專利名稱：：分離的發(fā)光蛋白AQdecay及其應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及發(fā)光蛋白AQdecay,涉及它的核苷酸和氨基酸序列，并且涉及發(fā)光蛋白AQdecay的活性和應用。
背景技術：
：發(fā)光蛋白活有機體發(fā)出光的現(xiàn)象被稱為生物發(fā)光。這是細胞中生物化學反應的結(jié)果，在該反應中化學能以光量子的形式發(fā)射出(稱為通過化學發(fā)光進行的冷發(fā)射)。通過這種方式產(chǎn)生的光是單色光，因為它的發(fā)射與分散的電子轉(zhuǎn)移相聯(lián)系，因此它可以被二級熒光染料(例如，在水母屬(Aequorm)發(fā)光水母(Leuchtquallen)的情況下為熒光蛋白質(zhì))遷移到較長波長的光譜區(qū)。生物發(fā)光具有多種生物功能在200~1000m(Mesopelagml)的海洋深度下，大約90%的所有生活有機體都發(fā)光。在這種情況下，發(fā)光信號用于吸引配偶、偽裝和作為誘斜。螢火蟲和火螢同樣使用光信號尋找配偶。另一方面，細菌、真菌和單細胞藻類中熒光的重要性尚不明確?？梢约俣ㄆ溆糜谂浜洗罅繑?shù)目的多個單獨個體或者表示一種類型的生物鐘。多種腔腸動物都是生物發(fā)光體(Morm等人，1974)。這些有才幾體發(fā)射藍色或者綠色光。作為分離的蛋白質(zhì)，來源于水母(AequoriaVictoria)(Shimomura等人，1969)、在1962年被首先確定為發(fā)光蛋白的水母發(fā)光蛋白(Aequorm)，在水母的情形中進行表型觀察時，發(fā)射藍光而不是綠光。由于受水母發(fā)光蛋白活化的結(jié)果，導致水母呈現(xiàn)綠色表型的綠色熒光蛋白(GFP)隨后從該水母中分離得到(Johnson等人，1962;Hastings等人，1969;Inouye等人，1994)。其它也-皮鑒定和描述的發(fā)光蛋白為Clytm(Inouye等人，1993)、Mitrocomin(Fagan等人，1993)和奧貝林(Obelm)(Illa謹ov等人，1995)。表1:一些發(fā)光蛋白的綜述。該表給出了名稱、分離蛋白質(zhì)的有機體和數(shù)據(jù)庫入口的識別編號(Acc.No.)。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表2:—些發(fā)光蛋白的綜述。該表給出了分離蛋白質(zhì)的有機體、發(fā)光蛋白的名稱和選擇的專利或者申請。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>當前，生物發(fā)光以多種不同的方式用于技術中，例如以環(huán)境污染生物指示物的形式，或者用于生物化學中以靈敏檢測蛋白質(zhì)或者定量具體化合物，或者作為與研究細胞中基因調(diào)節(jié)相聯(lián)系的所謂指示器(Reporter)。同，而且在于它們的生物化學和物理性質(zhì)不同。已經(jīng)證實，發(fā)光蛋白的物理和生化性質(zhì)可以通過改變這些發(fā)光蛋白質(zhì)的氨基酸序列得到改變。誘變處理的發(fā)光蛋白的實例描述在文獻中(US6,495,355;US5,541,309;US5,093,240;Shimomura等人,1986)。上述發(fā)光蛋白通過氧化腔腸發(fā)光(Haddock等人，2001;Jones等人，1999)。指示器系統(tǒng)通常，其基因產(chǎn)物可以通過使用簡單的生物化學或者組織化學方法得到輕易檢測的基因被稱為報導基因(Reportergen)或者指針基因(Indikatorgen)。至少兩種類型的報導基因已經(jīng)得到了區(qū)分。1.抗性基因。作為抗性基因表示其在細胞上表達使得細胞對抗生素或者對如果抗性基因不存在時，在生長培養(yǎng)基中的存在導致細胞死亡的其它物質(zhì)產(chǎn)生抗性的基因。2.報導基因。報導基因的產(chǎn)品在基因工程中被用作融合或者未融合的指針。一般的報導基因包括P-半乳糖苷酶(Alam等人，1990)、堿性磷酸酶(Yang等人，1997;Cullen等人，1992)和熒光素酶以及其它發(fā)光蛋白(Shmomura，1985;PhillipsGN,1997;Snowdowne等人，1984)。光子在可見光譜范圍內(nèi)的發(fā)射稱為發(fā)光，其中該發(fā)射受激發(fā)的發(fā)射體分子的影響。與熒光不同的是，在這種情況下，能量并不由外部以較短波輻射的形式提供?；瘜W發(fā)光和生物發(fā)光之間存在區(qū)別。導致當受激發(fā)的電子返回到其基態(tài)時，自身發(fā)光的激發(fā)分子的化學反應稱為化學發(fā)光。如果該反應受酶的催化，那么該現(xiàn)象稱為生物發(fā)光。在反應中涉及的酶通常稱為熒光素酶。制備變種(Mutante)為了制備變種，利用分子生物學方法在89位[Y89F](GenBank#AAA27716;SEQID5的89位)和139位[Y139F](GenBank#AAA27716;SEQID5的139位)嵌入突變體。為了實現(xiàn)該目的，使用Stratagene公司的"Quickchange"方法(目錄編號#200521;《奮正存063001b;2003版)。將(SEQIDNO:3)和(SEQIDNO:4)用作引物。士某介物表示為pET22b-AQdecay。AQdecay由于單個氨基酸被取代而顯示出改變的光譜或者生化性質(zhì)的發(fā)光蛋白已經(jīng)在文獻中進行了描述。這些發(fā)光蛋白包括奧貝林W92F(Vysotski等人，2003)和水母發(fā)光蛋白(Shrestha等人，2002;Ohmiya等人，1993)。同發(fā)光蛋白水母發(fā)光蛋白或者其它發(fā)光蛋白相比，水母發(fā)光蛋白變將造成光釋;改隨時間變化而變化的139位突變體與89位突變體組合。89位上的改變已經(jīng)得到了描述，其導致發(fā)光蛋白的光語性質(zhì)發(fā)生變化。除了表現(xiàn)光釋放隨時間變化而變化之外，所述選擇的組合還表現(xiàn)出改變的光譜性質(zhì)。可以將139位的改變與其它氨基酸的取代結(jié)合。還可以將139位的改變與剩余發(fā)光蛋白水母發(fā)光蛋白的野生型序列結(jié)合。發(fā)光蛋白AQdecay驚人地表現(xiàn)出迄今尚未描述的光釋放或者焚光的延遲動力學。除了通常的可能應用之外，該性質(zhì)使得發(fā)光蛋白可以具體用于研究真核細胞或者其它系統(tǒng)中涉及非?？焖兮}釋放的反應或者機制。光從迄今所述的發(fā)光蛋白變種或者發(fā)光蛋白野生型蛋白的釋放動力學被稱為"閃現(xiàn)"動力學，這是因為在激活(例如，用媽)之后，光在較短的時間內(nèi)釋放，然后反應停止或者至少變得顯著較弱。為了測量該快速動力學，需要特定的測量裝置。所述的發(fā)光蛋白變種AQdecay或者它的等價物，不僅使得其可以應用其它測量裝置或者測量方法，而且，特別是，可以研究非?？焖俚膭恿W。該動力學可以，例如，在P2X家族的離子通道聯(lián)合引發(fā)。在470nm處具有最大值的水母發(fā)光蛋白光譜已經(jīng)得到了描述(Shimomuro等人，1966)。腔腸的光譜性能已經(jīng)由Shmomuro進行了考察(Shimomura等人，2000)。發(fā)光蛋白AQdecay在氨基酸水平上顯示了與得自于水母的水母發(fā)光蛋白最高程度的同源性，具有99%的同一性(示于實施例8中)。BLAST方法用于序列比較(Altschul等人，1997)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及發(fā)光蛋白AQdecay,其具有由SEQIDN0:2表示的氨基酸序列。本發(fā)明同樣涉及在SEQIDNO:l中描述的核酸分子。本發(fā)明還涉及AQdecay的功能等價物。功能等價物是那些具有可比擬的物理化學性能的蛋白質(zhì)。本發(fā)明涉及水母發(fā)光蛋白發(fā)光蛋白，其在氨基酸位置129-149，124-134的區(qū)域，優(yōu)選137-141,特別是138-140(基于GenBank#AAA27716),表現(xiàn)出一個或者多個導致生物發(fā)光發(fā)生變化性質(zhì)的氨基酸突變體。此外，本發(fā)明涉及水母發(fā)光蛋白發(fā)光蛋白，其在139位(基于GenBank#AAA27716),表現(xiàn)出導致生物發(fā)光性能發(fā)生變化的氨基酸突變體。就此而言，水母發(fā)光蛋白發(fā)光蛋白還可以為在氨基酸134-145區(qū)域表現(xiàn)出與截斷的水母發(fā)光蛋白(GenBank#AAA27716)相似的基序的發(fā)光蛋白。就此而言，具有類似基序的區(qū)域被認為是在該區(qū)域內(nèi)表現(xiàn)出80%等同性的序列，優(yōu)選90%。本發(fā)明涉及在氨基酸位置79-99,84-94，優(yōu)選87-91,特別是88-90光鐠或者生物發(fā)光光譜產(chǎn)生變化的氨基酸突變體的水母發(fā)光蛋白發(fā)光蛋白，其具有在氨基酸139位區(qū)域內(nèi)的突變體。此外，本發(fā)明涉及在89位(基于GenBank#AAA27716)表現(xiàn)出導致熒光光譜或者生物發(fā)光光譜發(fā)生變化的氨基酸突變體的水母發(fā)光蛋白發(fā)光蛋白，其具有氨基酸139位區(qū)域內(nèi)的突變體。就此而言，優(yōu)選在480-520nm的范圍內(nèi)顯示出熒光光譜或者生物發(fā)光光譜最大值的那些發(fā)光蛋白，優(yōu)選485-515nm,特別優(yōu)選490-510nm、495-505nm,或者特別是在500nm。就此而言，水母發(fā)光蛋白發(fā)光蛋白還可以為在氨基酸84-94區(qū)域內(nèi)表現(xiàn)出與截斷的水母發(fā)光蛋白(GenBank#AAA27716)相似的基序的那些發(fā)光蛋白。就此而言，具有類似基序的區(qū)域被認為是在該區(qū)域內(nèi)表現(xiàn)出80%等同性(Indentitat)的那些序列，優(yōu)選90%。根據(jù)本發(fā)明，AQdecay蛋白的功能片段或者編碼所述片段的核酸是類似的。根據(jù)本發(fā)明的其它蛋白的截斷的官能片段或者編碼這些片段的核酸同樣構成本發(fā)明的一部分。所述發(fā)光蛋白AQdecay適于用作細胞系統(tǒng)，特別是受體、離子通道、轉(zhuǎn)運蛋白、轉(zhuǎn)錄因子或者誘導系統(tǒng)的報導基因。所述發(fā)光蛋白AQdecay還適于用作標記、鑒定和表征細胞器的報導基因，特別是線粒體的報導基因。所述發(fā)光蛋白AQdecay還適于用作確定細胞器，特別是線粒體，內(nèi)外參數(shù)，特別是鈣濃度，的報導基因。所述發(fā)光蛋白AQdecay適于在細菌和真核系統(tǒng)(特別是哺乳動物細胞)、細菌、酵母、Bacculo、和植物中用作報導基因。所述發(fā)光蛋白AQdecay適于結(jié)合生物發(fā)光或者化學發(fā)光系統(tǒng)，特別是使用熒光素酶、使用加氧酶或者使用磷酸酶的系統(tǒng)，用作細胞系統(tǒng)的報導基因。所述發(fā)光蛋白AQdecay適于用作融合蛋白，特別是受體、離子通道、轉(zhuǎn)運蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、蛋白酶、激酶、磷酸二酯酶、水解酶、肽酶、轉(zhuǎn)移酶、膜蛋白和糖蛋白的融合蛋白。所述發(fā)光蛋白AQdecay適用于進行固定，特別是通過抗體、通過生物素或者通過磁性或者可磁化載體進行固定。所述發(fā)光蛋白AQdecay適于用作能量轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的蛋白，特別是FRET(熒光共振能量傳遞)、BRET(生物發(fā)光共振能量傳遞)、FET(場效晶體管)、FP(熒光偏振)和HTRF(均質(zhì)時間分辨熒光)系統(tǒng)。所述發(fā)光蛋白AQdecay適于標記底物或者配體，特別是蛋白酶、激酶或者轉(zhuǎn)移酶。所述發(fā)光蛋白AQdecay適于在細菌系統(tǒng)中進行表達，特別是用于滴定度測定，或者作為生物化學系統(tǒng)的底物，特別是蛋白酶和激酶的底物。所述發(fā)光蛋白AQdecay適于用作標記物，特別是偶聯(lián)在抗體上、偶聯(lián)的酶上、偶聯(lián)在受體上或者偶聯(lián)在離子通道和其它蛋白上的標記物。所述發(fā)光蛋白AQdecay適于在尋找藥理學活性化合物中作為報導基因聯(lián)合使用，特別是在HTS(高通量篩選)中。所述發(fā)光蛋白AQdecay適于在表征、鑒定和研究離子通道中作為4艮導基因使用，特別是p2x、TRP、SC—N、KC—N、CNG或者ACCN類型離子通道。所述發(fā)光蛋白AQdecay適于用作檢測系統(tǒng)的組件，特別是用于ELISA(酶Jf關免疫吸附測定)、免疫組織化學、Western印跡法或者共焦顯微學。所述發(fā)光蛋白AQdecay適于用作分析相互作用的標記物，特別是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、DNA-蛋白質(zhì)相互作用、DNA-RNA相互作用、RNA-RNA相互作用或者RNA-蛋白質(zhì)相互作用(DNA:脫氧核糖核酸；RNA:核糖核酸)。者融合蛋白f特別是在小鼠、大鼠、倉鼠禾:其它哺乳動物、靈長類動::魚類、蠕蟲或者植物中。所述發(fā)光蛋白AQdecay適于用作分析胚胎發(fā)育的標記物或者融合蛋白。所述發(fā)光蛋白AQdecay適于通過偶聯(lián)介質(zhì)用作標記物，特別是通過Biotin、NHS(N-羥基磺基琥珀酰亞胺)或者CN-Br。所述發(fā)光蛋白AQdecay適于用作偶聯(lián)在核酸上的指示器(Reporter)，特別是偶聯(lián)在DNA或者RNA上的指示器。所述發(fā)光蛋白AQdecay適于用作偶聯(lián)在蛋白或者肽上的指示器。所述發(fā)光蛋白AQdecay適于用作測量胞內(nèi)或者胞外釣濃度的指示器。所述發(fā)光蛋白AQdecay適于表征細月包系統(tǒng)中的信號級耳關。與核酸或者肽偶聯(lián)的發(fā)光蛋白AQdecay適于用作探針，特別是用于Northern印跡、Southern印跡、Western印跡、ELISA、核酸4非序、蛋白質(zhì)分析或者碎片分析的探針。所述發(fā)光蛋白AQdecay適用于標記藥理學制劑，特別是感染藥物、抗體或者"小分子"。所述發(fā)光蛋白AQdecay適用于地質(zhì)研究，特別是海洋、地下水和河、、六所述發(fā)光蛋白AQdecay適于在表達系統(tǒng)中進行表達，特別是體外翻譯系統(tǒng)、細菌系統(tǒng)、酵母系統(tǒng)、桿狀病毒系統(tǒng)、病毒系統(tǒng)或者真核系統(tǒng)。所述發(fā)光蛋白AQdecay適于在外科手術中直3見觀察組織或者細i包，特別是在侵入性手術、非侵入性手術和最少量侵入性手術中。所述發(fā)光蛋白AQdecay還適于標記胂瘤組織和其它表型改變的組織，特別是在組織學研究或者在外科手術中。本發(fā)明還涉及發(fā)光蛋白AQdecay的純化，特別是為野生型蛋白質(zhì)、融合蛋白質(zhì)或者誘變處理蛋白質(zhì)的發(fā)光蛋白AQdecay的純化。所述發(fā)光蛋白AQdecay適于在表達系統(tǒng)中同時測量不同的報導基因(多路技術)。本發(fā)明還涉及發(fā)光蛋白AQdecay在化妝品領域的應用，特別是沐浴添加劑、洗液、月巴皂、人體染誶牛、牙膏和面霜領i或。本發(fā)明還涉及發(fā)光蛋白AQdecay用于染色的應用，特別是食物、沐浴添加劑、油墨、紡織物和塑料。本發(fā)明還涉及發(fā)光蛋白AQdecay用于對紙染色的應用，特別是賀卡、紙制品、壁紙和手工藝品。本發(fā)明還涉及發(fā)光蛋白AQdecay用于染色液體的應用，特別是玩具噴水槍、噴泉、飲料和冰。本發(fā)明還涉及發(fā)光蛋白AQdecay用于生產(chǎn)消遣品的應用，特別是指畫和裝飾。本發(fā)明涉及編碼由SEQIDNO:2或者其功能等價物或者功能片段揭示的多肽的核酸分子。本發(fā)明進一步涉及核酸分子或者其功能等價物或者功能片段，其選自a)編碼包含由SEQIDNO:2揭示的氨基酸序列的多肽的核酸分子；b)含有SEQIDNO:l所表明的序列的核酸分子；c)在嚴格條件下，其互補鏈與a)或者b)的核酸分子雜交并且其表達產(chǎn)物表現(xiàn)出發(fā)光蛋白的生物功能的核酸分子；核酸分子的嚴格雜交在68。C下，在含有0.2xSSC(1x標準鹽7K-斗寧檬酸鹽=150mMNaCl,15mM檸檬酸三鈉)的水溶液中進4亍(Sambrook等人，1989);d)由于遺傳密碼的退化而不同于c)中記載的核酸分子。本發(fā)明涉及上述核酸分子，其中所述序列含有功能啟動子5'至發(fā)光本發(fā)明還涉及如先前所述的核酸分子，其形成部分重組DNA或者RNA媒介物。本發(fā)明涉及包含所述纟某介物的有機體。本發(fā)明涉及通過先前所述的核苷酸序列編碼的發(fā)光蛋白。本發(fā)明涉及在細菌、真核細胞或者體外表達系統(tǒng)中表達根據(jù)本發(fā)明的發(fā)光蛋白多肽的方法。本發(fā)明還涉及純化/分離根據(jù)本發(fā)明的發(fā)光蛋白多肽的方法。本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的發(fā)光蛋白-編碼核酸作為標記基因或者報導基因的用途，特別是用于尋找藥理學活性化合物和用于診斷學。本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的發(fā)光蛋白或者根據(jù)本發(fā)明的發(fā)光蛋白-編碼核酸分別作為標記物或者指示器或作為標記基因或者報導基因的用蛋白-編碼/f本發(fā)明涉及發(fā)光蛋白AQdecay(SEQIDNO:2)或者它的功能片段或者等價物、或涉及發(fā)光蛋白AQdecay-編碼核酸或者它的功能片段或者等價物分別作為標記物或者指示器或作為標記基因或者報導基因的用途，特別是用于尋找藥理學活性化合物和用于診斷學。本發(fā)明涉及在SEQIDNO:1中表明的核酸作為標記基因或者報導基因的用途，特別是用于尋找藥理學活性化合物和用于診斷學。本發(fā)明還涉及識別根據(jù)本發(fā)明的多肽的多克隆或者單克隆抗體。本發(fā)明還涉及識別發(fā)光蛋白AQdecay(SEQIDNO:2)的單克隆或者多克隆抗體。本發(fā)明還涉及如前一段落所述的核酸，其含有功能啟動子5'至編碼序列。本發(fā)明包括含有先前所述的核酸的重組DNA或者RNA士某介物。通過如上所述的核酸序列編碼的多肽同樣構成本發(fā)明的一部分。按照本發(fā)明還涉及在細菌、真核細胞或者體外表達系統(tǒng)中表達先前所記載的多肽的方法。純化/分離根據(jù)本發(fā)明的多肽的方法同樣構成本發(fā)明的一部分。本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的核酸作為標記基因或者報導基因的用途。本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的發(fā)光蛋白作為標記物或者指示器的用途。根據(jù)本發(fā)明的多肽結(jié)合一種或者多種熒光素酶和/或一種或者多種發(fā)光蛋白的用途也構成本發(fā)明的一部分。在129-149,124-134,優(yōu)選137-141,特別是138-140區(qū)域(基于GenBank#AAA27716)具有一個或者多個突變體并且表現(xiàn)出改變的，特別是延遲的生物發(fā)光信號的發(fā)光蛋白或者其功能片段對應于本發(fā)明。包含編碼根據(jù)前兩個段落的蛋白質(zhì)的序列的核酸分子同樣對應于本發(fā)明。此外，本發(fā)明的一部分涉及制備發(fā)光蛋白的方法，其特征在于，基于GenBank#AAA27716,將一個或者多個突變體引入到發(fā)光蛋白的129-149,124-134位限定的區(qū)域，優(yōu)選137-141，特別是138-140位限定的區(qū)域，由此導致生物發(fā)光發(fā)生變化。通過如前一段落所述的方法制備的發(fā)光蛋白同樣對應于本發(fā)明。本發(fā)明還涉及其它發(fā)光蛋白，其由于氨基酸序列上的一個或者多個改變而顯示出改變的光釋放動力學。本發(fā)明還涉及其它改變的發(fā)光蛋白用于發(fā)光蛋白AQdecay的所述應用的用途。具有改變的光釋放動力學，特別是其中光釋放被延遲的光釋放或者延遲的持續(xù)時間的發(fā)光蛋白特別適于在基于細胞的方法中用作報導基因，特別是在尋找和表征藥理學活性化合物中和特別是在診斷學中。具有改變的光釋放動力學，特別是其中光釋放被延遲的光釋放或者延遲的持續(xù)時間的發(fā)光蛋白特別適于研究離子通道。本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的密碼子得到最優(yōu)化的變體，以改變其生物化學或者物理化學性能，特別是改良的表達，特別是改變的穩(wěn)定性。本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)與識別肽的融合，以將根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)運送或者定位于細胞器或者隔區(qū)中。本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的變體，其導致蛋白質(zhì)在光語性能、發(fā)光強度、底物特異性、輔因子的使用、鈣親合性或者其它物理化學或者生化性能上發(fā)生變化。本發(fā)明發(fā)光蛋白的表達在基因已經(jīng)一皮引入到適宜的宿主細胞之后，使得被克隆入表達載體的異體基因能夠被轉(zhuǎn)錄和翻譯的分子的形成被稱為表達。表達載體含有在原核或者真核細胞中表達基因所需的控制信號。原則上，表達載體可以以兩種不同的方式進行構造。在稱為轉(zhuǎn)錄融合的情形中，被克隆異體基因編碼的蛋白質(zhì)被合成為可信的、生物學活性的蛋白質(zhì)?；谠撃康?，表達載體帶有全部表達所需的5'和3'控制信在稱為翻譯融合的情形中，被克隆異體基因編碼的蛋白質(zhì)與另一種可以被輕易檢測的蛋白質(zhì)一起表達為雜化蛋白。對表達所需的5'和3'控制信號，包括起始密碼子以及可能的編碼;欲形成的雜化蛋白的N-末端區(qū)域的部分序列來源于媒介物。在多數(shù)情況下，其它嵌入的蛋白質(zhì)部分不僅穩(wěn)定通過克隆異體基因編碼的蛋白質(zhì)，防止其被細胞蛋白酶裂解；而且還用于檢測和分離所形成的雜化蛋白。所述表達可以或者短暫地或者穩(wěn)定地進行。適宜的宿主有才幾體為細菌、酵母、病毒或者真核系統(tǒng)。本發(fā)明發(fā)光蛋白的純化蛋白質(zhì)的分離(在它們也被過表達之后)通常稱為蛋白質(zhì)純化?？梢允褂枚喾N已經(jīng)證實的方法和工藝純化蛋白質(zhì)。固體/液體分離是涉及蛋白質(zhì)分離的基本操作。當從培養(yǎng)介質(zhì)中分離細胞時，當使細胞斷裂和除去細胞碎片之后凈化粗提取物時，和在沉淀之后分離沉積物等等時，都需要該工藝步驟。它通過離心和過濾的方式進行。為了獲得胞內(nèi)蛋白質(zhì)，必須將細胞壁破壞或者使其可滲透。取決于度量和有機體，可以將高壓勾漿器或者攪拌器球磨機或者玻璃珠研磨機用于該目的。其中在實驗室規(guī)模時，使用機械細胞粉碎機和超聲波處理。在胞外蛋白質(zhì)的情形和在胞內(nèi)蛋白質(zhì)的情形中(在細胞分裂之后)，多種使用鹽(特別是硫酸銨)或者有機溶劑(醇或者丙酮)的沉淀方法都代表著濃縮蛋白質(zhì)的快速和經(jīng)濟方法。當對胞內(nèi)蛋白質(zhì)進行純化時，可以合意地除去可溶性核酸(用，例如^L酸鏈霉素或者魚精蛋白^L酸鹽進行沉淀)。當對胞外蛋白質(zhì)進行分離時，為了獲得易于處理的沉積物，通常將載體(例如淀粉或者娃藻土)在加入沉淀劑之前加入。為了獲得高度純化，可以使用多種層析法和分離法(吸收色鐠學和離子交換色譜法、凝膠過濾、親和色譜法和電泳法)。在工業(yè)規(guī)^t上，還使用柱色譜法?？梢悦坎郊兓蜃幼罡哌_數(shù)百的親和色譜法對于實驗室規(guī)模是特別重要的。胞外蛋白質(zhì)在相對較稀的溶液中繁殖。正如胞外蛋白質(zhì)一樣，在進一步使用之前，必要要對它們進行濃縮。除了上述已經(jīng)記載的方法之外，在工業(yè)規(guī)模上，超過濾法也被證實是有價值的。們可以通過特別是,疑月交過濾、滲析和滲透過濾(Diafiltration)除去。多種蛋白質(zhì)作為無水制劑使用。重要的干燥方法為真空干燥、冷凍干燥和噴霧干燥。核香酸和氨基酸序列發(fā)光蛋白AQdecay通過以下核苷酸序列(SEQIDNO:l)進4亍編碼ATGTCAGTCAAGCTTACACCAGACTTCGACAACCCAAAATGGATTGGACGACACAAGCACATGTTTAATTTTCTrGATGTCAACCACAATGGAAGGATCTCTCTTGACGAGATGGTCTACAAGGCGTCCGATATTGTTATAAACAATCTTGGAGCAACACCTGAACAAGCCAAACGTCACAAAGATGCTGTAGAAGCCTTCTTCGGAGGAGCTGGAATGAAATATGGTGTAGAAACTGAATGGCCTGAATTTATCGAAGGATGGAAAAGACTGGCTTCCGAGGAATTGAAAAGGTATTCAAAAAACCAAATCACACTTATTCGTTTATGGGGTGATGCATTGTTCGATATCATTGACAAAGACCAAAATGGAGCTATTTCACTGGATGAATGGAAAGCATTCACCAAATCTGCTGGCATCATCCAATCGTCAGAAGATTGCGAGGAAACATTCAGAGTGTGCGATATTGATGAAAGTGGACAGCTCGATGTTGATGAGATGACAAGACAACATTTAGGATTTTGGTACACCATGGATCCTGCTTGCGAAAAGCTCTACGGTGGAGCTGTCCCCTAA-3、.這得到了以下(SEQIDNO:2)的氨基酸序列MTSEQYSVKLTPDFDNPKWIGRHKHMFNFLDVNHNGRISLDEMVYKASDIVINNLGATPEQAKRHKDAVEAFFGGAGMKYGVETEWPEFIEGWKRLASEELKRYSKNQITLIRLWGDALFD皿KDQNGAJSLDEWKAFTKSDGnQSSEDCEETFRVCDIDESGQLDVDEMTRQHLGFWYTMDPACEKLYGGAW引物(SEQIDNO:3):5'-GAATGGCCTGAATTTATCGAAGGATGGAA-3,(SEQEDNO:4):5'-TTCCATCCTTCGATAAATTCAGGCCATTC-3'(SEQIDNO:5):5'-GAATGGAAAGCATTCACCAAATCTGCTG-3'(SEQIDNO:6):5'-CAGCAGATTTGGTGAATGCTTTCCATTC-3'發(fā)光蛋白水母發(fā)光蛋白(Genbank:AAA27716)具有以下氨基酸序列(SEQIDNO:7)。89和139位以粗體和下劃線印刷。1、一種軟化水的方法，該方法包括(i)提供至少一個第一納米過濾元件；(ii)提供至少一個第二納米過濾元件，該第二納米過濾元件與第一納米過濾元件串聯(lián)連接；(iii)提供飲用水源；(iv)使所述飲用水a(chǎn))首先在第一時間周期內(nèi)通過所述第一納米過濾元件，形成第一軟化過濾水流以及第一濃縮水流，所述第一軟化過濾水流具有比所述飲用水源更低的硬度，所述第一濃縮水流具有比所述飲用水源更高的硬度，以及b)隨后，使所述第一濃縮水流通過所述第二納米過濾元件，形成第二軟化過濾水流以及第二濃縮水流，所述第二軟化過濾水流具有比所述飲用水源更低的硬度，所述第二濃縮水流具有比所述飲用水源更高的硬度；(V)反轉(zhuǎn)所述飲用水的流向，使得來自所述飲用水源的飲用水a(chǎn))首先在第二時間周期內(nèi)通過所述第二納米過濾元件，形成一個軟化過濾水流以及一個濃縮水流，該軟化過濾水流具有比所述飲用水源更低的硬度，該濃縮水流具有比所述飲用水源更高的硬度，以及b)隨后，使所述濃縮水流通過所述第一納米過濾元件，形成軟化過濾水流，該過濾水流具有比所述飲用水源更低的硬度；以及重復步驟(iv)和(v)。2、如權利要求l所述的軟化水的方法，其中，所述第一納米過濾元實施例3細菌表達通過用表達質(zhì)粒pET22b-AQdecay轉(zhuǎn)化細菌，細菌在大腸桿菌中的表達得到實現(xiàn)。在LB介質(zhì)中在37。C下將轉(zhuǎn)化的i田菌培養(yǎng)3小時，和其表達根據(jù)制造商(Novagen)指導書進行誘發(fā)。通過離心收集誘發(fā)的細菌，將其再懸浮于50mMTris/HC1(pH9.0)+5mMEDTA中并且通過超聲處理使其斷裂。然后，在13000rpm(16000rcf)下將所得溶胞產(chǎn)物離心15分鐘，并且將上清液除去。在暗處，用腔腸(在Tris/HC1pH9.0中的10E陽07M腔腸)將上清液(用Tris/HClpH9.0稀釋的1:5;1:10;l:20和l:50稀釋物)培養(yǎng)3小時。在加入5mM氯化鉤之后，立即在光度計中對生物發(fā)光進行測量。測定累積時間為40秒。圖4顯示了AQdecay在細菌中生物發(fā)光測量的動力學。實施例4真核表達結(jié)構真核表達在CHO細胞中進行，所述CHO細胞是瞬態(tài)實-驗中用表達質(zhì)粒pcDNA3-AQdecay和pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染細胞而得到的CHO細胞。對此，將在DMEM-F12介質(zhì)中的10000個細胞/孔從96-孔微過濾板中濾出，并且在37。C下將板培養(yǎng)過夜。使用Fugene6試劑盒(Roche)，根據(jù)制造商指導書，轉(zhuǎn)染得到實現(xiàn)。在37。C下，在DMEM-F12介質(zhì)中將轉(zhuǎn)染的細胞培養(yǎng)過夜。然后將介質(zhì)除去和替換為50ul腔腸(在PBS中的10E-07M腔腸)。在28。C下將細胞培養(yǎng)24小時，在此之后將ATP(腺苷三磷酸)加入其中直至最終濃度為1pM。在此次加入之后，立即啟動光度計進行測量。累積時間為l秒，總測定持續(xù)時間為60秒。圖3顯示了在CHO細胞中AQdecay生物發(fā)光測定的結(jié)果。圖5顯示了在CHO細胞中AQdecay生物發(fā)光測定的動力學。實施例5BLAST氨基酸水平的AQdecay的BLAST分析的結(jié)果>emb|CAC93774.1|未命名的蛋白產(chǎn)品[Aequoreavictoria]長度=196,記分=410節(jié)(1054),預期-e-113，同一性=194/196(98%),陽性=196/196(100%)〉pir||A26623水母發(fā)光蛋白-1前體-水螅水母類(A叫uoreavictoria)sp|P07164|AEQl—AEQVI水母發(fā)光蛋白1前體gb|AAA27716.lj水母發(fā)光蛋白1前體長度=196,記分=410節(jié)(1054),預期二e-113,同一性=194/196(98%),陽性=196/196(100%)〉gb|AAB14842.1|專利US5541309的序列1gb|AAA55424.1|專利EP0187519的序列2長度=196,記分=407節(jié)(1046),預期=6-113,同一性=193/196(98%),卩日性=195/196(99%)〉gblAAB14845.1l專利US5541309的序列4長度=196,記分=405節(jié)(1041),預期-e-112,同一性=192/196(97%),陽性=194/196(98%)〉gbiAAB14846.1l專利US5541309的序歹'J5長度=196，記分=405節(jié)(1040)，預期=6-112,同一性=192/196(97%),陽性=194/196(98%)〉gb!AAB14844.1l專利US5541309的序歹'J3長度=196,記分=405節(jié)(1040)，預期-e-112,同一性=192/196(97%),陽性=194/196(98%)〉emb|CAC93778.1|未命名的蛋白產(chǎn)品[A叫uoreaVictoria]長度=196,記分=402節(jié)(1034)，預期二e-111,同一性=191/196(97%)，陽性=193/196(98%)>dbj|BAC81730.1|apoaequorin[Aequoreavictoria]長度=196，記分=401節(jié)(1031)，預期二e-lll，同一性=189/196(96%)，陽性=195/196(99%)〉emb|CAC93779.1|未命名的蛋白產(chǎn)品[Aequoreavictoria]長度=196,記分=400節(jié)(1029),預期=6-111，同一性=190/196(96%)，陽性=192/196(97%)〉emb|CAC93780.1|未命名的蛋白產(chǎn)品[A叫uoreavictoria]長度=196，記分=400節(jié)(1028),預期二e-110,同一性=190/196(96%),陽性=192/196(97%)>pdb|lSL8|A鏈A,得自于A叫uoreaVictoria的負載鈣的Apo-水母發(fā)光蛋白長度=191,記分=395節(jié)(1015),預期二e-109，同一性=187/190(98%),陽性=189/190(99%)〉gblAAB14843.1i專利US5541309的序列2長度=189,記分=394節(jié)(1011)，預期-e-108,同一性=186/189(98%),陽性=188/189(99%)>emb|CAC93777.1|未命名的蛋白產(chǎn)品[A叫uoreavictoria]長度=189,記分=391節(jié)(1005),預期-e-108,同一性=185/189(97%)，陽性=187/189(98%)>emb|CAC93781.1|未命名的蛋白產(chǎn)品[Aequoreavictoria]長度=189,記分=391節(jié)(1004),預期-e-108,同一性=184/189(97%),陽性=187/189(98%)>emb|CAC93775.1|未命名的蛋白產(chǎn)品[A叫uoreavictoria]長度=196,記分=384節(jié)(985),預期=e陽105,同一性=176/196(89%),陽性=192/196(97%)>dbj|BAC81731.1|apoaequorin[Aequoreavictoria]長度=196,^己分=384節(jié)(985),預期=e-105,同一性=176/196(89%)，陽'1~生=192/196(97%)。實施例6BLAST核酸水平的AQdecay的BLAST分碎斤的結(jié)果>gb|M16103.1|AEVAEQAA.Victoria(水母)水母發(fā)光蛋白1mRNA,完全cds長度=672,記分=1104節(jié)(557),預期=0.0，同一性=569/573(99%)>dbj|AB103337.1|apoaequorin的AequoreavictoriamRNA,克隆:UTAEQ04長度=591，記分=961節(jié)(485)，預期=0.0，同一性=551/573(96%)〉dbj|AB103338.1|apoaequorin的AequoreavictoriamRNA,克隆:UTAEQ09長度=591，記分=739節(jié)(373),預期=0.0,同一性=523/573(91%)>gb|L29571.1|AEVAQ440XAequoreavictoria水母發(fā)光蛋白(AQ440)mRNA,完全cds長度=925,^己分=731節(jié)(369)，預期=0.0,同一性=522Z573(91%)>gb|M11394.1|AEVAEQDA叫uoreavictoria(水母)水母發(fā)光蛋白mRNA，完全cds長度=861,記分=731節(jié)(369),預期=0.0,同一性=522/573(91%)>dbj|AB103336.1|apoaequorin的AequoreavictoriamRNA，克隆:UTAEQOl長度=591,記分=724節(jié)(365),預期=0.0,同一性=521/573(90%)〉dbj|AB103339.1|apoaequorin的AequoreavictoriamRNA,克隆:UTAEQll長度=591,記分=716節(jié)(361),預期=0.0,同一性=520/573(90%)〉gb|AY601106.1|Aequoreavictoria水母發(fā)光蛋白mRNA,完全cds長度=600,記分=716節(jié)(361),預期=0.0,同一性=517/569(90%)>gb|AY604002.1|A叫uoreavictoria克隆AEQ一V44A改性的水母發(fā)光蛋白mRNA，完全cds長度=600,記分=708節(jié)(357),預期=0.0,同一性=516/569(90%)>gb|AY604001.1|Aequoreavictoria克隆AEQ—Q168R改性的水母發(fā)光蛋白mRNA,完全cds長度=600，記分=708節(jié)(357),預期=0.0,同一性=516/569(90%)>gb|AY604000.1|Aequoreavictoria克隆AEQN26D改性的水母發(fā)光蛋白mRNA，完全cds長度=600，記分=708節(jié)(357)，預期=0.0,同一性=516/569(90%)>gb|AY603999.11Aequoreavictoria克隆AEQ—L170I改性的水母發(fā)光蛋白mRNA，完全cds長度=600,記分=708節(jié)(357),預期=0.0,同一性=516/569(90%)>gb|AY603998.1|Aequoreavictoria克隆AEQ—F149S改性的水母發(fā)光蛋白mRNA,完全cds長度=600,記分=708節(jié)(357),預期=0.0，同一性=516/569(90%)>gb|AY603997.1|Aequoreavictoria克隆AEQ一E35G改性的水母發(fā)光蛋白mRNA,完全cds長度=600,記分=708節(jié)(357),預期=0.0,同一性=516/569(90%)〉gbjAY603996.11A叫uoreaVictoria克隆AEQ—E128G改性的水母發(fā)光蛋白mRNA,完全cds長度=600，記分=708節(jié)(357),預期=0.0,同一性=516/569(90%)〉gb|AY603995.1|Aequoreavictoria克隆AEQ一D153G改性的水母發(fā)光蛋白mRNA,完全cds長度=600，記分=708節(jié)(357),預期=0.0,同一性=516/569(90%)〉gb|AY603994.1|Aequoreavictoria克隆AEQ_D117G改性的水母發(fā)光蛋白mRNA,完全cds長度=600,記分=708節(jié)(357),預期=0.0,同一性=516/569(90%)〉gb|AY603993.1|Aequoreavictoria克隆AEQ-Q168A-L170V改性的水母發(fā)光蛋白mRNA,完全cds長度=600,記分=676節(jié)(341),預期=0.0,同一性=512/569(89%)。實施例7圖7顯示了氨基酸水平的具有水母發(fā)光蛋白(野生型；wt)的AQdecay的順序(Alignment)WTMTSEQYSVKLTPDFDNPKWIGRHKHMFNFLDVNHNGRISLDEMVYKASDIVTNNLDECAYMTSEQYSVKLTPDFDNPKWIGRHKHMFNFLDVNHNGRISLDEMVYKASDIVINNLWTGATTEQAKRHKDAVEAFFGGAGMKYGVETEWPEFIEGWKRLASEELKRYSKNQITDECAYGATPEQAKRHKDAVEAFFGGAGMKYGVETEWPEYIEGWKRLASEELKRYSKNQITWTLIRLWGDALFDI1DKDQNGA1SLDEWKAFTKSDGIIQSSEDCEETFRVCDIDESGDECAYLIRLWGDALFDIIDKDQNGAISLDEWKAYTKSDGIICJSSEDCEETFRVCDIDESGWTQLDVDEMTRQHLGFWYTMDPACEKLYGGAVPDECAYQLDVDEMTOQHLGFWYTMDPACEKLYGGAVP實施例8在細菌中表達的AQdecay的動力學分坤斤為了動力學分析AQdecay的生物發(fā)光，用pET22b-AQdecay或者pET22b(沒有結(jié)合的cDNA)對大腸桿菌BL21(DE3)進行轉(zhuǎn)化。如實施例3所述進行細菌的繁殖和斷裂。利用l秒鐘的累積時間，將測量數(shù)據(jù)收集60秒的時間。圖4顯示了AQdecay在細菌中的動力學分析結(jié)果。實施例9在CHO細胞中表達的AQdecay的動力學分析為了動力學分析AQdecay的生物發(fā)光，用pcDNA3-AQdecay或者pcDNA3(沒有結(jié)合的cDNA)對CHO(中國倉鼠卵巢細J包)細胞進行短暫轉(zhuǎn)染。如實施例4所示進行轉(zhuǎn)染和測量。利用l秒鐘的累積時間，將測量數(shù)據(jù)收集60秒的時間。圖5顯示了AQdecay在CHO細胞中的動力學分析結(jié)果。實施例10在多路化試驗中使用AQdecay發(fā)光蛋白Aqdecay適于在多路化讀出方法用作組分，在多路化讀出方法中將多種報導基因(例如熒光素酶或者發(fā)光蛋白)用于試驗混合物中。對此，將AQdecay表達的CHO細胞以1:1(或者1:2，1:3,...)的比例與表達野生型水母發(fā)光蛋白的CHO細胞混合。表達野生型水母發(fā)光蛋白的細胞另外表達G蛋白偶聯(lián)受體(例如神經(jīng)介肽U受體2)。將細胞混合物置于96-孔、384-孔或者1536-孔微滴定板上，然后在37。C下將其培養(yǎng)24小時。然后，用腔腸對細胞進行負載(如實施例4所示)。加入G蛋白受體激動劑導致鈣在胞內(nèi)釋放，該釋放可以利用野生型水母發(fā)光蛋白讀出(通過野生型水母發(fā)光蛋白進行的光釋放)。第二細胞類型的AQdecay可以通過隨后加入活化CHO內(nèi)源性受體的激動劑(例如ATP)得到活化。實施例11在細胞器或者隔室中定位AQdecay為了運送入或者定位于特定細胞小室或者細胞器中，發(fā)光蛋白AQdecay或者其等價物適于與肽、前導序列、易位信號、蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)片段融合。為了運送和隨后進行定位，使發(fā)光蛋白AQdecay，根據(jù)本發(fā)明的發(fā)光蛋白與月大MSVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSLPPEGKL融合。AQdecay氨基酸序列上游肽的融合導致融合蛋白質(zhì)移位入真核宿主細胞的線粒體內(nèi)。線粒體定位的發(fā)光蛋白AQdecay可以用于測量線粒體內(nèi)的鈣濃度。借助于分子生物學標準方法，AQdecay發(fā)光蛋白的氨基酸序列上游的所述肽的融合可以在核酸水平上得到實現(xiàn)。參考文獻/專利US6,495,355US5,541,309US5,093,240US-0卯8卯9US6,152,358JP-0176125GB-0024357WO03006497WO200168824AJa邁J，CookJL.Reportergenes:applicationtothestudyofmammaliangenetranscription.爿加/5i'ocA亂1990Augl;188(2):245-54Ahschul，StephenF.'ThomasLMadden,AlejandroA.SchMfer，JinghuiZhang,ZhengZhang，WebbMiller,和DavidJ-Lipman(1997);GappedBLASTandPSI-BLAST:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms;Muc/ei'cias.25:3389-3402ChiesaA，RapLzziE,ToselloV，PintonP，deVirgilioM，F(xiàn)ogartyKE，Ri2zut0R.Recombinantaequorinandgreenfluorescentproteinasvaluabletoolsinthestudyofcellsignalling,5i'oc/ie)71J2,Aprl^CPtiym-Claros,M-G.，Vincens，P.(1996);Computationalmethodtopredictmitochondriallyimportedproteinsandtheirtargetingseqeunces.五ur.Bioc力ewj241，779-786.CulleiiBryanR.,MalimMichaelH.，Secretedplacentalalkalinephosphataseasaeukaryoticreportergene.Afe/Aody五"^y柳/c^.216:362ffFaganTF，OhmiyaY,BlinksJR，InouyeS，TsujiFI.Cloning,expressionandsequenceanalysisofeDNAfortheCa(2+)-bindingphotoprotein,mitrocomin.i^5iS丄e〃.1993Novl;333(3):301-5Hastings,J.W.禾口iMorin,J.G.(1969)Comparativebiochemistryofcalcium-activatedphotoproteinsfromthectenophore,Af"柳io戸'sandthecoelenteratesv4叫worefl,Obe/i'a,andHaddockSH，RiversTJ,RobisonBH.CancoelenteratesmakecoelenterazineDietaryrequirementforluciferinincnidarianbioluminescence.尸rocMi///4cadt/5^2001Sep25;98(20):11148-51InouyeS,TsujiFI.(1994)Aequoreagreenfluorescentprotein.Expressionofthegeneandfluorescencecharacteristicsoftherecombinantprotein.FjEAS丄e〃1994Mar21;341(2-3):277-80InouyeS，TsujiFI.CloningandsequenceanalysisofcDNAfortheCa(2+)-activatedphotoprotein,clytin./^AS丄e".1993Jan11;315(3):343-6.IUarionovBA,BondarVS,Illario加vaVA>VysotskiES.SequenceofthecDNAencodingtheCa(2+)-activatedphotoproteinobdinfromthehydroidpolypObelialongissima.Ce"e.1995Feb14;153(2):273"4.JonesK，迅bbertF,KeenanM.Glowingjellyfish,luminescenceandamoleculecalledcoelenterazine.7h幼必AofecA/io/1999Dec;I7(12):477-81Johnson,F丑，Shimomura,O.，Saiga,Y.，Gershman，LC,，Reynolds,G.T,，andWaters,J.R.(1962)QuantumefficiencyofC^prW加luminescence,withanoteonthatofAequorea.乂CW/.Comp.尸/i少w'o/.(W,85-103.Morin，J,G.和Hastings,J.W.(1971)Biochemistryofthebioluminescenceofcolonialhydroidsandothercoelenterates./Ce〃./Vi^yWo/.77,305-311.OhmjyaY，TsujiFI.BioluminescenceoftheCa(2+)-bindingphotoprotein,aequorin，afterhistidinemodification.尸五aSZe".1993Apr12;320(3):267-70,PhillipsGN.Structureanddynamicsofgreenfluorescentprotein.Cw;riS/rwc/5〖o/.1997Dec;7(6):821-7Sa瓜brook，J,，F(xiàn)ritsch，E.Maniatis，T，1989，Molecularcloning.AlaboratorymanualVol1-3,CoWi5/7"gi/^or,NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPressShimo邁uraO,JohnsonFH,Propertiesofthebioluminescentproteinaequorin.5foc力e加'W;y.1969Oct;8(10):3991-7ShimomuraO,，Bioluminescenceinthesea:photoproteinsystems.辦wpiSoc￡印1985;39:351-72Shimomura,O.詳口TeranishiIC(2000)Z^/mwescertce15，51-58.ShimomuraO.Isolationandpropertiesofvariousmolecularformsofaequorin.1986Marl;234(2):271-7.Shimomura，0.和Johnson,FJBL(1966)in:BioluminescenceinProgress(Johnson，F(xiàn).H.andHaneda，Y.,Eds.)pp,496~521,PrincetonUniversityPress,Princeton,NJ,ShresthaS,PaengER,DeoSK，DaunertS,Cysteine-freemutantofaequorinasaphotolabelinimmunoassaydevelopment.5wco/y'"gCTie加.2002Mar-Apr;13(2):269-75SnowdovvneKW，BorleAB.Measurementofcytosoicfreecalciuminmammaliancelswithaequorin.J加J尸A;w'o/.1984Nov;247(5Pt1):C396408.VysotskiES，LiuZJ，MarkovaSV,BlinksJR,DengL，F(xiàn)rankLA,HerkoM，MalikovaNP,RoseJP,WangBC，LeeLVioletbioluminescenceandfastkineticsfromW92Fobelin:structure-basedproposalsforthebioluminescencetriggeringandtheidentificationoftheemittingspecies.腸cAe加勿.2003May27;42(20):6013-24.Ward,W*W*(1998)Biochemicalandphysicalpropertiesofgreenfluorescentprotein.In:Gree"尸/womce"/戶roW":戶ro;er〃ey,^p//zc。"o/w,fl/irfiVo/ocoA(Chalfie,M.andKain，S.,eds)pp.45-70.Wiley-Liss,Inc.YangTe-Tuan，SinaiParisa，KittsPaulA.KainSevenR，Quantificationofgeneexpresssionwithasecretedalkalinephosphatasereportersystem.5w"c/in!'gwe，199723(6)1110ff權利要求1.核酸分子或者其功能片段，其選自a)編碼包含由SEQIDNO2揭示的氨基酸序列的多肽的核酸分子；b)含有SEQIDNO1所表明的序列的核酸分子；c)在嚴格條件下，其互補鏈與a)或者b)的核酸分子雜交并且其表達產(chǎn)物表現(xiàn)出發(fā)光蛋白的生物功能的核酸分子；d)由于遺傳密碼的退化而不同于c)中記載的核酸分子。2、多肽或者其功能片段，其通過根據(jù)權利要求1的核酸序列進行編碼并且具有發(fā)光蛋白的性能。3、發(fā)光蛋白或者其功能片段，基于SEQIDNO:7，其在129至1494、發(fā)光蛋白或者其功能片段，基于SEQIDNO:7，其在139位具有5、核酸分子，其包含編碼根據(jù)權利要求3和4的蛋白的序列。6、根據(jù)權利要求1或5的核酸，其含有功能啟動子5'至編碼序列。7、重組DNA或者RNA媒介物，其含有根據(jù)權利要求6的核酸。8、有機體，其包含根據(jù)權利要求7的媒介物。9、低聚核苷酸，其具有多于10個與根據(jù)權利要求1或5的核酸分子的結(jié)構序列等同或者互補的連續(xù)核苦酸。10、在細菌、真核細胞或者體外表達系統(tǒng)中表達根據(jù)權利要求2、3或者4的多肽的方法。11、純化/分離已經(jīng)根據(jù)權利要求IO表達的發(fā)光蛋白多肽的方法。12、根據(jù)權利要求1或5的核酸作為標記基因或者報導基因的用途。13、根據(jù)權利要求1或5的核酸作為標記基因或者報導基因聯(lián)合其它報導基因的用途。14、制備發(fā)光蛋白的方法，其特征在于，將一個或者多個突變體引入到基于SEQIDNO:7的137至141位限定的區(qū)域內(nèi)的發(fā)光蛋白中，由此導致生物發(fā)光隨時間改變而改變。15、發(fā)光蛋白，其根據(jù)權利要求14的方法制備。16、根據(jù)權利要求2、3、4或者15的發(fā)光蛋白作為標記或者指示器的用途。17、根據(jù)權利要求2、3、4或者15的發(fā)光蛋白作為標記或者指示器聯(lián)合其它報導基因的用途。18、發(fā)光蛋白水母發(fā)光蛋白的變體，其表現(xiàn)出隨時間改變而改變的生物發(fā)光。全文摘要本發(fā)明涉及發(fā)光蛋白AQdecay，其核苷酸序列和氨基酸序列，以及發(fā)光蛋白Aqdecay的活性和用途。文檔編號C07K14/435GK101223188SQ200680025508公開日2008年7月16日申請日期2006年5月3日優(yōu)先權日2005年5月13日發(fā)明者E·維索特斯基,G·A·斯特彭尤克,L·弗蘭克,S·戈爾茨,S·馬科瓦申請人:拜耳醫(yī)藥保健股份公司