專利名稱：用于預(yù)防和治療Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及糖尿病的預(yù)防和治療。具體地，本發(fā)明提供一種用于 治療哺乳動(dòng)物i型和ii型糖尿病的組合物及其制備方法。所述組合物含
有GLP-l或Ex4融合蛋白。
背景技術(shù)：
糖尿病是造成人類死亡的主要病因，僅在北美就有超過(guò)2000萬(wàn)的 患者而全球大約有2億患者(美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)www.diabetes.org;加
拿大糖尿病協(xié)會(huì)www.diabctes.ca ; 世界衛(wèi)生組織 www.who.int.biabetes )。 I型糖尿病和II型糖尿病是糖尿病的兩種主要 形式。這兩種糖尿病都以(3-細(xì)胞的質(zhì)量減少及其功能的降低為特點(diǎn)。
I型糖尿病(又稱青少年糖尿病)是一種通常在低齡時(shí)形成的復(fù)雜的 T-細(xì)月包依賴自身免疫性疾病(Juneja and Palmer, Autoimmunity. 1999; 29(1): 65-83 )。 I型糖尿病是由胰島(3-細(xì)胞的免疫性破壞造成伴隨相應(yīng)的 胰島素缺乏和對(duì)外源性胰島素的依賴。單核細(xì)胞對(duì)胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞及 組織的病灶性侵潤(rùn)以及功能性(3-細(xì)胞質(zhì)量的顯著減少是診斷該疾病的 組織病理學(xué)的特點(diǎn)，但是就這些損傷的程度而言個(gè)體間差異顯著。自 身免疫性破壞使得T-細(xì)胞侵潤(rùn)到胰島(islets of Langerhans),結(jié)果出現(xiàn)[3-細(xì)胞的凋亡(Lee等人，Mol Genet Metab. 2004; 83(1-2): 82-92; Mandr叩-Poulsen, Biochem Pharmacol. 2003;66(8): 1433-1440; Sesti, Ann Med. 2002, 34(6) 444-450; Mathis等人，Nature. 2001; 414(6865) 792-798 )。為研究糖尿病潛在的分子機(jī)制，已經(jīng)建立了動(dòng)物模型。例如， 用鏈脲霉素(streptozotocin) (STZ)誘導(dǎo)的胰島素缺乏性的大鼠或小鼠模擬在糖尿病患者體內(nèi)可見(jiàn)的T-細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥和胰島p-細(xì)胞的破壞。此 外，非肥胖糖尿病(NOD)的小鼠是另一個(gè)研究自身免疫性疾病的模 型，其中胰島-抗原活性T-細(xì)胞浸潤(rùn)胰島并殺死胰島P-細(xì)胞，并且/或者 引發(fā)炎癥過(guò)程導(dǎo)致胰島f3-細(xì)胞的死亡(Anderson and Bluestone, Annu Rev Immunol. 2005; 23: 447-485)。
胰島素療法是干預(yù)J型糖尿病的主要手段。雖然胰腺的胰島移植 是一個(gè)有效的治療方法(Shapiro等人，N Engl J Med. 2000; 343(4): 230-238)，但由于人類胰島來(lái)源有限而大大受限。另外，胰島移植患者 要終生使用免疫抑制劑。盡管胰島素療法運(yùn)用于多數(shù)I型糖尿病患者， 但胰島素不能根治糖尿病，這是由于胰島素很難將血糖水平維持在一 個(gè)狹窄的生理范圍內(nèi)并且其既無(wú)法中止糖尿病的發(fā)展也不能阻止嚴(yán)重 的糖尿病并發(fā)癥的出現(xiàn)。
II型糖尿病是一種通常在成人期診斷的多基因功能失常，其以引起 高血糖癥的三個(gè)主要異常為特點(diǎn)1)外周胰島素抵抗、2)肝糖原的 過(guò)量生成、3)胰腺(3-細(xì)胞功能障礙。胰島素抵抗是指外周組織主要是 骨骼肌細(xì)胞對(duì)胰島素的反應(yīng)降低，導(dǎo)致葡萄糖運(yùn)輸?shù)竭@些組織的障礙 (Kahn and Goldfme， J Diabetes Complications. 1993; 7(2): 92-105; Weyer 等人.，J Clin Invest. 1999;104(6):787-794)。胰島素抵抗同樣可以發(fā)生在 肝臟，致使在肝臟中胰島素不能有效地抑制肝臟葡萄糖的生成(Kahn 和Goldfme, J Diabetes Complications. 1993; 7(2): 92-105; Lam等人，Am. J Physiol Endocrinol Metab. 2002; 283(4): E682-E691)。此夕卜，胰臟的胰 高血糖素的過(guò)量分泌也是造成肝糖原不成比例地過(guò)量生成的 一 個(gè)主要 原因(Unger and Orci, Arch Intern Med. 1977; 137(4): 482-491)。胰島素抵 抗的結(jié)果是機(jī)體對(duì)胰島素的需求增加。在胰島素抵抗的早期階段，通過(guò)增加胰島素分泌引起胰腺內(nèi)(3-細(xì)胞質(zhì)量增加的代償機(jī)制這些患者的
血糖水平仍然可維持在正常范圍內(nèi)(Bonner-Weir, Trends Endocrinol Metab. 2000; 11(9): 375-378; Bonner-Weir, Endocrinology. 2000, 141(6): 1926- 1929)。許多研究表明，如果能維持胰腺p-細(xì)胞的代償功能，胰島 素抵抗本身還不足以激發(fā)糖尿病的發(fā)作(Weyer等人，Diabetes. 1999; 48(11): 2197-2203 )。但胰島素抵抗長(zhǎng)時(shí)間不予糾正并變得嚴(yán)重，對(duì)胰 島素的過(guò)度需求導(dǎo)致P-細(xì)胞衰竭，胰島素分泌減少，并出現(xiàn)空腹高血糖 癥狀和明顯的凈唐尿病(DeFronzo， Diabetes. 1988; 37(6): 667-687; Kahn 等人，J Nutr. 2001; 131(2): 354S-360S; Weyer等人，J Clin Invest. 1999; 104(6): 787-794)。肥胖型胰島素抵抗db/db小鼠是重癥H型糖尿病的動(dòng)物 才莫型。這些小鼠瘦素信號(hào)途徑(leptin signaling)缺陷(Herberg和Coleman， Metabolism. 1977; 26(1): 59-99; Chen等人，Cel. 1996; 84(3): 491-495)。
II型糖尿病的常規(guī)治療包括節(jié)食和鍛煉以及使用磺基脲 (sulphonylureas)、甲福明二甲雙胍和胰島素進(jìn)行藥物性干預(yù)。但在大多 數(shù)患者中這些治療通常都無(wú)法阻止血糖控制的長(zhǎng)期下降和P-細(xì)胞的功 能紊亂(Matthews等人，Dmbet Med. 1998， 15(4): 297-303; Turner等人, JAMA. 1999; 281(21): 2005-2012)臨床上針對(duì)II型糖尿病所采用的階梯 式的治療方法最終也無(wú)法維持血糖平衡，對(duì)于大多數(shù)患者，從節(jié)食和 鍛煉到單因素藥物治療、從聯(lián)合治療最終到胰島素治療成為不可避免 的過(guò)程(Tumer等人，JAMA. 1999; 281(21): 2005-2012; Gench， Eur J ClmInvest 2002; 32 Suppl 3: 46-53)。上述治療既不能阻止II型糖尿病的 進(jìn)展又無(wú)法預(yù)防與該疾病相關(guān)的長(zhǎng)期并發(fā)癥，這可能是上述途徑針對(duì) 的是癥狀(即，高血糖癥)而不是lI型糖尿病的病因的結(jié)果(Gench， FAir J Clin Invest 2002; 32 Suppl 3: 46-53)。胰高血糖素類肽-l(GLP-l,7-36氨基化合物)是一種促胰島素分 泌激素(insulmotropic hormone) (Brubaker and Dmcker, Endocrinology. 2004; 145(6): 2653-2659; Perfetti和Merkel， Eur J Endocrinol. 2000; 143(6): 717-725; Holst， Gastroenterology. 1994; 107(6): 1848-1855; Hoist 和Gromada, Am J Physiol Endocrinol Metab. 2004; 287(2): E199-E206),、 該激素是由小腸L-細(xì)胞分泌通過(guò)調(diào)節(jié)胰島激素的分泌對(duì)營(yíng)養(yǎng)攝取起作 用并促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)吸收(Drucker, Diabetes. 1998; 47(2): 159-169)。 GUM與 GLP-l受體(GLP-1R)、 G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)結(jié)合。GLP-IR主要在 胰臟P-細(xì)胞表達(dá)，在其他組織細(xì)胞有一定程度的表達(dá)(肺臟、心臟、腎 臟、胃腸消化道和腦)，并且與環(huán)AMP(cAMP)第二信使途徑偶聯(lián)引發(fā) 其生物學(xué)作用(Dmcker, Endocrinology. 2001; 142(2): 521-527; Brubaker 和Drucker， Endocrinology. 2004; 145(6): 2653-2659)、 (Brubaker和 Dmcker, Receptors Channels. 2002; 8(3-4): 179-188; Brubaker和Dmcker, Endocrinology. 2004; 145(6): 2653-2659; Thorens, Proc Natl Acad Sci U S A. 1992; 89(18): 8641-8645)并且和蛋白激酶A(PKA )和cAMP調(diào)節(jié)的 鳥(niǎo)嘌呤置換因子(cAMPGEFs)的Epac家族偶聯(lián)發(fā)揮作用(Mmra和 Matsui, Toxicol Appl Pharmacol. 2006; Holz, Horm Metab Res. 2004; 36(11-12): 787-794)。其他蛋白激酶的活化包括蛋白激酶B (AKT)并 且還發(fā)現(xiàn)MAPK(有絲分裂原激活的蛋白激酶(MAPK) ) (Brubaker和 Drucker, Endocrinology. 2004; 145(6):2653-2659; Wang和Brubaker, Diabetologia. 2002; 45(9): 1263-1273; Wang等人，Diabetologia. 2004; 47(3): 478-487)在介導(dǎo)GLP-l促進(jìn)(3-細(xì)胞生長(zhǎng)和抑制其凋亡的作用中的 重要性。
GLP-l以葡萄糖依賴的方式促進(jìn)P-細(xì)胞增殖并抑制其凋亡(Nauck等人，Horm Metab Res. 1997; 29(9): 411-416; Nauck, Horm Metab Res. 2004; 36(11-12): 852-858; Drucker, Diabetes. 1998; 47(2): 159-169)。 GLP-1也可以增加I型(Gutniak等人，Diabetes Care. 1994; 17(9): 1039-1044)和II型(Nauck等人，Diabetes. 1997; 105(4): 187-195; Todd 等人，Eur J Clin Invest. 1997; 27(6): 533-536; Nathan等人，Diabetes Care. 1992; 15(2): 270-276)糖尿病的嚙齒動(dòng)物和人類的胰島素分泌及降低血 糖。在II型糖尿病動(dòng)物模型中，GLP-1或其長(zhǎng)效蛋白類似物 exendin-4(Ex-4)治療通過(guò)促進(jìn)(3-細(xì)胞生長(zhǎng)并抑制其凋亡(Wang和 Brubaker, Diabetologia. 2002; 45(9): 1263-1273; Wang， Endocrinology Rounds. 2004; 3(7); Wang等人，Diabetologia. 2004; 47(3): 478-487; Tourrel等人，Diabetes. 2002， 51(5): 1443-1452)而預(yù)防糖尿病的發(fā)生 (Wang和Bmbaker， Diabetologia. 2002， 45(9): 1263-1273; Tourrel等人， Diabetes. 2002; 51(5): 1443-1452)。已經(jīng)證實(shí)GLP-1對(duì)II型糖尿病有臨 床療效(Meier和Nauck, Diabetes Metab Res Rev. 2005; 21(2): 91-117)。 研究證明在分泌胰島素的p-細(xì)胞中，淋巴因子誘導(dǎo)的凋亡和壞死可以 明顯地被GLP-1或exendin-4(Ex4)所阻滯(Saldeen, Endocrinology. 2000; 141(6): 2003-2010; Li等人，Diabetologia. 2005)。對(duì)STZ處理誘導(dǎo)的卩-細(xì)胞死亡的新生大鼠給以GLP-1/Ex4治療導(dǎo)致大鼠在成年期持久地維 持改善的葡萄糖穩(wěn)態(tài)(Tourrel等人，Diabetes. 2001; 50(7): 1562-1570)。 此外，結(jié)合多克隆抗T-細(xì)胞抗體免疫抑制處理施用GLP-1/Ex4c治療， 使88 %的糖尿病NOD小鼠獲得完全治愈(Ogawa等人，Diabetes. 2004; 53(7): 1700-1705)。美國(guó)專利6,899,883和美國(guó)專利6,989，148公開(kāi)了用胰島素和胰高血 糖素類肽l(7-37)或胰高血糖素類肽l(7-36)氨基化合物治療I型糖尿病的方法。主要由于包括二肽酰二肽酶IV (DPP-IV)的快速酶促失活(Drucker, Diabetes. 1998; 47(2): 159-169)， 和/或腎臟的清除 (Montrose-Rafizadeh等人，Endocrinology. 1999, 140(3): 1132- 1140)，使 得天然的GLP-1具有短暫的循環(huán)半衰期"/2<2分鐘)。因此需要通過(guò)泵 采用持續(xù)性的皮下灌流以維持體內(nèi)GLP-1的功效(Toft-Nielsen等人， Diabetes Care. 1999; 22(7): 1137-1143)。 DPP-IV抑制劑能夠延長(zhǎng)GLP-l 的半衰期，DPP-IV抑制劑也能使其他幾種多肽激素和一些趨化因子失 活(Meier和Nauck, Diabetes Metab Res Rev. 2005; 21(2): 91-117)，并且 其抑制作用可能導(dǎo)致不良反應(yīng)。出于這個(gè)原因，科研人員進(jìn)行大量努 力來(lái)開(kāi)發(fā)長(zhǎng)效的抗降解的GLP-1類似肽。這些具有氨基酸取代基的 (Ahren和Schmitz， Horm Metab Res. 2004; 36(11-12): 867-876; Green等 人，Curr Pharm Des. 2004; 10(29): 3651-3662)和/或包括脂酰化的N-封 端改性的(Chang等人，Diabetes. 2003; 52(7): 1786-1791)和N-乙?；?(Lm等人，Cell Biol Int.2004; 28(1): 69-73)改性的人類GLP-1類似物顯 現(xiàn)出延長(zhǎng)的半衰期t1/2，并有效地減少了糖尿病受試者的血糖漂移 (glycemic excursion)( Chang等人，Diabetes. 2003; 52(7): 1786-1791)。 Ex-4，具有與哺乳動(dòng)物GLP-1高度的序列同源性的爬行動(dòng)物肽是 GLP-1R的有效激動(dòng)齊'](Fineman等人，Diabetes Care. 2003; 26(8): 2370-2377)。此外，白蛋白結(jié)合的GLP-l(Albugon)具有延長(zhǎng)的GLP-1 的半衰期，在抗糖尿病中起著有益作用(Kim等人Diabetes. 2003; 52(3): 751-759)。盡管DPP-IV-抗性的GLP-1R激動(dòng)劑和Ex-4顯現(xiàn)出可以作為治療糖 尿病的治療性藥物，但這些肽需要每日注射l - 2次和/或結(jié)合口服糖尿 病藥物的治療。如WO 02/46227或WO 05/000892中描述的GUM白蛋白融合蛋白或GLP-l融合IgG4融合蛋白的半衰期充分延長(zhǎng)可能是由于其 分子較大而腎臟排出減少造成的。然而體外研究顯示融合蛋白顯示出較低的功效(Kim等人，Diabetes. 2003; 52(3): 751-759)。這使得人們進(jìn) 行更多努力以產(chǎn)生在體內(nèi)功效穩(wěn)定的更有效的長(zhǎng)效因子。因此，依然需要開(kāi)發(fā)針對(duì)I型和II型糖尿病的潛在分子機(jī)制而非 該機(jī)制后果的有效治療策略。理想的發(fā)明是既針對(duì)(3-細(xì)胞功能障礙又 針對(duì)胰島素抵抗的治療。因此，需要一種既能促進(jìn)(3-細(xì)胞生長(zhǎng)并能保 護(hù)其免于p-細(xì)胞死亡的治療以有效治療該類疾病。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及預(yù)防和治療I型和II型糖尿病的方法和組合物。本發(fā) 明的組合物包含新的融合蛋白。該融合蛋白含有與IgG重鏈恒定(Fc) 區(qū)融合的GLP-1分子或者其類似物或片段。 一方面該IgG為任何鼠源 IgG，例如IgGi,但不局限于IgG!。另一方面，該IgG為人源的，可以 選自IgG, 、 IgG2或IgG3 。本發(fā)明的融合蛋白在本文中被稱為 "GLP-l/IgG-Fc"。在本發(fā)明的其他方面，該融合蛋白含有Ex4/IgG-Fc， 其中IgG可以是如本文所述的鼠源也可以是人源。本發(fā)明的組合物在受試者中對(duì)I型和II型糖尿病的治療有效。同 樣地，本發(fā)明提供了用于治療受試者的I型和II型糖尿病的方法，其 中如果需要給受試者使用所述的融合蛋白。本發(fā)明還提供了使用哺乳動(dòng)物表達(dá)細(xì)菌培養(yǎng)系統(tǒng)制備本發(fā)明的融 合蛋白GLP-l/IgG-Fc和Ex4/IgG-Fc的新方法。在這兩種系統(tǒng)中，培養(yǎng) 細(xì)胞克隆以制備包括GLP-l/IgG廣Fc和GLP-l/IgG2-Fc的融合蛋白以及 有效抵抗DPP- IV降解的治療有效性突變體型，例如但不限于 GLP-1 A8G/IgG-FC (在第8位的丙氨酸被甘氨酸取代)和Ex4/IgG-Fc。本發(fā)明的二價(jià)GLP-l/IgG-Fc融合蛋白具有獨(dú)特的特點(diǎn)1)增加了循 環(huán)半衰期f/2; 2)高親和性和效能；3)最小化的免疫原性和4)用于 大規(guī)模制備的簡(jiǎn)便的一步法提純?？梢詫⒈景l(fā)明的組合物按需要以多 種形式提供給受試者。在一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)行1次或2次 GLP-l/IgG-Fc和/或GLP-lA8G/IgG-FC和/或Ex4/IgG-Fc載體取得和在 兩周內(nèi)每日腹膜內(nèi)注射Ex4相似的效果。本發(fā)明的一方面提供了一種用于受試者控制血糖平^f的GLP-1融 合蛋白。本發(fā)明的一方面l是供了一種用于控制受試者血糖濃度的GLP-1融 合蛋白。本發(fā)明的 一方面提供了 一種GLP-1融合蛋白，其促進(jìn)受試者f3-細(xì) 胞增殖和/或減少p-細(xì)胞凋亡從而增加p-細(xì)胞質(zhì)量。根據(jù)本發(fā)明的 一 個(gè)方面，本發(fā)明的融合蛋白增加了受試者的胰島 素釋放和葡萄糖耐受性并降低空腹血糖水平。本發(fā)明的一方面提供了一種融合蛋白，該融合蛋白含有GLP-1多 肽或類似物、或者其突變體或其片段或者IgG多肽。本發(fā)明的 一方面提供了 一種異源性融合蛋白，該融合蛋白含有與 IgG多肽融合的GLP-1多肽或其變異體，其中所述的IgG不是IgG4。根據(jù)本發(fā)明的一方面，所述IgG是鼠源。根據(jù)本發(fā)明的一方面，所述lgG是鼠lgG!。根據(jù)本發(fā)明的一方面，所述IgG是人源。根據(jù)本發(fā)明的一方面，所述IgG是人IgG" IgG2或IgG3。根據(jù)本發(fā)明的一方面，所述IgG是人IgG2。根據(jù)本發(fā)明的一方面，所述GLP-1多肽選自由GLP-l(7-37)OII、 GLP-l(7-36)氨基化合物、DPP-IV抗性的GLP-1及其片段和衍生物組成 的組。根據(jù)本發(fā)明的一方面，所述DPP-IV抗性的GLP-1為GLP-1 A8G。根據(jù)本發(fā)明的一方面，所述衍生物含有大約70%至大約95%與 GLP-1 IDNO.l序列相同的序列的多肽。根據(jù)本發(fā)明的一方面，所述IgG片段含有至少5個(gè)氨基酸至多達(dá) 250個(gè)氨基酸。根據(jù)本發(fā)明的 一 方面，所述IgG含有IgG的Fc部分或者Fc部分 的片段或衍生物。本發(fā)明一方面提供了一種編碼所述異源性融合蛋白的cDNA。本發(fā)明一方面提供了一種含有所述融合蛋白的cDNA的載體。本發(fā)明一方面提供了一種經(jīng)含有所述異源性融合蛋白的cDNA的 載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的 一方面提供了 一種藥用組合物，所述組合物含有上述異 源性融合蛋白或者包含以可藥用栽體負(fù)載的異源性融合蛋白的cDNA 的載體。根據(jù)本發(fā)明的一方面，所述藥用組合物用于治療I型和II型糖尿病。根據(jù)本發(fā)明的一方面，所述藥用組合物可通過(guò)選自由局部施用、 口服、氣霧方式、腹膜內(nèi)注射、靜脈注射或肌肉注射組成的組的方式施用。根據(jù)本發(fā)明的一方面，所述藥用組合物用于受治療者的I型和II 型糖尿病的治療，所述組合物含有包含與IgG多肽融合的GLP-1多肽 或者其衍生物或活性片段的異源性融合蛋白。本發(fā)明一方面提供了 一種治療受試者的I型和/或II型糖尿病的方 法，所述方法包括施用治療有效量的融合蛋白或所述組合物或所述載體。 .本發(fā)明一方面提供了所述異源性融合蛋白用于治療或預(yù)防I型和/ 或II型糖尿病的藥物中的用途。本發(fā)明的一方面提供了一種含有與IgG多肽融合的exendin-4多肽 或者其衍生物或片段的異源性融合蛋白。根據(jù)本發(fā)明的一方面，所述IgG選自由人IgGl 、 1gG2、 IgG3和IgG4 組成的組。本發(fā)明的其他特點(diǎn)和優(yōu)越性可通過(guò)以下詳細(xì)的描述體現(xiàn)。但是， 應(yīng)該理解的是， <義以示例的方式給出詳細(xì)描述和具體實(shí)施例以表明本 發(fā)明的實(shí)施方案，這是因?yàn)閷?duì)于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員從所述的詳細(xì)描 述中在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍內(nèi)多種改變和改良是顯而易見(jiàn)的。


參考附圖從以下詳細(xì)描述中將進(jìn)一步理解本發(fā)明，其中圖1:構(gòu)建編碼GLP-l/IgG-Fc的質(zhì)粒。1A:將編碼GLP-l/mlgGl-Fc 融合蛋白的cDNA連接到載體的Mam H I和Eco RV位點(diǎn)之間。1B中 顯示由活性GLP-1 (7-37)分子和包含鼠IgGl恒定重鏈區(qū)(CH1 、 鉸鏈、CH2和CH3部分)的IgG-Fc組成的分泌的GLP-l/IgG-Fc融合蛋白的圖示。lC:將化學(xué)合成的編碼hGHRH/hGLP-l融合蛋白的cDNA 鏈接到PCR擴(kuò)增的編碼人IgG2-Fc (鉸鏈-ch2-ch3 )的cDNA片段上， 然后插入pAV0243載體的Nco I和Hind III位點(diǎn)之間產(chǎn)生 GLP-l/WgG-Fc/pAV0243。 1D中顯示由活性GLP-1分子(7-37)和 包含人IgG2恒定區(qū)重鏈(鉸鏈、CH2和CH3 )的IgG-Fc組成的可分 泌的GLP-l/WgG-Fc融合蛋白的圖示。這些蛋白質(zhì)表達(dá)時(shí)均以同型二 聚體的形式分泌。利用位點(diǎn)導(dǎo)向突變產(chǎn)生的編碼GLP-lA8G-IgG-Fc或 Ex4/IgG-Fc融合蛋白的cDNA。使用相同的方法產(chǎn)生Ex4/IgG-Fc cDNA 并克隆入pAV0243。-圖2顯示的是IgG-Fc融合蛋白在C0S-7細(xì)胞中的表達(dá)和檢測(cè)。用 質(zhì)粒載體編碼IgG-Fc融合轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48h后分離總RNA。 2A顯示的是用溴化乙錠顯色的在1%瓊脂糖凝膠上的RT-PCR產(chǎn)物。 2B顯示的是用G蛋白瓊脂糖凝膠純化融合蛋白并用SDS-PAGE溶解然 后轉(zhuǎn)移到醋酸纖維素膜上。上述膜用抗小鼠抗體(l: 5000 )探測(cè)并用 ECL顯影。圖3是顯示轉(zhuǎn)染后COS-7細(xì)胞的GLP-1融合蛋白的分泌的圖。將 COS-7細(xì)胞植入12孔培養(yǎng)板中并用僅含不同量的GLP-1/IgG-Fc或 IgG-Fc的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。于轉(zhuǎn)染48h后收集培養(yǎng)液并將15(^L培養(yǎng)液用于 RIA檢測(cè)GLP-1。圖4A顯示的是GLP-1融合蛋白在COS-7細(xì)胞中大量表達(dá)。將 COS-7細(xì)胞植入1.50mir^培養(yǎng)皿中并于次日用80figDNA轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后 48h收集培養(yǎng)液，用lmL G蛋白瓊脂糖凝膠培養(yǎng)過(guò)夜純化融合蛋白。 洗滌細(xì)胞團(tuán)(bead)，加入lmL0.1M的氨基乙酸(pH2.7)洗脫純化的蛋 白。重復(fù)洗脫并收集組分。取30(iL組分在所述的還原或非還原條件下通過(guò)SDS-PAGE分析并用考馬斯亮藍(lán)(Comasie Blue)染色。圖4B顯示的是GLP-1在哺乳動(dòng)物和細(xì)菌細(xì)胞中的表達(dá)。使用G 蛋白凝膠純化在COS-7細(xì)胞和細(xì)菌(Rosettagami 2J表達(dá)的IgG-Fc融合 蛋白。不同量的純化蛋白用總GLP-1 RIA試劑盒檢測(cè)GLP-1蛋白。圖5顯示的是在穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞中GLP-1的表達(dá)。用 GLP-l/IgG-Fc或IgG-Fc線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞并用500(ig/mL的 G418篩選。分揀可能的陽(yáng)性克隆后，分揀的細(xì)胞在12孔培養(yǎng)板上生 長(zhǎng)，種植后48h收集培養(yǎng)液。用該培養(yǎng)液在總GLP-1 RIA分析中檢測(cè) GLP-1蛋白。圖6顯示的是GLP-l/IgG-Fc融合蛋白治療對(duì)1NS-1細(xì)胞中的胰島 素分泌的影響。將INS-1細(xì)胞種植在24孔板上生長(zhǎng)過(guò)夜。將經(jīng)葡萄糖 和血清饑餓的細(xì)胞在含有0、 5或20mM葡萄糖的KRB緩沖液中用純 化的GLP-1 /IgG融合蛋白處理1 h。用胰島素放射性免疫測(cè)定分析培養(yǎng) 液的胰島素分泌量。圖7顯示的是示例GLP-l/gG-Fc具有與Ex-4相似的刺激.INS-l 細(xì)胞生成cAMP的功效。將INS-1細(xì)胞種植在24孔板上并培養(yǎng)過(guò)夜。 經(jīng)葡萄糖和血清饑餓的細(xì)胞在加有0或5mM葡萄糖的無(wú)血清RPMI中 用純化的GLP-l/IgG融合蛋白(IgG-Fc和Ex4作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照) 處理10 min。用放射性免疫測(cè)定測(cè)量冷凍干燥的細(xì)胞提取物中cAMP 的水平。圖8A-D顯示的是體內(nèi)表達(dá)GLP-l/IgG-Fc對(duì)患有II型糖尿病的 db/db模型鼠的作用。4周和/或6周齡的db/db小鼠通過(guò)電轉(zhuǎn)移肌肉注 射GLP-l/IgG-Fc和/或Ex4/IgG-Fc或IgG-Fc載體。收集注射前的和注 射后2、 12、 16周的血清?；钚訥LP-1水平通過(guò)GLP-1 Elisa試劑盒檢測(cè)(8A)。首次注射后12周檢測(cè)兩組小鼠的空腹血糖水平(n=5-6, pO.OOl )(圖8B)。在第12周經(jīng)過(guò)夜饑餓，用RIA檢測(cè)試驗(yàn)鼠血液胰 島素水平(8C)和胰高血糖素水平(8D)。圖9A和圖9B顯示的是體內(nèi)表達(dá)GLP-l/IgG-Fc對(duì)鏈脲霉素誘導(dǎo)的胰 島素缺陷的I型糖尿病模型中的作用。(9A)對(duì)CD1模型鼠肌肉注射編 碼GLP-l/IgG-Fc、 Ex4/IgG-Fc或IgG-Fc(每只鼠50嗎)并用電轉(zhuǎn)移促進(jìn) 基因轉(zhuǎn)移。DNA注射7d后，受試鼠受強(qiáng)化注射，并于當(dāng)日起接受連 續(xù)5日每日注射STZ ( 55mg/kg，腹膜內(nèi)注射)。注射STZ數(shù)天后注射 IgG-Fc的對(duì)照受試鼠血糖增加顯著(^17mM ),但GLP-l/IgG-Fc (或 Ex4/IgG-Fc )處理的受試鼠被保護(hù)并表現(xiàn)出低的明顯糖尿病的發(fā)生頻率(9B)。胰腺的組織學(xué)研究以先前報(bào)道的胰腺切片方法進(jìn)行(Wang等 人，Mol Biol Cell. 1998;9 ( 11 ) :3057-3069 )。卩-細(xì)胞在4。C經(jīng)豚鼠抗胰 島素IgG ( 1: l，OOO, Dako )過(guò)夜處理后，用生物素偶聯(lián)的鼠抗豚鼠IgG(1: 1，100)室溫處理60mm。加入Cy3偶聯(lián)的抗生物素蛋白(l: I，IOOO， Jackson Labs)另外處理45min。用Ziess激光共聚焦顯微鏡(510型)攝 影。胰腺胰島總的細(xì)胞質(zhì)量的確定是由總的胰島素陽(yáng)性切片的細(xì)胞面 積/總的胰腺組織面積乘以胰腺組織固定前的重量。圖中顯示在所有組 中用STZ處理的鼠出現(xiàn)胰島(3-細(xì)胞受破壞，而GLP-l/IgG-Fc (或 Ex4/IgG-Fc )處理的小鼠中受損程度較輕。在這些小鼠中觀察到單核細(xì) 胞(淋巴和/或巨嗜細(xì)胞)對(duì)胰島的侵潤(rùn)(沒(méi)有顯示)。有趣的是，盡管 Ex4/IgG-Fc預(yù)期對(duì)DPP-IV降解表現(xiàn)抗性，但該處理與GLP-l/IgG-Fc 處理的結(jié)果類似。上述結(jié)果表明，盡管胰島有炎癥存在(胰島炎)，但是 GLP-l/IgG-Fc (或Ex4/IgG-Fc)的表達(dá)保護(hù)試驗(yàn)動(dòng)物免受STZ-誘發(fā)的 (3-細(xì)胞損害()。圖10顯示的是體內(nèi)表達(dá)GLP-l/IgG-Fc及其對(duì)豬血糖的影響。雄性受試約克夏豬(23kg)每只注射4mg GLP-l/IgG-Fc或注射IgG-Fc 載體作為對(duì)照。注射3日后為誘導(dǎo)高血糖，在麻醉?xiàng)l件下將四氧嘧啶 一水化合物(Sigma/80mg/kg )混合25ml生理鹽水靜脈注射。開(kāi)始階 段，酸性的麻醉劑于注射前經(jīng)中和但未引起高血糖癥，后續(xù)試驗(yàn)免去 中和步驟。結(jié)果顯示，在IgG-Fc處理組引起中等程度高血糖， GLP-l/IgG-Fc處理組沒(méi)有引起高血糖。在鎮(zhèn)靜劑可他命處理下每周2 次測(cè)試受試豬空腹血糖值。血液樣品用血糖計(jì)抽耳又(A)， Fc蛋白表達(dá) 測(cè)試用ELISA ( B )。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明提供了預(yù)防和治療糖尿病的組合物和方法。該組合物含有 幫助調(diào)節(jié)血糖水平的融合蛋白。當(dāng)對(duì)個(gè)體施用有效量的組合物時(shí)，本 發(fā)明的組合物通過(guò)促進(jìn)(3-細(xì)胞的增殖和新生預(yù)防糖尿病的發(fā)生。增殖 是指一個(gè)(3-細(xì)胞分裂為2個(gè)。再生是指由原始細(xì)胞或干細(xì)胞產(chǎn)生新全 的(3-細(xì)胞。本發(fā)明組合物還降低了受試者的P-細(xì)胞的凋亡。增加增殖、 再生和減少凋亡使得(3-細(xì)胞質(zhì)量增加。此外，本發(fā)明的融合蛋白的組 合物還增加了 p-細(xì)胞胰島素的分泌量。本發(fā)明的含有新型融合蛋白的 組合物能活化cAMP及其偶聯(lián)的第二信使通路，增加了 p-細(xì)胞中蛋白 激酶(Aktl和/或MAPK)的表達(dá)，還減少了 caspase-3的活性。有效 量的含有融合蛋白的組合物在個(gè)體體內(nèi)增加了胰島素的分泌和葡萄糖 耐受性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物和方法延長(zhǎng)了 GLP-1的循環(huán) 半衰期增強(qiáng)了其功效。這是通過(guò)提供含有活性GLP-1和IgG重鏈恒定 區(qū)的融合蛋白(GLP-UIgG-Fc)而實(shí)現(xiàn)的。所述GLP-1肽是天然自身具有的，也可以是具有DPP-IV(二肽酰肽酶)抗性的。IgG可以是鼠源或人源。鼠源IgG可以為IgG"人源IgG可以選自IgG!、 IgG2和IgG3。 GIJM 多肽可以是鼠源或人源序列，因?yàn)樗鼈兊男蛄邢嗤LP-l多肽可以 是天然序列或衍生物的片段。GLP-l多肽可以是GLP-l (7-37) OH或 GLP-l (7-36)氨基化合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白含有Ex4多肽、Ex4片 段或衍生物、或其衍生物的片段和IgG片段(IgG-Fc)。本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明的可分泌的融合蛋白的載體，所述融 合蛋白包括但不局限于活性GLP-l和鼠IgG廣Fc cDNA或GLP-l人 IgG2-Fc cDNA用于哺乳動(dòng)物表達(dá)二價(jià)的GLP-l多肽；以及活性的 Ex4-IgG cDNA。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在如同在本文實(shí)施例中描述的載 體中或是以相同的方法容易地制備任何所需的GLP-1或Ex4序列。體 外細(xì)胞系研究結(jié)合I型和II型糖尿病模型鼠體內(nèi)肌肉注射基因轉(zhuǎn)染表 達(dá)的基因治療術(shù)，證明重組的人類GLP-l融合蛋白GLP-l/IgG-Fc的生 物學(xué)特性以及有效性。這種基因治療方法在嚴(yán)重的I型和II型糖尿病 模型中證明有效。運(yùn)用了電轉(zhuǎn)移因?yàn)槠湓黾踊蜣D(zhuǎn)染并可以證明在人 類和大型動(dòng)物中有效，而通過(guò)肌肉注射轉(zhuǎn)染基因在嚙齒類動(dòng)物中證明 效率較低。總之，本發(fā)明為用蛋白質(zhì)治療和基因治療在哺乳類中預(yù)防 和治療I型和II型糖尿病提供了 一種新的方法。本發(fā)明的融合蛋白可以是GLP-l或Ex4片段，其與GLP-l多肽有 至少60%或更多的相同序列；或與Ex4多肽有至少60%或更多的相同 序列。所述序列可以與已知形式的GLP-1多肽有至少70%、 80%、 90% 或95%或更多的相同序列；這些已知形式包括類似物、其衍生物和其 片段。例如這些形式的序列已經(jīng)在美國(guó)專利NO,6，268,343(該公開(kāi)在此完整引入作為參考)中公開(kāi)。本發(fā)明還包括將上述的組合物用于預(yù)防和 治療糖尿病的藥物中的用途，例如I型和II型糖尿病。本發(fā)明還包括 用于上述所有用途的 一種藥用組合物，例如預(yù)防性的組合物。融合蛋白的構(gòu)建是融合GLP-1和IgG-Fc分子組成一種新的分子，該分子能促進(jìn)GLP-1的功效并結(jié)合有IgG-Fc的優(yōu)點(diǎn)，即增加配體的親 和力和增加免疫耐受性。本發(fā)明提供了結(jié)合了 GLP-1分子衍生物的融 合蛋白，所述衍生物包括DPP-IV抗性的形式，例如GLP-1A8G與 IgG-Fc分子形成的新分子，其具有所述的促進(jìn)GLP-1功效和IgG-Fc 分子的優(yōu)點(diǎn)。同樣，融合蛋白結(jié)合GLP-1受體激動(dòng)劑(即，Ex4)和 IgG-Fc分子形成新分子，該新分子具有GLP-1類似的功效并具備 IgG-Fc分子的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的范圍包括產(chǎn)生其化學(xué)等價(jià)物或化學(xué)上相似的氨基酸序列 而作的變化。與GLP-1或Ex4序列具有相同序列的IgG-Fc融合多肽在本 發(fā)明的范圍內(nèi)，并經(jīng)試驗(yàn)確定適用于本發(fā)明的方法中。美國(guó)專利No. 6，268,343 (完整引入作為參考)描述了許多GLP-1衍生物和變異體。本 發(fā)明中的多種多肽可自然出現(xiàn)變異體，也可以經(jīng)過(guò)突變，或可以經(jīng)過(guò) 合成，例如通過(guò)如位點(diǎn)導(dǎo)向突變的蛋白質(zhì)工程技術(shù)，該技術(shù)是本領(lǐng)域 公知的氨基酸替換技術(shù)。比如一個(gè)疏水殘基像甘氨酸可以被另 一個(gè)疏 水殘基像丙氨酸替換，而丙氨酸殘基又可以被疏水性更強(qiáng)的亮氨酸、 纈氨酸、異亮氨酸替換。帶負(fù)電荷的氨基酸如天冬氨酸可被谷氨酸替 換，帶正電荷的氨基酸如賴氨酸可被另 一帶正電荷的氨基酸精氨酸替 換。所以，本發(fā)明包括在氨基酸序列上有保留的變動(dòng)或替換的IgG-Fc 融合多肽。有保留的替換插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸，其保留被替換氨基酸相同的化學(xué)特性。本發(fā)明包括有保守型的替代的序列，經(jīng)過(guò)保守性 替換后不破壞原有序列的活性。本發(fā)明預(yù)期IgG-Fc融合多肽含有l(wèi)或多 個(gè)D-氨基酸。預(yù)期N-末端有一個(gè)或多個(gè)氨基酸乙?；亩嚯?。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解能用多種技術(shù)來(lái)構(gòu)建多肽擬似物，該類似物具有所 需的與本發(fā)明的相應(yīng)多肽化合物相同或類似的性質(zhì)，但在溶解度、穩(wěn)定性和/或?qū)λ夂兔附獾拿舾行苑矫婢哂懈玫幕钚浴＠?，Morgan 和Gainor (Ann. Rep. Med. Chem.,24:243-252， 1989)中所述。多肽擬 似物的實(shí)施例在美國(guó)專利No. 5,643,873中描述。其他描述如何制備和 應(yīng)用多肽擬似物的專利包括，例如，5/786，322、 5，767，075、 5，763，571、 5,753,226、 5,683,983、 5,677,280、 5,672,584、 5,668,110、 5,654,276、 5，643,873,所有上迷文獻(xiàn)在此完整引入作為參考。也可以根據(jù)其他本 領(lǐng)域已知的技術(shù)制備本發(fā)明的多肽擬似物。例如，通過(guò)用化學(xué)上轉(zhuǎn)換 氫基團(tuán)為如羥基或氨基的另一種基團(tuán)來(lái)改變側(cè)基的因子來(lái)處理本發(fā)明 的IgG-Fc融合多肽。擬似物優(yōu)選包括完全是氨基酸的組成的序列或是 包括氨基酸和改性的氨基酸或其他有機(jī)分子的雜交物。本發(fā)明同樣包 括雜交物和IgG-Fc融合多肽，例如，其中一個(gè)核苷酸序列與另一個(gè)序 列結(jié)合。本發(fā)明也包括本發(fā)明的IgG-Fc融合多肽的具有相同活性的片斷， 還包括IgG-Fc融合多肽的可以作為檢驗(yàn)多肽性質(zhì)和活性的研究工具的 片斷。這種多肽優(yōu)選由至少5個(gè)氨基酸組成。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，它 們可以由6~10、 11~15、 16~25、 26 — 50、 51~75、 76~100或101~ 250個(gè)氨基酸組成。片斷可以包含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失的序列，例 如，化合物序列中的C-末端氨基酸。通過(guò)選擇性位點(diǎn)導(dǎo)向突變提高或降低復(fù)合的融合多肽的活性。通常傾向于用DNA質(zhì)?；蚴呛泻怂岱肿拥谋磉_(dá)載體或是含有相同的序 列的核酸分子來(lái)進(jìn)行這方面的研究。通常這些工作可以用如從Pharmacm生物技術(shù)公司購(gòu)得的去除特殊位點(diǎn)的U.S.E.突變?cè)噭┖谢蚴?其他公司的突變?cè)噭┖?，或可以用PCR的方法來(lái)進(jìn)行獲得。 一旦建立 起突變并通過(guò)DNA序列分析加以證實(shí)，就可以通過(guò)表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)這 個(gè)突變?nèi)诤系鞍撞⑶宜幕钚跃涂梢员粰z測(cè)。>25%、 >28%、 >30%、 >35%、 >40%、 >50%、 >60%、 〉70%、 >80%或 >90%更優(yōu)選約>95%、 >99%或>99.5%相同的序列的融合蛋白。改性的 融合蛋白分子在下面討論。優(yōu)選大約l、 2、 3、 4、 5、 6~10、 10-25、 26 ~ 50或51 ~ IOO或IOI ~ 250個(gè)核苷酸或氨基酸被改性。根據(jù)本領(lǐng)域公 知的方法計(jì)算一致性。最優(yōu)選使用BLAST 2.1程序的高級(jí)搜索評(píng)估序列 的一致性(參數(shù)同上)。BLAST是一套復(fù)合程序，可以通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)來(lái)獲得 和4吏用這些程序。網(wǎng)址是〈http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST>。高級(jí) BLAST搜索(hUp:〃www.ncbi,nlm.nih.gov/blast/blast.cgi Jform-l )被設(shè) 成默^人參凄史(ie Matrix BLOSUM62; Gap existence cost 11; Per residue gap cost 1; Lambda ratio 0.85 default )。 BLAST搜索的參考文南史Altschul， S.F., Gish， W., Miller, W.， Myers, E.W. & Upman， D丄(1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215:403—410. Gish, W. & States, D.J. (1993) "Identification of protein coding regions by database similarity search." Nature Genet. 3:266—272. Madden, T.L., Tatusov， R.L. & Zhang, 丄 (1996) "Applications of network BLAST server" Meth. Enzymol. 266:131一141. Altschul, S.F., Madden, T丄.，Schaffer, A.A.， Zhang, J.， Zhang, Z.， Miller, W. & Lipman, D丄(1997) "Gapped BLAST and PSI—BLAST: a new generation of protein database search programs."Nucleic Acids Res. 25:3389—3402. Zhang， J. & Madden， TL. (1997) "PowerBLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation." Genome Res. 7:649—656。本發(fā)明包括帶突變的融合蛋白，這些氨基酸突變可以發(fā)生在融合 蛋白無(wú)活性區(qū)部分，這些氨基酸突變也可以發(fā)生在活性區(qū)部分從而增 加或減少了融合蛋白的活性。在本發(fā)明中，如美國(guó)專利 WO.05/000892(在此完整引入作為參考)中所述，可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人 員公知的技術(shù)修飾融合蛋白的IgG-Fc部分以改變(增加或減少)免疫 原寸生(immunogemcity)或者步文應(yīng)器功能(effector function)。本發(fā)明的融合蛋白可以單獨(dú)有效使用，但也可以在藥物組合物中 與其他如藥用載體的成分一起使用?？梢越Y(jié)合本發(fā)明的融合蛋白，即 可將超過(guò)一種類型的可溶形式用于如人類或是動(dòng)物的受治療對(duì)象，以 預(yù)防或治療糖尿病。本發(fā)明的融合蛋白作為藥物應(yīng)用于人類或動(dòng)物可以通過(guò)多種途 徑，并不局限于局部施用，如口服、噴霧、氣管內(nèi)灌輸、腹膜內(nèi)注射、 靜脈注射、肌肉注射和基因療法。施用劑量取決于患者需要、期望取 得的效果和施用途徑。例如人類的施用量可以為2 nmol/kg體重或是 0.02 - 100 nmol/kg體重。當(dāng)使用基因治療時(shí)，人的DNA注射濃度可以 為l叱/kg體重或是0.1 ~ 100 pg/kg體重。用體內(nèi)脂質(zhì)體或是病毒轉(zhuǎn)運(yùn)載 體可以將融合蛋白導(dǎo)入細(xì)胞。適用于本發(fā)明的多種轉(zhuǎn)運(yùn)栽體對(duì)本領(lǐng)域 技術(shù)人員是公知的。本發(fā)明的組合物可以每日、每周或是遵醫(yī)囑施用 持續(xù)需要的時(shí)間。本發(fā)明的藥用組合物可用公知的制備能施用給患者的可藥用載體 的方法制備，從而使有效量的核苷酸或多肽分子與可藥用的載體結(jié)合形成混合物。這些適合的載體，在例如雷明頓制藥學(xué)(Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton， Pa. ， USA) 中已有闡述。在此基礎(chǔ)上，所述藥用組合物可以包括與一種或多種可 藥用的載體或稀釋液相結(jié)合、并存在于具適當(dāng)pH值并與生理液體等滲 的緩沖液中的活性化合物或物質(zhì)，例如復(fù)合核酸分子、多肽分子或融 合蛋。結(jié)合活性分子和載體或?qū)烧吲c稀釋劑結(jié)合的方法對(duì)本領(lǐng)域技 術(shù)人員是公知的。所述組合物可包括用于運(yùn)送活性化合物到組織內(nèi)特 定部位的乾向制劑(targeting agent)?？梢詫?duì)與GLP-1或Ex4受體有相同序列的蛋白進(jìn)行試驗(yàn)以證明它 們適用于本發(fā)明的方法。有機(jī)小分子同樣也試驗(yàn)過(guò)。本發(fā)明包括那些 已經(jīng)用本發(fā)明的篩選方法確認(rèn)的化合物，以及那些適合于本發(fā)明的方 法和用途的化合物，以及本發(fā)明的藥用組合物中的化合物。在優(yōu)選的 實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一個(gè)評(píng)價(jià)候選化合物是否能增加cAMP的產(chǎn) 生、增加Akt-1或MAPK的表達(dá)或活性、或是減少caspase-3的表達(dá)或 活性的鑒定方法。通過(guò)培養(yǎng)細(xì)胞(優(yōu)選(3-細(xì)胞)并在至少存在一種能 調(diào)節(jié)(抑制或激活)表達(dá)活性化合物的情況下，測(cè)定和監(jiān)測(cè)細(xì)胞是增 加還是減少Akt-1或MAPK表達(dá)或活性，或者是否減少caspase-3的表 達(dá)或活性。受體結(jié)合試驗(yàn)(receptor binding assay)是評(píng)價(jià)化合物對(duì)細(xì)胞膜受體 的特異性的優(yōu)選方法，因?yàn)樗械男盘?hào)傳導(dǎo)事件都起始于這種配體-受 體的結(jié)合。如果候選化合物與受體結(jié)合(例如，通過(guò)交聯(lián)技術(shù)的凝膠-移動(dòng)遷移率試驗(yàn)或竟?fàn)幨荏w結(jié)合試驗(yàn)來(lái)鑒定)，這種結(jié)合表明該化合物適合在本發(fā)明隨后的步驟中使用。受體激活試驗(yàn)可用于進(jìn)一步測(cè)定候 選化合物是否適合本發(fā)明的方法。例如，cAMP測(cè)定可用于評(píng)價(jià)受體的激活(GLP-1受體為GPCR)。此外，Akt激酶試驗(yàn)可進(jìn)一步說(shuō)明Akt 的激活。在最初的篩選中，當(dāng)有大量候選化合物時(shí)，可使用受體結(jié)合 試驗(yàn)。對(duì)結(jié)合到受體上的化合物優(yōu)選進(jìn)行cAMP測(cè)定和最終的的Akt 激酶試驗(yàn)。有機(jī)小分子同樣可以作為候選化合物來(lái)測(cè)定其對(duì)本發(fā)明的 方法的適用性。最后，可選擇使用cAMP測(cè)定以篩選對(duì)GPCR的結(jié)合 與激活。正如以上提到的每一項(xiàng)測(cè)定原理所描述的，Akt激酶試驗(yàn)，或 MAPK試驗(yàn)非必須地用于評(píng)價(jià)化合物的細(xì)胞效率。為驗(yàn)證所篩選的多肽和有機(jī)分子化合物，可以在前期糖尿病動(dòng)物 模型長(zhǎng)期(如2-12周)給予本發(fā)明的化合物后進(jìn)行P -細(xì)胞質(zhì)量分析。 為此，也可使用胰島素放射免疫測(cè)定試劑盒(Linco Research, St. Louis， MO)進(jìn)行另外的胰島素釋放的檢測(cè)。這些試驗(yàn)手段可用來(lái)證明所篩選 的化合物對(duì)(3 -細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。為了驗(yàn)證篩選的載體，可以通過(guò)基因 轉(zhuǎn)移(genetransfer)對(duì)前糖尿病動(dòng)物模型施用DNA質(zhì)粒。如果需要，可 以每2個(gè)月、6個(gè)月或1年進(jìn)行重復(fù)施用。本發(fā)明的組合物可以與已知的I型和/或II型糖尿病的治療措施如 使用降糖藥物或結(jié)合胰島素共同進(jìn)行治療。例如，治療糖尿病的藥物 可以包括Actos、 Amaryl、 avandia、 DiaBeta、 Diabinese、 Dymelor、 Glucophage、 Glucophage XR、 Glucotrol、 GlucotrolXL、 Glucovancc、 Glynase、 PresTab、 Glyset、 Micronase、 Orinase、 Pandin、 Prccose、 Starlix 和Tolmase。例如，適合的胰島素包括Aspart、 Insulin Glargine( Lantus )、 Lente 、 Lispro(Humalog) 、 NPH和Ultralente 。本發(fā)明適用于任何需要此類治療的個(gè)體。這些個(gè)體有可能發(fā)展成 糖尿病、或新近診斷為糖尿病的患者或是已經(jīng)診斷為糖尿病的患者。本發(fā)明與預(yù)防和治療如本文所述的I型和II型糖尿病相關(guān)。例如，這 樣的個(gè)體可以為肥胖的人或有糖尿病遺傳史但尚未發(fā)病的人、或新近 診斷為或已經(jīng)診斷為糖尿病的人。世界衛(wèi)生組織(WHO)根據(jù)身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)定義肥胖。BMI是用Kg體重除以身高米數(shù)的平方得來(lái)。 BMI為18.5~25則體重正常。個(gè)體的BMI為25 -30則為超重，等于 或超過(guò)30則為肥胖。這些個(gè)體也可以是血糖高于相同年齡與體重的正 常值(正常血糖可以是根據(jù)醫(yī)學(xué)參考資料常規(guī)測(cè)定的)的人，盡管還不至 于診斷為糖尿病。這些個(gè)體也可以是有糖尿病遺傳史但是還沒(méi)有發(fā)展 成為糖尿病的人。當(dāng)血糖值高于普遍認(rèn)可的正常范圍時(shí)即可診斷為糖 尿病。根據(jù)ADA (美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì))和CDA (加拿大糖尿病協(xié)會(huì))的 標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)個(gè)體的空腹血糖值超過(guò)7.0 nmol/L，或是隨機(jī)血糖值(任意時(shí) 段的血糖值)超過(guò)11. lnmol/L可認(rèn)定為始患糖尿病。 一旦診斷為糖尿 病，任何對(duì)患者進(jìn)行的對(duì)抗高血糖癥的努力/方法都是治療措施而不是 用于預(yù)防措施。有些人盡管還沒(méi)有診斷為糖尿病，(例如，肥胖人群， 其過(guò)量的體重通常與胰島素抵抗相關(guān))健康狀況不佳，有發(fā)展為II型糖 尿病的高風(fēng)險(xiǎn)。為降低或減少其發(fā)展為II型糖尿病的高風(fēng)險(xiǎn)，施用本 發(fā)明的化合物用于預(yù)防和/或治療II型糖尿病。此外，施用本發(fā)明的化 合物以預(yù)防或治療I型糖尿病。I型糖尿病是指通常有遺傳性易患病 體質(zhì)、或具有胰島P-細(xì)胞損傷、或具有缺乏胰島素反應(yīng)第一期的"前" 糖尿病、或是剛剛診斷為糖尿病的個(gè)體。在新近診斷為I型糖尿病的患 者中，免疫系統(tǒng)攻擊并破壞產(chǎn)生胰島素的胰島(3-細(xì)胞的結(jié)果是他們的 胰腺不產(chǎn)生或是產(chǎn)生很少的胰島素。本發(fā)明還提供了新的編碼融合蛋白的質(zhì)粒，該融合蛋白編碼含有 通過(guò)應(yīng)用交迭PCR(聚合酶鏈反應(yīng))得到的人GLP-1 (7-37)和人或鼠IgG-Fc(圖1)。圖例顯示IgG-Fc區(qū)域含有鼠IgGl恒定重鏈(包括Cin、合蛋白可以表達(dá)后分泌到細(xì)胞外培養(yǎng)液環(huán)境中去的方法。如圖顯示，一段IgK分泌先導(dǎo)肽序列與GLP-1序列融合引導(dǎo)合成的多肽分泌到培 養(yǎng)液中。在本發(fā)明的實(shí)施例中， 一段人類生長(zhǎng)激素釋放激素(GIIRII) 先導(dǎo)月太序歹寸(gtg etc tgg gtg ttc ttc ttt gtg ate etc acc etc age aac age tec cac tgc tec )與GLP-1及IgG-Fc序列融合引導(dǎo)合成的多肽分泌到培養(yǎng)液中。 每一個(gè)實(shí)施例中，這一戰(zhàn)略保證了在分泌過(guò)程中在切除分泌先導(dǎo)肽之 后將使產(chǎn)生的GLP-1與IgG-Fc融合蛋白N端的活性組氨酸殘基融合。 有代表性的GLP-l/IgG-Fc見(jiàn)圖1。這種方法能達(dá)到1 )由于Fc融合 蛋白以均一的二聚體的形式分泌，GLP-l-Fc融合蛋白半衰期長(zhǎng)并且， 其較高的配體親和性從而使融合蛋白具有更高的效價(jià)。2)由于大量的 GPCR在細(xì)胞表面以二聚體的前體形式存在，因而增強(qiáng)了多肽的藥效。 3)簡(jiǎn)化了純化過(guò)程。利用G蛋白葡聚糖凝膠可以一步完成提純，利于 融合蛋白的分離純化。本專利還公開(kāi)了使用哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)證明了上述融合蛋白的新 載體的表達(dá)。為評(píng)估載體表達(dá)和分泌GLP-l/IgG-Fc融合蛋白的能力， 將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染至COS-7細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后48h，從表達(dá)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞中 提取總RNA,用RT-PCR評(píng)估融合蛋白的表達(dá)情況。用基因特異性 引物(圖2aH企測(cè)GLP-l-Fc融合蛋白和IgG-Fc對(duì)照蛋白在轉(zhuǎn)錄水平 上的表達(dá)。而非轉(zhuǎn)染樣品沒(méi)有檢測(cè)到上述蛋白在基因轉(zhuǎn)錄水平上的表 達(dá)。用Western免疫印跡法和抗鼠抗體還分析了轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞裂 解物和細(xì)胞培養(yǎng)液以確定融合蛋白在翻"^斧水平上的表達(dá)。如圖2b中所示，在培養(yǎng)液和細(xì)胞裂解物檢測(cè)Fc融合蛋白?？梢酝ㄟ^(guò)RT-PCR (逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))、Western免疫印跡法或GLP-1放射免疫法 (RIA)來(lái)檢測(cè)融合蛋白。在條件培養(yǎng)液和細(xì)胞裂解物中同時(shí)檢測(cè)融合 蛋白表明融合蛋白已經(jīng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中合成并分泌。由于GLP-1放射免疫法可以檢測(cè)鑒別所有形式的GLP-l,因此利 用RIA進(jìn)一步確i人了 GLP-1融合蛋白的特征。COS-7細(xì)胞系分別瞬時(shí) 轉(zhuǎn)染了遞增量的GLP-l/IgG-Fc質(zhì)粒和IgG-Fc-only質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后48h 收集細(xì)胞培養(yǎng)液。將該培養(yǎng)液用于GLP-1 RIAs以檢測(cè)總的GLP-1。而 在未轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染IgG-Fc-only的COS-7細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)到GLP-1的存 在，從轉(zhuǎn)染GLP-l/IgG-Fc的細(xì)胞收集的培養(yǎng)液中檢測(cè)到與DNA轉(zhuǎn)染 量依賴的GLP-1 (圖3 )。從50mL培養(yǎng)液(接種濃度約1.25x 105個(gè)細(xì) 胞/ml， 2天靜止培養(yǎng))利用G蛋白葡聚糖凝膠一步純化融合蛋白 (Jungbauer等人，J Chromatogr. 1989;476:257-268 )得到約300嗎融 合蛋白。樣品再分別經(jīng)還原和非還原的2種凝膠電泳分離并經(jīng)考馬斯 亮蘭染色分別檢測(cè)到了一個(gè)約35 kDa或約70 kDa的條帶(圖4 ),表 明二聚體GLP-l/IgG-Fc融合蛋白以天然狀態(tài)存在。融合蛋白顯現(xiàn)出在 INS-1細(xì)胞中以葡萄糖水平依賴的形式刺激分泌胰島素(圖6)和cAMP 產(chǎn)生(圖7)能力。用各種檢測(cè)方法對(duì)融合蛋白GLP-l/IgG-Fc(其DPP-IV抗性突變體 型和Ex4-IgG-Fc)進(jìn)行了試驗(yàn)和證實(shí)。試驗(yàn)方法包括受體結(jié)合試驗(yàn)， cAMP (腺苷3',5'-環(huán)一磷酸)試驗(yàn)和用在適當(dāng)?shù)拇碳l件下可以分泌 胰島素的(3-細(xì)胞進(jìn)行胰島素刺激試驗(yàn)。其他檢測(cè)技術(shù)用還可來(lái)研究在 融合蛋白作用下p-細(xì)胞的增殖和GLP-l/IgG-Fc及其衍生物作用下 GLP-1受體的激活下信號(hào)的連鎖傳導(dǎo)。這些試驗(yàn)包括增殖試驗(yàn)(311-胸苷結(jié)合試驗(yàn))，AKt激酶活性試驗(yàn)，促細(xì)胞分裂劑激活性蛋白激酶(MAPK )試驗(yàn)以及應(yīng)用caspase-3或其他caspase家族成員進(jìn)行的凋亡 試驗(yàn)。體內(nèi)表達(dá)GLP-l/IgG-Fc分子的技術(shù)描述如下。例如在鼠或是豬體 內(nèi)，通過(guò)肌肉注射融合蛋白可以持續(xù)性地在體內(nèi)表達(dá)?？梢愿郊討?yīng)用 局部電轉(zhuǎn)移技術(shù)因?yàn)槠淇梢詷O大地提高基因轉(zhuǎn)移這可能在人體和大型 動(dòng)物中的需要。在本研究中，每周都要測(cè)定動(dòng)物的體重和空腹血糖。 在注射前、第一次注射后2周和12周的時(shí)候收集隱靜脈血以測(cè)定空腹 胰島素和血糖水平。用GLP-1 Elisa試劑盒(Linco)測(cè)定血漿中活性 GLP-1的水平來(lái)評(píng)價(jià)GLP-1 /IgG-Fc蛋白的表達(dá)。如圖中所示，在第一 次注射兩周后，與注射IgG-Fc載體的小鼠相比，注射GLP-l/IgG-Fc的 小鼠血漿中的GLP-1水平有顯著提高。在注射16周后這些升高的 GLP-1水平下降，但是仍然高于對(duì)照小鼠的水平(圖表8A)。在一個(gè)實(shí)施方案中，顯示的是GLP-l/IgG-Fc、 GLP-lA8G/IgG-Fc 和Ex4/IgG-Fc在預(yù)防和治療I型和II型糖尿病中有效，用于實(shí)施例中， 1)前期糖尿病db/db鼠作為II型糖尿病的模型；2)由鏈脲霉素(STZ) 誘導(dǎo)的I型缺乏胰島素的鼠作為I型糖尿病模型。Db/db小鼠缺乏功能 性的瘦素受體，因此形成肥胖、高胰島素癥(hypennsulinemia)并在4 到6周齡時(shí)出現(xiàn)葡萄糖不耐受，在8周齡時(shí)出現(xiàn)明顯的糖尿病。因此 這些小鼠被廣泛應(yīng)用并被認(rèn)為是II型糖尿病的模型。通過(guò)低劑量，多 次用藥，使用鏈脲霉素(STZ)誘導(dǎo)缺乏胰島素的小鼠。鏈脲霉素可以 特異性地破壞(3-細(xì)胞，伴隨T-細(xì)胞介導(dǎo)的浸潤(rùn)。因此這些小鼠被被廣 泛應(yīng)用并被認(rèn)為是模擬個(gè)體I型糖尿病的動(dòng)物模式。目前可以獲得并 能應(yīng)用于本發(fā)明的其他小鼠糖尿病模型還有高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗的小鼠模型；這種小鼠因過(guò)度攝入脂肪導(dǎo)致體內(nèi)脂肪過(guò)量沉積， 因而形成肥胖，具胰島素抗性，和葡萄糖的不耐受性。另一種動(dòng)物模型是非肥胖糖尿病(NOD)小鼠。這些小鼠是很好的自體免疫型糖尿 病(I型糖尿病)模型，其中胰島抗原活性T-細(xì)胞浸潤(rùn)胰島并殺死胰 島細(xì)胞，和/或是引起炎癥過(guò)程使胰島細(xì)胞死亡(Anderson和Bluestone, 2005)。通過(guò)非病毒性基因治療途徑施用GLP-l/IgG-Fc (或者Ex4/IgG-Fc ) 的在預(yù)防和治療I型和II型糖尿病中有效。編碼本發(fā)明的任意融合蛋 白例如GLP-l/IgG-Fc分子(或者它的DPP- IV抗性融合蛋白或者 Ex-4/IgG-Fc分子)的非病毒性載體用于治療是有效的。通過(guò)基因轉(zhuǎn)染和 對(duì)4周齡db/db受試鼠施加電脈沖即電穿孔施用上述的融合蛋白。在所有 的受試鼠中，在第一次注射后2周進(jìn)行第二次注射，并監(jiān)控受試鼠糖尿病的進(jìn)展情況。遺傳性缺乏瘦素受體的必/必鼠是嚙齒類的n型糖尿病模型(Leiter, FASEB J. 1989,3 ( 11):2231-2241 )。如上所示，同時(shí)通過(guò) 基因治療途徑用GLP-l/IgG-Fc處理的年齡匹配的c/b/c/b鼠在16周齡時(shí)(注 射后12周)顯示出血糖量正常，而對(duì)照組小鼠空腹血糖(FBG)水平 則高出了正常范圍(圖8)。用GLP-l/IgG-Fc處理過(guò)的受試鼠顯示出空 腹胰島素濃度提高和空腹胰高血糖素濃度降低(圖8)。這些結(jié)果表明 用GLP-l/IgG-Fc的治療可以防止db/db鼠發(fā)生糖尿病。在表達(dá) GLP-l/IgG-Fc的db/db受試鼠中沒(méi)有糖尿病的發(fā)生，這與我們先前的發(fā) 現(xiàn)結(jié)果即每日注射Ex4 (i.p.)持續(xù)兩周可以阻止db/db受試鼠糖尿病的 發(fā)展的結(jié)果(Wang和Brubaker， Dmbetobgm. 2002;45 ( 9 ) : 1263-1273 ) 是非常吻合的。我們目前的治療方案的意義在于肌肉注射GLP-l-Fc載 體2次獲得了與連續(xù)兩周每天腹膜腔注射Ex4相似的效果。通過(guò)基因轉(zhuǎn)移并通過(guò)局部電轉(zhuǎn)移法增強(qiáng)將GLP-1/IgG-Fc和 Ex4/IgG-Fc分別被4殳送到CD1受試鼠中。DNA注射7天后，對(duì)小鼠進(jìn) 行了 一次后續(xù)注射并開(kāi)始連續(xù)5天每天注射STZ ( 55mg/kg, i.p.)。結(jié)果 發(fā)現(xiàn)，IgG-Fc-對(duì)照小鼠的血糖濃度顯著上升，幾天后血糖濃度達(dá)到了 糖尿病的水平(17 mM),但是GLP-l/IgG-Fc (或者Ex4/IgG-Fc )小鼠 受到保護(hù)并顯現(xiàn)出明顯糖尿病的低發(fā)生率(圖9)。胰腺的組織學(xué)研究 表明這兩組小鼠中都存在胰島(3-細(xì)胞被破壞的現(xiàn)象，但是 GLP-l/IgG-Fc (或者Ex4/IgG-Fc)小鼠被破壞的程度較輕(圖9),這 表明了 GLP-l/IgG-Fc (或者Ex4/IgG-Fc )對(duì)p-細(xì)胞有保護(hù)作用。在兩 組小鼠中都觀察到單核細(xì)胞(淋巴細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞)浸潤(rùn)胰島(附圖 中未顯示)。有趣的是，盡管預(yù)期Ex4/IgG-Fc能抗DPP-1V降解，但是 Ex4/IgG -Fc的治療效果卻與GLP-l/IgG-Fc的相近。盡管出現(xiàn)胰島發(fā)炎 的情況(胰島炎)，但這些發(fā)現(xiàn)還是表明了 GLP-l/IgG-Fc (或者 Ex4-IgG-Fc)可以抵抗鏈脲霉素誘導(dǎo)的f3-細(xì)胞損傷。GLP-l/IgG-:Fc(或 者Ee-4/IgG-Fc)的治療能保護(hù)(3-細(xì)胞免受鏈脲霉素誘導(dǎo)的損傷，其可能 原因是GLP-l/IgG-Fc或者Ex-4/IgG-Fc加速了卩-細(xì)胞的增殖和新生， 減少了 P-細(xì)胞的凋亡。這些發(fā)現(xiàn)與先前在這些小鼠中使用GLP-1/Ex4 的研究結(jié)果是一致的。本專利中所述的GLP-1衍生分子是由融合GLP-1與IgG-Fc cDNA 序列的結(jié)果(圖1)。在本專利的實(shí)施方案中，IgG的進(jìn)一步分類可以 是鼠IgG!或是人IgG2。在本發(fā)明的融合蛋白中用人IgG2較使用其他類 型的IgG，如IgG4有著很大優(yōu)越性。不像IgG4， IgG2并不結(jié)合Fc-yR I 。 Fc-yR I是激活型的Fc受體可以高親和性地結(jié)合單價(jià)的IgG。因此 IgG2不會(huì)傳遞任何活性信號(hào)以激活免疫細(xì)胞上Fc受體更不會(huì)傳遞任何由FC受體激活而引起的激活其他效應(yīng)因子的效應(yīng)。繼而，由于種群在Fc受體的遺傳差異尤其是在Fc-YRIIa活性受體上的差異，只有在50% 的人群中IgG2可能能充當(dāng)調(diào)理素(opsonin)的角色。相比之下，由于 IgG4能與Fc-yRI結(jié)合，因此IgG4在所有人群中充當(dāng)調(diào)理素角色。顯而 易見(jiàn)，在IgG2不充當(dāng)調(diào)理素的人群中，表面結(jié)合有IgG2-Fc分子的細(xì) 胞被巨噬細(xì)胞或吞噬細(xì)胞攻擊和吞噬的可能性會(huì)降低。另外，由于 Fc-yRIIa受體的多態(tài)性，在缺乏調(diào)理素性(opsonization)的50%的人 群中，正由于IgG2-Fc對(duì)效應(yīng)免疫細(xì)胞缺乏激活效應(yīng)，IgG2-Fc不能激 活效應(yīng)免疫細(xì)胞。相反，與IgG4相比較，因?yàn)镮gG2能激活抑制型的 Fc-YRIIb受體因此其對(duì)一些免疫細(xì)胞調(diào)控的抑制效應(yīng)得到加強(qiáng)。這意味 著，F(xiàn)c受體的遺傳差異會(huì)使大約50%的人群受益，即，IgGrFc的安全 性要好于IgG4-Fc。另 一項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)是，懷孕的婦女經(jīng)胎盤轉(zhuǎn)移的IgG2會(huì)少， 從而降低任何對(duì)胎兒的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于育齡婦女而言，這是一個(gè)很重要的 J尤點(diǎn)(Kolar, GR and Capra, JD. Immunoglobulins: Structure and Function. In Fundamental Immuhnology(Ed. William E. Paul), Lippmcott Willimans and Wilkins publishers, Philadelphia, 2003, pp.47-68; Janeway Jr, CA, Travers, P, Walport M, Schlomchik MJ(Editors). Immunobiology, Garland Science publishers, New York, 2005， pp. 387-391; and Roitt, R, Brostoff， J， Male, D(Editors). Immunology, 6th Edition, Mosby publishers, Kdinburgh, 2001， pp/ 73-78)?；贗gG-Fc的藥物有多項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)。因?yàn)镮gG融合分子以70Kda均一 二聚體的形式制備，并不會(huì)被腎臟在短時(shí)間內(nèi)清除，故它們具有實(shí)質(zhì) 上更長(zhǎng)的半衰期(Larrick and Fry, Hum Antibodies Hybridomas. 1991 ;2 (4) :172-189; Weir等人，BiochemSoc Trans. 2002;30 (4) :512-516)。因此，大的GLP-l/IgG-Fc同型二聚體融合分子較天然GLP-1半衰期增 長(zhǎng)。由于一些酶更容易降解較小的多肽(Hupe-Sodmann等人，Regul Pept. 1995;58 (3 ) :149-156 )，而分子量較大的GLP-l/IgG-Fc不容易被 降解。而且GLP-1 二聚體可以增加配體的親和性，通過(guò)預(yù)先形成的 GPCR 二聚體/多聚體(George等人，Nat Rev Drug Disco v. 2002; 1 (10 ) :808-820; Dupms等人，Brain Res Mol Brain Res. 1999;67 (1 ) :107-123 )增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，因此以同型二聚體形式存在的 GLP-融合分子有更多潛力結(jié)合更多的GLP-1受體。本專利所進(jìn)行的 cAMP和胰島素分泌試驗(yàn)表明，本發(fā)明的融合蛋白在克隆INS-1細(xì)胞中 能活化GLP-lRs。融合蛋白以葡萄糖依賴性的方式促進(jìn)胰島素分泌， 進(jìn)一步表明GLP-1融合蛋白保留著天然GLP-1的生物學(xué)功能。GLP-l/IgG-Fc融合蛋白在體內(nèi)有降血糖的作用已在由肌肉注射進(jìn) 行轉(zhuǎn)基因的db/db小鼠中得到了證明。這種方法具有在持續(xù)數(shù)周的時(shí)間 里連續(xù)釋放融合蛋白進(jìn)入血液循環(huán)中的優(yōu)點(diǎn)。肌肉注射GLP-l/IgG-Fc 載體db/db小鼠中，兩周以后已經(jīng)可以檢測(cè)到在血液循環(huán)中的GLP-1 融合蛋白，但是作為對(duì)照的只注射IgG質(zhì)粒載體的小鼠中卻檢測(cè)不到 GLP-1融合蛋白。有趣的是，僅在第一次注射后12周觀察到空腹血糖 有明顯的下降。在表達(dá)GLP-l/IgG-Fc的小鼠中空腹血糖水平的下降伴 隨著空腹胰島素水平的增加和空腹胰高血糖素水平的下降，這說(shuō)明由 于胰島素的分泌增強(qiáng)了，同時(shí)抑制了胰高血糖的釋放，使得空腹血糖 達(dá)到了正常的水平。db/db受試鼠作為重癥II型糖尿病模型是因?yàn)樗谑菟匦盘?hào)傳導(dǎo)途 徑方面存在缺陷(Herberg and Coleman, Metabolism. 1977;26( 1 ) :59-99; Chen等人，Cell. 1996;84 ( 3 ) :491-495 )。起初，可能由于db/db受試鼠糖尿病進(jìn)行性的不減弱的發(fā)展，受試組與對(duì)照組血糖水平都持續(xù)升高， 注射融合蛋白基因的受試鼠血糖在注射后3月才觀察到趨于正常。對(duì)比一般肌肉DNA注射試驗(yàn)質(zhì)粒的表達(dá)都在注射后1 - 2周出現(xiàn)峰值。我們 的試驗(yàn)顯示，注射2周后血清中GLP-l的水平開(kāi)始增加(圖8A)。這一 增加導(dǎo)致的血糖水平實(shí)現(xiàn)正常，空腹胰島素增加和胰高血糖素減少卻 是較晚的時(shí)候才觀察到。有可能血糖的正?；嗟厥鞘艿饺诤系鞍?對(duì)胰腺p-細(xì)胞再生(包括p-細(xì)胞增殖和新生)的影響。而較少地受到天 然GLP - 1通常有的即時(shí)胰島素敏感性效應(yīng)的影響。另外，盡管我們沒(méi)有看到一些例子中對(duì)嚙齒動(dòng)物模型用天然GLP-1 治療觀察到的降低體重的作用(Turton等人，Nature. 1996;379(6560) :69-72)。我們也沒(méi)有觀察到GLP-l/IgG-Fc對(duì)動(dòng)物有厭食的情 況發(fā)生(Kim等人，Diabetes. 2003;52 (3 ) :751-759)。盡管長(zhǎng)時(shí)間而有 效的GLP-l受體激動(dòng)劑Ex4的處理改變了肥胖癥小鼠的空腹血糖并伴隨 著P-細(xì)胞質(zhì)量和功能的增強(qiáng)(Wang和Brubaker, Dmbetologia. 2002;45(9 ):1263-1273 )。但是，體重和外圍胰島素敏感性依然沒(méi)有改變(Wang 和Brubaker， Diabetologia. 2002;45 ( 9 ) :1263-1273 )。這個(gè)發(fā)現(xiàn)更進(jìn)一 步支持了僅有胰島素抵抗不足以導(dǎo)致II型糖尿病的發(fā)生，只有當(dāng)B細(xì)胞 功能失常時(shí)才會(huì)發(fā)生II型糖尿病(Weyer等人，J Clin Invest. 1999;104(6 ) :787-794; Weyer等人，Diabetes. 1999; 48 ( 11 ): 2197- 2203 )。 GLP-1 的厭食效果取決于對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦部多個(gè)區(qū)域的作用(Schick等人, Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2003;284 ( 6 ) : R1427-R1435 )， GLP-l/IgG-Fc融合蛋白穿透血腦屏障的能力還需要進(jìn)一步的探究。經(jīng)由對(duì)肌肉組織注射棵露的DNA質(zhì)粒不僅比其他大多數(shù)組織更為 便捷(Wolff等人，Biotechmques. 1991;11 ( 4 ) :474-485; Wolff等人,Science. 1990;247 (4949Ptl) :1465-1468 )。而且轉(zhuǎn)基因肌肉組織的表 達(dá)通常比其他組織中更為長(zhǎng)久，條紋狀的肌細(xì)胞是非分裂的壽命較長(zhǎng) 的細(xì)胞可能與此有關(guān)。通常注射棵露的DNA效率并不高，而活體施加 電轉(zhuǎn)移能極大地改善轉(zhuǎn)移效率(50 ~ IOOO倍)(Wells, Gene Ther. 2004,11 (18 ) :1363-1369; Mir等人，Proc Natl Acad Sci USA. 1999;96 (8) .4262-4267)。認(rèn)為電脈沖能在細(xì)胞膜上造成暫時(shí)性的孔從而促進(jìn) DNA轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)胞。我們施加了低的電場(chǎng)強(qiáng)度(100 ~ 200V/cm )和相對(duì) 較長(zhǎng)的(20 ~ 50 mS )方波電脈沖，快速連續(xù)6 ~ 8次。雖然這種低電壓 電脈沖在某種程度上有可能使肌肉受損，但是它一般較溫和而且是暫 時(shí)的。電轉(zhuǎn)移后2周，肌肉基本上可以恢復(fù)正常(Mathiesen, Gene Ther. (1999;6 (4 ) : 508-514)。肌肉注射質(zhì)粒載體并結(jié)合體內(nèi)電轉(zhuǎn)移已被證明是基因轉(zhuǎn)移有效而 安全的方法。這種方法已被廣泛使用，并已經(jīng)用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞因子、肽 類激素、可溶性受體以及許多膜結(jié)合蛋白或細(xì)胞質(zhì)蛋白。確實(shí)如此， 這種方法在系統(tǒng)性地轉(zhuǎn)染諸如GLP-l/IgG-Fc融合蛋白這類蛋白質(zhì)類調(diào) 節(jié)因子方面特別有用。IgG融合技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是在試驗(yàn)室可以通過(guò)簡(jiǎn)單的 一步程序得到試驗(yàn)室規(guī)模量的GLP-l/IgG-Fc融合蛋白。GLP-lRIAs表明 細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)效率要低于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)效率， 這可能歸結(jié)于在大腸桿菌中表達(dá)較COS-7細(xì)胞表達(dá)的錯(cuò)誤折疊(misfold) 的蛋白質(zhì)。雖然Rosetta ga/m 2細(xì)菌細(xì)胞表達(dá)的正確折疊和功能化蛋白 比起其他細(xì)菌系已大大提高(Pnnz等人，J Biol Chem. 1997;272(25 ) :15661-15667)這種提高是通過(guò)增加細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)體中蛋白二硫健 的形成并提供大腸杵菌系統(tǒng)中缺乏的特異密碼子的tRNAs實(shí)現(xiàn)(Kurland和Gallant, Curr Opm Biotechnol. 1996;7 ( 5)) 489-493 )?？傊景l(fā)明是GLP-1 (鼠源或人源，因?yàn)镚LP-1在一些物種中是相同的(Perfetti and Merkel, Eur J Endocrinol. 2000;143(6)717-725, Holst， Gastroenterology. 1994; 107(6)1848- 1855 )與IgG-Fc衍生物融合(形成 GLP- 1/IgG-Fc )以增加半衰期、增強(qiáng)在體內(nèi)活性并減少免疫原性。 GLP-l/IgG-Fc融合蛋白以天然二價(jià)的形式存在。融合蛋白表現(xiàn)出在 INS-1細(xì)胞中以葡萄糖依賴性的方式刺激胰島素分泌和產(chǎn)生cAMP的功 效。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，GLP-l/IgG-Fc融合蛋白可以直接通 過(guò)注射施用。用鼠糖尿病模型體內(nèi)試驗(yàn)表明，可以通過(guò)非病毒性的基 因療法施用，這種方法可以在體內(nèi)長(zhǎng)久表達(dá)融合蛋白。在p-細(xì)胞受損的 I型糖尿病模型上證明可以保護(hù)免于發(fā)生STZ誘導(dǎo)的糖尿病；在II型糖尿 病db/db鼠模型證明可以治療糖尿病。最后，還證明該組合物能對(duì)抗四 氧嘧啶一水化物誘導(dǎo)的豬的高血糖癥。上述公開(kāi)的內(nèi)容對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了大體的描述。通過(guò)參考下列具體 實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做更全面的理解。這些實(shí)施例僅僅是為了進(jìn)一步的說(shuō) 明，而不是為了限定本發(fā)明的范圍。換言之， 一些形式上的變異或替 換是用作達(dá)意的考量。因此，在下文例引用的一些特殊的術(shù)語(yǔ)旨在達(dá) 意，而非限止其意的目的。實(shí)施例實(shí)施例l:載體的構(gòu)建使用交迭PCR (overlap PCR )構(gòu)建了含有人GLP-1 (7-37)和鼠 IgG廣Fc的編碼融合蛋白的載體。IgG廣Fc區(qū)含有IgGi恒定重鏈(CH1、 鉸鏈、CH2和CH3部分)。將IgK分泌先導(dǎo)肽序列與GLP-l序列融合以便 引導(dǎo)合成的融合蛋白分泌到培養(yǎng)液中。編碼hGHRH/hGLP-1融合蛋白的 cDNA是化學(xué)合成的，并將其連接到編碼人IgG2-FC (鉸鏈-CH2-CI-13 )的PCR擴(kuò)增的cDNA上，然后插入pAV0243載體的Nco I和Hmd III位點(diǎn) 間構(gòu)建GLP- l/hIgG-Fc/pAV0243載體。可分泌的GLP- 1/hlgG-Fc融合蛋白 含有IgG2恒定重鏈(鉸鏈、CH2和CH3 )。 GHRH分泌引導(dǎo)肽序列與 GLP-l序列融合？ 1導(dǎo)合成的蛋白分泌到細(xì)胞培養(yǎng)液中。該方法確保在分 泌過(guò)程中，分泌引導(dǎo)肽被切除之后，融合蛋白的GLP-1的氨基端可以和 一個(gè)活性組氨酸殘基融合。圖l顯示了分泌的GLP-l/IgG-Fc融合蛋白的 圖示。其特點(diǎn)是l )解決了GLP-1半衰期短的問(wèn)題，因?yàn)槿诤系鞍资且?同型二聚體的形式分泌的，在體內(nèi)具有長(zhǎng)的半衰期并由于配體的高度 親和性而達(dá)到了高效價(jià)(Ozmen等人，J Immunol. 1993; 150 (7 ) :2698-2705; Kurschner等人，J Immunol. 1992;149( 12 ) :4096-4100; Kurschner等人，J Biol Chem. 1992;267 ( 13 ) :9354-9360 ) ; 2 )由于大多 數(shù)GPCR是在細(xì)胞表面預(yù)先形成二聚體(George等人，Nat Rev Drug Discov. 2002;l(10):808-820; Dupms等人，Brain Res Mol Bram Res. 1999;67(1):107-123 )，因而多肽與其受體的結(jié)合將更為有效；3 )有利于 生產(chǎn)中的提純過(guò)程，可以通過(guò)G蛋白葡聚糖凝膠一步純化(Jungbaucr等 人，Chromatogr. 1989;476:257-268 )。使用基因特異性引物和交迭PCR從GLP- 1/PCR2.1 (黃(X Huang ) 博士惠贈(zèng))和IgG質(zhì)粒擴(kuò)增全長(zhǎng)GLP-l和鼠IgG-FccDNA。對(duì)于第一輪 交迭PCR， 4吏用TACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACCA-3，和5'-TGCTGAAGGGACCTTTACCAGTG-3，。在第二輪交迭PCR中使用 PCR產(chǎn)物制備備用(contmgent)GLP-l/IgG-Fc cDNA。將擴(kuò)增的產(chǎn)物亞克 隆到載體d Bam HI和Eco RV位點(diǎn)。為構(gòu)建編碼IgG-Fc的對(duì)照載體，使用ACCGTCACC-3，和5'-CGCGGATCCCTATCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGG-3，通過(guò) PCR單獨(dú)擴(kuò)增IgG cDNA，并克隆到載體Bam HI和Eco RV位點(diǎn)。用于編碼人IgG2Fc (鉸鏈-ch2-ch3)的cDNA片段的PCR-擴(kuò)增的引 物為5'-AAGGATATCGATCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCA-3'和 5 ，-CGTAAGCTTC ATTTACCCGGAGACAGGG AGAG-3 ，。載體含有CMV直接-早期(immediate-early)增強(qiáng)子和啟動(dòng)子、單一真 核生物轉(zhuǎn)錄單元，兔最小)3球蛋白多聚腺噪呤尾和轉(zhuǎn)錄終止序列 (Hartikka等人，Hum Gene Ther. 1996;7 ( 10) :1205- 1217)。載體是 VR1255載體(Hartikka等人，Hum Gene Ther. 1996;7( 10 ) :1205-1217 ) 通過(guò)刪除焚光素酶報(bào)告基因改性并添加了限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的衍生 物。為使GLP-l或Exendin-4序列分泌，通過(guò)PCR于其5'端引入IgK-鏈信 號(hào)肽序列。為在細(xì)菌中表達(dá)GLP-l/IgG-Fc融合蛋白，融合cDNA序列通 過(guò)PCR擴(kuò)增并亞克隆至pET-28a載體(Novagen， EMD Bioscience, San Diego， CA )。實(shí)施例2:哺乳動(dòng)物的GLP-l/IgG-Fc融合蛋白的表達(dá)為了估價(jià)載體在表達(dá)與分泌GLP-l/IgG-Fc融合蛋白的能力，構(gòu)建 的融合蛋白載體轉(zhuǎn)染至COS-7細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)。轉(zhuǎn)染后48h,自轉(zhuǎn)染細(xì) 胞中提取總RNA并用RT-PCR評(píng)估表達(dá)效果。應(yīng)用基因特異性引物，檢 測(cè)到GLP-l/IgG-Fc融合蛋白基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)和IgG-Fc對(duì)照基因的表達(dá)(圖2a)。在未轉(zhuǎn)染對(duì)照樣品中沒(méi)有檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。用Western免疫印記法和抗鼠抗體4企測(cè)了轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞裂解物 和細(xì)胞培養(yǎng)液以確定融合蛋白在翻譯水平上的表達(dá)。如圖2b中所示， 同時(shí)在培養(yǎng)液和細(xì)胞裂解物中檢測(cè)到Fc融合蛋白。融合蛋白在電泳遷 移位置大約在35kDa,是在還原的SDS-PAGE條件下融合蛋白單體的分 子量。在條件培養(yǎng)液和細(xì)胞裂解物中同時(shí)檢測(cè)到融合蛋白表明融合蛋 白已經(jīng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中合成并分泌。GLP-1融合蛋白還進(jìn)一步用放射性免疫測(cè)定(RIA)加以鑒定，該 方法可以檢測(cè)以所有形式存在的GLP-1 。用漸增量的 GLP-1 /IgG-Fc/VRnew/Fc-only質(zhì)粒瞬間轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞并在轉(zhuǎn)染后48h 收集細(xì)胞培養(yǎng)液。并將該培養(yǎng)液用于GLP-1 RIA以檢測(cè)總的GIJM。而 在未轉(zhuǎn)染和Fc-only/VRnew轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)到GLP-1的存 在。從GLP-l-Fc/VRnew轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中還檢測(cè)到GLP-1的含量與DNA轉(zhuǎn) 染量呈正相關(guān)(圖3 )。使用了0.8 Hg的DNA對(duì)1.25 x 1()S個(gè)細(xì)胞/mL進(jìn)行 轉(zhuǎn)染。而后從50mLCOS-7培養(yǎng)液純化出總量為100(imol的GLP-l。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)，是將GLP-l/IgG-Fc或IgG-Fc的cDNA通 過(guò)脂質(zhì)體(Lipofectamme)2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)轉(zhuǎn)染到COS-7 細(xì)胞中。其過(guò)程是先將密度為每孔2.5x 1()S個(gè)的COS-7細(xì)胞生長(zhǎng)在6孔細(xì) 胞培養(yǎng)板。添加含有4 (ig GLP-1/ IgG-Fc cDNA和10 ^L轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體的無(wú) 血清無(wú)抗菌素的DMEM (Invitrogen)進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6h后，轉(zhuǎn)換為全 培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染后48h分別收集培養(yǎng)液和細(xì)胞。為了大規(guī)模地表達(dá) GLP-l/IgG-Fc融合蛋白，將生長(zhǎng)在150 mm培養(yǎng)皿內(nèi)的COS-7細(xì)胞用陽(yáng) 離子轉(zhuǎn)染試劑、聚(乙撐亞胺)(Poly(ethyleneimme)(PEI， 25kDa)和80嗎 相關(guān)cDNA轉(zhuǎn)染。用150mMNacl分別稀釋DNA和PEI，混合后培養(yǎng)20分鐘。然后將DNA/PEI復(fù)合物加到細(xì)胞中，并在無(wú)血清無(wú)抗菌素的DMEM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)6h。以加有10% FBS和P/。 P/S的DMEM替換培養(yǎng)液。該 方法的轉(zhuǎn)染率可高達(dá)85%。為建立穩(wěn)定表達(dá)GLP-l/IgG-Fc的COS-7細(xì)胞，將在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板 (2.5 x 1()5個(gè)細(xì)胞/孔)上生長(zhǎng)的細(xì)胞用4ng線性化的GLP-l/IgG-Fc或 IgG-Fc轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24h后，細(xì)胞在含有G418 ( 500 ^g/mL )的DMEM培 養(yǎng)液分裂和培養(yǎng)，以篩選那些已經(jīng)將重組質(zhì)粒穩(wěn)定整合到其基因組內(nèi) 的細(xì)胞。培養(yǎng)過(guò)程中，每3天換培養(yǎng)液一次直至細(xì)胞克隆形成。分離單 克隆細(xì)胞并擴(kuò)展成穩(wěn)定的細(xì)胞系并將這些細(xì)胞系在24-孔板上生長(zhǎng)的組 織培養(yǎng)的上清液用鼠GLP-1 RIA試劑盒(見(jiàn)下文)檢測(cè)融合蛋白。選擇能 分泌融合蛋白的細(xì)胞用作以后的特性分析。實(shí)施例3:從哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液中純化GLP-l/IgG-Fc融合蛋白為進(jìn)行d、規(guī)模的純化，將從轉(zhuǎn)染細(xì)胞收集的培養(yǎng)液(通常為6孔培養(yǎng) 板中每孔取2.5mL)加入用含100mM Tris pH值8.0和150mM NaCl的緩沖 液預(yù)沖洗的70pL(滿體積(packed volume))G蛋白的葡聚糖凝膠4快速洗 脫樹(shù)月旨(Amersham-Pharmacia, Piscataway, NJ )中。在4。C下培養(yǎng)過(guò)夜 后，以Tris緩沖液沖洗，然后以30pL含SDS的樣品緩沖液直接將蛋白從 樹(shù)脂上洗脫。為獲得大量的融合蛋白，應(yīng)用G蛋白葡聚糖凝膠柱可以進(jìn)行中規(guī)模 的蛋白純化。50ml的柱體積可以純化15cm培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)染 GLP-l/IgG-Fc-融合載體的C0S-7細(xì)胞的條件培養(yǎng)液。收集細(xì)胞轉(zhuǎn)染后 48h的50mL DMEM培養(yǎng)液，或是收集穩(wěn)定表達(dá)融合蛋白的細(xì)胞，將其 加入G蛋白葡聚糖凝膠(1 mL滿體積，Amersham-Pharmacia )。加入1 % Tnton x -100在4。C下培養(yǎng)過(guò)夜。然后用含l。/。Triton x -IOO的PBS緩沖液洗滌，然后用150mMNaCl洗滌，最后用lmL 0.1M氨基乙酸(pl12.7) 將蛋白從樹(shù)脂上洗脫。洗脫液立即用Tns緩沖液(pH9.0 )中和并且純 化的蛋白用PD-1 O凝膠柱除鹽(Amersham-Pharmacia)并用PBS洗脫。 如圖中所見(jiàn)(圖4A),兩步洗脫方法可以將大部分融合蛋白由葡聚糖凝 膠柱上洗脫下來(lái)。樣品的組分經(jīng)SDS PAGE溶解并經(jīng)考馬斯亮蘭染色顯 影以評(píng)估產(chǎn)率和純化率(結(jié)果顯示每ml培養(yǎng)液接種1.25 x 105細(xì)胞培養(yǎng) 2d后，融合蛋白得率約為6嗎/mL)。實(shí)施例4: GLP-l/IgG-Fc融合蛋白的細(xì)菌表達(dá)在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)GLP-l/IgG-Fc融合蛋白。為了補(bǔ)償大腸桿 菌BL21細(xì)胞的密碼子偏倚(codon bias),使用了可以促進(jìn)二硫鍵形成并 可額外4荅載質(zhì)粒以表達(dá)7個(gè)罕見(jiàn)的tRNAs的i osetta gam; 2細(xì)胞 (Novagen, EMD, biosciences, San Diego, CA )。用GLP-l/IgG-Fc/pET28a 或lgG-Fc/pET28a載體(Novagen)轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，選擇并篩選出其中幾個(gè)克 隆以最佳表達(dá)融合蛋白。蛋白質(zhì)的表達(dá)是將單一克隆培養(yǎng)在有卡那霉 素的50mL的2X YT培養(yǎng)液中于37。C過(guò)夜培養(yǎng)。而后將培養(yǎng)液稀釋成 (l:50)新培養(yǎng)液，直至細(xì)胞密度達(dá)到O.D6Qo讀數(shù)值0.6后，再在培養(yǎng)液中 添力olmM的IPTG ( EMD ) 3小時(shí)以誘導(dǎo)表達(dá)。收集細(xì)菌并將菌球(pallet) 在-80。C保存以進(jìn)行其他步驟。蛋白質(zhì)的提取簡(jiǎn)言之是將離心后的細(xì)菌 重新懸浮在冰浴的含有蛋白酶抑制劑雞尾酒(Sigma, St. Loms, MO )的 PBS緩沖液后用超聲波裂解細(xì)胞。添力口l。/。Triton x -IOO以溶解蛋白， 30mm后離心(12,000g, 10mm)收集含有融合蛋白的上清液。表達(dá)的融 合蛋白通過(guò)G蛋白葡聚糖凝膠純化并通過(guò)SDS-PAGE和考馬斯亮蘭染 色分析驗(yàn)證(未顯示數(shù)據(jù))。從4L的細(xì)菌培養(yǎng)液中可以提純約120嗎的 GLP-l/IgG-Fc和Fc-only融合蛋白。由哺乳動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌中純化的融合蛋白進(jìn)一 步通過(guò)總GLP-1放射性免疫測(cè)定(RIA)以確定GLP-1的表達(dá)。在表達(dá)GLP-1融合蛋白的 哺乳動(dòng)物和細(xì)菌細(xì)胞中均能觀察到GLP-1水平呈肽劑量依賴性增力6。但 發(fā)現(xiàn)總GLP-1在細(xì)菌中的表達(dá)水平低于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的水平(圖 4B)。實(shí)施例5:分泌GLP-l/IgG-Fc融合蛋白的穩(wěn)定COS-7細(xì)胞經(jīng)過(guò)G 148篩選和用RIA驗(yàn)證細(xì)胞系分泌GLP-1之后，建立起表達(dá) GLP-l/IgG-Fc融合蛋白的穩(wěn)定的COS-7細(xì)胞系。以生長(zhǎng)穩(wěn)定細(xì)胞系的培 養(yǎng)液中總GLP-l水平作為評(píng)估細(xì)胞分泌GLP-l/IgG-Fc融合蛋白水平的 基線。如圖中所示(圖5)，所有表達(dá)Fc-only蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞的分泌 GLP-1的水平都低于培養(yǎng)液的基準(zhǔn)線。我們分離了分泌GLP-1 /IgG-Fc 融合蛋白量高于基線的幾抹穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞并建立了穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系(圖 5)。但是，分泌水平低，增加少于基線的2倍。實(shí)施例6: GLP-l/IgG-Fc融合蛋白的體外特征天然的GLP-1能依賴葡萄糖水平刺激p-細(xì)胞分泌胰島素(100)。為評(píng) 估由哺乳動(dòng)物細(xì)胞系分泌純化的GLP-1 /IgG-Fc融合蛋白是否具有生物 學(xué)功能，將其對(duì)克隆培養(yǎng)的具胰島素分泌功能的INS-1細(xì)胞系的分泌功 能的影響進(jìn)行了評(píng)估。經(jīng)無(wú)血清培養(yǎng)和葡萄糖饑餓的INS-1細(xì)胞用不同 劑量的純化后GLP-l/IgG-Fc融合蛋白處理，同時(shí)添加0、 5或20mM的葡 萄糖進(jìn)行培養(yǎng)。如圖所示(圖6),沒(méi)有葡萄糖存在的情況下， GLP-l/IgG-Fc融合蛋白并不能刺激(3-細(xì)胞的胰島素分泌。然而，在5mM 或20mM葡萄糖存在的情況下，GLP-l/IgG-Fc以劑量依賴的形式刺激卩-細(xì)胞胰島素的分泌。這些數(shù)據(jù)表明，GLP-l/IgG-Fc融合蛋白具有生物 學(xué)活性并可以以葡萄糖依賴的形式刺激(3-細(xì)胞胰島素的分泌。實(shí)施例7: GLP-l/IgG-Fc融合蛋白誘導(dǎo)cAMP圖7顯示，當(dāng)葡萄糖含量為零時(shí)，以120nMGLP-l/IgG-Fc融合蛋白 處理的INS-l細(xì)胞內(nèi)cAMP水平為基礎(chǔ)水平(圖7)。但是，在5mM葡萄糖 存在的條件下，經(jīng)GLP-l/IgG-Fc處理的細(xì)胞的cAMP水平顯著增加，與 經(jīng)Ex-4處理的細(xì)胞cAMP水平幾乎相同(圖7)。這一結(jié)果表明， GLP- 1/IgG-Fc融合蛋白以葡萄糖濃度依賴的方式刺激INS-1細(xì)胞內(nèi) cAMP的產(chǎn)生。實(shí)施例8: GLP-l/IgG-Fc治療預(yù)防db/db小鼠中(H型糖尿病模型) 糖尿病的發(fā)生4周齡的雌性db/db鼠(8&8.0經(jīng)-111+/+1^口3，1^0000642,購(gòu)自Jackson 試驗(yàn)室(Bar Harbor， ME, USA )。年齡背景匹配的對(duì)照鼠C57BLKS/J和 CD1購(gòu)自Charles River Canada ( Motreal， QC,Canada )。受試鼠在有控光 照U2光照/12小時(shí)黑暗)和恒溫條件下飼養(yǎng)，提供充足的(適宜嚙齒類 的)食物和飲水。所有程序都依照加拿大保護(hù)動(dòng)物協(xié)會(huì)的守則進(jìn)行并經(jīng) 多倫多大學(xué)保護(hù)動(dòng)物委員會(huì)批準(zhǔn)。通過(guò)如前所述的DNA注射/電轉(zhuǎn)移法處理糖尿病db/db受試鼠 (Prud'homme and Chang, Gene Ther. 1999;6 ( 5 ) :771-777 )以促進(jìn)基因 轉(zhuǎn)移。簡(jiǎn)言之，對(duì)麻醉處理的受試鼠脛腓骨肌肉注射了含有50叱的 GLP-l/IgG-Fc或IgG-Fc質(zhì)粒的PBS，注射使用有塑料套的27號(hào)針頭以限 制針頭注射深度為5mm。注射后對(duì)肌肉實(shí)行100V方波電脈沖3次以強(qiáng)化 轉(zhuǎn)染效果，每次脈沖間隔ls。在第一次注射后2周，對(duì)所有受試鼠又進(jìn) 行了第二次注射。每周對(duì)其體重和空腹血糖水平進(jìn)行監(jiān)測(cè)。在注射前 和第 一 次注射后2周和12周收集隱靜脈血以測(cè)量空腹胰島素和胰高血糖素水平。DNA注射后4、 6、 32周取空腹條件下的隱靜脈血。用加拿 大Lifecsan公司生產(chǎn)的基礎(chǔ)血糖計(jì)(BC, Canada)測(cè)量空腹血糖水平， GLP-1 、胰島素和胰高血糖素水平的測(cè)量如下所述GLP-l/IgG-Fc融合蛋白體內(nèi)的表達(dá)量是用Linco公司GLP-l Elisa試 劑盒檢測(cè)血漿活性GLP-1含量來(lái)進(jìn)行評(píng)估。如圖所示，第一次注射后2 周，注射GLP-l/IgG-Fc的受試鼠較注射IgG-Fc載體的受試鼠血清GLP-
水平顯著提高。而第一次注射后16周，受試鼠血漿GLP-1水平回落至基 線水平附近(圖8A)。在試驗(yàn)過(guò)程中，兩組受試鼠的體重并沒(méi)有發(fā)生顯著的變化(未顯 示)。在注射后第一個(gè)月里，兩組受試鼠空腹血糖水平也沒(méi)有顯著的差 異(未顯示)。然而，在注射后12周，注射過(guò)GLP-l/IgG-Fc的受試鼠空腹 血糖水平顯著低于對(duì)照組(PO.001 )(圖8B)。此外，GLP-l/lgG-l'，c的 受試鼠空腹胰島素水平顯著高于IgG-Fc對(duì)照鼠(PO.05)(圖8C)，空腹 胰高血糖素水平在GLP-1組受試鼠低于對(duì)照鼠(PO.05 )(圖8C )。這一 結(jié)果表明，體內(nèi)表達(dá)的GLP-l/IgG-Fc對(duì)db/de受試鼠有降低血糖的功效， 其原因很可能是由于促進(jìn)了胰島素的分泌和減少了基礎(chǔ)胰高血糖素分 泌所致。實(shí)施例9: GLP-l/IgG-Fc預(yù)防STZ誘導(dǎo)的胰島素缺乏性小鼠(I 型糖尿病模型)中糖尿病的發(fā)生最近的研究結(jié)果表明，腸泌素的功能(如GLP-1 )可能在調(diào)節(jié)血糖 緩解I型糖尿病中起重要作用(Dupre等人，J Clm Endocrinol Metab. 2004;89 ( 7 ) :3469-3473 )。為了確定GLP-l/IgG-Fc基因治療對(duì)胰島p-細(xì)胞損傷模型的有效性，我們研究了其對(duì)鏈脲霉素(STZ )誘導(dǎo)的糖尿 病CD1小鼠的作用。分別將編碼GLP-l/IgG-Fc、 Ex4/IgG-Fc或IgG-Fc的載體(50ng/小鼠)肌肉注射到CD1受試鼠，用局部電轉(zhuǎn)移加強(qiáng)基因轉(zhuǎn) 移。DNA注射7天后，連續(xù)5d注射STZ( 55 mg/kg， i.p.)。結(jié)果顯示，IgG-Fc 對(duì)照組血糖顯著增加，幾天內(nèi)達(dá)到糖尿病的水平(血糖上17mM)， {旦 是注射GLP-l/IgG-Fc (或Ex4/IgG-Fc )的受試鼠受到保護(hù)顯現(xiàn)出明顯糖 尿病的低發(fā)生率(圖9)。胰腺組織學(xué)研究表明兩組小鼠中均出現(xiàn)了胰 島卩-細(xì)胞的損害，但是發(fā)現(xiàn)在GLP-l/IgG-Fc (或Ex4/IgG-Fc)小鼠體內(nèi) 損害程度較輕(圖9)。在兩組受試鼠體內(nèi)均觀察到了胰島單核細(xì)胞(淋 巴細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞)的侵潤(rùn)(未顯示)。有趣的是，盡管期望Ex4/IgG-Fc 對(duì)DPP-IV降解有抵抗作用，但是Ex4/IgG-Fc處理的結(jié)果和GUVIgG-Fc 處理效果幾乎一樣。這些發(fā)現(xiàn)表明，盡管胰島發(fā)生炎癥(胰島炎)，但 是GLP-l/IgG-Fc(或Ex4/IgG-Fc )的表達(dá)對(duì)抗了 STZ誘導(dǎo)的(3 -細(xì)胞損害。實(shí)施例10: GLP-ZIgG-Fc的體內(nèi)表達(dá)及其對(duì)豬血糖的影響雄性受試約克夏豬(23kg)肌肉注射(muscularly) GLP-l/IgG廣Fc 或作為對(duì)照的IgG廣Fc載體(4mg/只豬)，注射后用ADVISYS電轉(zhuǎn)移儀 進(jìn)行電轉(zhuǎn)移。注射3日后為誘導(dǎo)高血糖，用Flurotan進(jìn)行麻醉將四氧 嘧啶一水合物(Sigma 80mg/kg)混合25ml生理鹽水靜脈注射。開(kāi)始 階段，于注射前將酸性的四氧嘧啶中和，但中和后的溶液未能引起高 血糖癥于是后續(xù)試驗(yàn)免去中和步驟，并在IgG-Fc處理組引起中等程度 高血糖，而GLP-l/IgG-Fc處理組沒(méi)有發(fā)生高血糖。在克他命-鎮(zhèn)靜的 (ketamme-sedated)的受試豬中每?jī)芍軝z測(cè)空腹血糖值。血液樣品用血糖 計(jì)抽取(A )，用ELISA測(cè)定Fc蛋白的表達(dá)(B )。實(shí)施例11: RT-PCR法檢測(cè)GLP-l/IgG-Fc融合蛋白的表達(dá)使用 一步法RT-PCR試劑盒(Qiagen， Valencia, CA )和基因特異性 引物檢測(cè)IgG融合蛋白在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)。為檢測(cè)GLP-1融合蛋白基因表達(dá)，100 ng的總RNA作為模板和添加0.6 iiM的特異性引物 (SEQ ID No: 15)
ACCGTCACC-3，和 (SEQ ID No: 16)
5 ，-CGCGGATCCCTATC ATTTACC AGGAGAGTGGGAGAGG-3 ，。 同時(shí)為檢觀'JIgG-Fc的表達(dá)，使用特異性引物 (SEQID No: 17)
GGGACCTTTACCAGTG-3 ，和 (SEQID No:18 )
5 ,-CGCGGATCCCTATCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGG-3 ，)。
一步RT-PCR的條件是50°C 30分鐘，95°C 15分鐘，40個(gè)循環(huán)的94。C 30 秒、55°C 30秒和72。C 60秒，隨后在72。C下進(jìn)行10 mm的延伸。RT-PCR 產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色^f全測(cè)。
實(shí)施例12: SDS PAGE和/或免疫印跡法檢測(cè)GLP-l/IgG-Fc融合
蛋白
對(duì)表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行翻譯水平上的檢測(cè)。取小規(guī)模提取的溶于 SDS上樣緩沖液的融合蛋白30 nL經(jīng)10。/c) SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn) 移至醋酸纖維素膜，并用抗鼠抗體(1:5000, Amersham-Pharmacia)探 測(cè)，用ECL顯影(Amersham-Pharmacia )。 30 jliL中等規(guī)模提取的融合蛋白則經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳分離后用考馬斯亮蘭染色檢測(cè)。 實(shí)施例13: GLP-1分泌試驗(yàn)
GLP-1分泌試驗(yàn)是采用總(所有類型)GLP-1放射免疫試劑盒 (Linco ),對(duì)/人瞬時(shí)或永久表達(dá)GLP- 1/IgG-Fc或IgG-Fc融合蛋白的 COS-7細(xì)胞或表達(dá)融合蛋白的細(xì)菌裂解液收集的培養(yǎng)液(150(iL)檢測(cè)其 GLP-1水平。為進(jìn)行體內(nèi)檢測(cè)，使用活性GLP-1 ELISA試劑盒(Lmco ) 對(duì)取自db/db受試鼠的血清進(jìn)行GLP-1水平檢測(cè)。
實(shí)施例14:胰島素和胰高血糖素分泌試驗(yàn)
將INS-1細(xì)胞以每孔2.5 x 105的密度在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)。使用 含10 % FBS的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液。次日，以無(wú)葡萄糖的新鮮KRB緩 沖液培養(yǎng)2次每次30分鐘。然后細(xì)胞分別接受加有O、 5或20mM的葡萄 糖及不同濃度的纟屯化的GLP-1/ IgG融合蛋白的KRB緩沖液處理1小時(shí)。 用鼠胰島素RIA試劑盒(Linco， St.Charles， MO )測(cè)量25 iiLKRB緩沖液 中的胰島素水平。按照廠家的指導(dǎo)手冊(cè)，用大鼠胰島素RIA試劑盒或大 鼠胰高血糖素RIA試劑盒(Linco)測(cè)量從空腹16小時(shí)的db/db受試鼠獲得 的血清樣品
測(cè)量cAMP:將INS-l細(xì)胞以62,500個(gè)/孔種植在24-孔板上。在試驗(yàn) 前一天對(duì)該細(xì)胞在含有100^M IBMX的SF-RPMI中血清饑餓5小時(shí)。接 著將該細(xì)胞在450(iL SF-RPMI培養(yǎng)液中與純化的GLP-l/IgG-Fc-融合多 肽(120nM)或Ex4(100nM)培養(yǎng)10分鐘。通過(guò)加入lmL冰冷的乙醇終止試 驗(yàn)。將提取物在20。C下培養(yǎng)3小時(shí)至過(guò)夜，接著將200nL提取物制樣 (ahquoted)并冰凍。將冰凍的提取物再懸浮與50)iL的醋酸鈉試驗(yàn)緩沖液 中并用于cAMP RIAs(Biomedical Technologies, Stoughton， MA)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)都以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差(mean士SEM)的形式 表示。用SAS軟件(Statistical Analysis Systems, Cary, NC)進(jìn)行學(xué)生T檢 驗(yàn)或是方差分析(ANOVA),用"n-l"假設(shè)檢驗(yàn)(post hoc custom hypotheses test),以p<0.05表示顯著性差異。
實(shí)施例15:檢測(cè)融合蛋白的例舉方法
卩-細(xì)胞質(zhì)量測(cè)定胰腺切片(4mm)按如前描述的處理(Fmegood 等人，Diabetes. 2001 ;50(5): 1021-1029)。筒言之，通過(guò)脫蠟，脫水和在 檸檬酸鹽緩沖液中煮沸進(jìn)行抗原修復(fù)后，切片與豚鼠抗胰島素抗體 (Dako Diagnostics, Mississauga， ON, Canada)在4°C孵育過(guò)夜，然后樣品 用生物素標(biāo)記的抗月豕鼠抗體(Vector Laboratories,Burlington, ON， Canada) 孵育1小時(shí)，隨后用抗生物素蛋白/生物素復(fù)合物(Vectastam Elite ABC Kit; Vector Laboratories, Burlmgame, CA.).處理1小時(shí)。切片然后用3,3'-二氨基聯(lián)笨胺鹽酸鹽(3,3'國(guó)diaminobenzidine tetrahydrochloride)(DAB; Sigma-Aldrich)染色10分鐘。DAB染色后,切片用自來(lái)水沖洗,并用蘇木 精復(fù)染。通過(guò)連接帶有彩色監(jiān)視器和圖像采集軟件的視頻照像設(shè)備的 Nikon (ECLIPSE-E1000)顯微鏡，從切片上胰島素抗體著色程度測(cè)定(3-細(xì)胞質(zhì)量。由(3-細(xì)胞占據(jù)的樣品切面區(qū)和所有胰腺組織的樣品切面區(qū) 進(jìn)行定量。計(jì)算每一個(gè)動(dòng)物總的p-細(xì)胞面積和總的胰腺質(zhì)量是通過(guò)測(cè) 定每個(gè)胰腺的8-10個(gè)胰腺切片，每個(gè)胰腺數(shù)1000-1500個(gè)p-細(xì)胞，將 切面總的(3-細(xì)胞面積除以總的胰腺組織切面面積乘以固定前的胰腺重 量，得到每個(gè)胰腺的總的(3-細(xì)胞質(zhì)量。
受體結(jié)合試驗(yàn):本發(fā)明的組合物用傳統(tǒng)的氯胺-T法處理(HUNTER 和GREENWOOD, Nature. 1962;194:495-496)。受體結(jié)合試-瞼如前述的方法進(jìn)行(Wang等人，Cell Physiol Biochem. 1998;8(6):304-313 )。將分 離的胰島細(xì)胞和胰島素分泌細(xì)胞懸浮于PBS中，用600G離心10分鐘， 將沉淀的細(xì)胞重懸浮于分裝的PBS中。細(xì)胞與同位素碘標(biāo)記的化合物 的結(jié)合是在裝有300mL分析緩沖液(PBS含0.2% BSA)的聚笨乙烯管 (7 x 35 mm )中于4°C進(jìn)行。標(biāo)記的本發(fā)明化合物(20,000 cpm)分別在 未標(biāo)記的本發(fā)明化合物存在或不存在的情況下孵育4.5小時(shí)，當(dāng)分析體 系達(dá)到一平衡狀態(tài)后加入冷的PBS緩沖液。樣品于4。C 600 g下離心 10min，棄上清，用冷PBS洗滌細(xì)胞沉淀后其放射活性用伽馬計(jì)數(shù)器測(cè) 定。
cAMP測(cè)定試驗(yàn):測(cè)定cAMP可以評(píng)價(jià)G蛋白偶聯(lián)的受體(GPCR) 活性(Lee等人，BiochmiBiophys Acta. 2000;1490(3):311-323 )。細(xì)胞內(nèi) cAMP水平的測(cè)定是以分離的胰島細(xì)胞或培養(yǎng)在35 mm器皿中的胰島 素分泌細(xì)胞進(jìn)行的。先將細(xì)胞預(yù)先孵育在緩沖液(130mM NaCl， 5mM KC1, ImM磷酸鈉，lmM MgS04， 2mM CaCl2, 20mM HEPES ( pH7.4 )， 6mM glucose,和0.1% BSA (RIA grade, Sigma) (pH 7.4)， 1小時(shí)后加入 PKA抑制劑孵育20分鐘，再加入lOOpM異丁基甲基黃噤呤孵育 lOmm后加入化合物孵育20分鐘。再用冰浴的PBS洗滌細(xì)胞3次，用 0.1M, 300^1鹽酸提取cAMP,用放免試劑盒(Biomedical Technologies, Stoughton， MA)按操作說(shuō)明檢測(cè)。
PI 3-激酶活性試驗(yàn):PI 3是Akt的上游激酶(Wang等人，Mol Cell Biol. 1999;19(6):4008-4018 )。從分離的胰島細(xì)胞和胰島素分泌細(xì)胞系 (INS-1細(xì)胞和TC細(xì)胞)獲得的全部細(xì)胞裂解物用本發(fā)明的組合物 預(yù)處理20分鐘，PI 3激酶與抗PI 3激酶p85調(diào)節(jié)亞基的抗體(SantaCruz Biotechnology)形成免疫共沉淀。通過(guò)測(cè)定形成的["P]PI 3-磷酸鹽以檢測(cè)PI 3-激酶和定量其活性(Wang等人，Biochem J. 1998;331(Pt 3):917-928)。簡(jiǎn)言之，經(jīng)過(guò)與抗體包被的球珠孵育過(guò)夜，抗體結(jié)合的蛋 白用緩沖液I (PBS添加1% Nonidet P-40和100)iM Na3V04)洗滌3次 后用緩沖液II (100mM Tris-HCl (pH 7.5), 500mM LiCl,和lOO^M Na3V04)洗3次，最后用緩沖液in (Tns-HCI (pH 7.5)， 100mM NaCI, lmM EDTA和100pM Na3V04)洗3次。洗滌后的免疫共沉淀產(chǎn)物重懸 于添加了 10 pl 100 mM MgCl2和10|il PI (2pg/ml)的50^1緩沖液II。樣 品于室溫放置5分鐘后加入lO(il ATP (440 ATP和30 pCi/10 pi ["P]A丁P)振蕩IO分鐘，加入20pl 8 N鹽酸和160pl氯仿-甲醇(l:l)終 止反應(yīng)。用標(biāo)準(zhǔn)方法提取脂類,干燥，重懸于20 ^氯仿-甲醇(1:1),. 用硅膠薄層板采用氯仿-甲醇-水-氫氧化銨(60:47:11:2.2, vol/vol/vol/vol) 溶劑系統(tǒng)里分離，通過(guò)放射自顯影測(cè)定結(jié)合到PI 3-磷酸中的32P,用分 子動(dòng)力學(xué)石壽顯影系纟克(Molecular Dynamics Phosphorlmager System) (Sunnyvale, CA)定量其活性。細(xì)胞凋亡試驗(yàn):分離的胰島細(xì)胞和胰島素分泌細(xì)胞系(INS-1細(xì) 胞和(3-TC細(xì)胞)經(jīng)本發(fā)明的組合物處理0.5-24小時(shí)后，細(xì)胞的凋亡 率用APO比率試驗(yàn)試劑盒(Biocolor Ltd. Ireland) 4安操作說(shuō)明進(jìn)行測(cè) 定。在體內(nèi)試驗(yàn)的動(dòng)物模型中，分別將用組合物處理組和對(duì)照組胰腺 切片進(jìn)行胰島素雙重免疫組化染色。DNA片段用Timel染色檢測(cè)凋亡 細(xì)胞的核酸片段特性。Tunel染色使用ApopTag試劑盒(Intergen， Purchas， NY )，按操作說(shuō)明進(jìn)行。胰島組織因胰島素著色成紅色區(qū) (chromagen: New Fuchsin Substrate, DAKO)，而凋亡細(xì)胞核著色成暗 棕色(chromagen: 3，3，-二氨基聯(lián)笨胺，Sigma)。試驗(yàn)結(jié)果用Tunel陽(yáng)性的 (3-細(xì)胞的百分率表示。Akt激酶試驗(yàn):用本發(fā)明的組合物處理10分鐘后，將分離的胰島細(xì)胞和胰島素分泌細(xì)胞系(INS-1細(xì)胞和j3-TC細(xì)胞)置于細(xì)胞裂介緩 沖液(組成為50mM HEPES (pH 7.6), 150rnM NaCl, 10% (vol/vol)甘油, 1% (vol/vol) Triton x -100, 30mM焦磷酸鈉，10mM NaF， lmM EDTA, 1 mM笨基曱磺酰氟，lmM苯曱脒，1 mM Na3V04, 1 mM 二硫蘇糖醇 [DTT],和100nM聚醚類毒素)得到全部細(xì)胞的裂解物(Wang等人, Mol Cell Biol. 1999;19(6):4008-4018 )。預(yù)先將Akt抗體與混合有A蛋白 和G蛋白的瓊脂糖凝膠球珠耦聯(lián)16小時(shí)，這些抗體球珠復(fù)合物用PBS 洗滌2次后用裂解緩沖液洗1次(4°C )。 200jig細(xì)胞總蛋白與帶抗Akt 抗體的球珠復(fù)合物于4°C旋轉(zhuǎn)孵育2 ~ 3小時(shí)后Akt形成免疫沉淀。用 lml緩沖液(25mM HEPES [pH7.8], 10% [vol/vol]甘油，1% [vol/vol] Triton x-100， 0.1%[wt/vol] BSA, 1M NaCl, lmM DTT， lmM笨基甲磺 酰氟，1 mM小胱氨酸(microcystin)，和100nM聚醚類毒素)洗滌Akt免 疫復(fù)合物4次，再用lmL激酶緩沖液(50mM Tns-HCl [pH 7.5]， 10mM MgCb和lmM DTT)洗滌2次。免疫復(fù)合物在30°C與30mL的反應(yīng)混 合物(激酶緩沖液含有5(iM ATP, 2 pCi [，32P ]ATP, 100 (iM Crosstide)振 蕩孵育30分鐘。反應(yīng)之后，蔣30上清液轉(zhuǎn)移到Whatman p81濾紙 上，用3ml 175mM磷酸洗滌，每次10分鐘，再用蒸餾水洗l次，每 次5分鐘。重復(fù)4次。置于空氣千燥后用于液體閃爍計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。MAP激酶試驗(yàn):(3-細(xì)胞經(jīng)本發(fā)明的組合物處理20分鐘后，在37°C 下無(wú)磷酸鹽無(wú)血清的RPMI細(xì)胞培養(yǎng)液中，用1.25微居里的"Pi/組 (NEN Life Science Products Boston MA )標(biāo)記3小時(shí)。收獲細(xì)胞并置 于加有100 ng/ml PS-結(jié)合蛋白(LBP)的RPMI細(xì)胞培養(yǎng)液，用本發(fā)明 的組合物處理細(xì)胞30分鐘。隨后在37°C條件下用LPS刺激細(xì)胞15分鐘。收集細(xì)胞并將其置于裂介緩沖液(1% Nomdet P-40 1% sodium deoxycholate 0.1% SDS 0.15 M NaCl 0.01 M Na3P04 ( pH 7.2， 2mM Na3V04, l^M聚醚類毒素，100 (ig/ml PMSF， 50 pg/ml抑肽酶，10 |ig/ml亮肽素，50 (ig/ml胃酶抑素。Boehnnger Mannheim公司產(chǎn)品) 進(jìn)行超聲處理。裂解產(chǎn)物中免疫沉淀MEK，用10% SDS-PAGE不連續(xù) 凝月交電泳分離才羊品，用抗-磷-MEK抗體(Oncogene Research Products San Diego CA)進(jìn)行免疫印跡反應(yīng)。其他的 一 些檢測(cè)方案包括諸如上述檢測(cè)方法的變異在美國(guó)專利 No.5,851,788、 5,736,337和5,767，075所列舉的參考文獻(xiàn)中有描述。例 如，本發(fā)明的組合物可以與(3-細(xì)胞共孵育，并應(yīng)用特異性的抗磷 -caspase-3抗體進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)以確定其是否抑制caspase-3。表一GLP-1、 Ex4、鼠IgG廣Fc、 IgK、人lgG，、人GHRH引導(dǎo)序列、 PCR引物的序列以及一些在本申請(qǐng)中描述的試驗(yàn)中非必須使用的化合物的序列GLP-1 HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EHAWLVKGR-NH2 ( Sb:Q ID NO:l )Ex4 HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPPS-NH2 ( SEQ ID NO:2 )IgGi國(guó)FcPSETVTCNVA HPASSTKVDK KIVPRDCGCKPCICTVPEVS SVFIFPPKPK DVLTITLTPK VTCVVVDISK DDPEVQFSWF VDDVEVHTAQ TQPREEQFNS TFRSVSELPI MHQDWLNGKE FKCRVNSAAF PAPIEKTISK TKGRPKAPQV YTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDIT VEWQWNGQPAENYKNTQPIM NTNGSYFVYS KLNVQKSNWE AGNTFTCSVL HEGL麗HHTE KSLSHSPGK ( SEQ ID NO: 3 )IgK METDTLLLWV LLLWVPGSTGD ( SEQ ID NO:4 )人Akt/蛋白激酶B:1 mkterprpnt fiirclqwtt viertfhvet peereewtta iqtvadglkk qeeeemdfrs61 gspsdnsgae emevslakpk hrvtn]nefey lkllgkgtfg kvilvkekat ayyamkilkk121 evivakdeva htltenrvqq nsrhpfltrl kysfqthdrl cfVmeyangg elffhlsrer181 vfaedrarfy gaeivsaldy lhseknvvyr dlklenlmld kdghikitdf glckegikdg241 atmktfcgtp eylapevled ndygravdww glgvvmyemm cgrlpfynqd heklfelUm301eeirfprtlg peaksllsgl lkkdpkqrlg ggsedakeim qhrffigivw qhvyekklsp 361 pfkpqvtset dtryfdeeft aqmititppd qddsmecvds errp啤qfs yspsata(SEQ ID NO:5) 人MAP激酶1 msdskcdsqf ysvqvadstf tvlkryqqlk pigsgaqgiv caafdtvlgi nvavkklsrp61fqnqthakra yrelvllkcv nhkmislln vftpqktlee fqdvylvmel mdanlcqvih121 meldhermsy llyqmlcgik hlhsagiihr dlkpsmvvk sdctlkildf glartactnf181 mmtpyvvtry yrapevilgm gykenvdiws vgcimgelvk gcvifqgldh idqwnkvieq241 lgtpsaefmk klqptvrnyv enrpkypgik fee地dwif pseserdkik tsqardllsk 301 mlvidpdkrisvdealrhpyitvwydpaeaeapppqiyda qleerehaieewkeliykev361 mdweerskng vvkdqpsdaa vssnatpsqs ssmdissms teqtlasdtd ssldastgpl421 egcr (SEQIDN0:6)人caspase國(guó)3:1 mentensvds ksiknlepki ihgsesmdsg mswdtgykmd ypcmglciii nnknflikstg61mtsrsgtdvd aanlretfrn lkyevrnknd ltreeivelm rdvskedhsk rssfvcvlls121 hgeegiifgt ngpvdlkkit nffrgdrcrs ltgkpklfii qacrgteldc gietdsgvdd181 dmachkipvd adflyaysta pgyyswrnsk dgswfiqslc amlkqyadl(l efmhiltrvn241 rkvatefesfsfdatfhakkqipcivsmlt kelyfyhl (SEQIDNO:7) 人IgQrFc (788-1689) -cDNA:788 gag cgcaaatgtt gtgtcga跑cccaccgtgc ccaggtaagc cagcccaggc 841 ctcgccctcc agctcaaggc gggacagglg ccctagagta gcctgcatcc agggacaggc 901 cccagctggg tgctgacacg tccacctcca tctcttcctc agcaccacct跑gcaggac %1 cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg 1021 aggtcacgtg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaactggt 1081 acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc acgggaggag cagttcaaca 1141 gcacgttccg tgtggtcagc gtccteaccg ttgtgcacca ggactggctg aacggcaagg 1201 agtacaagtg caaggtctcc aacaaaggcc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca1261 aaaccaaagg tgggacccgc ggggtatgag ggccacatgg acagaggccg gctcggccca1321 ccctctgccc tgggagtgac cgctgtgcca acctctgtcc ctacagggca gccccgagaa1381 ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg1441 acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg1501 cagccggaga acaactacaa gaccacacct cccatgctgg actccgacgg ctccttcUc1561 ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc1621 tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg1681 ggtaaatga( SEQ ID NO: 8 )人IgQrFc (788-1689) -#^酸ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVQF麗YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQD WLNGKEYKCKVSNKGLPAP正KTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE麗YKTTPPMLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 9 )人生長(zhǎng)激素#^放激素(GHRH)引導(dǎo)序列(leader sequence):gtg etc tgg gtg ttc ttc ttt gtg ate etc acc etc age aac age tec cac tgc tec (SEQ ID No: 10) PCR引物TACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACCA-3:(SEQ ID No:ll ) 5,-TGCTGAAGGGACCTTTACCAGTG-3， ( SEQ ID No: 12 )ACCGTCACC-3' ( SEQ ID No: 13 )5，-CGCGGATCCCTATCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGG-3' ( SEQ ID No: 14)GGACCTTTACCAGTG-3' ( SEQ ID No: 15 )5'-CGCGGATCCCTATCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGG-3' (SEQ ID No: 16)ACCGTCACC-3' ( SEQ ID No: 17 )5'-CGCGGATCCCTATCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGG-3' (SKQ ID No: 18)5'-AAGGATATCG ATCGC AAATGTTGTGTCGAGTGCCC A-3' (SEQ ID No: 19)5 ,-CGTAAGCTTC ATTTACCCGGAGAC AGGGAGAG-3' (SEQ ID No: 20)
權(quán)利要求
1、一種含有與IgG多肽融合的GLP-1多肽或其衍生物的異源性融合蛋白，其中所述的IgG不是IgG4。
2、 如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其中所述的IgG是鼠源。
3、 如權(quán)利要求2所述的融合蛋白，其中所述的IgG是鼠IgGl。
4、 如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其中所述的IgG是人源。
5 、如權(quán)利要求4所述的融合蛋白，其中所述的IgG選自由人IgGl 、 IgG2和IgG3組成的組。
6、 如權(quán)利要求5所述的融合蛋白，其中所述的IgG是人IgG2。
7、 如權(quán)利要求1 ~ 6中任一項(xiàng)所述的融合蛋白，其中所述的GLP-1 多肽選自由GLP-1 ( 7-37 ) OH、 GLP-1 ( 7-36 )氨基化合物-1 、 DPP-IV 抗性GLP-1及其片段和衍生物組成的組。
8、 如權(quán)利要求7所述的融合蛋白，其中所述的DPP-IV抗性GLP-1 是GLP-1A8G。
9、 如權(quán)利要求7所述的融合蛋白，其中所述的衍生物含有與GLP-1 ID NO.l序列大約70%至大約95%相同的序列的多肽。
10、 如權(quán)利要求7所述的融合蛋白，其中所述片段含有至少5個(gè) 氨基酸至最多達(dá)大約250個(gè)氨基酸。
11、 如權(quán)利要求1 ~ 10中任一項(xiàng)所述的融合蛋白，其中所述的IgG 含有IgG的Fc部分或者Fc部分的片段或衍生物。
12、 一種cDNA，所述cDNA編碼如權(quán)利要求1所述的異源性融合蛋白。
13、 一種載體，所述載體含有如權(quán)利要求12所述的cDNA。
14、 一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞經(jīng)如權(quán)利要求13所述的載體轉(zhuǎn)染。
15、 一種藥用組合物，所述藥用組合物含有如權(quán)利要求1至11中 任一項(xiàng)所述的融合蛋白，或由可藥用載體搭載的如權(quán)利要求13所述的 載體。
16、 如權(quán)利要求5所述的組合物，所述組合物用于治療I型和II 型糖尿病。
17、 如權(quán)利要求16所述的組合物，其中通過(guò)選自由局部、口服、 氣霧劑、腹膜內(nèi)注射、靜脈注射和肌肉注射組成的組的方式施用所述 的纟且合物。
18、 一種用于治療受試者的I型和II型糖尿病的藥用組合物，其 中所述的組合物含有包含與IgG多肽融合的GLP-1多肽或者其衍生物 或其活性片段的融合蛋白的異源融合蛋白。
19、 如權(quán)利要求18所述的組合物，其中所述的IgG是鼠源。
20、 如權(quán)利要求19所述的組合物，其中所述的IgG是鼠IgGl。
21、 如權(quán)利要求18所述的組合物，其中所述的IgG是人源。
22、 如權(quán)利要求21所述的組合物，其中所述的IgG選自由人IgGl、 IgG2和IgG3組成的組。
23、 如權(quán)利要求22所述的組合物，其中所述的IgG是人IgG2序 列ID No.9。
24、 如權(quán)利要求17~23中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述的GLP-1 多肽是選自由GLP-1 (7-37) OH、 GLP-1 (7-36)氨基化合物-1、 DPP-IV抗性GLP-1和其片段或衍生物組成的組。
25、 如權(quán)利要求24所述的組合物，其中所述的DPP-IV抗性GLP-1 是GLP陽(yáng)1A8G。
26、 如權(quán)利要求24所述的組合物，其中所述的衍生物含有與GLP-1 ID NO. 1序列大約70%至大約95%相同的序列的多肽。
27、 如權(quán)利要求24所述的組合物，其中所述的片段含有至少5個(gè) 氨基酸至多達(dá)約250個(gè)氨基酸。
28、 如權(quán)利要求18~27中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述的IgG 含有IgG的Fc部分或者Fc部分的片段或衍生物。
29、 如權(quán)利要求18~28中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物 通過(guò)選自由局部、口服、氣霧劑、腹膜內(nèi)注射、靜脈注射和肌肉注射 組成的組的方式施用。
30、 一種治療受試者I型和II型糖尿病的方法，所述方法包括施 用治療有效量的如權(quán)利要求1 ~ 11中任一項(xiàng)所述的融合蛋白、或如權(quán) 利要求18~29中任一項(xiàng)所述的組合物或,權(quán)利要求13所述的載體。
31、 將如權(quán)利要求1 ~ 11中任一項(xiàng)所述的融合蛋白用作預(yù)防和治 療受試者I型和II型糖尿病的藥物的用途。
32、 一種制備如權(quán)利要求1所述的融合蛋白的方法，所述方法包 括在適宜條件下培養(yǎng)如權(quán)利要求14所述的宿主細(xì)胞以表達(dá)所述的蛋白質(zhì)。
33、 一種制備如權(quán)利要求1所述的融合蛋白的方法，所述方法包 括在合適的宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯如權(quán)利要求12所述的載體及在一定 條件下表達(dá)所述的蛋白質(zhì)。
34、 一種異源融合蛋白，所述融合蛋白含有與IgG多肽融合的 exendin-4多肽或其書(shū)f生物。
35、 如權(quán)利要求34所述的融合蛋白，其中所述的IgG是鼠源。
36、 如權(quán)利要求35所述的融合蛋白，其中所述的IgG是鼠IgGl。
37、 如權(quán)利要求34所述的融合蛋白，其中所述的的IgG是人源。
38、 如權(quán)利要求37所述的融合蛋白，其中所述的IgG是選自由人 IgGl、 IgG2、 IgG3和IgG4組成的組。
39、 如權(quán)利要求38所述的融合蛋白，其中所述的IgG是人IgG2。
40、 如權(quán)利要求34所述的融合蛋白，其中所述的衍生物包含大約 70%至大約95%與exendin-4 ID N0.2序列相同的序列的多肽。
41、 如權(quán)利要求34所述的融合蛋白，其中所述的片段含有至少5 個(gè)氨基酸至多達(dá)約250個(gè)氨基酸。
42、 如權(quán)利要求34-41中任一項(xiàng)所述的融合蛋白，其中所述的IgG 含有IgG的Fc部分或者Fc部分的片段或衍生物。
43、 一種編碼如權(quán)利要求34所述的融合蛋白的cDNA。
44、 一種包含如權(quán)利要求43所述的cDNA的載體。
45、 一種經(jīng)如權(quán)利要求44所述的載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
46、 一種用于治療受試者I型和II型糖尿病的藥用組合物，所述 的組合物包含含有與IgG多肽融合的exendin-4多肽或者其書(shū)f生物或活 性片段的異源融合蛋白。
47、 如權(quán)利要求46所述的組合物，其中所述的IgG是鼠源。
48、 如權(quán)利要求47所述的組合物，其中所述的IgG是鼠IgGl。
49、 如權(quán)利要求46所述的組合物，其中所述的IgG是人源。
50、 如權(quán)利要求49所述的組合物，其中所述的IgG選自由人IgGl、 IgG2、 IgG3和IgG4組成的組。
51、 如權(quán)利要求50所述的組合物，其中所述的IgG是人IgG2。
52、 如權(quán)利要求46所述的組合物，其中所述的載體含有大約70% 至大約95%序列與exendin-4多肽ID N0.2序列相同的多肽。
53、 如權(quán)利要求46所述的組合物，其中所述的片段含有至少5個(gè) 氨基酸至多達(dá)約250個(gè)氨基酸。
54、 如斥又利要求46 53中4壬一項(xiàng)所述的組合物，其中所述的IgG 含有IgG的Fc部分或者Fc部分的片段或其衍生物。
55、 如權(quán)利要求46所述的組合物，其中所述的片段含有至少5個(gè) 氨基酸至多達(dá)約250個(gè)氨基酸。
56、 如權(quán)利要求46~55中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述的IgG 含有IgG的Fc部分或者Fc部分的片段或書(shū)f生物。
57、 如權(quán)利要求46~55中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述的組合 物通過(guò)選自由局部、口服、氣霧劑、腹膜內(nèi)注射、靜脈注射或肌肉注 射組成的組的方式施用。
58、 一種用于治療受試者I型和II型糖尿病的方法，所述方法包 括施用治療有效劑量的如權(quán)利34 ~ 42中任一項(xiàng)所述的融合蛋白，或者 施用如權(quán)利要求46 ~ 47中任一項(xiàng)所述的組合物或如權(quán)利要求44所述 的載體。
59、 如權(quán)利要求34~42中任一項(xiàng)所述的融合蛋白用于在預(yù)防和治 療受試者I型和II型糖尿病患者的藥物中的用途。
60、 一種制備如權(quán)利要求34所述的融合蛋白的方法，所述方法包 含在適宜條件下培養(yǎng)如權(quán)利要求45所述的宿主細(xì)胞以表達(dá)蛋白質(zhì)。
61、 一種制備如權(quán)利要求34所述的融合蛋白的方法，所述方法包 括在合適的宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯如權(quán)利44要求中的載體在一定條件 下表達(dá)所述蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于在受試者體內(nèi)預(yù)防和治療I型和II型糖尿病的方法和組合物。所述組合物含有IgG-Fc融合蛋白，其中，該融合蛋白含有GLP-1、GLP-1突變體或者exendin-4。
文檔編號(hào)C07K19/00GK101273134SQ200680035546
公開(kāi)日2008年9月24日 申請(qǐng)日期2006年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月27日
發(fā)明者杰拉爾德·J·普魯?shù)禄裟? 王慶華, 莫汗·庫(kù)馬爾 申請(qǐng)人:王慶華