專(zhuān)利名稱(chēng)：：具有抗腫瘤活性的抗雙鏈dna單克隆抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域以及腫瘤免疫治療領(lǐng)域，涉及一種單克隆抗體，特別是一種具有抗腫瘤活性的抗雙鏈DNA單克隆抗體及其制備方法。
背景技術(shù)：
：腫瘤生物免疫治療是繼手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)藥物治療之后新型的腫瘤治療手段，其中，針對(duì)腫瘤抗原物質(zhì)而研制的單克隆抗體(monoclonalantibody,mAb)是目前腫瘤生物治療的熱點(diǎn)之一。抗原抗體反應(yīng)的特異性決定了針對(duì)腫瘤特異性靶抗原的單克隆抗體會(huì)優(yōu)先與相應(yīng)的腫瘤組織結(jié)合，而不識(shí)別正常的組織。單克隆抗體不僅直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡，并可偶聯(lián)放療化療藥物從而降低藥物對(duì)正常組織的非特異損傷，減少治療的副作用。單克隆抗體正是以其特異性、抑制腫瘤特性成為腫瘤靶向治療的重要手段?？闺p鏈DNA(dsDNA)抗體是診斷系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的主要標(biāo)志。自身免疫病患者特別是SLE病人由于針對(duì)自身細(xì)胞來(lái)源的dsDNA發(fā)生免疫應(yīng)答持續(xù)產(chǎn)生大量抗dsDNA抗體，因此抗dsDNA抗體在系統(tǒng)性自身免疫病的發(fā)生發(fā)展和免疫病理中起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在一些腫瘤病人的血清中也存在一定滴度的抗dsDNA抗體，且其水平直接與腫瘤病人的預(yù)后相關(guān)，即血清中含有高滴度抗dsDNA抗體的病人，往往預(yù)后較好，提示這種自身抗體可能具有抗腫瘤作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種具有抗腫瘤活性的抗雙鏈DNA單克隆抗體及其制備方法，所述的這種具有抗腫瘤活性的抗雙鏈DNA單克隆抗體及其制備方法要解決現(xiàn)有技術(shù)中的抗腫瘤藥物治療腫瘤效果不佳，副作用大的技術(shù)問(wèn)題。本發(fā)明提供了一種具有抗腫瘤活性的抗雙鏈DNA單克隆抗體，所述的單克隆抗體特異性結(jié)合dsDNA、或者能表達(dá)dsDNA的腫瘤細(xì)胞，所述的雙鏈DNA來(lái)自BALB/c小鼠全基因組DNA序列(于2006年10月在國(guó)際上正式公開(kāi)發(fā)表，參見(jiàn)美國(guó)NationalInstituteofEnvironmentalHealthScience國(guó)家環(huán)境衛(wèi)生科學(xué)研究所15種近交系小鼠全基因組測(cè)序perlegen計(jì)劃之BALB/c小鼠全基因組序列下載http:〃mouse.perleaen.com/mouse/download.html#SNP?；蛘邊⒁?jiàn)PubmedNCBI/Genomes/Eukaryotagenome/Vertebrates/Musmusculus(laboratorvmouse)genomeview/Chromosome1-22,X,Yhttp:〃www.ncbi,nlm.nih.gov/mapvJew/map—search.cgitaxid=10090)、或者BALB/c小鼠腫瘤細(xì)胞的全基因組dsDNA、或者BALB/c小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0的全基因組dsDNA。進(jìn)一步的，所述的dsDNA是經(jīng)蛋白酶和S1核酸酶處理的，因此不含蛋白成分和單鏈DNA(ssDNA)。進(jìn)一步的，所述的抗雙鏈DNA單克隆抗體的亞型是小鼠IgG1。進(jìn)一步的，所述的抗腫瘤活性的腫瘤細(xì)胞包括但不限于BALB/c小鼠來(lái)源的Wehi164腫瘤、SP2/0腫瘤細(xì)胞、B16、p815、NS1、4T1腫瘤細(xì)胞以及C57BL/6小鼠來(lái)源的3LL、EL4細(xì)胞。本發(fā)明還提供了一種具有抗腫瘤活性的抗雙鏈DNA單克隆抗體的制備方法，包括一個(gè)通過(guò)小鼠dsDNA免疫BALB/c小鼠的步驟，包括一個(gè)獲得分泌高效價(jià)抗dsDNA抗體的脾細(xì)胞的步驟，包括一個(gè)將分泌高效價(jià)抗dsDNA抗體的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合的步驟，包括一個(gè)反復(fù)篩選得到分泌該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系的步驟，通過(guò)雜交瘤細(xì)胞系分泌得到抗雙鏈DNA單克隆抗體。進(jìn)一步的，所述的具有抗腫瘤活性的抗雙鏈DNA單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟(1)提取BALB/c小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0的全基因組dsDNA;(2)以福氏完全或不完全佐劑與dsDNA充分混勻呈乳濁液；(3)以皮下注射方式免疫BALB/c小鼠；(4)免疫后以ELISA方法證實(shí)小鼠血清中誘導(dǎo)了高效價(jià)的抗dsDNA抗體后，分離得到小鼠脾細(xì)胞，小鼠脾細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞瘤融合，篩選永生化的分泌抗dsDNA單克隆抗體的融合雜交瘤細(xì)胞株；(5)通過(guò)雜交瘤細(xì)胞株分泌獲得抗dsDNA單克隆抗體。進(jìn)一步的，通過(guò)皮下注射免疫時(shí)，共免疫四次，第一次混合福氏完全佐劑，第二次混合福氏不完全佐劑；第三次和第四次直接注射dsDNA。本發(fā)明還提供了一種雜交瘤細(xì)胞株，采用如下步驟制備，包括一個(gè)通過(guò)小鼠dsDNA免疫BALB/c小鼠的步驟，包括一個(gè)獲得分泌高效價(jià)抗dsDNA抗體的脾細(xì)胞的步驟，包括一個(gè)將分泌高效價(jià)抗dsDNA抗體的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合的步驟，包括一個(gè)反復(fù)篩選得到分泌該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系的步驟。進(jìn)一步的，所述的一種雜交瘤細(xì)胞株的制備方法，包括以下步驟-(1)提取BALB/c小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0的全基因組dsDNA，(2)以福氏完全或不完全佐劑與dsDNA充分混勻呈乳濁液，(3)以皮下注射方式免疫BALB/c小鼠，(4)免疫后以ELISA方法證實(shí)小鼠血清中誘導(dǎo)了高效價(jià)的抗dsDNA抗體后，分離得到小鼠脾細(xì)胞，小鼠脾細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞瘤融合，篩選永生化的分泌抗dsDNA單克隆抗體的融合雜交瘤細(xì)胞株。進(jìn)一步的，通過(guò)皮下注射免疫時(shí)，共免疫四次，第一次混合福氏完全佐劑，第二次混合福氏不完全佐劑；第三次和第四次直接注射dsDNA。本發(fā)明還提供了一種具有抗腫瘤功能的藥物組合物，含有上述的具有抗腫瘤活性的抗雙鏈DNA單克隆抗體、或者含有有效量的上述的雜交瘤細(xì)胞株、或者含有有效量的上述的雜交瘤細(xì)胞株和抗腫瘤藥物的組合，以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)試劑，其特征在于含有上述的具有抗腫瘤活性的抗雙鏈DNA單克隆抗體。本發(fā)明的單克隆抗體可在體外發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，加入Wehi164腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中時(shí)，可以劑量依賴(lài)性的方式抑制腫瘤生長(zhǎng)。20ug/ml單克隆抗體和Wehi164孵育48hr抑瘤效率達(dá)35X;72hr達(dá)40X。進(jìn)一步的，本發(fā)明的單克隆抗體有顯著的體內(nèi)抑瘤作用，可有效治療荷瘤動(dòng)物。荷Wehi164腫瘤10天的裸鼠給予單克隆抗體注射治療，15天后可以抑制腫瘤體積達(dá)84%以上，并可顯著延長(zhǎng)荷瘤小鼠的存活時(shí)間達(dá)2倍以上。將抗含有dsDNA單克隆抗體的藥物復(fù)合物注射荷瘤動(dòng)物，可抑制腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)存活時(shí)間。本發(fā)明的單克隆抗體可在體內(nèi)、外發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的機(jī)制在于可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞鈹縮、細(xì)胞核固縮、DNA片段化等。本發(fā)明的含有該單克隆抗體的檢測(cè)試劑，可用于體內(nèi)示蹤技術(shù)、ELISA檢測(cè)方法中的抗體以及腫瘤原位組織切片檢測(cè)中的抗體。本發(fā)明中，dsDNA的獲得，可以通過(guò)多種方式獲得，包括但不限于1)直接提純；2)化學(xué)合成DNA;3)通過(guò)適當(dāng)引物以PCR技術(shù)擴(kuò)增得到。本發(fā)明中，將dsDNA注射小鼠的方法采用皮下注射方式，以本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行以注射器吸取<100|^1液體直接注射小鼠皮下(皮膚與肌肉的空隙)?？蓛H注射一點(diǎn)，但較好的方法是多點(diǎn)皮下注射。本發(fā)明中，所述的含有抗dsDNA單克隆抗體2G8的藥物復(fù)合物中有效成分的存在形式，包括但不限于以下幾類(lèi)1)抗dsDNA單克隆抗體2G8蛋白；2)抗dsDNA單克隆抗體2G8蛋白與其他抗腫瘤藥物或分子的組合。在給藥時(shí)，可直接給予1)或2)所述的有效成分，以及藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明中，"藥學(xué)上可接受的"成分是適用于人和動(dòng)物而無(wú)過(guò)度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激、變態(tài)反應(yīng))、有合理效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。本發(fā)明中，"藥學(xué)上可接受的載體"成分是用于將具有活性的有效成分傳送給人或動(dòng)物的藥學(xué)上可接受的溶劑、懸浮劑和賦形劑。所述的載體可以是液體、固體或半固體。載體包括但不限于水、PBS緩沖液、生理鹽水、葡萄糖、甘油、疊氮鈉及其組合。本發(fā)明的藥物組合物，含有上述有效成分和藥學(xué)上可接受的載體。通常將其配制于無(wú)毒、中性、惰性和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，pH值通常約6—8，但根據(jù)具體腫瘤情況以及有效成分性質(zhì)可有所改變。本發(fā)明研制的具有抗腫瘤活性的單克隆抗體，經(jīng)由基因免疫手段制備，對(duì)多種腫瘤尤其是Wehi164腫瘤細(xì)胞有顯著的細(xì)胞毒作用，并具有體內(nèi)顯著抑瘤活性，具有治療荷瘤動(dòng)物作用。單克隆抗體可以通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮其體內(nèi)外抗腫瘤效應(yīng)。單克隆抗體以及含有單克隆抗體的藥物組合物在腫瘤免疫生物治療、腫瘤定性定量免疫檢測(cè)、腫瘤示蹤定位等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相對(duì)比，其效果是積極和明顯的?，F(xiàn)有技術(shù)中抗dsDNA單克隆抗體的制備主要由自身免疫病小鼠制備，而自身免疫病小鼠通常具有不確切的或不同的部分基因缺陷的遺傳背景，這樣得到的抗dsDNA單克隆抗體無(wú)法明確其針對(duì)的靶抗原，使其性質(zhì)研究困難。本發(fā)明的抗dsDNA單克隆抗體的制備是使用正常遺傳背景的小鼠，即非SLE易感小鼠，通過(guò)將來(lái)自于BALB/c小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0的基因組dsDNA皮下基因免疫正常BALB/c小鼠，制備了多株正常小鼠產(chǎn)生的抗dsDNA單克隆抗體，并以此為基礎(chǔ)篩選獲得了具有顯著抗腫瘤作用的抗dsDNA單克隆抗體?？筪sDNA單克隆抗體在體外和體內(nèi)均可有效抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，具有延長(zhǎng)荷瘤小鼠存活的功能。本發(fā)明不僅可用于研究dsDNA的特性，更為基于dsDNA的腫瘤免疫治療提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。圖1顯示了小鼠Sp2/0腫瘤細(xì)胞來(lái)源的dsDNA皮下免疫小鼠后誘導(dǎo)產(chǎn)生了anti-dsDNAIgG抗體。圖2顯示了融合后雜交瘤細(xì)胞的倒置顯微鏡圖和雜交瘤細(xì)胞染色體的Giemsa染色體個(gè)數(shù)。圖3顯示了純化后單克隆抗體的SDS-PAGE鑒定電泳圖，其中，M:proteinmarker;1:non-reduced;2:reduced。圖4顯示單克隆抗體2G8可與dsDNA特異性結(jié)合并可以及腫瘤細(xì)胞表面結(jié)合，圖A通過(guò)ELISA方法證實(shí)2G8特異性結(jié)合dsDNA而不能結(jié)合ssDNA或RNA;圖B用FACS顯示2G8可有效結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面。圖5顯示了單克隆抗體2G8顯著抑制腫瘤細(xì)胞Wehi164生長(zhǎng)，存在時(shí)間、劑量依賴(lài)關(guān)系。圖6顯示了荷瘤小鼠給予抗體2G8干預(yù)后腫瘤生長(zhǎng)受到抑制，圖A顯示腫瘤體積在抗體注射12天起顯著減小，15天減小80%以上；圖B顯示荷瘤小鼠的生存率，2G8干預(yù)可提高小鼠生存率2倍。圖7顯示了2G8與Wehi164腫瘤細(xì)胞共孵育后的基因組DNA經(jīng)電泳鑒定出現(xiàn)片段化，其中，1:medium;2:isotypecontrol;3:mAb2G8;4:DNAmsrter.圖8顯示了2G8誘導(dǎo)Wehi164腫瘤細(xì)胞調(diào)亡，以AnnexinV染色后進(jìn)行流式檢測(cè)，圖A顯示2G8作用48小時(shí)誘導(dǎo)30X細(xì)胞凋亡，顯著高于對(duì)照抗體；圖B顯示2G8誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞調(diào)亡呈時(shí)間依賴(lài)關(guān)系，圖C顯示2G8誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞調(diào)亡呈時(shí)間劑量關(guān)系。具體實(shí)施例方式以下所述本發(fā)明的具體實(shí)施例用于描述本發(fā)明的使用和用途，而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例中所采用的SP2/0細(xì)胞和NS-1細(xì)胞通過(guò)中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所購(gòu)買(mǎi)；常見(jiàn)生化試劑購(gòu)自Sigma公司、蛋白酶和Sl核酸酶購(gòu)自Takara公司；細(xì)胞培養(yǎng)試劑購(gòu)買(mǎi)自GibcoBRL和Invitrogen公司。小牛胸腺DNA購(gòu)自上海華美公司。AnnexinV購(gòu)自BD公司。6-8周齡雌性BALB/c(H-2d)小鼠購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，清潔級(jí)詞養(yǎng)。動(dòng)物詞養(yǎng)及操作符合國(guó)家相關(guān)規(guī)定。本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞均按常規(guī)方法培養(yǎng)，以含10。/。FCS、2mML-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和硫酸卡那霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基在37'C、5。/。C02條件下培養(yǎng)。實(shí)施例1提取純化小鼠腫瘤細(xì)胞來(lái)源dsDNA:收集小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0，離心，以PBS洗滌3次，抽提基因組DNA，過(guò)程如下加入細(xì)胞裂解液(100ng/ml蛋白酶K，20pg/mlRNaseA,10mMTris國(guó)CLpH8.0,15mMNaCI，10mMEDTApH8.0，0.4%SDS)，37°C作用12-24小時(shí)。加入平衡酚，混勻后5000g10min離心；轉(zhuǎn)移上層水相，重復(fù)酚抽提過(guò)程1次；轉(zhuǎn)移上層水相，加入氯仿/異丙醇抽(V/V=24:1)混勻后抽提2次，5000g10min離心；轉(zhuǎn)移上層水相，加入1/10體積乙酸鈉(pH5.2)和2.5倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇，混勻，-70"作用1小時(shí)，10000g15min離心；以70。/Q乙醇洗滌1次，晾干，沉淀溶解于三蒸水中。再加入S1核酸酶，37XM乍用3小時(shí)，以pH7.4的PBS透析過(guò)夜，最后用pH7.4的PBS調(diào)整dsDNA濃度0.5mg/ml，，-2CTC凍存。蛋白酶K和S1核酸酶的作用是去處dsDNA中可能混雜的蛋白成分和單鏈DNA(ssDNA)實(shí)施例2以dsDNA免疫BALB/c小鼠按照50pgDNA/只/次免疫BALB/c小鼠，共免疫4次首次免疫取50pg/0.1mlDNA,與福氏完全佐劑等體積混勻呈均一乳濁液，皮下多點(diǎn)注射；兩周后，再次免疫，改為不完全佐劑與dsDNA混勻；在第28天和38天，不加任何佐劑，只用dsDNA加強(qiáng)免疫2次。采血并分離血清。-20°C保存?zhèn)溆?。?shí)施例3免疫小鼠血清中抗dsDNA抗體的檢測(cè)腫瘤細(xì)胞來(lái)源dsDNA免疫小鼠，每隔2周收集小鼠血清，以ELISA方法檢測(cè)小鼠血清抗dsDNA抗體的產(chǎn)生和效價(jià)。以常規(guī)ELISA方法檢測(cè)0.5%硫酸魚(yú)精蛋白處理96孔酶標(biāo)板，37。C1h;洗液(PBS-0.05。/。Tween-20pH7.4)洗1次；dsDNA(50ijg/ml,包被液0.1MNa2C03,pH9.6、0.1。/。BSA)包被抗原，37°C2h后置《C過(guò)夜；洗3次；加封閉液(含10%羊血清的0.05MpH9.6包被液)37i:孵育2h,洗滌1次；以稀釋液(含10%小牛血清、1~5%羊血清的pH7.4的PBS-T)1:50稀釋待測(cè)血清，加樣，37。C2h,洗3次，加1:8000稀釋的羊抗小鼠IgG-HRP，37°C2h，洗4次；加底物液(鄰苯二胺[OPD]10.0mg溶于0.1MpH5.0的磷酸鹽-檸檬酸緩沖液[24.3ml0.1M擰檬酸，25.7ml0.2MNa2HP04，50.0ml1~120混勻即可]25ml，加371~1202)，顯色終止；檢測(cè)OD492nm。結(jié)果顯示:DNA初次免疫后第14天即可檢測(cè)出抗dsDNA特異性抗體，經(jīng)4次加強(qiáng)免疫后抗體水平顯著增高，IgG滴度達(dá)1:640P，提示腫瘤細(xì)胞SP2/0來(lái)源dsDNA免疫小鼠可誘生高滴度的抗dsDNAIgG類(lèi)抗體(圖1A和B所示)。實(shí)施例4抗dsDNA雜交瘤細(xì)胞株的建立1)飼養(yǎng)細(xì)胞的制備取未免疫過(guò)的BALB/C小鼠摘眼球放血，置于EP管中，留取血清作陰性對(duì)照。脫頸推處死小鼠，超凈臺(tái)內(nèi)剪開(kāi)小鼠腹腔，吸取少許無(wú)血清1640培養(yǎng)基注入小鼠腹腔內(nèi)，吹打2-3次，吸出腹腔內(nèi)細(xì)胞懸液(主要為巨噬細(xì)胞)，1500rpm離心5分鐘，棄上清加入HAT培養(yǎng)基，制成飼養(yǎng)細(xì)胞懸液置C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日供細(xì)胞融合用。2)小鼠骨髓瘤細(xì)胞NS-1準(zhǔn)備融合前兩周用8-氮雜鳥(niǎo)嘌呤(8-AG)對(duì)NS-1細(xì)胞作選擇培養(yǎng)。融合當(dāng)天收集處于指數(shù)生長(zhǎng)期的、活率大于95%的細(xì)胞，用無(wú)血清RPMI-1640洗細(xì)胞一次，取5乂107細(xì)胞備用。3)小鼠脾細(xì)胞制備選取血清抗體效價(jià)最高小鼠，脫頸處死，無(wú)菌取脾，用200目尼龍指套制成單細(xì)胞懸液，無(wú)血清1640懸浮，取2X1()S細(xì)胞備用。4)細(xì)胞融合采用常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合將小鼠脾細(xì)胞和NS-1按4:15:1的比例混合，無(wú)血清1640洗滌2~3次，離心棄上清；輕彈使沉淀細(xì)胞疏松，37'C下將預(yù)熱的lml50%PEG于1分鐘內(nèi)逐滴加入細(xì)胞沉淀中，邊加邊緩慢均勻地旋轉(zhuǎn)離心管，使液滴沿管壁加入，靜置融合90秒，然后于2分鐘內(nèi)加完lml無(wú)血清1640，再于1分鐘內(nèi)加完lml無(wú)血清1640，再于30秒鐘內(nèi)加lml無(wú)血清1640，逐滴加入無(wú)血清164030-40ml,低速離心5分鐘，棄上清，沉淀細(xì)胞用含20%小牛血清HAT培養(yǎng)液重懸，滴加于預(yù)先鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，每孔10(^1。置37°C,5%C02孵箱培養(yǎng)。融合后的細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天后換用HT培養(yǎng)基，再過(guò)兩周后逐步換成含20。/。胎牛血-RPMI1640完全培養(yǎng)液。5)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞篩選取抗體效價(jià)最高的小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞NS-1按融合，在4塊96孔板中，共有551孔可見(jiàn)明顯雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，融合率為95%。融合后第7天觀察到雜交瘤細(xì)胞呈克隆性生長(zhǎng)(圖2A)。在第14天待克隆長(zhǎng)至孔底面積的1/31/2，取培養(yǎng)上清液，用ELISA再次驗(yàn)證是否分泌特異性抗體，取抗體水平較高的孔用有限稀釋法進(jìn)行連續(xù)三次克隆和篩選，最終獲得12株分泌anti-dsDNA單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。對(duì)已建立的雜交瘤細(xì)胞制備對(duì)數(shù)期雜交瘤細(xì)胞株中期染色體，Giemsa染色法鏡檢顯示12株雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)均在96-106條之間(如表1、圖2B所示)，證明所篩選的陽(yáng)性細(xì)胞確實(shí)為雜交瘤細(xì)胞。表1顯示了12株雜交瘤細(xì)胞染色體個(gè)數(shù)。MAbChromosome1C5972B5992G81043F21014H121045D91016A1966E8987F2998H101039G29710H598Spleencell40NS-160-68將12株雜交瘤細(xì)胞株與不同腫瘤細(xì)胞共育，檢測(cè)腫瘤細(xì)胞活性，篩選具有最強(qiáng)抗腫瘤活性的單克隆抗體。發(fā)現(xiàn)有5株抗體和腫瘤細(xì)胞共育后有抑瘤效應(yīng)，單抗2G8對(duì)Wehi164的細(xì)胞毒作用最明顯，并且這種細(xì)胞毒作用存在時(shí)間和劑量依賴(lài)關(guān)系(表2)。表2顯示了12株單克隆抗體作用于不同腫瘤細(xì)胞活性的抑制。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實(shí)施例5抗dsDNA單克隆抗體的制備純化采用小鼠腹水法制備高效價(jià)高純度的2G8單克隆抗體，取大于8~10周齡的BALB/c雌性小鼠，一側(cè)腹腔注入不完全福氏佐劑(IFA)與降植烷(Pristane)的等體積復(fù)合物(簡(jiǎn)稱(chēng)IFAP)0.5ml/只致敏；另一側(cè)腹腔注入雜交瘤細(xì)胞5x1(f/只，輕輕按摩小鼠腹部，使復(fù)合物與雜交瘤細(xì)胞充分混勻并擴(kuò)散至整個(gè)腹腔；接種后約10天，小鼠腹部明顯膨大，用注射器抽取腹水。收集的血性腹水置于離心管中3000rpm離心10分鐘，吸取中間層，棄沉淀和上層的不溶性物質(zhì)和油狀物。取腹水上清按50。/n飽和度加入等體積的飽和(NH4)2S04溶液，混勻后置40。C4-6小時(shí)，離心棄上清。取沉淀加0.01mol/LPBS(PH7.4)復(fù)溶。透析去除(NH4)2S04，按照Pharmacia公司提供的ProteinG親和層析進(jìn)行單抗純化，步驟如下柱子再生與平衡先用5CV甘氨酸-鹽酸(20mmol/L,pH2.7)再生層析柱，再用5CV平衡緩沖的磷酸鹽緩沖液(PB20mmo1/1,pH7.0)平衡層析柱，流速1.0ml/min;上樣將預(yù)處理好的腹水上樣，流速1.0ml/min;再平衡用平衡緩沖液沖洗層析柱，使其在280nm處紫外吸收接近基線，流速1.0ml/min;洗脫用甘氨酸-鹽酸(20mmol/L，pH2.7)洗脫液洗脫，流速1.0ml/min，接收蛋白洗脫峰,立即用lmol/LTris-HCl(pH9.0)調(diào)節(jié)至中性。PBS(PH7.0)透析后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定抗體蛋白的含量，其濃度的計(jì)算公式為:抗體蛋白含量(mg/ml)-OD280X1.55-OD260X0.76。用SDS-PAGE鑒定單克隆抗體純度分離膠濃度10%，濃縮膠濃度5%，分別在還原狀態(tài)和非還原狀態(tài)下處理樣品，上樣量15ml,電泳采用恒壓方式，濃縮膠150V,分離膠120V。電泳后以考馬斯亮藍(lán)R250染色，然后經(jīng)凝膠成像儀掃描鑒定純度，結(jié)果顯示腹水經(jīng)ProteinG親和層析柱純化，用SDS-PAGE電泳鑒定純度達(dá)到90%以上(圖3)。實(shí)施例62G8可與dsDNA特異性結(jié)合并可以及腫瘤細(xì)胞表面結(jié)合為檢測(cè)所制備的抗dsDNA單抗2G8的結(jié)合特異性，分別以Sl核酸酶處理后的CT-DNA(小牛胸腺dsDNA)、ssDNA、組蛋白、BSA、dsRNA為抗原包板，間接ELISA分別檢測(cè)與單抗2G8的結(jié)合特性。圖4A顯示單抗2G8只能特異性識(shí)別dsDNA,不能識(shí)別dsRNA、組蛋白、BSA，對(duì)dsDNA的結(jié)合能力明顯高于ssDNA。為證實(shí)2G8能和WehM64細(xì)胞膜結(jié)合，收集3><106/1巾1腫瘤細(xì)胞，和純化的2G8(20|jg/ml)或同型對(duì)照抗體4"C孵育1h，滴加羊抗鼠lgG-FITC(1:30)，4'C孵育30min，預(yù)冷的PBS洗滌3次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果顯示2G8與Wehi164結(jié)合效率(15.46%)顯著高于對(duì)照(5.96%，P<0.05)，表明2G8能結(jié)合于Wehi164細(xì)胞表面(圖4B)。實(shí)施例7抗dsDNA單克隆抗體2G8具有體外和體內(nèi)抗腫瘤作用1)抗dsDNA單克隆抗體的體外抗腫瘤作用將2G8與腫瘤細(xì)胞共育48hr后檢測(cè)腫瘤細(xì)胞活性發(fā)現(xiàn)20ug/ml2G8和WehM64孵育48hr抑瘤效率達(dá)35X;72hr達(dá)40X;同時(shí)，當(dāng)2G8濃度逐漸增加至40ug/ml時(shí)，48hr抑瘤達(dá)40。/。，證實(shí)2G8對(duì)Wehi164的抑制作用存在時(shí)間和劑量依賴(lài)關(guān)系(圖5)。2)抗dsDNA單克隆抗體2G8的體內(nèi)抗腫瘤作用收集5x1(^的Wehi164腫瘤細(xì)胞，接種裸鼠肩胛部皮下,10天后進(jìn)行抗體治療。定期觀察腫瘤大小和生存率。每23天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑和短徑，計(jì)算腫瘤的體積。腫瘤的體積以如下公式計(jì)算1/2XlXw2，其中I是腫瘤的長(zhǎng)徑(mm)，w代表腫瘤與長(zhǎng)徑垂直的短徑(mm)。在接種后第10天腫瘤體積達(dá)60-80mm3，將成瘤裸鼠隨機(jī)分3組，6只/組，分別為PBS處理組、同型對(duì)照抗體處理組和2G8mAb處理組，此時(shí)進(jìn)行抗體干預(yù)，腹腔注射抗體500ijg/只/次，每3天一次，共6次。繪制生存曲線。如圖6A所示第25天Wehi164荷瘤小鼠的平均腫瘤體積2G8處理組為226.7±96.5mm3，與PBS組(1441.7土642.56mm3)和同型對(duì)照組(1241.7土326.0mm3)相比，腫瘤顯著減小80%以上(P<0.05)。自22天-28天，2G8處理均有非常顯著的抑瘤效果。小鼠的生存率顯示2G8處理小鼠均存活至52天，到80天還有50。/。小鼠存活，而PBS、同型對(duì)照組小鼠平均生存為32和36天，證明2G8可以有效抑制體內(nèi)Wehi164腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)荷瘤小鼠生存期2倍以上(圖6B)。提示2G8有顯著的體內(nèi)抑瘤作用，可有效治療荷瘤動(dòng)物。實(shí)施例8抗dsDNA單克隆抗體2G8可以誘導(dǎo)凋亡2G8抗體處理48h后的Wehi164細(xì)胞以相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，部分細(xì)胞體積變小，表面無(wú)光澤，變圓，細(xì)胞表面突起多個(gè)小球狀的凋亡小體，提示2G8能誘發(fā)Wehi164腫瘤細(xì)胞活力下降甚至凋亡。抽提了2G8(20ng/ml)處理48h后的Wehi164細(xì)胞的DNA，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果與正常細(xì)胞基因組DNA相比，2G8孵育后的Wehi164細(xì)胞的基因組DNA發(fā)生了典型的凋亡片段化"DNAladder"(圖7)，提示2G8誘導(dǎo)了Wehi164細(xì)胞凋亡。將與2G8共育的Wehi164細(xì)胞用AnnexinV-FITC染色后流式檢測(cè)凋亡細(xì)胞比例。如圖8示在共培養(yǎng)48h后，2G8誘導(dǎo)了29.73。/。的Wehi164細(xì)胞凋亡，顯著高于對(duì)照2.53。/。(P<0.05)，并且這種凋亡存在時(shí)間和劑量依賴(lài)關(guān)系，2G8作用72小時(shí)誘導(dǎo)35%細(xì)胞調(diào)亡，進(jìn)一步證實(shí)抗dsDNA單抗2G8可以誘導(dǎo)Wehi164細(xì)胞凋亡。權(quán)利要求1.一種具有抗腫瘤活性的抗雙鏈DNA單克隆抗體，其特征在于所述的單克隆抗體特異性結(jié)合雙鏈DNA、或者能表達(dá)雙鏈DNA的腫瘤細(xì)胞，所述的雙鏈DNA是來(lái)自BALB/c小鼠全基因組DNA序列、或者來(lái)自BALB/c小鼠腫瘤細(xì)胞的全基因組DNA序列、或者BALB/c小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0的全基因組DNA序列。2.如權(quán)利要求1所述的具有抗腫瘤活性的抗雙鏈DNA單克隆抗體，其特征在于所述的雙鏈DNA經(jīng)蛋白酶和S1核酸酶處理。3.如權(quán)利要求1所述的具有抗腫瘤活性的抗雙鏈DNA單克隆抗體，其特征在于所述的抗雙鏈DNA單克隆抗體的亞型是小鼠IgG1。4.如權(quán)利要求1所述的具有抗腫瘤活性的抗雙鏈DNA單克隆抗體，其特征在于所述的腫瘤細(xì)胞為BALB/c小鼠來(lái)源的Wehi164、或者SP2/0、或者B16、或者p815、或者NS1、或者4T1腫瘤細(xì)胞以及C57BL/6小鼠來(lái)源的3LL、或者EL4細(xì)胞。5.—種制備如權(quán)利要求1所述的具有抗腫瘤活性的抗雙鏈DNA單克隆抗體的方法，其特征在于所述的方法包括一個(gè)通過(guò)小鼠雙鏈DNA免疫BALB/c小鼠的步驟、一個(gè)獲得分泌高效價(jià)抗雙鏈DNA抗體的脾細(xì)胞的步驟、一個(gè)將分泌高效價(jià)抗雙鏈DNA抗體的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合的步驟和一個(gè)反復(fù)篩選得到分泌該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系的步驟，通過(guò)雜交瘤細(xì)胞系分泌得到抗雙鏈DNA單克隆抗體。6.如權(quán)利要求5所述的具有抗腫瘤活性的抗雙鏈DNA單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的方法包括以下步驟(1)提取BALB/c小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0的全基因組雙鏈DNA;(2)以福氏完全或不完全佐劑與雙鏈DNA充分混勻呈乳濁液；(3)以皮下注射方式免疫BALB/c小鼠；(4)免疫后以ELISA方法證實(shí)小鼠血清中誘導(dǎo)了高效價(jià)的抗雙鏈DNA抗體后，分離得到小鼠脾細(xì)胞，小鼠脾細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞瘤融合，篩選永生化的分泌抗雙鏈DNA單克隆抗體的融合雜交瘤細(xì)胞株；(5)通過(guò)雜交瘤細(xì)胞株分泌獲得抗雙鏈DNA單克隆抗體。7.如權(quán)利要求6所述的具有抗腫瘤活性的抗雙鏈DNA單克隆抗體的制備方法，其特征在于通過(guò)皮下注射免疫時(shí)，共免疫四次，第一次混合福氏完全佐劑，第二次混合福氏不完全佐劑；第三次和第四次直接注射雙鏈DNA。8.—種雜交瘤細(xì)胞株，其特征在于采用如下步驟制備，包括一個(gè)通過(guò)小鼠雙鏈DNA免疫BALB/c小鼠的步驟，包括一個(gè)獲得分泌高效價(jià)抗雙鏈DNA抗體的脾細(xì)胞的步驟，包括一個(gè)將分泌高效價(jià)抗雙鏈DNA抗體的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合的步驟，包括一個(gè)反復(fù)篩選得到分泌該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系的步驟。9.如權(quán)利要求8所述的雜交瘤細(xì)胞株的制備方法，其特征在于所述的方法包括以下步驟(1)提取BALB/c小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0的全基因組雙鏈DNA，(2)以福氏完全或不完全佐劑與雙鏈DNA充分混勻成乳濁液，(3)以皮下注射方式免疫BALB/c小鼠，(4)免疫后以ELISA方法證實(shí)小鼠血清中誘導(dǎo)了高效價(jià)的抗雙鏈DNA抗體后，分離得到小鼠脾細(xì)胞，小鼠脾細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞瘤融合，篩選永生化的分泌抗雙鏈DNA單克隆抗體的融合雜交瘤細(xì)胞株。10.如權(quán)利要求9所述的雜交瘤細(xì)胞株的制備方法，其特征在于通過(guò)皮下注射免疫時(shí)，共免疫四次，第一次混合福氏完全佐劑，第二次混合福氏不完全佐劑；第三次和第四次直接注射雙鏈DNA。11.一種具有抗腫瘤功能的藥物組合物，其特征在于含有權(quán)利要求1所述的具有抗腫瘤活性的抗雙鏈DNA單克隆抗體、或者含有有效量的權(quán)利要求8所述的雜交瘤細(xì)胞株、或者含有有效量的權(quán)利要求8所述的雜交瘤細(xì)胞株和抗腫瘤藥物的組合，以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。12.—種檢測(cè)試劑，其特征在于含有權(quán)利要求1所述的具有抗腫瘤活性的抗雙鏈DNA單克隆抗體。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種具有抗腫瘤活性的抗雙鏈DNA單克隆抗體及其制備方法，所述的單克隆抗體特異性結(jié)合雙鏈DNA、或者能表達(dá)雙鏈DNA的腫瘤細(xì)胞，所述的雙鏈DNA來(lái)自BALB/c小鼠全基因組DNA序列，該方法通過(guò)提純BALB/c小鼠腫瘤細(xì)胞來(lái)源雙鏈DNA，以提純的腫瘤細(xì)胞來(lái)源的dsDNA免疫BALB/c小鼠，將分泌高效價(jià)抗dsDNA抗體的小鼠脾細(xì)胞與小鼠B細(xì)胞淋巴瘤融合、經(jīng)篩選、反復(fù)克隆化，獲得能穩(wěn)定分泌抗dsDNA單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。本發(fā)明的抗dsDNA單克隆抗體可特異性結(jié)合dsDNA，并可與腫瘤細(xì)胞表面結(jié)合，在體外和體內(nèi)有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，具有顯著的治療荷瘤動(dòng)物作用。文檔編號(hào)C07K16/18GK101429248SQ200710048068公開(kāi)日2009年5月13日申請(qǐng)日期2007年11月9日優(yōu)先權(quán)日2007年11月9日發(fā)明者薇徐,曹清華,熊思東申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)