專利名稱：：低pH充氣產(chǎn)品的制作方法<氐pH充氣產(chǎn)品發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及包含疏水蛋白的低pH充氣組合物如食品。發(fā)明背景有多種食品含有引入的氣體，如空氣、氮?dú)夂?或二氧化碳。通常，充氣食品往往處在相對(duì)中性pH—大約pH6.0-7.5。這種產(chǎn)品的實(shí)例包括冰洪淋、裱花料(whippedtopping)、摜奶油(whippedcream)。大多數(shù)充氣食品包含蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)對(duì)于氣泡的摻入和及其之后的穩(wěn)定性至關(guān)重要。但是，乳蛋白質(zhì)尤其趨向于對(duì)pH敏感。也就是說，它們的電荷、相互作用和構(gòu)象可隨pH而變。這會(huì)不利影響蛋白質(zhì)的氣泡能力和用蛋白質(zhì)所產(chǎn)生的泡沫的穩(wěn)定性,特別是對(duì)于pH5.4和更低的充氣產(chǎn)品。這是因?yàn)殡S著pH的下降，許多蛋白質(zhì)的表面活性和溶解性都減少。例如，酪蛋白酸鈉在約4.6-4.8下會(huì)發(fā)生沉淀。這導(dǎo)致空氣摻入差，致使充氣產(chǎn)品不穩(wěn)定。這個(gè)事實(shí)在文獻(xiàn)中已有詳盡描述，要在低pH下產(chǎn)生穩(wěn)定的泡沫是一個(gè)公知的難題。但是，盡管本領(lǐng)域提到促進(jìn)在低pH下形成充氣食品的途徑，但這些途徑往往有限制。本發(fā)明克服了這些限制。例如，往往加入明膠作為穩(wěn)定劑，在使產(chǎn)品增稠的同時(shí)也有助于空氣穩(wěn)定性。大多數(shù)"奶油凍(mousse)"產(chǎn)品都利用到明膠的好處。但是，明膠是動(dòng)物源性穩(wěn)定劑，許多消費(fèi)者并不認(rèn)為是合適的成份。此外，使用明膠通常意味著產(chǎn)品會(huì)發(fā)生"凝固，，，也即不會(huì)流動(dòng)。這意味著可用這種配方技術(shù)制造的產(chǎn)品的類型有限。其它方法利用了其它的化學(xué)乳化劑體系如蔗糖酯和/或飽和脂肪酸的單/二甘油酯的變體(variant)。盡管這些非乳基配方技術(shù)會(huì)在的pH下形成可充氣產(chǎn)品，但往往需要大量的乳化劑才能得到長期穩(wěn)定性(超過3個(gè)星期)。這對(duì)口味和質(zhì)地都會(huì)產(chǎn)生不適宜的影響。此外，食品中大量的化學(xué)乳化劑對(duì)消費(fèi)者來說是不可接受的。理想的是，合適的充氣劑會(huì)對(duì)pH不敏感(就其起泡行為而言)，在低濃度下具功能性以使對(duì)口味和質(zhì)地的不適宜影響不明顯，且可用來形成在冷卻或環(huán)境溫度下泡沫穩(wěn)定超過3個(gè)星期的充氣食品。發(fā)明概述在我們共同待審申請(qǐng)WO06/010425中，我們已確認(rèn)被稱為疏水蛋白的真菌蛋白質(zhì)在使充氣食品穩(wěn)定化方面高度有效。我們現(xiàn)在出乎意料地發(fā)現(xiàn)，可將低濃度的疏水蛋白(<0.5wt.%)與酸形成低pH溶液，該溶液容易起泡，在冷卻和環(huán)境溫度下會(huì)形成穩(wěn)定超過3個(gè)星期的泡沫。由于疏水蛋白不會(huì)導(dǎo)致連續(xù)相的凝膠化或者不導(dǎo)致不適宜的口中質(zhì)地，這意味著不管連續(xù)相流變性如何都可在低pH下制得穩(wěn)定的泡沫。因此，充氣產(chǎn)品類型機(jī)會(huì)(opportunity)很寬，例如有充氣酸性冰沙(smoothie)和充氣茶飲料。這些機(jī)會(huì)并不限于食品，也可適用于具有的pH的其它充氣組合物。因此，本發(fā)明提供pH低于5.5的充氣組合物，所述組合物包含疏水蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，疏水蛋白為基本上分離形式。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，疏水蛋白以至少0.001wt%、更優(yōu)選至少0.01wt。/。的量存在。優(yōu)選疏水蛋白是II類疏水蛋白。本發(fā)明還提供疏水蛋白在抑制pH低于5.5的充氣組合物中的氣泡粗化的方法中的用途。在一個(gè)相關(guān)方面，本發(fā)明提供抑制pH低于5.5的充氣組合物中的氣泡粗化的方法，所述方法包括在組合物的充氣之前和/或充氣過程中將疏水蛋白加入到組合物中。本發(fā)明還提供疏水蛋白在使pH低于5.5的充氣組合物中的泡沫穩(wěn)定化的方法中的用途。在一個(gè)相關(guān)方面，本發(fā)明提供使pH低于5.5的充氣組合物中的泡沫穩(wěn)定化的方法，所述方法包括在組合物的充氣之前和/或充氣過程中將疏水蛋白加入到組合物中。發(fā)明詳述除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本領(lǐng)域(如冷卻甜食/冷凍甜食制造、化學(xué)和生物
技術(shù)領(lǐng)域：
)普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。冷卻/冷凍甜食制造中使用的各種術(shù)語和技術(shù)的定義和描述見于IceCream，第4版，Arbuckle(1986),VanNostrandReinholdCompany,NewYork,NY。用于分子和生化方法的標(biāo)準(zhǔn)纟支術(shù)可見于Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第3版(2001)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.禾口Ausubel等，ShortProtocolsinMolecularBiology(1999)第4版，JohnWiley&Sons,Inc.,完全版本名為CurrentProtocolsinMolecularBiology)。疏水蛋白是定義明確的一類蛋白質(zhì)(Wessels,1997,Adv.Microb.Physio.38:1-45;Wosten,2001，AnnuRev.Microbiol.55:625-646)，能夠在疏水/親水界面自裝配，具有以下保守序列Xn-C-X5—9-C-C-Xu_39-C-X8.23-C-X5.9-C-C-X6.18-C-Xm(SEQIDNo.l)其中X代表任何氨基酸，n和m獨(dú)立代表整數(shù)。通常，疏水蛋白的長度最多達(dá)125個(gè)氨基酸。保守序列中的半胱氨酸殘基(C)是二硫鍵的一部分。在本發(fā)明情形中，術(shù)語疏水蛋白具有更寬的含義，包括仍顯示在疏水-親水界面自裝配產(chǎn)生蛋白質(zhì)膜這樣的特性的功能上等價(jià)的蛋白質(zhì)，如包含以下序列或其部分的、仍顯示在疏水-親水界面自裝配產(chǎn)生蛋白質(zhì)膜這樣的特性的蛋白質(zhì)Xn-C-Xb5(rC-Xo-5_C-Xi.ioo-C-Xi—100一C畫Xi.50-C-Xo.5—C-Xi—50隱C-Xm(SEQIDNo.2)按照本發(fā)明的定義，自裝配可通過將蛋白質(zhì)吸附到特氟隆(Teflon)上，并用圓二色性確定二級(jí)結(jié)構(gòu)(一般是a-螺旋)的存在來檢測(cè)(DeVocht等，1998,Biophys.J.74:2059-68)。膜的形成可通過將特氟隆薄片(sheet)在蛋白質(zhì)溶液中溫育，然后用水或緩沖液至少洗滌三次來確定(Wosten等，1994,Embo.J.13:5848-54)。蛋白質(zhì)膜可用任何合適的方法來顯現(xiàn)，如用熒光標(biāo)志進(jìn)行標(biāo)記，或者使用熒光抗體，這在本領(lǐng)域是已經(jīng)確立的。m和n的數(shù)值通常在0-2000的范圍，但更通常是m和n加起來小于100或200。在本發(fā)明情形中，疏水蛋白的定義包括疏水蛋白和另一種多肽的融和蛋白以及疏水蛋白與其他分子如多糖的綴合物。目前為止得到鑒定的疏水蛋白一般可歸類為I類或II類疏水蛋白。這兩種類型的疏水蛋白在真菌中已被鑒定為分泌蛋白，其可在疏水—親水界面自裝配成兩性膜。I類疏水蛋白的裝配物相對(duì)不可溶，而II類疏水蛋白的裝配物則容易溶解于各種溶劑中。還在絲狀纟田菌如放線菌(jcd朋w^cetesp.)和鏈霉菌(5Veptomyc&ssp.)中鑒定出疏水蛋白樣蛋白質(zhì)(WOO1/74864)。這些細(xì)菌蛋白質(zhì)與真菌疏水蛋白相比，只能最多形成一個(gè)二石克鍵，因?yàn)樗鼈冎挥袃蓚€(gè)半胱氨酸殘基。這種蛋白質(zhì)是具有SEQIDNo.1和2所示共有序列的疏水蛋白功能等價(jià)物的實(shí)例，落入本發(fā)明的范圍之內(nèi)?？捎萌魏魏线m的方法從天然來源如絲狀真菌提取獲得疏水蛋白。例如，可通過培養(yǎng)能將疏水蛋白分泌到增長培養(yǎng)基中的絲狀真菌，或者通過用60%乙醇從真菌菌絲體提取，來獲得疏水蛋白。特別優(yōu)選從能天然分泌疏水蛋白的宿主生物分離疏水蛋白。優(yōu)選的宿主是絲孢菌(例如木霉屬)、擔(dān)子菌和子嚢菌。特別優(yōu)選的宿主是食品級(jí)生物，如能分另'J稱為cryparin的疏水蛋白的栗疫病菌(CV7p/20"ecWaparasWca)(MacCabe和VanAlfen,1999,App.Environ.Microbiol65:5431-5435)?；蛘撸捎弥亟M技術(shù)獲得疏水蛋白。例如可對(duì)宿主細(xì)胞(通常是微生物)進(jìn)行修飾以表達(dá)疏水蛋白，然后疏水蛋白可根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行分離和使用。用以將編碼疏水蛋白的核酸構(gòu)建物引入到宿主細(xì)胞中的方法是本領(lǐng)域公知的。已經(jīng)克隆了超過34個(gè)編碼疏水蛋白的基因，這些基因來自16種以上的真菌(參見例如W096/41882,該專利給出了在雙孢蘑菇04gahcM6&;7oruy)中鑒定出的疏水蛋白的序列；和Wosten,2001,AnnuRev.Microbiol.55:625-646)。也可以用重組技術(shù)來修飾疏水蛋白序列或者合成具有需要的/改進(jìn)的特性的新型疏水蛋白。通常，用編碼所需的疏水蛋白的核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞或生物?？蓪⒕幋a所述多肽的核苷酸序列插入到編碼轉(zhuǎn)錄和翻譯的必需元件的合適表達(dá)載體中，插入的方式要使得所述核香酸序列在適當(dāng)條件下會(huì)被表達(dá)(例如在適當(dāng)?shù)姆较蛏虾驼_的讀框中，有適合的革巴向和表達(dá)序列)。構(gòu)建這些表達(dá)載體所需的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。有多種表達(dá)系統(tǒng)可用來表達(dá)多肽編碼序列。這些表達(dá)系統(tǒng)包括但不限于細(xì)菌、真菌(包括酵母)、昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)、植物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和植物，它們都用用適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體轉(zhuǎn)化。優(yōu)選的宿主是被認(rèn)為是食品級(jí)——^H人為安全(GRAS)的宿主。合適的真菌包括酵母如(但不限于)酵母菌屬(&cc/2"rawyce力、(K/《yvera^yce力、畢赤氏酵母屬(尸/c/n'a)、漢遜酵母屬(/forae"w&)、fl絲酵母屬(Om^^0、裂殖酵母屬OSc/^o^cc/zarom;;cM)等屬酵母和絲狀真菌如(但不限于)曲霉屬04^^^///"力、木霉屬(7Wc/2o&mw)、毛霉屬(Mwcw)、鏈孢霉屬(A^wro^ora)、鐮刀菌屬OF^an'ww)等屬絲狀真菌。編碼疏水蛋白的序列優(yōu)選在氨基酸水平上與在自然界鑒定的疏水蛋白有至少80°/。的同一性，更優(yōu)選有至少95%或100%的同一性。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可作出不降低疏水蛋白的生物活性的保守置換或其他氨基酸變化。出于本發(fā)明的目的，這些擁有這一與天然出現(xiàn)疏水蛋白的高水平同一性的疏水蛋白，也包括在"疏水蛋白"這一術(shù)語當(dāng)中。疏水蛋白可例如按WO01/57076描述的程序從培養(yǎng)基或細(xì)胞提取物中純化，所述程序涉及將存在于含疏水蛋白的溶液中的疏水蛋白吸附到表面上，然后將該表面與表面活性劑如Tween20接觸，以從該表面洗脫出疏水蛋白。另參見Collen等，2002,BiochimBiophysActa.1569:139-50;Calonje等，2002，Can.J.Microbiol.48:1030-4;Askolin等，2001,ApplMicrobiolBiotechnol.57:124-30和DeVries等，1999,EurJBiochem.262:377-85。充氣低pH組合物術(shù)語"低pH組合物"是指在產(chǎn)品壽命期的一部分或整個(gè)壽命期內(nèi)其水相pH低于5.5的任何組合物。優(yōu)選該pH低于5.4、低于5.2或低于5.0。通常，該pH等于或大于l.O，優(yōu)選3.0或以上，如4.0或以上。通常，對(duì)于充氣食品，j氐pH產(chǎn)品會(huì)顯示3.0-5.4的pH。術(shù)語"充氣"指已例如通過機(jī)械手段有意地將氣體引入到了產(chǎn)品中。氣體可以是任何氣體，但優(yōu)選是食品級(jí)氣體如空氣、氮?dú)饣蚨趸?，特別是在食品的情形中。充氣程度通常以"膨脹度，，來定義。在本發(fā)明的情形中，％膨脹度按體積定義為((充氣終產(chǎn)品的體積-混合料的體積)/混合料的體積)X100產(chǎn)品的膨脹度須根據(jù)所需的產(chǎn)品特性而變。例如，冷凍酸乳酪(yoghurt)的膨脹度水平通常是約70-100%,甜食如奶油凍的膨脹度可高達(dá)200-250wt%。一些冷卻產(chǎn)品、常溫產(chǎn)品和熱產(chǎn)品的膨脹度水平可能較低，但通常也超過10%,例如奶昔(milkshake)的膨脹度水平通常為10-40wt%。其它產(chǎn)品的膨脹度水平優(yōu)選為100-800%。泡沫在產(chǎn)品中并不需要是均勻的。盡管如此，在一個(gè)實(shí)施方案中，泡沫基本上是均勻的。本發(fā)明的充氣組合物包括充氣食品。其它的組合物包括在低pH連續(xù)相中需要有能在所需的產(chǎn)品使用時(shí)內(nèi)保持該相穩(wěn)定性的泡沫的那些組合物。優(yōu)選本發(fā)明充氣組合物在至少3個(gè)星期的時(shí)間后能保持其原始空氣相體積的至少50%(通常在冷卻溫度(約5。C)下保藏后測(cè)量)。膨脹度不要求在整個(gè)產(chǎn)品當(dāng)中均勻分散。優(yōu)選地，組合物中的平均氣泡直徑在3個(gè)星期的時(shí)間后與氣泡在時(shí)間t=O初次制備時(shí)的平均大小相比不會(huì)有明顯變化(通常在冷卻溫度(約5。C)下保藏后測(cè)量)。優(yōu)選地，在3個(gè)星期時(shí)間后相對(duì)平均氣泡直徑(d》的變化小于2.5倍，更優(yōu)選小于2倍。時(shí)間=1時(shí)的相對(duì)氣泡直徑(d》如在實(shí)施例中按以下方程確定式中do為制備后當(dāng)時(shí)即t-O時(shí)的平均直徑，dt為時(shí)間二t時(shí)的平均氣泡直徑。測(cè)量氣泡大小和泡沫體積的變化的合適方法是用光散射技術(shù)進(jìn)行?？煞奖愕厥褂肨urbiscanTlab測(cè)量系統(tǒng)(Formulaction,法國)，該系統(tǒng)能同時(shí)分析目的充氣樣品的反向散射光和透射光。將待分析泡沫裝入圓柱形樣品池(例如直徑25mm,充入20ml泡沫)。用波長=880nm的光源供應(yīng)入射光，兩個(gè)光學(xué)傳感器接受透過樣品的光線(與入射光成180。)和從樣品反向散射的光線((與入射光成45°)。在掃描模式下，光學(xué)傳感器掃描試管的高度，獲得作為樣品高度和時(shí)間的函數(shù)的透射和反向散射數(shù)據(jù)。由此可對(duì)遷移現(xiàn)象(如乳油化(creaming))和顆粒大小(如氣泡大小)變化進(jìn)行一段時(shí)間的監(jiān)測(cè)。Turbiscan測(cè)量系統(tǒng)的卩吏用的相關(guān)理i侖和實(shí)例可見于Mengualetal.，ColloidsandSurfacesA,1999，152,112-123;Rouimietal.,FoodHydrocolloids,2005,19,467-478;另可從廠商網(wǎng)站www.turbiscan.com獲得應(yīng)用說明和有用信息。在實(shí)驗(yàn)上，由反向散射光通過一定面積的沒有發(fā)生其它變化(如泡沫崩潰或氣泡乳油化)的樣品時(shí)的變化情況來觀察平均氣泡大小變化最好。這里，我們使用了泡沫的中部面積。反向散射水平(BS)與通過泡沫的光子傳輸平均自由程P有以下關(guān)系<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>X*與氣體體積分?jǐn)?shù)cp和氣泡平均直徑d有以下關(guān)系<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>Q和g均為Mie理論的光學(xué)參數(shù)，其中Q為散射效率因子，g為不對(duì)稱因子。對(duì)于空氣的體積分?jǐn)?shù)已知的泡沫，可對(duì)平均氣泡直徑的變化進(jìn)行歷時(shí)監(jiān)測(cè)。這通過Turbiscan軟件進(jìn)行自動(dòng)計(jì)算?？梢允褂玫木_測(cè)量參數(shù)在實(shí)施例中規(guī)定。泡沫穩(wěn)定性(泡沫體積與時(shí)間的函數(shù)關(guān)系)和乳油化程度也可通過目測(cè)方法來確定，即觀察取樣到量筒中的泡沫中的這些現(xiàn)象。乳油化(因空氣氣泡的浮力所致)是一種導(dǎo)致容器中發(fā)生垂直相分離，致使大部分的氣泡靠近上部表面而底部則氣泡竭盡的過程。本發(fā)明的充氣食品通常落入以下四種類別之一熱的、常溫的(即產(chǎn)品在室溫下保藏和/或提供而無需冷藏/水凍)、冷卻的或水凍的。術(shù)語"食品，，包括飲料。冷卻充氣食品包括水沙和茶葉。冷凍充氣食品包括冷凍糖食如冷凍酸乳酪(yoghurt)。用于本發(fā)明低pH食品的合適的酸包括但不限于抗壞血酸、檸檬酸、乳酸、酒石酸、>暖酸、琥珀酸、蘋果酸、葡糖酸和它們的混合物。食品可任選含有其它成分，如一種或多種以下成分其它的蛋白質(zhì)如乳蛋白質(zhì)，可為純成分或?yàn)橐后w成分，例如奶或奶油；油或脂，主要以乳化相的形式出現(xiàn)；糖類；鹽類；著色劑和香料；化學(xué)乳化劑如單甘油酯；茶葉或咖啡；果泥或蔬菜泥/提取物/汁；穩(wěn)定劑或增稠劑如多糖；防腐劑；夾雜物(inclusion)如堅(jiān)果、水果、太妃糖。優(yōu)選地，本發(fā)明的食品不含明膠。本發(fā)明實(shí)施方案的一些具體實(shí)施例在下文給出。在一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)品是充氣飲料如奶昔、冰沙、碳S吏飲料、啤酒或茶葉，該產(chǎn)品在低pH下需要泡沫，且在其壽命期內(nèi)能保持穩(wěn)定性。在這種情況下，充氣產(chǎn)品的膨脹度可為5-300%，更優(yōu)選10-200%。氣體不要求均勻分散在整個(gè)產(chǎn)品當(dāng)中。在第二個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)品是充氣凝固產(chǎn)品如奶油凍、干酪餅(cheesecake)、果醬(jam)、裱花料或奶油(cream),該產(chǎn)品在低pH下需要泡沫，且在其壽命期內(nèi)能保持穩(wěn)定性。在這種情況下，優(yōu)選的膨脹度為50-400%。在第三個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)品是充氣冷凍甜點(diǎn)(dessert)如果汁冰糕(sorbet)、水淇淋或冷凍酸乳酪，該產(chǎn)品在低pH下需要泡沫，且在其壽命期內(nèi)能保持穩(wěn)定性。優(yōu)選的膨脹度為50-300%。優(yōu)選充氣食品是充氣糖食產(chǎn)品。疏水蛋白在產(chǎn)品中的存在量通常須隨產(chǎn)品配方和空氣相體積而變。通常，產(chǎn)品須含有至少0.001wt。/。疏水蛋白，更優(yōu)選至少0.005或0.01wt%。通常，產(chǎn)品須含有1wt。/。以下的疏水蛋白。疏水蛋白可來自單一來源或多個(gè)來源，例如疏水蛋白可以是兩種或多種不同的疏水蛋白多肽的混合物。優(yōu)選疏水蛋白是II類疏水蛋白。本發(fā)明還涵括用以生產(chǎn)本發(fā)明充氣食品的組合物，所述組合物包含疏水蛋白。這種組合物包括液體預(yù)混合料，例如用以生產(chǎn)冷凍甜食的預(yù)混合料，和干混合料例如粉末料，其在充氣之前或充氣過程中加入含水液體如乳或水。用以生產(chǎn)本發(fā)明的冷凍食品的組合物除包含疏水蛋白外，還須包含食品中通常包括的其他成分，例如糖、脂肪、乳化劑、調(diào)味劑等。所述組合物可包含制作所述食品所需的所有其余成分，使得它準(zhǔn)備好可被加工(即充氣)形成本發(fā)明的充氣食品。用以生產(chǎn)本發(fā)明的充氣食品的干組合物除包含疏水蛋白外，還須包含食品中通常包括的其他成分，例如糖、脂肪、乳化劑、調(diào)味劑等。所述組合物可包含制作所述食品所需的所有其余非液體成分，使得使用者所要做的只是加入含水液體如水或乳，所述組合物就準(zhǔn)備好可被加工形成本發(fā)明的充氣食品。這些干組合物的實(shí)例包括粉末料和顆粒料，可被設(shè)計(jì)成供工業(yè)使用和零售使用，且得益于體積減少和貨架期延長。用以生產(chǎn)本發(fā)明充氣食品的組合物其pH通常須在5.5以下，或者在干組合物的情況下，當(dāng)加入水或乳將產(chǎn)品復(fù)水成其通常的最終形式時(shí)，能形成pH在5.5以下的組合物。所加入的疏水蛋白的形式和數(shù)量，要使得疏水蛋白能使空氣相穩(wěn)定。術(shù)語"加入"是指有意地將疏水蛋白引入到食品中，目的是利用它的泡沫穩(wěn)定特性。因此，對(duì)于存在或加入了含有真菌污染物的成分，而真菌污染物可能含有疏水蛋白多肽的情況，這并不等同于本發(fā)明情形當(dāng)中的加入疏水蛋白。通常，加入到產(chǎn)品中的疏水蛋白的形式是能夠在空氣-液體表面自裝配的形式。通常，疏水蛋白以分離形式加入的本發(fā)明的食品或組合物中，通常至少部分純化，如以固形物重量計(jì)至少10%純。所謂"以分離形式加入"是指疏水蛋白并不是作為天然表達(dá)疏水蛋白的天然生物如蘑菇的一部分來加入。相反，疏水蛋白通常須是從天然來源提取得到的，或者是通過在宿主生物中重組表達(dá)獲得的。在一個(gè)實(shí)施方案中，疏水蛋白以單體、二聚體和/或寡聚體(即由10個(gè)或10個(gè)以下的單體單位組成)形式加入到產(chǎn)品中。優(yōu)選至少50wt。/。的所加入疏水蛋白為至少一種這些形式，更優(yōu)選至少75、80、85或90wt。/。。疏水蛋白一旦加入，通常會(huì)在空氣/液體界面進(jìn)行自裝配，因此單體、二聚體和寡聚體的量預(yù)期會(huì)減少。在一個(gè)實(shí)施方案中，疏水蛋白以分離形式加入到本發(fā)明的充氣組合物中，通常至少部分上純化。所加入的疏水蛋白可用來使充氣食品中的氣相穩(wěn)定化，通常是通過抑制氣泡粗化來穩(wěn)定，即發(fā)現(xiàn)疏水蛋白不但能穩(wěn)定泡沫體積，而且能穩(wěn)定泡沫當(dāng)中的氣泡大小?，F(xiàn)將參考以下只是示例性而非限制性的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。附圖簡述圖1:平均氣泡直徑(相對(duì)于時(shí)間t=0時(shí)的平均氣泡直徑)與時(shí)間的函數(shù)關(guān)系。圖2:用0.1%HFBII和0.5%黃原膠在pH3.5和5.2下(分別為左圖和右圖)產(chǎn)生并在5。C下保藏3個(gè)星期的泡沫。在這個(gè)時(shí)間后，沒有發(fā)生泡沫體積損失或出現(xiàn)可見的氣泡增長。圖3:在pH3.5下產(chǎn)生的含有0.5%黃原膠及(左)0.1%HFBII-3個(gè)星期保藏、(中)1.5%LACTEM-2個(gè)星期保藏和(右)0.5%hyfoama-3個(gè)星期保藏的泡沫。所有泡沫均在5。C下保藏。圖4:在pH3.5下產(chǎn)生的含有0.5%黃原膠及(左)0.1%HFBII-3個(gè)星期保藏、(右)1.5%LACTEM-2個(gè)星期保藏的泡沫的近拍圖(closeuppicture)。注意，含HFBII的實(shí)施例所顯示的泡沫沒有可見氣泡，而含LACTEM的實(shí)施例顯示出在保藏過程中增長的可見氣泡。圖5:含泡沫綠茶葉的平均氣泡直徑(相對(duì)于時(shí)間t=0時(shí)的平均氣泡直徑)與時(shí)間的函數(shù)關(guān)系。圖6:用0.2%hygel和0.1%HFBII產(chǎn)生的果汁水糕(兩者均分新制的和溫度過度處理(temperatureabuse)后的)的顯微結(jié)構(gòu)的SEM圖像。圖7:用0.2。/。hygel和0.1。/。HFBn產(chǎn)生的果汁水糕在溫度過度處理后的顯微結(jié)構(gòu)的更高倍SEM圖像。圖8:用0.2%hygel和0.1%HFBII產(chǎn)生的果汁冰糕在2個(gè)星期溫度過度處理后的照片。圖9:含0.1%HFBII和0.41%黃原膠的新制(左)和5。C下保藏3個(gè)星期后(右)的充氣水果水沙產(chǎn)品的照片，產(chǎn)品顯示極少的乳油化或氣泡增長。圖10:含0.1。/。HFBI1和0.25。/。黃原膠的新制(左)和5。C下保藏3個(gè)星期后(右)的充氣酸辣醬油(vinaigrette)產(chǎn)品的照片，產(chǎn)品顯示極少的乳油化或氣泡增長。實(shí)施例1:充氣低pH產(chǎn)品制備包含含酸、黃原膠和下列三種充氣劑(A-C)之一的溶液的充氣產(chǎn)品。A:HyfoamaDSB:乳酸單甘油酉旨(GrinstedLactemP22,LACTEM)C:里氏木霉(TWc/20&rma廠ee"0疏水蛋白(HFBII)(HFBII獲自芬蘭VTTBiotechnology公司，基本上按WOOO/58342和Linder等，2001,Biomacromolecules2:511-517的描述從里氏木霉純化得到)。所用材料的說明在表l中匯總，制備每種泡沫樣品所用的配方在表2中顯示(混合料A-C)。將黃原膠加入到每種混合料中以防止泡沫發(fā)生乳油化。這使得可以對(duì)氣泡大小與時(shí)間的函數(shù)關(guān)系作出完全的分析，而不受其它失穩(wěn)因素如乳油化的擾亂。換句話說，我們測(cè)量的是泡沫對(duì)諸如不均衡(disproportionation)禾口)疑聚(coalescence)的失穩(wěn)、才幾制的穩(wěn)、定斗生?；旌狭现苽鋵?duì)于混合料A，將蛋白質(zhì)和黃原膠摻合在一起，慢慢加入到攪動(dòng)下的室溫水中。然后將所得溶液加熱到40。C,確保蛋白質(zhì)得到適當(dāng)溶解，總混合時(shí)間為30分鐘。將所得混合料冷卻，在5。C下保藏備用。對(duì)于混合料B，將Lactem和黃原膠分散到攪動(dòng)下的室溫水中。然后將此M液加熱到60°C,確保Lactem得到適當(dāng)分散，總混合時(shí)間為30分鐘。將所得混合料冷卻，在5。C下保藏備用。對(duì)于混合料C，將黃原膠在攪動(dòng)下慢慢加入到冷水中，攪拌至少30分鐘，確保黃原膠高分子得到完全水化。然后，將所需濃度的HFBII以等分試樣形式(asanaliquot)加入。然后將所得溶液在超聲浴中溫和超聲處理30秒鐘，以使HFBII完全溶解。將所得混合料冷卻，在5°C下保藏備用。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表l.所用材料<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表2.加酸前所用的基礎(chǔ)配方充氣過程充氣前，先將樣品溶液用10wt。/。檸檬酸溶液酸化至5.4或3.5的所需pH。這匯總于表3中。混合料/充氣產(chǎn)品pHAl(自混合料A)5.4A2(自混合料A)3,5Bl(自混合料B)5.4B2(自混合料B)3.5Cl(自混合料C)5.2C2(自混合料C)3'5表3:混合料加入檸檬酸后的pH取80mL的酸化混合料用攪拌罐裝置(stirredpotapparatus)剪切定時(shí)的一段時(shí)間，這段時(shí)間對(duì)應(yīng)于獲得100%膨脹度。這個(gè)裝置包括一內(nèi)高105mm、內(nèi)徑72mm的圓柱形垂直安裝帶夾套不銹鋼罐。用以剪切樣品的轉(zhuǎn)子為一矩形葉輪(impeller)，其大小恰好能使其在旋轉(zhuǎn)時(shí)刮擦罐的內(nèi)表面。還有兩個(gè)半圓形(直徑60mm)高剪切槳葉(blade)附接到該轉(zhuǎn)子，每個(gè)槳葉與該矩形葉輪裝置成45。角安裝。轉(zhuǎn)速為1200rpm，在充氣過程中將裝著轉(zhuǎn)子的該鋼罐冷卻到5°C。充氣后，將樣品在Turbiscan小瓶或100mL量筒中5。C保藏，以備作進(jìn)一步分析。泡沫及其中的氣泡的穩(wěn)定性用TurbiscanTlab進(jìn)行測(cè)量，上文說明了TurbiscanTlab的操作說明。這使得可以測(cè)量以下兩者與時(shí)間的函凄t關(guān)系(l)泡沫體積(即總空氣相損失的測(cè)量)，(2)平均氣泡大小。將所產(chǎn)生的泡沫投加到Turbiscan玻璃樣品管中直到高度達(dá)約42mm，這對(duì)應(yīng)于大約20mL的泡沫。然后設(shè)備掃描和測(cè)量高度2-55mm之間的反向散射光和透射光。進(jìn)行幾個(gè)星期時(shí)間的測(cè)量，具體時(shí)間取決于泡沫的穩(wěn)定性。由于數(shù)據(jù)是在整個(gè)樣品高度收集的，因此各確定界限(下限高度和上限高度)之間的反向散射曲線的平均值能給出關(guān)于該區(qū)域中的樣品變化的信息，例如氣泡大小。氣泡大小由20-30mm之間測(cè)量的反向散射數(shù)據(jù)，從反向散射光自動(dòng)計(jì)算出平均氣泡大小。折光指數(shù)當(dāng)作水和空氣的折光指數(shù)。泡沫的空氣相體積分?jǐn)?shù)為0.5(等于100%膨脹度)。盡管泡沫的空氣相體積分?jǐn)?shù)會(huì)隨時(shí)間變化，特別是如果泡沫不穩(wěn)定和有乳油化發(fā)生的話，但是我們發(fā)現(xiàn)在樣品的20-30mm高度之間進(jìn)行測(cè)量能得出可靠的大小數(shù)據(jù)，除非泡沫十分不穩(wěn)定。如果泡沫高度不穩(wěn)定，則其大小數(shù)據(jù)在定量意義上需要小心對(duì)待，但還是可以與其它泡沫的大小數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。結(jié)果和討論處定#與#/《W涵炎^,秀圖1顯示每種起泡混合料所測(cè)量到的平均氣泡大小(相對(duì)于t=0分鐘時(shí)測(cè)量到的平均氣泡大小)與時(shí)間的函數(shù)關(guān)系。在pH3.5和5.2，HFBII形成的泡沫其當(dāng)中的氣泡保持穩(wěn)定的時(shí)間遠(yuǎn)超過用Hyfoama或Lactem充氣所得的泡沫當(dāng)中的氣泡。用HFBII穩(wěn)定化的泡沫保持穩(wěn)定超過3個(gè)星期。用Hyfoama和Lactem產(chǎn)生的泡沫不但有顯著的氣泡增長，而且在它們短壽命期的較后階段出現(xiàn)崩潰(失去空氣相體積)。在HFBII的情況中，沒有測(cè)出產(chǎn)品有空氣相體積失去。圖2和3顯示用HFBII、Lactem或Hyfoama作為充氣劑產(chǎn)生的泡沫的圖像。圖2清楚顯示，用HFBII產(chǎn)生的泡沫在pH3.5和5.4下均高度穩(wěn)定。即使在3個(gè)星期保藏后，也不會(huì)觀察到泡沫崩潰或可見的氣泡增長。圖3和4同樣證明用HFBII產(chǎn)生的泡沫的穩(wěn)定性。用Lactem在pH3.4下產(chǎn)生的泡沫就保持空氣相體積而言顯示相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性，但從圖4中的顯示可見空氣氣泡的近拍圖清楚可見，有顯著的氣泡增長出現(xiàn)。在Hyfoama的情況中，不但出現(xiàn)了顯著的氣泡增長，而且空氣相體積也失去了。因此，顯然可用疏水蛋白在酸的存在下形成高度穩(wěn)定的泡沫。這些泡沫在冷卻下保持其空氣相體積超過3個(gè)星期的時(shí)間，且在這段時(shí)間中氣泡大小不會(huì)有顯著變化。實(shí)施例2:含茶葉提取物的充氣產(chǎn)品充氣產(chǎn)品的制備由以下配方制備出含茶葉提取物的混合料。0.1%HFBII、0.5%黃原膠、0.16%綠茶粉末，其余為水。如下制備混合料將黃原膠和綠茶粉末在攪動(dòng)下慢慢加入到冷水中，攪拌至少30分鐘，確保高分子物質(zhì)完全^f皮水化。然后，將所需濃度的HFBII以等分試樣形式加入。然后將所得溶液在超聲浴中溫和超聲處理30秒鐘，以使HFBII完全溶解。將所得混合料冷卻，在5。C下保藏備用。充氣前，先將該:容液用10wt。/。檸檬酸溶液酸化至所需的pH5.4。然后按對(duì)實(shí)施例1的混合料所述的相同方式，用攪拌罐將該混合料充氣至100%膨脹度。然后將充氣混合料在5°C下保藏，按實(shí)施例1中所述的相同實(shí)驗(yàn)配置，分析氣泡大小和泡沫體積與時(shí)間的函數(shù)關(guān)系。結(jié)果和討論圖5顯示以平均氣泡直徑表示的泡沫穩(wěn)定性。顯然，一段時(shí)間后氣泡大小極少變化，表明氣泡穩(wěn)定不會(huì)發(fā)生顯著變化。此外，在這段時(shí)間內(nèi)，總泡沫體積保持不變。實(shí)施例3:充氣和冷凍水果果汁冰糕用表4所列成分制備兩份果汁水糕。產(chǎn)品J用表5所示的混合料J的配方制備。這個(gè)產(chǎn)品中的空氣穩(wěn)定劑是稱為Hygel的市售充氣劑，為水解乳蛋白質(zhì)。產(chǎn)品K用所示的混合料K的配方制備。這個(gè)產(chǎn)品中的空氣穩(wěn)定劑是疏水蛋白HFBII。成分說明及供應(yīng)商蔗糖TateandLyleLF963DE玉米糖漿，C*Trusweet017Y4,Cerestar,英國黃原膠(KeltrolRD)CPKelco檸檬酸JungbunzlauerAG草莓果泥SVZInternationalBV疏水蛋白HFBII從里氏木霉純化得到，購自芬蘭VTTBiotechnologyHygel8293水解乳蛋白質(zhì)，最少80%蛋白質(zhì)，獲自KerryBioscience,英國表4.所用材料<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表5.配方齡弱務(wù)對(duì)于混合料J,將所有的成分加入到冷水中，用磁力攪拌器分散，在連續(xù)混合下加熱至80。C。用設(shè)定在-18。C的冷卻浴將所得溶液快速冷卻至5。C。對(duì)于包含疏水蛋白的混合料K，執(zhí)行相同的程序，除此之外還將HFBII以等分試樣形式加入到冷卻的溶液中。兩種混合料在5。C下保藏以備進(jìn)一步加工。未充氣混合料的pH經(jīng)測(cè)定為pH4。^氣和冷《#嚴(yán)將80mL的冷混合料轉(zhuǎn)移到攪拌罐(實(shí)施例1所述)中進(jìn)行充氣和冷凍。冷凍是通過使冷凍劑循環(huán)通過圍繞攪拌罐的夾套實(shí)現(xiàn)的。用以下剪切和溫度方案，將混合料充氣和冷凍產(chǎn)生果汁水糕產(chǎn)品100rpml分鐘，啟動(dòng)冷卻劑循環(huán)(-18。C),接著1000rpm2分鐘，然后300rpm，直到轉(zhuǎn)矩達(dá)到lNm(這在-5。C的產(chǎn)品溫度下出現(xiàn))。將所得果汁冰糕收集到已冷卻至-20。C以下的合適容器中。產(chǎn)品J的膨脹度經(jīng)測(cè)定為113%,產(chǎn)品K的膨脹度為1010/。。絲^C^《顛、理才襲隨后將果汁冰糕產(chǎn)品在兩種溫度方案下保藏(a)"新制，，樣品在-80。C下一直保藏至進(jìn)行分析為止(約1個(gè)星期)。在-80。C下，沒有出現(xiàn)結(jié)構(gòu)變化，因此顯孩t結(jié)構(gòu)基本上與新制產(chǎn)品相同。(b)"溫度過度處理"樣品在-10。C下保藏1個(gè)星期。一些樣品還在-10。C下再保藏一個(gè)星期。保藏后，通過掃描電鏡術(shù)(SEM)和通過對(duì)總體產(chǎn)品質(zhì)量的目測(cè)檢查，對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行分析。用低溫掃描電鏡術(shù)(SEM)顯示產(chǎn)品的顯微結(jié)構(gòu)。為制備電鏡樣本，將樣品在干冰上冷卻至-80。C,切取切片。該切片大小約為6mmx6mmx10mm,在正要》K凍的時(shí)"f矣(onthepointoffreezing)用TissueTek:OCTtm化合物(PVA11%、Carbowax5%和85。/。非反應(yīng)性成分)將其安放在樣品支持器上。將樣品連同支持器投入液氮泥(liquidnitrogenslush)中，轉(zhuǎn)移到保持在約IO-4mbar真空下的低溫制備室(OxfordInstrumentCT1500HF)。用手術(shù)刀片在制備室中將樣品破碎。然后將樣品升溫至-90。C保持約60-90秒鐘，使冰慢慢升華露出表面細(xì)節(jié)。然后將樣品冷卻至-110。C結(jié)束升華。接著，用氬等離子體給樣品包^皮上金。這個(gè)過程也在真空下進(jìn)行，所施加的壓力為10"mbar，電流為6毫安，持續(xù)45秒鐘。然后將樣品轉(zhuǎn)移到常規(guī)掃描電子顯微鏡(JSM5600)，該鏡裝有在-150。C溫度下的OxfordInstruments冷臺(tái)。將樣品照像，通過數(shù)字影像擷取軟件捕獲目的區(qū)域。結(jié)果圖6顯示本發(fā)明的產(chǎn)品J(左，比較產(chǎn)品)和產(chǎn)品K(右)的顯微結(jié)構(gòu)的SEM圖像。上方圖像顯示新制產(chǎn)品，下方圖像顯示溫度過度處理產(chǎn)品o新制產(chǎn)品具有類似的顯微結(jié)構(gòu)，空氣氣泡小，球形。但是，溫度過度處理后，比較產(chǎn)品J顯示有大的空氣通道，分立空氣胞(aircell)極少，表明已發(fā)生嚴(yán)重的氣泡凝聚。本發(fā)明的產(chǎn)品K(即含有疏水蛋白)顯示空氣相的凝聚和通道化要少得多，保留有大量的小分離氣泡。圖7更高倍顯示溫度過度處理樣品的顯微結(jié)構(gòu)。果汁冰糕K顯示有小空氣氣泡(直徑小于100^im)存在，而果汁水糕J卻沒有。圖8顯示比較果汁水糕產(chǎn)品(J)和包含疏水蛋白的杲汁冰糕產(chǎn)品(K)在溫度過度處理2個(gè)星期后的照片。果汁冰糕J比果汁水糕K更深色，因?yàn)闃悠分械臍馀荽笮≡龃蟆４送?，果汁水糕J因空氣的失去造成體積降低，而果汁水糕K則沒有。從這些圖像可見，含疏水蛋白的低pH果汁冰糕(K)比含標(biāo)準(zhǔn)的穩(wěn)定空氣用乳蛋白質(zhì)(airstabilisingmilkprotein)的比較果汁水糕(J)具有穩(wěn)定得多的空氣相。實(shí)施例4:充氣水果水沙用英國Unilever公司生產(chǎn)的VieShotsTM飲料作為果泥基料，制備充氣水果沙水。VieShotsTM含香蕉泥(28%)、橙濃縮汁(26%)、胡蘿卜濃縮汁(23%)、南瓜濃縮汁(14%)、橙漿(4%)、檸檬濃縮汁、針葉櫻桃(acerolacheny)濃縮汁(1.5Q/。)和蘋果果膠。pH經(jīng)測(cè)定(室溫下)為pH4.17。將黃原膠在攪拌下慢慢加入到果泥中至濃度達(dá)0.5wt.%。然后混合20分鐘，讓黃原膠充分水化。用手持式aerolatteTM裝置將已知體積的0.5wt.%疏水蛋白溶液充氣至400%膨脹度。將此充氣溶液加入到果泥中，得到膨脹度大約100%、總疏水蛋白濃度為0.1wt。/。和總黃原膠濃度約0.41wt。/。的充氣水果沙冰產(chǎn)品。然后將充氣水果沙冰產(chǎn)品在5。C下保藏，監(jiān)測(cè)其穩(wěn)定性三個(gè)星期的時(shí)間。圖9顯示3個(gè)星期后充氣水果沙水產(chǎn)品保持穩(wěn)定的空氣相，沒有出現(xiàn)顯著的氣泡增長或乳油化。實(shí)施例5:酸辣醬油調(diào)味料用Hellman，sTM清淡酸辣醬油作為基料制備充氣調(diào)味料(dressing)。該基料含水、酒醋(spiritvinegar)、糖、變性馬鈴薯淀粉、大蒜、鹽、紅辣椒、防腐劑、歐芽、黑辣椒、百里香和色料。pH經(jīng)測(cè)定(室溫下)為pH3.58。將黃原膠在攪拌下慢慢加入到酸辣醬油中至濃度達(dá)0.3wt.%。然后混合20分鐘，讓黃原膠充分水化。用手持式aerolatteTM裝置將已知體積的0.5wt.%疏水蛋白溶液充氣至400%膨"長度。將此充氣溶液加入到酸辣醬油調(diào)味料中，得到膨脹度大約100%、總疏水蛋白濃度為0.1wt%和總黃原膠濃度約0.25wt%的充氣酸辣醬油調(diào)味料產(chǎn)品。然后將此產(chǎn)品在5。C下保藏，監(jiān)測(cè)其穩(wěn)定性三個(gè)星期的時(shí)間。圖10顯示3個(gè)星期后沒有顯著的泡沫崩潰或氣泡增長。乳油化量也不顯著。因此，疏水蛋白能夠在可倒出的低pH調(diào)味料中使泡沫充分穩(wěn)定達(dá)至少3個(gè)星期。上文各單獨(dú)段節(jié)內(nèi)容提及到的本發(fā)明各個(gè)不同的特征和實(shí)施方案，在適當(dāng)?shù)那闆r下作了必要的修正也適用于其他段節(jié)。因此，在適當(dāng)?shù)那闆r下可將在一個(gè)段節(jié)中載明的特征與在其他段節(jié)中載明的特征結(jié)合在一起。以上說明書中提到的所有出版物通過引用結(jié)合到本文中。不背離本發(fā)明的范圍對(duì)已描述的本發(fā)明方法和產(chǎn)品所作的各種修改和變化，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是顯而易見的。雖然本發(fā)明已結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但應(yīng)認(rèn)識(shí)到，要求保護(hù)的本發(fā)明不應(yīng)不適當(dāng)?shù)叵拗朴谶@些具體實(shí)施方案。實(shí)際上，對(duì)已描述的本發(fā)明各實(shí)施方式所作的各種對(duì)相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的修改，都意味著落入以下權(quán)利要求的范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.一種pH低于5.5的充氣組合物，所述組合物包含疏水蛋白。2.權(quán)利要求1的充氣組合物，所述組合物包含至少0.001wt。/o疏水蛋白。3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的充氣組合物，其中所述疏水蛋白為分離形式。4.權(quán)利要求l-3任一項(xiàng)的充氣組合物，其中所述疏水蛋白是n類疏水蛋白。5.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的充氣組合物，所述組合物是充氣食品。6.權(quán)利要求5的充氣食品，所述食品是冷卻食品。7.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的充氣組合物，所述組合物的pH為3.0-5.4。8.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的充氣組合物，所述組合物的pH為3.0-5.0。9.疏水蛋白在抑制pH低于5.5的充氣組合物中的氣泡粗化的方法中的用途。10.疏水蛋白在使pH低于5.5的充氣組合物中的泡沫穩(wěn)定化的方法中的用途。全文摘要本發(fā)明提供一種pH低于5.5的充氣組合物，所述組合物包含疏水蛋白。文檔編號(hào)C07K14/37GK101267744SQ200680034413公開日2008年9月17日申請(qǐng)日期2006年9月13日優(yōu)先權(quán)日2005年9月23日發(fā)明者A·R·科克斯,D·L·阿爾德雷德申請(qǐng)人:荷蘭聯(lián)合利華有限公司