中，二價陽離子是鈣陽離子。在進(jìn)而更優(yōu)選的實施方式中，根據(jù)原子吸收或熱重分析的測定，結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素或達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽包含大約1-10重量％的二價鈣陽離子和大約0-15重量％的水。在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方式中，根據(jù)HPLC分析，結(jié)晶性或晶體狀脂肽是包含大約5重量％二價鈣陽離子和大約10重量％水的達(dá)托霉素，結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素的純度是至少95％、96％、97％或98％，或者是在95-98％之間的任意純度，相對于相關(guān)物質(zhì)和有機污染物而言。作為替代選擇，結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素或達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽包含一價陽離子，例如鈉。不希望拘泥于任何理論地認(rèn)為達(dá)托霉素或達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽當(dāng)結(jié)晶或沉淀時，可以與一價或二價陽離子生成鹽。
脂肽的結(jié)晶形式可以比脂肽的無定形形式表現(xiàn)增加了的在溶液中的溶解度或增加了的在溶液中的再生率。人們可以借助本領(lǐng)域已知的任意方法測量結(jié)晶性脂肽是否表現(xiàn)增加了的溶解度或增加了的再生率。例如，人們可以將一定量結(jié)晶性脂肽溶于水溶液，測量所溶解的脂肽濃度，并將等量無定形脂肽溶于水溶液，比較二者所溶解的脂肽濃度。類似地，人們可以這樣測量結(jié)晶性脂肽的再生率，向水溶液加入結(jié)晶性脂肽，然后測量經(jīng)過一定時間所溶解的脂肽濃度，并與無定形脂肽的再生率進(jìn)行比較。脂肽的濃度是用HPLC測量的。
上述方法提供了結(jié)晶性或晶體狀脂肽的生產(chǎn)方法，它們是從無定形脂肽結(jié)晶或沉淀而來的，但是更純。在一種實施方式中，脂肽是達(dá)托霉素或達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽。在另一種實施方式中，達(dá)托霉素或達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽在結(jié)晶前純度不超過92％，在結(jié)晶或沉淀出晶體狀脂肽后純度至少是大約95％、96％、97％或98％，或者是在95-98％之間的任意純度。在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方式中，達(dá)托霉素或達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽在結(jié)晶前純度不超過90％，在結(jié)晶后純度大約是至少97％或98％。
在另一種實施方式中，達(dá)托霉素在結(jié)晶或沉淀前純度不超過80％，優(yōu)選不超過70％，更優(yōu)選不超過60％，在純化后純度至少是大約95％、96％、97％或98％，或者是在95-98％之間的任意純度。在另一種實施方式中，達(dá)托霉素在結(jié)晶前純度不超過50％，優(yōu)選不超過40％，更優(yōu)選不超過30％，在結(jié)晶或沉淀純化后純度至少是大約95％、96％、97％或98％，或者是在95-98％之間的任意純度。進(jìn)一步優(yōu)選的是這樣一種實施方式，其中達(dá)托霉素在結(jié)晶前純度不超過20％，更優(yōu)選不超過15％，進(jìn)而更優(yōu)選不超過10％，在純化后純度至少是大約95％、96％、97％或98％，或者是在95-98％之間的任意純度。
在更優(yōu)選的實施方式中，脂肽是達(dá)托霉素。達(dá)托霉素制備物可以借助任意已公開的方法獲得，例如美國專利RE32,333、RE32,455、4,800,157、RE32,310、RE32,311、4,537,717、4,482,487、4,524,135、4,874,843、4,885,243或5,912,226，它們被具體結(jié)合在此作為參考。達(dá)托霉素制備物還可以借助2001年7月26日公布的國際PCT公報WO 01/53330所述方法之一獲得。制成脂肽制備物后，遵照本說明書的教導(dǎo)使脂肽制備物結(jié)晶或沉淀，生成結(jié)晶性或晶體狀脂肽，它比純化前的脂肽制備物更純或者含有更低水平的特定雜質(zhì)，例如脫水達(dá)托霉素。
從發(fā)酵培養(yǎng)物生產(chǎn)純化脂肽的方法本發(fā)明的另一種實施方式涉及聯(lián)合色譜步驟和結(jié)晶或純化以生產(chǎn)純化脂肽的方法。在優(yōu)選的實施方式中，該方法包含這樣的步驟，借助本領(lǐng)域已知的任意方法生產(chǎn)脂肽，例如天然存在或重組生物的發(fā)酵，然后對脂肽制備物進(jìn)行任意一種或多種純化方法，例如微過濾、陰離子交換色譜、疏水作用色譜、和/或尺寸排阻色譜(經(jīng)由傳統(tǒng)的尺寸排阻色譜介質(zhì)或者經(jīng)由超濾)，以生成已被部分純化的脂肽制備物，然后使脂肽制備物結(jié)晶或沉淀，得到純化的結(jié)晶性或晶體狀脂肽。在優(yōu)選的實施方式中，脂肽是達(dá)托霉素或達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽。關(guān)于發(fā)酵、微過濾、陰離子交換色譜、疏水作用色譜和超濾，各步驟在本領(lǐng)域中已有公開，例如美國專利RE32,333、RE32,455、4,800,157、RE32,310、RE32,311、4,537,717、4,482,487、4,524,135、4,874,843、4,885,243或5,912,226、2001年7月26日公布的國際PCT公報WO 01/53330的任意一篇。
該方法可選地包含在結(jié)晶或沉淀步驟后收集和/或洗滌結(jié)晶性或晶體狀物的步驟。在優(yōu)選的實施方式中，結(jié)晶性脂肽制備物可以借助過濾收集。在另一種實施方式中，將結(jié)晶性或晶體狀物干燥。
在一種實施方式中，純化方法包含發(fā)酵玫瑰孢鏈霉菌，得到含有達(dá)托霉素的發(fā)酵培養(yǎng)物。在一種實施方式中，玫瑰孢鏈霉菌可以如美國專利4,885,243所述被發(fā)酵。在另一種實施方式中，其中由玫瑰孢鏈霉菌產(chǎn)生含有A-21978C0的粗產(chǎn)物的發(fā)酵條件被改變了，目的是增加達(dá)托霉素產(chǎn)量，減少雜質(zhì)和由玫瑰孢鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生的相關(guān)污染物，如2001年7月26日公布的國際PCT公報WO 01/53330所述。WO 01/53330公報描述了如’243專利所述發(fā)酵玫瑰孢鏈霉菌，并作了調(diào)整在于癸酸原料被保持在盡可能低的水平，不會降低發(fā)酵的總收率。
作為替代選擇，發(fā)酵重組產(chǎn)生達(dá)托霉素的菌株或其他生物，可以得到達(dá)托霉素。在一種實施方式中，重組菌株或其他重組生物包含達(dá)托霉素生物合成基因簇。在另一種實施方式中，達(dá)托霉素生物合成基因簇或其蛋白質(zhì)是經(jīng)由細(xì)菌人工染色體(BAC)而被引入到生物或菌株內(nèi)的。在另一種實施方式中，所用重組菌株是包含BAC的玫瑰孢鏈霉菌或淺青紫鏈霉菌，BAC含有達(dá)托霉素生物合成基因簇。2001年2月28日提交的美國臨時申請60/272,207描述了來自玫瑰孢鏈霉菌的達(dá)托霉素生物合成基因簇及其用途，全文結(jié)合在此作為參考。
發(fā)酵后，借助離心、微過濾或萃取使發(fā)酵肉湯澄清，這是本領(lǐng)域已知的或者如WO 01/53330公報所述。在優(yōu)選的實施方式中，澄清是借助微過濾進(jìn)行的。例如參見實施例13-16和圖11-15。圖11顯示不采用結(jié)晶或沉淀的示范性制造方法。
使發(fā)酵肉湯澄清后，達(dá)托霉素在肉湯中的濃度大約是5-10％。在本發(fā)明的一種實施方式中，在微過濾之后立即對達(dá)托霉素制備物進(jìn)行上述結(jié)晶/沉淀方法。在一種實施方式中，結(jié)晶或沉淀是在無菌條件下進(jìn)行的。結(jié)晶或沉淀完全后，可選地將結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素收集、洗滌和干燥，如下面進(jìn)一步詳述。干燥的活性藥物然后可以用于無水無菌裝瓶。例如參見實施例16和圖12。
發(fā)酵肉湯的澄清后，借助陰離子交換色譜可以將脂肽富集在制備物中，這是本領(lǐng)域已知的或者如WO 01/53330公報或本文所述。例如參見實施例13-14和圖12-13。陰離子交換色譜后，肉湯中達(dá)托霉素的純度大約是35-40％。在本發(fā)明的一種實施方式中，在陰離子交換色譜之后立即對達(dá)托霉素制備物進(jìn)行上述結(jié)晶或沉淀方法。在一種實施方式中，結(jié)晶或沉淀是在無菌條件下進(jìn)行的。結(jié)晶或沉淀完全后，可選地將結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素收集、洗滌和干燥，如下所述。干燥的活性藥物然后可以用于無水無菌裝瓶。例如參見實施例14和圖13。
在本發(fā)明的另一種實施方式中，在陰離子交換色譜后對達(dá)托霉素制備物進(jìn)行尺寸排阻超濾。尺寸排阻超濾描述在WO 01/53330公報中。2001年7月26日公布的申請描述了利用標(biāo)稱分子量(NMW)為10,000至30,000的超濾膜除熱原、過濾和濃縮達(dá)托霉素的方法。該申請公開了這樣一種方法，其中脂肽穿過超濾膜，而大分子雜質(zhì)、例如內(nèi)毒素被濾膜截留。脂肽穿過濾膜后，改變脂肽溶液的pH、溫度和/或鹽濃度，以便脂肽形成膠束。然后在這樣的條件下在超濾膜上過濾脂肽溶液，其中脂肽膠束被留在膜上，而更小的雜質(zhì)穿過濾膜。按照這種方式，脂肽被進(jìn)一步純化了。該申請公開了可以形成和分離脂肽膠束的條件和以及過濾脂肽溶液以得到更純的脂肽應(yīng)用的方法。在進(jìn)而更優(yōu)選的實施方式中，脂肽是達(dá)托霉素或達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽。然后可以使脂肽結(jié)晶，如本文所述。陰離子交換色譜和尺寸排阻超濾之后，達(dá)托霉素的純度大約是80-90％。如上所述，然后對達(dá)托霉素制備物進(jìn)行上述結(jié)晶/沉淀方法，優(yōu)選地在無菌條件下?？梢钥蛇x地將結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素收集、洗滌、干燥，用于無水裝瓶，如下所述。例如參見實施例13和圖12。
在本發(fā)明的另一種實施方式中，對粗達(dá)托霉素制備物進(jìn)行尺寸排阻超濾，無需陰離子交換色譜。在尺寸排阻超濾后，達(dá)托霉素的純度大約是35-40％。然后可以使脂肽結(jié)晶或沉淀，如本文所述，優(yōu)選地借助無菌的方法。如上所述，可以將結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素收集、洗滌、干燥，用于無水裝瓶。例如參見實施例15和圖14。
在替代的實施方式中，在陰離子交換色譜或尺寸排阻過濾之后，對脂肽制備物進(jìn)行疏水作用色譜(HIC)，例如WO 01/53330公報所述。然后可以使脂肽結(jié)晶或沉淀，如本文所述。
結(jié)晶或沉淀后，可以借助本文所述方法收集結(jié)晶性或晶體狀脂肽，例如過濾或離心?？蛇x地洗滌結(jié)晶性或晶體狀脂肽，以除去殘留的結(jié)晶或沉淀溶劑。洗滌晶體或晶體狀物的方法如下所述。例如參見實施例3。經(jīng)過洗滌或未經(jīng)洗滌的晶體或晶體狀物可以被干燥。干燥可以借助本領(lǐng)域已知的任意方法進(jìn)行，非限制性地包括真空干燥、噴霧干燥、盤式干燥或冷凍干燥。在一種實施方式中，干燥是在無菌條件下進(jìn)行的。在另一種實施方式中，干燥是借助真空干燥進(jìn)行的。在更優(yōu)選的實施方式中，利用0.65m3Klein Hastelloy-B雙錐體真空干燥機或等價設(shè)備進(jìn)行干燥。經(jīng)過干燥的結(jié)晶性或晶體狀脂肽是穩(wěn)定的，容易貯存。
在一種實施方式中，用任意適量的經(jīng)過干燥的結(jié)晶性或晶體狀脂肽裝瓶。在一種實施方式中，在無菌條件下裝瓶，然后密封。在另一種實施方式中，向每支小瓶裝入50至5000mg經(jīng)過干燥的結(jié)晶性或晶體狀脂肽。在另一種實施方式中，每支小瓶裝入100至1000mg。在另一種實施方式中，每支小瓶裝入200至500mg。在另一種實施方式中，經(jīng)過干燥的結(jié)晶性或晶體狀脂肽用于脂肽的批量包裝。每份批量包裝通常大于5000mg經(jīng)過干燥的結(jié)晶性或晶體狀脂肽。在一種實施方式中，批量包裝是在無菌條件下進(jìn)行的。
在一種實施方式中，結(jié)晶或沉淀步驟是在無菌條件下進(jìn)行的。在這種實施方式中，采用無菌的結(jié)晶或沉淀試劑和無菌、受控的工作環(huán)境。在一種實施方式中，在與無菌的結(jié)晶/沉淀試劑混合之前，將脂肽在超濾膜上過濾，如上所述。結(jié)晶或沉淀后，在無菌條件下借助離心或過濾收集結(jié)晶性或晶體狀脂肽制備物。在一種實施方式中，借助無菌過濾收集脂肽制備物。在另一種實施方式中，將結(jié)晶性或晶體狀脂肽在收集后滅菌。無菌結(jié)晶、沉淀和過濾的方法以及對最終藥物產(chǎn)品滅菌的方法是本領(lǐng)域已知的。例如參見RemingtonTheScience and Practice of Pharmacy，Easton，Pennsylvania，MackPublishing Company(1995)，pp.1474-1487，結(jié)合在此作為參考。
在另一種實施方式中，不將結(jié)晶性或晶體狀脂肽干燥。在這種實施方式中，優(yōu)選地將結(jié)晶性或晶體狀脂肽貯存在保持脂肽的結(jié)晶性或晶體狀性質(zhì)的溶液中?？梢栽跓o菌或非無菌條件下向小瓶裝入脂肽和溶液。在一種實施方式中，條件是無菌的。作為替代選擇，結(jié)晶性或晶體狀脂肽和溶液可以用于批量包裝。
圖10和11提供流程圖，描述采用結(jié)晶的示范性達(dá)托霉素制造方案。在制造方案中結(jié)合無菌結(jié)晶可顯著縮短方案，消除該方法中的3至4個步驟。
結(jié)晶性或晶體狀脂肽、其藥物組合物和使用方法本發(fā)明的另一個目的是提供結(jié)晶性或晶體狀脂肽或其鹽，以及包含結(jié)晶性或晶體狀脂肽或其鹽的藥物制劑。在一種實施方式中，結(jié)晶性或晶體狀脂肽是達(dá)托霉素。不過，本文所有結(jié)晶性或晶體狀脂肽的提法具體涵蓋達(dá)托霉素、達(dá)托霉素相關(guān)性分子，尤其包括達(dá)托霉素、A54145和達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽，如上所述。
達(dá)托霉素晶體或晶體狀粒子以及其他脂肽晶體或晶體狀粒子可以具有一定形狀，尤其例如針狀、板狀、條狀、equant狀、urchin狀或棒狀的形狀。在一種實施方式中，達(dá)托霉素晶體或晶體狀粒子具有urchin狀、針狀或棒狀的形狀。晶體或晶體狀粒子的大小可以從大約0.5μm至大于100μm。在一種實施方式中，粒子大小是至少5μm或以上。在更優(yōu)選的實施方式中，粒子大小是至少10μm或以上，更優(yōu)選至少50μm。在進(jìn)而更優(yōu)選的實施方式中，粒子大小是至少100μm。
進(jìn)而，在一種實施方式中，達(dá)托霉素晶體的X-射線衍射圖樣如圖6、7和8所示。在另一種實施方式中，脂肽晶體表現(xiàn)不同于脂肽的無定形形式的熔點。
在本發(fā)明的一種實施方式中，脂肽的結(jié)晶形式表現(xiàn)等于或大于脂肽的無定形形式的穩(wěn)定性。在優(yōu)選的實施方式中，結(jié)晶形式是達(dá)托霉素或達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽。在另一種優(yōu)選的實施方式中，結(jié)晶性脂肽是無菌的。在另一種優(yōu)選的實施方式中，結(jié)晶性脂肽的穩(wěn)定性大于脂肽的無定形形式。結(jié)晶性脂肽可以表現(xiàn)比無定形形式更高的對熱、光、降解作用或潮濕的穩(wěn)定性。脂肽的穩(wěn)定性可以借助任意手段測量，例如包括抗生活性、脂肽的降解作用或達(dá)托霉素向脫水達(dá)托霉素或達(dá)托霉素β-異構(gòu)體的轉(zhuǎn)化作用。在本發(fā)明的另一種實施方式中，脂肽的結(jié)晶形式可以比脂肽的無定形形式更快速地在水溶液中再生。
結(jié)晶性或晶體狀脂肽、例如達(dá)托霉素或達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽、其藥學(xué)上可接受的鹽、酯、酰胺、醚和被保護(hù)的形式可以被配制成口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、氣霧、局部或腸胃外給藥劑型，用于疾病、特別是細(xì)菌感染的治療性、實驗性或預(yù)防性處置。本文“結(jié)晶性或晶體狀脂肽”或“結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素”的提法包括其藥學(xué)上可接受的鹽。結(jié)晶性或晶體狀脂肽、例如達(dá)托霉素對藥物組合物而言可能是特別有利的，因為它們?nèi)菀妆慌渲瞥晌⒘；蛭⑶?，這有利于制備用于口服釋放的腸溶衣脂肽、用于氣霧劑釋放(例如至肺)的藥物組合物和用于持續(xù)釋放的脂肽制劑。結(jié)晶性或晶體狀脂肽和結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素還可更容易地溶解在水溶液中。
結(jié)晶性或晶體狀脂肽、包括達(dá)托霉素或達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽可以使用任意藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑加以配制，它們與達(dá)托霉素或有關(guān)脂肽是相容的。例如參見Handbook of PharmaceuticalAdditivesAn International Guide to More than 6000 Productsby Trade Name，Chemical，F(xiàn)unction，and Manufacturer，AshgatePublishing Co.，eds.，M.Ash and I.Ash，1996；The Merck IndexAn Encyclopedia of Chemicals，Drugs and Biologicals，ed.S.Budavari，annual；Remington’s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Company，Easton，PA；MartindaleThe Complete DrugReference，ed.K.Parfitt，1999；Goodman & Gilman’s ThePharmaceutical Basis of Therapeutics，Pergamon Press，New York，NY，ed.L.S.Goodman et al；其內(nèi)容結(jié)合在此作為參考關(guān)于人用各種抗微生物劑給藥方法的一般說明。本發(fā)明化合物可以與常規(guī)藥物載體和賦形劑混合，以片劑、膠囊劑、酏劑、懸液、糖漿劑、紙囊劑、霜劑等形式使用。本發(fā)明化合物還可以與治療劑和抗生素混合，例如本文所述。包含本發(fā)明化合物的組合物將含有約0.1至約90重量％的活性化合物，更一般為約10至約30％。
本發(fā)明組合物可以利用控釋釋放系統(tǒng)(例如膠囊劑)或緩釋釋放系統(tǒng)(例如生物可侵蝕的基質(zhì))加以釋放。適合于本發(fā)明組合物給藥的、用于藥物釋放的示范性延遲釋放系統(tǒng)描述在美國專利4,452,775(頒給Kent)、5,239,660(頒給Leonard)、3,854,480(頒給Zaffaroni)中。
組合物可以含有常用的載體和賦形劑，例如玉米淀粉或明膠、乳糖、蔗糖、微晶纖維素、高嶺土、甘露糖醇、磷酸二鈣、氯化鈉和藻酸。組合物可以含有交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素、玉米淀粉、淀粉羥乙酸鈉和藻酸。
可以包括在內(nèi)的片劑粘合劑是阿拉伯膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯吡咯烷酮(聚維酮)、羥丙基甲基纖維素、蔗糖、淀粉和乙基纖維素。
可以使用的潤滑劑包括硬脂酸鎂或其他金屬的硬脂酸鹽、硬脂酸、硅酮液、滑石、蠟、油和膠體二氧化硅。
還可以使用矯味劑，例如薄荷油、冬青油、櫻桃矯味劑等。還可能需要加入著色劑，以使劑型在外觀上更美觀或者有助于鑒別產(chǎn)品。
關(guān)于口用，固體制劑是特別有用的，例如片劑和膠囊劑。還可以設(shè)計持續(xù)釋放或腸溶衣的制劑。在另一種實施方式中，結(jié)晶性或晶體狀脂肽可以與一種載體組合物聯(lián)合，后者增強脂肽的口服利用度。在優(yōu)選的實施方式中，結(jié)晶性或晶體狀脂肽是達(dá)托霉素。關(guān)于兒童和老人用藥，懸液、糖漿劑和咀嚼片是尤其適合的。關(guān)于口服給藥，藥物組合物例如是片劑、膠囊劑、懸液或液體的形式。藥物組合物優(yōu)選地被制成劑量單元的形式，其中含有治療有效量的活性成分。這類劑量單元的實例是片劑和膠囊劑。出于治療目的，片劑和膠囊劑除了活性成分以外還可以含有常規(guī)的載體，例如粘合劑，例如阿拉伯膠、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、山梨糖醇或黃蓍膠；填充劑，例如磷酸鈣、甘氨酸、乳糖、玉米淀粉、山梨糖醇或蔗糖；潤滑劑，例如硬脂酸鎂、聚乙二醇、二氧化硅或滑石；崩解劑，例如馬鈴薯淀粉；矯味或著色劑；或可接受的濕潤劑?？诜后w制劑一般是水性或油性溶液、懸液、乳液、糖漿劑或酏劑的形式，可以含有常規(guī)的添加劑，例如懸浮劑、乳化劑、除水劑(non-aqueous agent)、防腐劑、著色劑和矯味劑?？诜后w制劑可以包含脂肽膠束或脂肽的單體形式。液體制劑添加劑的實例包括阿拉伯膠、杏仁油、乙醇、分餾椰子油、明膠、葡萄糖漿、甘油、氫化食用脂肪、卵磷脂、甲基纖維素、甲基或丙基對羥基苯甲酸酯、丙二醇、山梨糖醇或山梨酸。
關(guān)于靜脈內(nèi)(IV)使用，可以將本發(fā)明化合物的水溶性形式溶于任意常用的靜脈內(nèi)流體，輸注給藥。靜脈內(nèi)制劑可以包括載體、賦形劑或穩(wěn)定劑，非限制性地包括鈣、人血清白蛋白、檸檬酸鹽、乙酸鹽、氯化鈣、碳酸鹽和其他鹽類。靜脈內(nèi)流體非限制性地包括生理鹽水或林格氏溶液。還可以將達(dá)托霉素或其他脂肽置于注射器、套管、導(dǎo)管和線中。
腸胃外給藥制劑可以是水性或非水性等滲無菌注射溶液或懸液的形式。這些溶液或懸液可以從無菌的粉末或顆粒制備，具有一種或多種口服給藥制劑所用的載體。可以將結(jié)晶性或晶體狀脂肽溶于聚乙二醇、丙二醇、乙醇、玉米油、苯甲醇、氯化鈉和/或各種緩沖液。關(guān)于肌內(nèi)、腸胃外或靜脈內(nèi)制劑，可以將結(jié)晶性或晶體狀脂肽化合物或該化合物的適合的可溶性鹽形式、例如鹽酸鹽的無菌制劑溶于藥物稀釋劑后給藥，例如注射用水(WFI)、生理鹽水或5％葡萄糖。結(jié)晶性或晶體狀脂肽的適合的不溶性形式也可以被制成懸液給藥，懸液具有水性基質(zhì)或藥學(xué)上可接受的油基質(zhì)，例如長鏈脂肪酸的酯，例如油酸乙酯。
可注射的藥庫劑型可以這樣制備，在生物可降解的聚合物中，例如聚交酯-聚乙醇酸交酯，形成結(jié)晶性或晶體狀脂肽的微囊包封基質(zhì)。根據(jù)藥物與聚合物的比例和所采用的特定聚合物的性質(zhì)，可以控制藥物釋放的速率。其他生物可降解的聚合物的實例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。可注射的藥庫制劑還可以這樣制備，在與機體組織相容的微乳中捕集藥物。
關(guān)于局部使用，還可以將本發(fā)明化合物制成適合的劑型，用于皮膚或鼻咽粘膜，可以采取霜劑、軟膏劑、液體噴霧劑或吸入劑、錠劑或咽喉涂劑的形式。這類局部制劑可以進(jìn)一步包括二甲基亞砜(DMSO)等化合物，促進(jìn)活性成分的表面滲透。關(guān)于局部制劑，可以以霜劑、軟膏劑、噴霧劑或其他局部敷劑的形式給以無菌制劑，其中包含結(jié)晶性或晶體狀脂肽，例如結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素、其適合的鹽形式。局部制劑還可以是繃帶的形式，它已經(jīng)浸漬有脂肽組合物。
關(guān)于眼部或耳部用藥，本發(fā)明化合物可以是液體或半液體的形式，在疏水性或親水性基質(zhì)中配制成軟膏劑、霜劑、洗劑、涂劑或粉劑。
關(guān)于直腸給藥，本發(fā)明化合物可以以栓劑的形式給藥，其中混合有常規(guī)的載體，例如可可脂、蠟或其他甘油酯。
關(guān)于氣霧劑，結(jié)晶性或晶體狀脂肽或該化合物的鹽形式的無菌制劑可以用在吸入器——例如計量吸入器——和噴霧器中。霧化形式尤其可以用于治療呼吸感染，例如肺炎和竇類感染。
作為替代選擇，本發(fā)明化合物可以是粉末的結(jié)晶性或晶體狀形式，用于在釋放時再生在適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)上可接受的載體中。在另一種實施方式中，化合物的單元劑型可以是化合物或其鹽在適合稀釋劑中的溶液，置于無菌的密封安瓿內(nèi)?；衔镌趩卧獎┬椭械臐舛瓤梢愿鞑幌嗤?，例如從約1％至約50％，這取決于所用化合物及其溶解度和醫(yī)師所需的劑量。如果組合物含有劑量單元，每個劑量單元優(yōu)選地含有大約10-5000mg活性成分，更優(yōu)選50至1000mg，進(jìn)而更優(yōu)選100至500mg。關(guān)于成年人的治療，所采用的劑量優(yōu)選地從100mg至3g每天，這取決于給藥的途徑和頻率。
在進(jìn)一方面，本發(fā)明提供治療由革蘭氏陽性細(xì)菌導(dǎo)致的受治療者感染的方法。在優(yōu)選的實施方式中，該方法可以用于治療由革蘭氏陽性細(xì)菌導(dǎo)致的感染。術(shù)語“治療”被定義為對受治療者給以治療有效量的本發(fā)明化合物，既預(yù)防感染的發(fā)生，也控制或消除感染，例如既定的感染。本文所述的術(shù)語“受治療者”被定義為哺乳動物、植物或細(xì)胞培養(yǎng)物。本文所用的措辭“治療有效量”表示根據(jù)本發(fā)明的達(dá)托霉素、達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽或其他抗菌性脂肽預(yù)防細(xì)菌感染的發(fā)生、減輕其癥狀或終止其進(jìn)展的量。在優(yōu)選的實施方式中，受治療者是需要脂肽治療的人或其他動物患者。既定感染可以是急性的或慢性的。有效劑量一般在約0.1與約75mg/kg結(jié)晶性或晶體狀脂肽之間，例如結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素或達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽、或其藥學(xué)上可接受的鹽。優(yōu)選的劑量為約1至約25mg/kg結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素或達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽或其藥學(xué)上可接受的鹽。更優(yōu)選的劑量為約1至12mg/kg結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素或達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽或其藥學(xué)上可接受的鹽。進(jìn)而更優(yōu)選的劑量為約3至8mg/kg結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素或達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽或其藥學(xué)上可接受的鹽。釋放抗菌劑的示范性工藝描述在美國專利5,041,567(頒給Rogers)和國際PCT公報WO 95/05384中，這些文獻(xiàn)的全部內(nèi)容結(jié)合在此作為參考。
結(jié)晶性或晶體狀脂肽、例如達(dá)托霉素可以按單一的每日劑量或每天多次劑量給藥。治療方案可能需要給藥長達(dá)一定時間，例如數(shù)天或二至四周。每次給藥劑量或給藥總量將取決于感染的性質(zhì)與嚴(yán)重性、患者的年齡與一般健康狀況、患者對脂肽的耐受性和感染所牽涉的微生物等因素。給藥的方法公開在2000年4月6日公布的WO00/18419中，結(jié)合在此作為參考。
本發(fā)明的方法包含將本發(fā)明化合物或其藥物組合物對需要的患者給藥，給藥量對減少或消除革蘭氏陽性細(xì)菌感染是有效的。脂肽可以通過口服、腸胃外、吸入、局部、直腸、鼻、頰、陰道方式給藥，或者借助植入藥庫、外部泵或?qū)Ч芙o藥。脂肽可以被制成眼用或霧化使用的形式。本發(fā)明化合物或其藥物組合物還可以被直接注射或給藥至膿腫部位、室或關(guān)節(jié)內(nèi)。腸胃外給藥包括皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、池內(nèi)、鞘內(nèi)、肝內(nèi)、損傷部位內(nèi)和顱內(nèi)注射或輸注。在優(yōu)選的實施方式中，結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素、達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽或其他脂肽是靜脈內(nèi)、皮下或口服給藥的。
本發(fā)明的方法可以用于治療患有細(xì)菌感染的患者，其中該感染是由任意類型革蘭氏陽性細(xì)菌所導(dǎo)致或惡化的。在優(yōu)選的實施方式中，結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素、達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽或其他脂肽、或其藥物組合物是按照本發(fā)明的方法對患者給藥的。在另一種實施方式中，細(xì)菌感染可以是由下列細(xì)菌所導(dǎo)致或惡化的，包括但不限于甲氧西林敏感性與甲氧西林耐藥性葡萄球菌(包括金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、人葡萄球菌、腐物寄生性葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌)、糖肽中等敏感性金黃色葡萄球菌(GISA)、青霉素敏感性與青霉素耐藥性鏈球菌(包括肺炎鏈球菌、釀膿鏈球菌、無乳鏈球菌、鳥鏈球菌、牛鏈球菌、乳鏈球菌、血鏈球菌、和C族鏈球菌、G族鏈球菌和亞急性鏈球菌)、腸球菌(包括萬古霉素敏感性與萬古霉素耐藥性菌株，例如屎腸球菌和糞腸球菌)、艱難梭菌、梭狀梭菌、無害梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、多枝梭菌、流感嗜血桿菌、單核細(xì)胞增多性李司忒氏菌、杰氏棒桿菌、雙歧桿菌、產(chǎn)氣真桿菌、遲緩真桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、胚芽乳桿菌、乳球菌、明串珠菌、小球菌屬、厭氧消化鏈球菌、不解糖消化鏈球菌、大消化鏈球菌、微小消化鏈球菌、普氏消化鏈球菌、產(chǎn)生消化鏈球菌、瘡皰丙酸桿菌和放線菌。
達(dá)托霉素在體外實驗中對經(jīng)典“耐藥性”菌株的抗菌活性相當(dāng)于對經(jīng)典“敏感性”菌株的抗菌活性。另外，達(dá)托霉素對敏感性菌株的最低抑制濃度(MIC)值通常比萬古霉素低4倍。因而在優(yōu)選的實施方式中，將本發(fā)明化合物、或任意一種這些結(jié)晶性或晶體狀脂肽的藥物組合物按照本發(fā)明的方法對患者給藥，該患者表現(xiàn)對其他抗生素、包括萬古霉素是耐藥性的細(xì)菌感染。另外，不象糖肽類抗生素，達(dá)托霉素對革蘭氏陽性生物表現(xiàn)迅速的、濃度依賴性殺菌活性。因而在優(yōu)選的實施方式中，將本發(fā)明化合物、或任意一種這些結(jié)晶性或晶體狀脂肽的藥物組合物按照本發(fā)明的方法對患者給藥，該患者需要迅速起效的抗生素療法。
本發(fā)明的方法可以用于機體任意器官或組織的革蘭氏陽性細(xì)菌感染。這些器官或組織非限制性地包括骨骼肌、皮膚、血液、腎、心、肺和骨。本發(fā)明的方法可以用于非限制性地治療皮膚與軟組織感染、菌血癥和尿道感染。本發(fā)明的方法可以用于治療公共獲得性呼吸感染，非限制性地包括中耳炎、鼻竇炎、慢性支氣管炎和肺炎，包括由耐藥性肺炎鏈球菌或流感嗜血桿菌導(dǎo)致的肺炎。本發(fā)明的方法還可以用于治療混合型感染，包含不同類型的革蘭氏陽性細(xì)菌，包括需氧的、caprophilic或厭氧的細(xì)菌。這些類型的感染包括腹內(nèi)感染、肺炎、骨與關(guān)節(jié)感染和產(chǎn)科/婦科感染。本發(fā)明的方法還可以用于治療這樣一種感染，非限制性地包括心內(nèi)膜炎、腎炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎和骨髓炎。在優(yōu)選的實施方式中，任意上述疾病都可以用結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素、達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽、抗菌性脂肽或任意一種這些結(jié)晶性或晶體狀脂肽的藥物組合物加以治療。
結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素、達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽或其他脂肽還可以在患者或動物的飲食或飼料中給藥。如果作為總飲食攝取的一部分給藥，達(dá)托霉素或其他脂肽的量可以低于飲食的1重量％，優(yōu)選不超過0.5重量％。動物飼料可以是正常的飼料，可以向其中加入達(dá)托霉素或其他脂肽，或者可以加入到預(yù)混合物中。
本發(fā)明的方法在實施時還可以同時給以另一種形式的達(dá)托霉素或其他脂肽抗生素，例如不是結(jié)晶性或晶體狀的，或者除結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素或其他結(jié)晶性或晶體狀脂肽抗生素以外的一種或多種抗真菌劑和/或一種或多種抗生素。除結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素或另一種脂肽抗生素以外的抗真菌劑和抗生素的共同給藥可以用于混合型感染，例如由不同類型革蘭氏陽性細(xì)菌導(dǎo)致的那些，或者由細(xì)菌和真菌導(dǎo)致的那些。進(jìn)而，結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素或其他脂肽抗生素可以改良一種或多種共同給藥的抗生素的毒性。已經(jīng)顯示達(dá)托霉素與一種氨基苷的給藥可以改善由該氨基苷導(dǎo)致的腎毒性。在優(yōu)選的實施方式中，抗生素和/或抗真菌劑可以與本發(fā)明化合物同時給藥，或者在包含本發(fā)明化合物的藥物組合物中給藥。
可以與本發(fā)明化合物共同給藥的抗菌劑及其分類非限制性地包括青霉素類與相關(guān)藥物、卡巴培南類、頭孢菌素類與相關(guān)藥物、氨基苷類、桿菌肽、短桿菌肽、莫匹羅星、氯霉素、甲砜霉素、夫西地酸鈉、林可霉素、克林霉素、大環(huán)內(nèi)酯類、新生霉素、多粘菌素類、利福霉素類、壯觀霉素、四環(huán)素類、萬古霉素、替考拉寧、鏈陽性菌素類、抗葉酸劑(包括磺胺類、甲氧芐啶及其組合和乙胺嘧啶)、合成的抗菌劑(包括硝基呋喃類、扁桃酸烏洛托品和馬尿酸烏洛托品)、硝基咪唑類、喹諾酮類、氟喹諾酮類、異煙肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、對氨基水楊酸(PAS)、環(huán)絲氨酸、卷曲霉素、乙硫異煙胺、丙硫異煙胺、氨硫脲、紫霉素、扁枝衣霉素、糖肽、glycylcylcline、酮醇類、唑烷酮類、亞胺培南、阿米卡星、奈替米星、磷霉素、慶大霉素、頭孢曲松、Ziracin、LY 333328、CL331002、HMR 3647、Linezolid、Synercid、氨曲南、甲硝唑、依匹普林、OCA_983、GV_143253、Sanfetrinem sodium、CS_834、比阿培南、A_99058.1、A_165600、A_179796、KA 159、DynemicinA、DX 8739、DU 6681、Cefluprenam、ER 35786、Cefoselis、Sanfetrinemcelexetil、HGP_31、頭孢匹羅、HMR_3647、RU_59863、Mersacidin、KP 73 、Rifalazil、Kosan、AM 1732、MEN 10700、Lenapenem、BO2502A、NE_1530、PR 39、K130、OPC 20000、OPC 2045、Veneprim、PD 138312、PD 140248、CP 111905、硫培南、利替培南acoxyl、RO_65_5788、Cyclothialidine、Sch_40832、SEP_132613、micacocidin A、SB_275833、SR_15402、SUN A0026、TOC 39、卡蘆莫南、頭孢唑蘭、頭孢他美pivoxil和T 3811。
在優(yōu)選的實施方式中，可以與本發(fā)明化合物共同給藥的抗菌劑非限制性地包括亞胺培南、阿米卡星、奈替米星、磷霉素、慶大霉素、頭孢曲松、替考拉寧、Ziracin、LY 333328、CL 331002、HMR 3647、Linezolid、Synercid、氨曲南和甲硝唑。
可以與本發(fā)明化合物共同給藥的抗真菌劑非限制性地包括Caspofungen、Voriconazole、舍他康唑、IB_367、FK_463、LY_303366、Sch_56592、Sitafloxacin、DB_289多烯類，例如兩性霉素、制霉菌素、Primaricin；唑系，例如氟康唑、衣曲康唑和酮康唑；烯丙胺類，例如萘替芬和特比萘芬；和抗代謝產(chǎn)物劑，例如氟胞嘧啶。其他抗真菌劑非限制性地包括公開在Fostel等，Drug DiscoveryToday 525_32(2000)中的那些，結(jié)合在此作為參考。Fostel等公開的抗真菌化合物包括Corynecandin、Mer_WF 3010、Fusacandins、Artrichitin/LL 15G256、Sordarins、Cispentacin、Azoxybacillin、Aureobasidin和Khafrefungin。
本發(fā)明化合物、或任意一種或多種這些結(jié)晶性或晶體狀脂肽的藥物組合物可以按照這種方法給藥，直至細(xì)菌感染被根除或減少。在一種實施方式中，結(jié)晶性或晶體狀脂肽給藥的時間從大約3天至大約6個月。在優(yōu)選的實施方式中，結(jié)晶性或晶體狀脂肽給藥7至56天。在更優(yōu)選的實施方式中，結(jié)晶性或晶體狀脂肽給藥7至28天。在進(jìn)而更優(yōu)選的實施方式中，結(jié)晶性或晶體狀脂肽給藥7至14天。結(jié)晶性或晶體狀脂肽可以給藥更長或更短的時間，如果需要這樣做的話。在優(yōu)選的實施方式中，脂肽是達(dá)托霉素或達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽。
為了更充分地理解本發(fā)明，列出下列實施例。這些實施例僅供舉例說明之目的，決不被解釋為限制發(fā)明的范圍。
實施例1借助常規(guī)技術(shù)制備達(dá)托霉素。達(dá)托霉素制備物是淡黃色無定形粉末，在25℃下在水中的溶解度大于1g/ml，在乙醇中的溶解度為2.8mg/ml。無定形達(dá)托霉素制備物是吸濕性的，在215℃下分解。
其余實施例描述在有或沒有有機沉淀劑(例如PEG)的存在下使脂肽結(jié)晶或沉淀。
實施例2在微量成批結(jié)晶中，將25μl達(dá)托霉素儲備液(含20mg/ml的甲醇)先后與15μl試劑儲備液(200mM乙酸鈣、0.1M二甲胂酸鹽(pH6.5)、18％(w/v)PEG 8000和15μl乙二醇)混合，得到一種溶液，它含有27.5％水性組分、45％甲醇和27.5％乙二醇。形成urchin狀晶體，收率50％，用HPLC測量的純度98％。
實施例3將440mg達(dá)托霉素溶于含有25mM乙酸鈉(pH5.0)和5mM CaCl2的1ml緩沖液，制備達(dá)托霉素儲備液。借助蒸汽擴散(懸滴)法進(jìn)行結(jié)晶，其中向5μl 0.1M檸檬酸三鈉二水合物(pH5.6)與35％(v/v)叔丁醇的水溶液加入5μl達(dá)托霉素儲備液，形成液滴。在氣密環(huán)境中將液滴懸浮在貯存溶液(0.1M檸檬酸三鈉二水合物(pH5.6)與35％(v/v)叔丁醇的水溶液)中，直至結(jié)晶發(fā)生。這種方法得到urchin狀達(dá)托霉素晶體。例如參見圖2。
實施例4向含有0.1M二甲胂酸鈉(pH6.5)、0.2M乙酸鈣與9％(w/v)PEG8000的5μl溶液加入根據(jù)實施例3制備的5μl達(dá)托霉素儲備液。如實施例3所述借助蒸汽擴散法進(jìn)行結(jié)晶。這種方法得到針狀達(dá)托霉素晶體。例如參見圖3。
實施例5向含有0.1M二甲胂酸鈉(pH6.5)、0.2M乙酸鋅、9％(w/v)PEG8000與0.1μl芐脒的5μl溶液加入根據(jù)實施例3制備的5μl達(dá)托霉素儲備液，得到達(dá)托霉素的最終濃度為220mg/ml。如實施例3所述借助蒸汽擴散法進(jìn)行結(jié)晶。這種方法得到棒狀達(dá)托霉素晶體。例如參見圖4。
實施例6將濃度為20-25mg/ml的1ml達(dá)托霉素(根據(jù)HPLC測定純度97.1％)水溶液先后與231μl水、77μl乙酸鈣(pH6.0)、960μl丙二醇和231μl 50％(w/v)PEG 4000混合。將溶液在4℃下放置4-5小時。形成urchin狀晶體，收率75％。將結(jié)晶性達(dá)托霉素用異丙醇洗滌。根據(jù)HPLC的測定，達(dá)托霉素的純度為98.4％。
實施例7將達(dá)托霉素(200mg，純度97.1％)溶于2.54ml水。將達(dá)托霉素溶液按順序先后與10.0ml甲醇、0.78ml 1M乙酸鈣(pH6.0)、9.50ml丙二醇和2.20ml 50％(w/v)PEG 4000混合，得到最終體積為25.02ml。在室溫下，將混合物在血液學(xué)混合機(Fischer)內(nèi)顛倒10-14小時。在幾小時內(nèi)有晶體開始出現(xiàn)。14小時后最終收率大約是70-80％。在1000rpm下離心15分鐘，收獲晶體。除去上清液，將晶體再懸浮在12.5ml異丙醇中。將達(dá)托霉素懸液轉(zhuǎn)移到柱子(Biorad)上，借助重力滴下而除去異丙醇。用氮氣流干燥晶體。在干燥工藝期間打碎所有結(jié)塊，得到均勻的干燥樣本。用這種方法制備的晶體是urchin狀的，純度為98.37％。
實施例8按照實施例7使達(dá)托霉素結(jié)晶，但是使用PEG 8000代替PEG4000。所用試劑的量等于實施例7。用這種方法制備的晶體是urchin狀的，純度為98.84％。
實施例9利用USP<695>結(jié)晶度試驗分析按照實施例7制備的兩份達(dá)托霉素樣本和一份無定形樣本。在玻片上制作達(dá)托霉素粒子在礦物油中的標(biāo)本，然后用偏振光顯微鏡(PLM)檢查。如果它們是雙折射的(具有干擾色)，并且當(dāng)載物臺旋轉(zhuǎn)時具有消光位置，那么確定這些粒子是結(jié)晶性的。
無定形達(dá)托霉素樣本由花邊狀的、薄片狀的粒子組成，它們不是雙折射的。在有些薄片中存在一些梳毛狀區(qū)域，具有微弱的雙折射，但是粒子主要還是無定形的。相形之下，按照實施例7制備的達(dá)托霉素樣本由多晶粒子組成，具有微弱的雙折射和一些消光，說明它們主要是結(jié)晶性的。參見圖5。
實施例10利用X-射線粉末衍射分析按照實施例7制備的兩份達(dá)托霉素樣本和一份無定形樣本的結(jié)晶度。樣本是在Siemens D500自動粉末衍射測定儀(ORS 1D No.LD-301-4)上進(jìn)行分析的，按照ORS標(biāo)準(zhǔn)操作工藝EQ-27Rev.9操作儀器。衍射測定儀配有石墨單色器和Cu(λ＝1.54)X-射線光源，在50kV、40mA下操作。利用NBS云母標(biāo)準(zhǔn)(SRM675)進(jìn)行雙θ校準(zhǔn)。利用下列儀器參數(shù)分析樣本2θ測量范圍(度) 4.0-40.0步長(度) 0.05每步測量時間(秒) 1.2光束狹縫 1(1°)，2(1°)，3(1°)，4(0.15°)，5(0.15°)利用零背景樣本平板，按照ORS標(biāo)準(zhǔn)操作工藝MIC-7 Rev.1進(jìn)行樣本制備。
所有樣本都是利用Cu(λ＝1.54)X-射線光源測量的。無定形達(dá)托霉素樣本不顯示任何X-射線粉末衍射峰。參見圖6。相形之下，兩份達(dá)托霉素樣本都顯示X-射線粉末衍射峰。第一份達(dá)托霉素樣本(圖7)的衍射角(2θ)為19.225、23.242、23.427和23.603(度)。第二份達(dá)托霉素樣本(圖8)的衍射角(2θ)為10.966、19.205和23.344(度)。第一份結(jié)晶性達(dá)托霉素樣本在10-11°之間還顯示一個小峰。參見圖7。
實施例11將達(dá)托霉素溶于水。加入乙酸鈉，最終濃度達(dá)到187mM。加入氯化鈣，最終濃度達(dá)到28mM?；旌线_(dá)托霉素溶液，加入異丙醇，最終濃度達(dá)到78.4％。將溶液混合，培育。培育后生成沉淀物。沉淀物似乎是urchin狀晶體，光學(xué)顯微鏡檢查直徑大約60μm。然后將其干燥。干燥物含有大約30-40％鹽。干燥后，進(jìn)行粉末X-射線衍射。粉末X-射線衍射不顯示在干燥后的達(dá)托霉素沉淀中存在晶體。
實施例12向16.8ml蒸餾水加入1g達(dá)托霉素(根據(jù)HPLC測量純度大約91.5％)，溶解。加入2.5ml 1M乙酸鈣(pH6.1)和60ml異丙醇。將溶液置于27℃水浴中，達(dá)到與水浴溫度的平衡。緩慢加入5ml異丙醇等分試樣，直至溶液變渾濁(總計大約30ml異丙醇)。將溶液在27℃下培育過夜，生成沉淀。沉淀似乎含有urchin狀晶體，光學(xué)顯微鏡檢查大約60μm。參見圖2。
將達(dá)托霉素沉淀倒入壓力過濾/干燥漏斗內(nèi)，借助重力過濾。將沉淀用洗滌溶液(80％異丙醇與20％A溶液，其中A溶液由18ml水和2ml冰乙酸組成)洗滌，每次25ml，借助重力滴下過夜。然后將沉淀轉(zhuǎn)移至干燥器內(nèi)，在真空下干燥。干燥后，進(jìn)行粉末X-射線衍射。粉末X-射線衍射不顯示在干燥后的達(dá)托霉素沉淀中存在晶體。不過，利用HPLC進(jìn)行沉淀物的純度分析顯示它是98.2％純的達(dá)托霉素。顯然，沉淀后的達(dá)托霉素制備物比沉淀前的達(dá)托霉素制備物具有顯著更少的脫水達(dá)托霉素。
不希望拘泥于任何理論的是，申請人相信實施例11和12中用于使達(dá)托霉素沉淀的條件實際上生成達(dá)托霉素的結(jié)晶形式，但是隨后的洗滌步驟和/或干燥步驟導(dǎo)致結(jié)晶性達(dá)托霉素恢復(fù)為非結(jié)晶形式。盡管如此，非結(jié)晶性達(dá)托霉素仍然是晶體狀的，如圖3所示，晶體樣本在偏振光下具有雙折射。
實施例13在受控制的癸酸原料發(fā)酵中進(jìn)行玫瑰孢鏈霉菌NRRL菌株15998的發(fā)酵培養(yǎng)，其水平優(yōu)化抗生素的產(chǎn)生同時減少污染物的產(chǎn)生。用氣相色譜測量殘留的癸酸原料，從開始引入(大約第30小時)直至收獲的目標(biāo)殘留水平是10ppm硅酸。培養(yǎng)物的離心和隨后澄清肉湯的分析用于借助HPLC測量達(dá)托霉素的產(chǎn)生。收獲效價通常在1.0與3.0克每升發(fā)酵肉湯之間。
發(fā)酵培養(yǎng)物是這樣收獲的，利用Pall-Sep或等價微過濾系統(tǒng)進(jìn)行微過濾，或者進(jìn)行全商業(yè)規(guī)模離心和深度過濾。將澄清后的肉湯上陰離子交換樹脂Mitsubishi FP-DA 13，用30mM NaCl pH6.5洗滌，用300mM NaGl pH6.0-6.5洗脫。作為替代選擇，將FP-DA 13柱子用30mM NaCl pH6.5洗滌，用300mM NaCl pH6.0-6.5洗脫。pH調(diào)至3.0-4.8，溫度調(diào)至2-15℃。在這些條件下，達(dá)托霉素形成膠束。將膠束狀達(dá)托霉素溶液用任意構(gòu)型的10,000NMW超濾器(AGTechnology Corp.UF中空纖維或等價物)過濾-洗滌。達(dá)托霉素膠束被濾器截留，但是大量雜質(zhì)被排除了，因為它們穿過了10,000NMW濾器。達(dá)托霉素膠束的超濾增加達(dá)托霉素純度至大約80-90％。
然后利用上述方法之一，在無菌條件下使達(dá)托霉素制備物結(jié)晶或沉淀。在優(yōu)選的實施方式中，按照實施例7、8或12所述方案使達(dá)托霉素結(jié)晶或沉淀，但是可以按比例擴大，用于達(dá)托霉素的大量制備。借助過濾，優(yōu)選真空過濾，從結(jié)晶/沉淀溶液中分離結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素。將結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素用洗滌溶液洗滌(見實施例3)。然后利用0.65m3Klein Hastelloy-B雙錐體真空干燥機或等價設(shè)備，在無菌條件下真空干燥結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素。然后向每支小瓶裝入250或500mg干燥后的結(jié)晶性達(dá)托霉素。圖9顯示這種制造方法的流程圖。
實施例14如實施例13所述進(jìn)行玫瑰孢鏈霉菌的發(fā)酵、發(fā)酵培養(yǎng)物的微過濾和陰離子交換色譜。此時達(dá)托霉素制備物的純度大約是35-40％。陰離子交換色譜后，按照實施例13所述方案使達(dá)托霉素結(jié)晶或沉淀。然后按照實施例13所述方案將達(dá)托霉素洗滌和干燥。干燥后的結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素然后用于裝入無菌小瓶，如實施例13所述。圖6顯示這種制造方法的流程圖。
實施例15如實施例13所述進(jìn)行玫瑰孢鏈霉菌的發(fā)酵和發(fā)酵培養(yǎng)物的微過濾。微過濾后，對發(fā)酵培養(yǎng)物進(jìn)行尺寸排阻超濾，如實施例13所述。此時達(dá)托霉素制備物的純度大約是35-40％。超濾后，按照實施例13所述方案使達(dá)托霉素結(jié)晶或沉淀。然后按照實施例13所述方案將達(dá)托霉素洗滌和干燥。干燥后的結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素然后用于裝入無菌小瓶，如實施例13所述。圖7顯示這種制造方法的流程圖。
實施例16如實施例13所述進(jìn)行玫瑰孢鏈霉菌的發(fā)酵和發(fā)酵培養(yǎng)物的微過濾。此時達(dá)托霉素制備物的純度是5-10％。微過濾后，按照實施例13所述方案使達(dá)托霉素結(jié)晶或沉淀。然后將達(dá)托霉素洗滌，干燥，用于裝入無菌小瓶，如實施例13所述。圖8顯示這種制造方法的流程圖。
實施例17經(jīng)由半合成途徑從達(dá)托霉素制備CB-131547(見圖x)，它是達(dá)托霉素的一種環(huán)狀脂肽類似物。CB-131547是淡黃色無定形粉末，在25℃下、在生理鹽水中的溶解度為～80mg/ml。
將CB-131547(60mg，～90％純)溶于2.5ml水。將CB-131547溶液按順序先后與5.0ml甲醇、0.2ml 1M乙酸鈣(pH6.0)、2.5ml丙二醇和1.0ml 50％(w/v)PEG 4000混合，得到最終體積為11.2ml。將溶液在4℃下放置4至24小時。生成CB-131547晶體，收率～70％，根據(jù)HPLC測定純度～98.0％。
實施例18經(jīng)由半合成途徑從達(dá)托霉素制備CB-131547(見圖x)，它是達(dá)托霉素的一種環(huán)狀脂肽類似物。CB-131547是淡黃色無定形粉末，在25℃下、在生理鹽水中的溶解度為～80mg/ml。
將CB-131547(60mg，～90％純)溶于2.5ml水。加入0.2ml 1M乙酸鈣(pH6.0)和8ml異丙醇。使溶液在室溫(25℃)下平衡5分鐘。緩慢加入1ml異丙醇等分試樣，直至溶液變渾濁。將溶液貯存在室溫下過夜，生成晶體。
本說明書引用的所有出版物和專利申請都結(jié)合在此作為參考，仿佛每篇出版物或?qū)＠暾埗急痪唧w、單獨結(jié)合在此作為參考一樣。盡管出于清楚理解的目的，已經(jīng)借助舉例說明和實施例詳細(xì)描述了上述發(fā)明，不過按照本發(fā)明的教導(dǎo)對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說顯而易見的是，可以對其進(jìn)行某些改變和調(diào)整，而不背離所附權(quán)利要求的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.結(jié)晶性或晶體狀脂肽或其鹽，其中該脂肽選自由達(dá)托霉素、A54145和達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽組成的組。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的結(jié)晶性或晶體狀脂肽或其鹽，其中該鹽是二價鈣鹽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的結(jié)晶性或晶體狀脂肽或其鹽，其中該脂肽是達(dá)托霉素。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的結(jié)晶性或晶體狀脂肽或其鹽，其中該鹽是二價鈣鹽。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的結(jié)晶性或晶體狀脂肽或其鹽，在使用Cu(λ＝1.54)X-射線光源時，該結(jié)晶性達(dá)托霉素的X-射線衍射圖樣具有衍射角＝10.9，19.2和23.3°或衍射角(2θ)＝19.2，23.2，23.4和23.6°。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項的結(jié)晶性或晶體狀脂肽或其鹽，其中該脂肽是晶體狀脂肽，它根據(jù)雙折射具有結(jié)晶特征，但是根據(jù)X-射線粉末衍射不具有結(jié)晶特征。
7.根據(jù)權(quán)利要求3的結(jié)晶性或晶體狀脂肽或其鹽，是結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素，其中該結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素包含urchin狀晶體或針晶、針狀或棒狀晶體簇。
8.根據(jù)權(quán)利要求3的結(jié)晶性或晶體狀脂肽或其鹽，是結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素，其中該結(jié)晶性達(dá)托霉素具有至少95％的純度。
9.根據(jù)權(quán)利要求3的結(jié)晶性或晶體狀脂肽或其鹽，是結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素，其中該結(jié)晶性達(dá)托霉素或其鹽具有至少97％的純度。
10.根據(jù)權(quán)利要求3的結(jié)晶性或晶體狀脂肽或其鹽，是結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素，其中該結(jié)晶性達(dá)托霉素或其鹽不含大于1％的單一雜質(zhì)。
11.根據(jù)權(quán)利要求8-10任一項的結(jié)晶性或晶體狀脂肽或其鹽，是結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素，其中該純度是用HPLC測量的。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的結(jié)晶性或晶體狀脂肽或其鹽，其中該脂肽的晶體是至少5μm的。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的結(jié)晶性或晶體狀脂肽或其鹽，其中該晶體是至少50μm的。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13的結(jié)晶性或晶體狀脂肽或其鹽，其中該脂肽是達(dá)托霉素。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的結(jié)晶性或晶體狀脂肽或其鹽，是結(jié)晶性脂肽，其中該結(jié)晶性脂肽表現(xiàn)比脂肽的無定形形式更高的穩(wěn)定性。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的結(jié)晶性或晶體狀脂肽或其鹽，是結(jié)晶性脂肽，其中該結(jié)晶性脂肽表現(xiàn)比無定形形式更高的對熱、光、降解作用或潮濕的穩(wěn)定性。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的結(jié)晶性或晶體狀脂肽或其鹽，是結(jié)晶性脂肽，其中該穩(wěn)定性是借助脂肽抗生素的抗生活性或降解作用測量的。
18.根據(jù)權(quán)利要求15的結(jié)晶性或晶體狀脂肽或其鹽，是結(jié)晶性脂肽，其中該脂肽是達(dá)托霉素。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的結(jié)晶性或晶體狀脂肽或其鹽，是結(jié)晶性達(dá)托霉素，其中該結(jié)晶性脂肽表現(xiàn)比達(dá)托霉素的無定形形式更低的向無水達(dá)托霉素或達(dá)托霉素異構(gòu)體的轉(zhuǎn)化率。
20.根據(jù)權(quán)利要求1的結(jié)晶性或晶體狀脂肽或其鹽，是結(jié)晶性脂肽，是一種達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽。
21.藥物組合物，包含權(quán)利要求1至19任一項的結(jié)晶性或晶體狀脂肽和藥學(xué)上可接受的載體。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的藥物組合物，其中該結(jié)晶性或晶體狀脂肽是達(dá)托霉素，該結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素包有用于口服給藥的腸溶衣。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的藥物組合物，其中該結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素是按3至75mg/kg的劑量配制的。
24.根據(jù)權(quán)利要求22的藥物組合物，其中該載體增強達(dá)托霉素的口服利用度。
25.根據(jù)權(quán)利要求22的藥物組合物，它是微?；蛭⑶虻男问健?br> 26.根據(jù)權(quán)利要求25的藥物組合物，它被用作氣霧劑。
27.容器，包含根據(jù)權(quán)利要求21的藥物組合物。
28.制劑，包含權(quán)利要求1至19任一項的結(jié)晶性或晶體狀脂肽和藥學(xué)上可接受的載體。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的制劑，它是藥物制劑，其中該制劑進(jìn)一步包含另一種抗生素、穩(wěn)定劑、吸收助劑、pH緩沖劑或無機鹽。
30.權(quán)利要求1至19任一項的結(jié)晶性或晶體狀脂肽或其藥學(xué)上可接受的鹽或其藥物組合物在藥物制造或制備中的用途，該藥物用于治療受治療者的感染。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的用途，其中該結(jié)晶性或晶體狀脂肽是作為微粒給藥的。
32.根據(jù)權(quán)利要求30的用途，其中該結(jié)晶性或晶體狀脂肽是作為定向釋放劑型給藥的。
33.貯存脂肽的方法，其中該脂肽選自由達(dá)托霉素、A54145和達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽組成的組，該方法包含下列步驟a)提供脂肽的溶液；b)使該脂肽結(jié)晶或沉淀；c)收集并干燥該脂肽；d)貯存該脂肽；其中該結(jié)晶性或晶體狀脂肽比脂肽的無定形形式更穩(wěn)定。
34.制造結(jié)晶性或晶體狀脂肽的方法，其中該脂肽選自由達(dá)托霉素、A54145和達(dá)托霉素相關(guān)性脂肽組成的組，該方法包含下列步驟a)提供脂肽的無定形形式；b)使該脂肽結(jié)晶或沉淀；c)收集該結(jié)晶性或晶體狀脂肽。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述收集是借助過濾進(jìn)行的。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，進(jìn)一步包含在步驟b)后洗滌該脂肽的步驟。
37.根據(jù)權(quán)利要求34或35的方法，進(jìn)一步包含在步驟c)后干燥該脂肽的步驟。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，進(jìn)一步包含在干燥后對該脂肽滅菌的步驟。
39.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中步驟c)是在無菌條件下進(jìn)行的。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中步驟b)是在無菌條件下進(jìn)行的。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，進(jìn)一步包含在步驟c)后在無菌條件下干燥該脂肽的步驟。
42.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中該結(jié)晶性脂肽的純度高于脂肽的無定形形式。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中該無定形形式的純度大約是90％，該結(jié)晶性或晶體狀形式的純度大于95％。
44.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中該無定形形式的純度大約是93％，該結(jié)晶性或晶體狀形式的純度大于95％。
45.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中該無定形形式的純度大約是93％，該結(jié)晶性或晶體狀形式的純度大約是98％。
46.制備達(dá)托霉素的方法，包含下列步驟提供達(dá)托霉素的無定形形式；使達(dá)托霉素從結(jié)晶溶液中結(jié)晶出來，結(jié)晶溶液包含鹽的陽離子、緩沖劑、有機沉淀劑和小分子醇。
47.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中該緩沖劑選自由HEPES、TrisHCl、咪唑、MES、CHES、檸檬酸鹽和二甲胂酸鹽組成的組。
48.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中該醇選自由乙二醇、丙二醇、叔丁醇、甘油、異丙醇、1，4-丁二醇、1，2-丙二醇和甲醇組成的組。
49.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中該有機沉淀劑是聚乙二醇一甲醚。
50.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中該結(jié)晶溶液進(jìn)一步包含二價陽離子。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中該二價陽離子是鈣、鋅或鎂。
52.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中該結(jié)晶溶液的pH在5至8.5的范圍內(nèi)。
53.根據(jù)權(quán)利要求52的方法，其中該結(jié)晶溶液的pH在5.5至7.5的范圍內(nèi)。
54.根據(jù)權(quán)利要求53的方法，其中該結(jié)晶溶液的pH在5.9至6.6的范圍內(nèi)。
55.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中該結(jié)晶是借助懸滴法或成批結(jié)晶進(jìn)行的。
56.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中該達(dá)托霉素的晶體是urchin狀、針狀簇或棒狀的。
57.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，進(jìn)一步包含收集達(dá)托霉素晶體的步驟。
58.根據(jù)權(quán)利要求57的方法，其中所述收集是借助離心、沉淀或過濾進(jìn)行的。
59.根據(jù)權(quán)利要求46或58的方法，進(jìn)一步包含洗滌該結(jié)晶性達(dá)托霉素。
60.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中該達(dá)托霉素的起始純度為至少90％。
61.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中所述結(jié)晶是在低于20℃的溫度下進(jìn)行的。
62.根據(jù)權(quán)利要求61的方法，其中所述結(jié)晶是在約4℃下進(jìn)行的。
63.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中所述結(jié)晶是在攪拌下進(jìn)行的。
64.根據(jù)權(quán)利要求42-46任意一項的方法，其中達(dá)托霉素在結(jié)晶或沉淀后具有至少98％的純度。
65.制備結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素的方法，包含下列步驟a)提供一種溶液，包含達(dá)托霉素、包含一價或二價陽離子的鹽、pH緩沖劑和小分子或多元醇；b)使達(dá)托霉素從溶液中結(jié)晶或沉淀出來，分別得到結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素制備物。
66.根據(jù)權(quán)利要求65的方法，其中該緩沖劑選自由HEPES、TrisHCl、咪唑、MES、CHES、醋酸鈉、醋酸鈣、檸檬酸鹽和二甲胂酸鹽組成的組。
67.根據(jù)權(quán)利要求65的方法，其中該醇選自由乙二醇、丙二醇、叔丁醇、甘油、異丙醇、1，4-丁二醇、1，2-丙二醇和甲醇組成的組。
68.根據(jù)權(quán)利要求67的方法，其中該醇是異丙醇。
69.根據(jù)權(quán)利要求65的方法，其中該鹽包含二價陽離子，該二價陽離子是鎂陽離子、鋅陽離子或鈣陽離子。
70.制備結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素的方法，包含下列步驟a)提供一種溶液，包含達(dá)托霉素、pH緩沖劑和小分子或多元醇，和b)使達(dá)托霉素從溶液中結(jié)晶或沉淀出來，分別得到結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素制備物。
71.根據(jù)權(quán)利要求70的方法，其中該緩沖劑包含二價陽離子，選自鈣陽離子或鎂陽離子。
72.根據(jù)權(quán)利要求65或70的方法，其中該溶液的pH在5.0至9.5的范圍內(nèi)。
73.根據(jù)權(quán)利要求72的方法，其中該溶液的pH在5.9至6.3的范圍內(nèi)。
74.根據(jù)權(quán)利要求65或70的方法，其中所述結(jié)晶或沉淀步驟是在0-30℃的溫度下進(jìn)行的。
75.根據(jù)權(quán)利要求74的方法，其中該溫度是23-28℃。
76.根據(jù)權(quán)利要求70的方法，其中該溶液包含乙酸鈣pH6.1和異丙醇。
77.根據(jù)權(quán)利要求76的方法，其中所述結(jié)晶或沉淀步驟包含加入異丙醇，直至混合物變渾濁。
78.根據(jù)權(quán)利要求77的方法，其中所述結(jié)晶或沉淀步驟進(jìn)行一小時至三周的時間。
79.根據(jù)權(quán)利要求65的方法，其中所述結(jié)晶或沉淀分別是借助成批結(jié)晶或成批沉淀進(jìn)行的。
80.根據(jù)權(quán)利要求65或70的方法，進(jìn)一步包含收集該結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素的步驟。
81.根據(jù)權(quán)利要求80的方法，其中所述收集步驟是借助過濾或離心進(jìn)行的。
82.根據(jù)權(quán)利要求81的方法，其中所述收集是借助過濾進(jìn)行的。
83.根據(jù)權(quán)利要求80的方法，進(jìn)一步包含洗滌該結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素的步驟。
84.根據(jù)權(quán)利要求65或70的方法，其中該結(jié)晶性或晶體狀達(dá)托霉素具有urchin狀形狀。
85.根據(jù)權(quán)利要求65或70的方法，其中達(dá)托霉素在結(jié)晶或沉淀前具有不大于80％的純度，在結(jié)晶或沉淀后具有至少95％的純度。
86.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中達(dá)托霉素在結(jié)晶或沉淀后具有至少96％的純度。
87.制備純化的達(dá)托霉素的方法，包含下列步驟a)提供一種溶液，包含達(dá)托霉素、pH緩沖劑和小分子或多元醇，該pH緩沖劑是包含一價或二價陽離子的鹽；b)使達(dá)托霉素從溶液中結(jié)晶或沉淀出來，得到純化的達(dá)托霉素制備物。
88.根據(jù)權(quán)利要求87的方法，其中該純化的達(dá)托霉素制備物是至少95％純的。
89.根據(jù)權(quán)利要求87的方法，其中所述純化的達(dá)托霉素制備物是至少97％純的。
全文摘要
本發(fā)明涉及脂肽的結(jié)晶性和晶體狀形式，脂肽包括達(dá)托霉素，它是一種對革蘭氏陽性細(xì)菌、包括對常規(guī)抗生素具有耐藥性的菌株都具有有力殺菌活性的脂肽抗生素。本發(fā)明涉及純化脂肽的方法，脂肽包括達(dá)托霉素，它是一種對革蘭氏陽性細(xì)菌、包括對常規(guī)抗生素具有耐藥性的菌株都具有有力殺菌活性的脂肽抗生素。本發(fā)明還涉及包含純化形式脂肽的藥物組合物和使用這些組合物的方法。
文檔編號C07K7/54GK1982330SQ20061014856
公開日2007年6月20日 申請日期2001年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月18日
發(fā)明者D·凱斯, 賴正吉, C·戈瓦爾丹, N·哈拉夫 申請人:卡比斯特制藥公司