專利名稱：一種具有抗菌功能的融合蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種融合蛋白及其應(yīng)用，尤其涉及一種用基因工程技術(shù)建立的動(dòng)物抗菌 肽基因載體和通過(guò)酵母表達(dá)系統(tǒng)獲得的抗菌肽融合蛋白，及其在制備抗菌藥物或具有病 害防治功能的水生生物或養(yǎng)殖畜禽飼料產(chǎn)品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
抗菌肽是生物體自身產(chǎn)生的，抵抗外界微生物、病毒等病原體侵染，用于肌體非特 異性防御的免疫物質(zhì)。其廣泛存在于動(dòng)物和植物中，具有殺菌活力高、作用迅速、不產(chǎn) 生耐藥性等特點(diǎn)，是多細(xì)胞生物免疫防御的有效手段，在生物的生存與進(jìn)化過(guò)程中發(fā)揮 著重要作用?？咕牟粌H能直接殺滅病原微生物，而且能激活生物體的免疫系統(tǒng)，增加 抵抗外界病原體入侵的能力。迄今為止，已經(jīng)有包括自較為低等的動(dòng)物至高等哺乳動(dòng)物 和人類來(lái)源的多種抗菌肽被分離、純化。例如家蠶中的cecropin、 cecatotoxin，鯊、 貝類、被囊動(dòng)物中的防御素(defensin)，七鰻魚(yú)、比目魚(yú)中的pleurocidin，兩棲動(dòng) 物的鵬gainin和dermas印in,鳥(niǎo)類中的防御素，哺乳動(dòng)物中的a -def ensin 、 P -defensin,植物中的thionin、植物防御素等。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的抗菌肽數(shù)目超過(guò)800余種。
海洋生物抗菌肽是機(jī)體天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，由于大部分海洋動(dòng)物的免疫 系統(tǒng)為先天性免疫系統(tǒng)，因而較哺乳動(dòng)物而言，作為先天性免疫系統(tǒng)成員的抗菌肽對(duì)海 洋動(dòng)物的作用就顯得更為重要。對(duì)海洋生物抗菌肽的研究主要集中在一些甲殼類動(dòng)物， 如鱟、蟹等方面，近年來(lái)也有關(guān)于蝦、貝類抗菌肽或抗菌肽類似物質(zhì)的研究報(bào)道，表明 海洋生物抗菌肽及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的應(yīng)用前景正在受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注。但是對(duì)魚(yú)類 抗菌肽的研究起步較晚，分離得到的抗菌肽種類有限。
defensin是一類重要的抗菌肽家族，其中h印cidin是e-defensin蛋白家族中的 一員(Verga F， et al' Gene. 2005， 364: 37-44 )。 h印cidin最初是從人的血漿抽濾 液或尿液中分離得到的，經(jīng)檢測(cè)證實(shí)它是一種富含半胱氨酸的抗菌蛋白，其抗菌活性已 得到多方的證實(shí)(Krause A， et al, FEBS Lett, 2000， 480: 147 — 150; Park C H， et al， J Biol Chem, 2001， 276: 7806 - 7810)。在對(duì)其進(jìn)行抗菌活性研究的同時(shí)又發(fā)現(xiàn) H印cidin在鐵代謝中也發(fā)揮著作用(Nicolas G， et al， Proc Natl Acad, 2001， 98: 8780 - 8785)。隨后克隆得到了多種h印cidin的同源異構(gòu)體基因。Shike等從雜交石斑 鱸魚(yú)中得到了 h印cidin基因，是首次從魚(yú)類中得到的h印cidin基因(Shike H, et al， Eur J Biochem, 2002， 269: 2232 - 2237)。 magainin最初是從蟾蜍的皮膚中分離得到 的，這類抗菌肽具有a螺旋結(jié)構(gòu)，通常是由L型兩性氨基酸組成，對(duì)革蘭陰性菌、陽(yáng)性 菌、都有殺傷作用(Zasloff M, Proc Natl Acad Sci USA, 1987, 84:5449-5453; Barrell PJ，et al， Protein Expr Purif， 2004， 33:153-159)。
盡管抗菌肽抗菌功效顯著，應(yīng)用前景廣闊，但天然抗菌肽的含量很低，無(wú)法從生物 體內(nèi)大量獲?。欢瘜W(xué)合成肽價(jià)格昂貴，限制了其廣泛應(yīng)用。目前由于環(huán)境污染的嚴(yán)重 致使水產(chǎn)養(yǎng)殖病害頻繁發(fā)生，常造成比較大的經(jīng)濟(jì)損失。水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)廣泛和大量使用氯 霉素等抗生素，造成抗生素在水產(chǎn)品中超標(biāo)累積，給消費(fèi)者的健康帶來(lái)巨大危害。目前 歐盟己經(jīng)禁止我國(guó)抗菌素超標(biāo)的水產(chǎn)品出口歐盟國(guó)家。因此，利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)基 因工程重組的具有高效殺菌效果的抗菌肽并應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，以及用于各種畜禽動(dòng)物 的飼養(yǎng)中，以替代日益受到禁用的抗菌素已經(jīng)成為我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和畜牧業(yè)的必然選 擇。
應(yīng)用酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)真核生物基因在DNA重組技術(shù)中正在得到越來(lái)越廣泛的應(yīng) 用。最先使用的是釀酒酵母系統(tǒng)，迄后具有優(yōu)良特性的巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)越來(lái) 越受到科學(xué)一工業(yè)界的重視，并逐漸取代釀酒酵母系統(tǒng)。酵母表達(dá)系統(tǒng)具有獨(dú)特的生 物學(xué)特性，具有嚴(yán)格調(diào)控外源真核細(xì)胞蛋白的表達(dá)，加工修飾表達(dá)產(chǎn)物，表達(dá)量高， 營(yíng)養(yǎng)要求低等優(yōu)點(diǎn)。由于抗菌肽直接作用于原核生物細(xì)胞膜，抑制其生長(zhǎng)以至殺滅菌 體，因此采用真核生物酵母的表達(dá)系統(tǒng)幾乎成為生產(chǎn)基因工程重組抗菌肽的唯一選擇。 另外，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)能利用甲醇作為唯一碳源大量合成蛋白質(zhì)，曾用于工業(yè)規(guī)模的 單細(xì)胞蛋白的生產(chǎn)。以酵母工程菌表達(dá)基因工程抗菌肽，能夠大量生產(chǎn)水生生物和動(dòng) 物飼養(yǎng)所急需的、可以替代抗菌素的動(dòng)物自身基因表達(dá)的抗菌肽，為市場(chǎng)提供無(wú)毒無(wú) 害、健康的綠色產(chǎn)品。并且對(duì)抗菌肽的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用將產(chǎn)生很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和巨 大的社會(huì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用基因工程技術(shù)建立的動(dòng)物抗菌肽基因載體和通過(guò)酵母 表達(dá)系統(tǒng)獲得的抗菌肽融合蛋白，及其在制備抗菌藥物或具有病害防治功能的水生生物 或養(yǎng)殖畜禽詞料產(chǎn)品中的應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思是將魚(yú)類的抗菌肽和兩棲動(dòng)物的抗菌肽組成新型的融合蛋白，使 用基因工程的手段構(gòu)建含融合蛋白cDNA序列的表達(dá)載體并整合至酵母基因組進(jìn)行表達(dá)。 其表達(dá)產(chǎn)物可以應(yīng)用于水生生物或畜禽動(dòng)物養(yǎng)殖中；也可以通過(guò)純化或濃縮的方法，得 到高純度的融合蛋白，直接作為抗生素的替代品用于生物的病害防治，細(xì)菌性甚至病毒 性疾病的治療。
本發(fā)明的具有抗菌功能的融合蛋白由經(jīng)過(guò)修飾的魚(yú)類抗菌肽h印cidin和兩棲動(dòng)物 抗菌肽magainin組成，其特征在于所述融合蛋白是含有SEQ ID N0: 1所示氨基酸序 列的短肽。
上述融合蛋白的基因由編碼魚(yú)類h印cidinl precursor成熟肽的cDNA序列、編碼 兩棲動(dòng)物抗菌肽magainin成熟肽的cDNA序列、限制性內(nèi)切酶EcroR I位點(diǎn)的cDNA序列 以及符合真核生物表達(dá)偏好性的基因序列組成，其特征在于所述融合蛋白基因的核苷 酸序列是SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列。
本發(fā)明所述的融合蛋白在制備在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的融合蛋白在制備具有病害防治功能的水生生物或養(yǎng)殖畜禽飼料中的 應(yīng)用。
其中所述融合蛋白直接作為免疫添加劑添加到水生生物或畜禽詞料中，或經(jīng)純化 后作為病害防治藥物直接使用或作為飼料添加劑使用。
本發(fā)明所述融合蛋白的酵母表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于，含有外源融合蛋白cDNA的酵 母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)載體PA0815或其它類型的酵母表達(dá)載體，以及利用載體使融合蛋白基因 在畢赤酵母、釀酒酵母、假絲酵母或其它可食性酵母中進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外表達(dá)。它的
步驟為
表達(dá)載體的構(gòu)建人工合成的抗菌融合蛋白CDNA序列上設(shè)計(jì)有限制性內(nèi)切酶的酶 切位點(diǎn)，融合蛋白cDNA序列和Invitrogen公司的酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)質(zhì)粒pA0815酶切后 鏈接在一起，通過(guò)PCR反應(yīng)檢測(cè)融合蛋白基因插入的方向，篩選出含有正向插入的融合 蛋白基因的克隆。
酵母表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建使用限制性內(nèi)切酶酶切酵母表達(dá)質(zhì)粒，使其線性化，通過(guò)電 擊轉(zhuǎn)化的方法，將融合蛋白cDNA序列整合到酵母的基因組中。將轉(zhuǎn)化后的菌體懸液涂 布于MD平板上，30。C培養(yǎng)，誘導(dǎo)篩選直至單個(gè)菌落出現(xiàn)。挑取單菌落，將其作為模板， 通過(guò)PCR反應(yīng)確認(rèn)陽(yáng)性克隆。
融合蛋白的細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外誘導(dǎo)表達(dá)及活性檢測(cè)。
表達(dá)產(chǎn)物抗菌活性的檢測(cè)方法如下
挑選陽(yáng)性克隆菌落，于3(TC培養(yǎng)，收集菌體，用含有甲醇的培養(yǎng)基重懸菌體，使外 源基因能夠被誘導(dǎo)表達(dá)。如使用細(xì)胞內(nèi)表達(dá)載體，收集菌體，破碎細(xì)胞后取得蛋白粗提 液。如使用細(xì)胞外表達(dá)載體，收集細(xì)胞培養(yǎng)液后通過(guò)硫酸銨沉淀、離子交換層析和凝膠 層析純化，通過(guò)聚丙烯酰銨凝膠電泳分離得到電泳純的融合蛋白。
通過(guò)在培養(yǎng)皿上涂布融合蛋白粗提液并同時(shí)接種大腸桿菌、鰻弧菌、溶藻弧菌等種 類致病菌，進(jìn)行抑菌圈實(shí)驗(yàn)，或是通過(guò)在上述致病菌培養(yǎng)液中添加融合蛋白粗提液，檢 測(cè)A600吸光值來(lái)檢測(cè)其抗菌活性。
本發(fā)明的融合蛋白經(jīng)檢測(cè)具有明顯的抗菌活性，可以用于水生生物、養(yǎng)殖動(dòng)物對(duì)抗 生素有耐藥性的細(xì)菌性疾病的防治，或者將純化的融合蛋白直接作為藥品，用于對(duì)細(xì)菌 甚至病毒所引起的疾病的治療。
本發(fā)明的有益效果是
(1) 應(yīng)用基因工程技術(shù)可以大量生產(chǎn)新型的水生生物和養(yǎng)殖動(dòng)物的抗菌肽。
(2) 解決靜她長(zhǎng)其鵬的病害危害,J^品及禽驢口口oiM^辯鵬示的問(wèn)題。
(3) 用高技術(shù)帶動(dòng)養(yǎng)殖業(yè)以及養(yǎng)殖餌料工業(yè)的行業(yè)技術(shù)進(jìn)步。
(4) 向社會(huì)衛(wèi)繊泰白WfeK^品和禽熟口口。


圖1. 魚(yú)類h印cidinl precursor基因的克隆。圖2.表達(dá)融合蛋白cDNA的載體pA0815 — antibac質(zhì)粒。
圖3. pA0815-antibac陽(yáng)性克隆的檢測(cè)。
圖4.畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的抗菌融合蛋白對(duì)大腸桿菌的抑菌效果。 圖5.畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的抗菌融合蛋白對(duì)鰻弧菌的抑菌效果。 圖6.畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的抗菌融合蛋白對(duì)溶藻弧菌的抑菌效果。
其中圖4 6中1X、2X、3X為不同濃度的抗菌融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)蛋白粗體液，
0為對(duì)照(表達(dá)f3-Gal的酵母表達(dá)系統(tǒng)蛋白粗體液)。
具體實(shí)施例方式
下面以實(shí)施例并結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明內(nèi)容做進(jìn)一步說(shuō)明
1.魚(yú)類肝臟cDNA的制備大鯪鲆注射鰻弧菌感染24h后，取出肝臟，迅速放于液 氮中，將硬的組織塊置于一80。C冷凍保藏。參照TRIZOLS試劑操作說(shuō)明，取冷凍保藏的
組織約100mg，加入到lml TRIZ0L試劑中，置室溫下勻化5分鐘之后，加入200W氯仿 劇烈振蕩15秒，室溫下溫育3min。 4'C條件下以12， 600rpm轉(zhuǎn)速離心15 min。獲取界 面上層液體加入25014以0.腦乙酸鈉和1. 2M氯化鈉組成的高濃度鹽溶液，混勻后再加 入250rt異丙醇混勻，于室溫下沉淀10min，再在4'C以12, 600rpm轉(zhuǎn)速離心10 min。 移去上清后用lml 70%乙醇漂洗沉淀，以11，000rpm轉(zhuǎn)速4。C離心5 min。以20WDEPC 處理過(guò)的雙蒸水(無(wú)RNase) 55。C溶解RNA沉淀10 min后，取2. Oug總RNA，加入 50pM的隨機(jī)引物，以DEPC水稀釋至17. U4。 70°C 5 min破壞RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)后置冰上驟 冷。依次加入5^1 M-MLV 5X轉(zhuǎn)錄緩沖液，1. IO固dNTP， 24U rRNA酶抑制劑和200U M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶。于42。C反應(yīng)lh后在94。C維持5 min終止反應(yīng)，于4。C保藏。
2. 魚(yú)類抗菌肽h印cidinl precursor基因的克隆和序列分析以大菱鲆肝臟cDNA 為模板，使用引物 W朋sp ( 5—-CAAACCCTCCTAAGATGAAG-3' )， WBHap
(5—-AATCCTCAGAACCTACAGCA-3')進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)退火溫度為52°C, 30個(gè)循環(huán)得 到大約300bp的PCR條帶(見(jiàn)圖l)。得到的PCR產(chǎn)物使用凝膠電泳試劑盒回收，經(jīng)測(cè) 序證實(shí)，該序列全長(zhǎng)293bp，包括完整的編碼區(qū)，其中開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)273bp，編碼90個(gè) 氨基酸，詳見(jiàn)GenBank序列號(hào)AM113708。。通過(guò)NCBI的Blastn服務(wù)器對(duì)核酸序列進(jìn) 行同源相似性比對(duì)。同源相似性較高的序列多為H印cidin家族的基因序列，其中與牙鲆 的同源相似性為90%[ /^e〃t/oscj'ae朋 crocea(DQ307050)]，與白鱸的同源相似性為84 % [yfforw e c力/ysoA (AF394246)]，與黑鯛的同源相似性為83% [/)ca/ t力o/)艱r〃s sc/^e^^h'(AY669380)]。確定該序列為大菱鲆h印cidinl precursor基因。使用signalP 月艮務(wù)器予頁(yè)測(cè)hepcidinl precursor蛋白序列的iW號(hào)月太區(qū)土或，hepcidinl precursor蛋白 序列中C端24個(gè)氨基酸為信號(hào)肽。使用軟件0miga2. 0預(yù)測(cè)h印cidinl precursor蛋白 序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)，h印cidinl precursor的蛋白序列中N端21個(gè)氨基酸為{3 -折疊結(jié)構(gòu)， 而這部分序列包含八個(gè)半胱氨酸。H印cidin蛋白家族成熟肽的最顯著的特征就是由這八 個(gè)半胱氨酸形成的P-折疊結(jié)構(gòu)，這符合h印cidin蛋白家族的特征。比較鱸魚(yú)、斑馬魚(yú) H印cidin成熟肽，從而得出大菱鉀h印cidinl precursor的成熟肽具有21個(gè)氨基酸。
3. 融合蛋白cDNA的的設(shè)計(jì)與制備融合蛋白cDNA序列由編碼魚(yú)類h印cidinl precursor成熟肽的基因序列、編碼兩棲動(dòng)物抗菌肽Magainin成熟肽的基因序列、限制 性內(nèi)切酶EcroR I位點(diǎn)的序列以及符合真核生物表達(dá)偏好性，同時(shí)符合Kozak規(guī)則的基 因序列組成。進(jìn)行基因工程修飾的位點(diǎn)描述如下(l)第4位的偏好堿基為G; (2)ATG 的5'端約15bp范圍的側(cè)翼序列內(nèi)不含堿基T; (3)在-3， -6和-9位置，G是偏好堿基； (4)除-3， -6和-9位，在整個(gè)側(cè)翼序列區(qū)，C是偏好堿基。所以融合蛋白基因序列編碼 的蛋白序列是由h印cidinl precursor和Magainin的兩段成熟肽序列經(jīng)基因工程方法 優(yōu)化設(shè)計(jì)修飾組成。使用固相亞磷酸酰胺法人工合成這段基因序列，序列長(zhǎng)151bp (見(jiàn) SEQIDN0: 2所示的核苷酸序列)，編碼39個(gè)氨基酸，后續(xù)構(gòu)建的酵母表達(dá)系統(tǒng)所表達(dá) 的蛋白就是這個(gè)含有39個(gè)氨基酸的短肽(見(jiàn)SEQ ID NO: l所示氨基酸序列)。
4. 酵母表達(dá)系統(tǒng)pA0815-antibac載體的構(gòu)建人工合成的抗菌融合蛋白基因序列 上設(shè)計(jì)有限制性內(nèi)切酶EcroR I的酶切位點(diǎn)，酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)質(zhì)粒載體pA0815同樣具有 EcroRl的單酶切位點(diǎn)，融合蛋白基因和pA0815質(zhì)粒酶切后具有同樣的粘性末端。使用 EcroR I分別酶切融合蛋白基因和pA0815質(zhì)粒，使用凝膠電泳回收試劑盒分別回收酶切 后的產(chǎn)物。使用DNA Ligation Kit試劑盒進(jìn)行連接，取融合蛋白基因加入pA0815載體2W連接緩沖液2. 5W、連接酶4.5W， 16匸連接過(guò)夜。使其鏈接在一起，并導(dǎo)入 到大腸桿菌DH5a中。使用引物HMsp (5—-GGACAGCCACATCTCCCTTT-3')和HMap (5、-GTGCGAATTCTCAGAACTTC-3—)，以轉(zhuǎn)化后大腸桿菌DH5 a菌懸液為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)， 退火溫度53'C，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。連接產(chǎn)物檢測(cè)融合蛋白基因插入的方向。如果融合蛋 白基因正向插入到質(zhì)粒pA0815中則會(huì)出現(xiàn)大約130bp的PCR條帶，如果融合蛋白基因 反向插入則不會(huì)出現(xiàn)PCR條帶。篩選出含有正向插入的融合蛋白基因的克隆。將得到的 表達(dá)載體命名為pA0815-antibac質(zhì)粒(圖2)。將該質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌中，使其形成 多克隆。制備pA0815-antibac質(zhì)粒，使用限制性內(nèi)切酶Sal I酶切質(zhì)粒，使其線性化。 將約20Pg的線性化pA0815-antibac質(zhì)粒溶液與80Ml的GS115感受態(tài)細(xì)胞混勻，轉(zhuǎn)至 0.2ml冰預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中。將電轉(zhuǎn)化杯冰浴5min后使用電轉(zhuǎn)化儀進(jìn)行轉(zhuǎn)化。條件為 電壓1. 5kV，電擊10msec，使外源基因整合到酵母GS115的基因組中。轉(zhuǎn)化后將菌體加 入lml冰預(yù)冷的lmol山梨醇溶液混勻，轉(zhuǎn)至1. 5ml的EP管中。轉(zhuǎn)化后的菌體懸液隨后 均勻涂布于MD平板上于3(TC培養(yǎng)，直至單個(gè)菌落出現(xiàn)。挑取單菌落，將其作為模板， 使 用 引 物 5—A0X (5、-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3—) 和 3—AOX (5、-GCAAATGGCCATTCTGACATCC-3')，通過(guò)PCR反應(yīng)篩選具有pA0815-antibac的陽(yáng)性克 隆。整合融合蛋白cDNA序列的陽(yáng)性克隆出現(xiàn)600bp左右的PCR條帶(圖3)。挑選含 pA0815-antibac的菌落，置于裝有25ml剛GY培養(yǎng)基的搖瓶中，于3(TC培養(yǎng)至菌液的 0D6。。 = 2. 0。收集菌體，用歷MY重懸菌體，使0D6 。 =1. 0左右。所得的菌液置于1L的 搖瓶中，放置于3(TC培養(yǎng)，每24h向培養(yǎng)基中添加無(wú)水甲醇至終濃度為0. 5%培養(yǎng)至0D6 。 =3.0。收集菌體，破碎細(xì)胞后取得蛋白粗提液，其中富含融合蛋白。
也可以將蛋白粗提液用梯度硫酸銨沉淀，然后將沉淀收集溶于磷酸緩沖液后，分別 經(jīng)離子交換層析和凝膠層析處理，得到電泳純的融合蛋白。
同時(shí)，以同樣條件下培養(yǎng)的，可以表達(dá)P-Gal的酵母表達(dá)系統(tǒng)蛋白粗體液作為對(duì)照。
5. 抑菌試驗(yàn)在涂布有大腸桿菌、鰻弧菌或溶藻弧菌的平板培養(yǎng)皿上滴加不同濃度 的酵母蛋白粗提液或經(jīng)過(guò)純化的融合蛋白。將培養(yǎng)皿至于37'C過(guò)夜培養(yǎng)，次日觀察并記 錄抑菌效果。
上述富含融合蛋白的粗提液和經(jīng)過(guò)純化的融合蛋白，均表現(xiàn)有抗菌活性(結(jié)果見(jiàn)圖 4 6)。
6. 融合蛋白在制備抗菌藥物中的應(yīng)用將含融合蛋白分泌型表達(dá)載體的酵母，經(jīng) 常規(guī)培養(yǎng)后收集培養(yǎng)液，再經(jīng)常規(guī)沉淀、離心、脫鹽、層析等步驟得到獸藥級(jí)的融合蛋 白；或在融合蛋白序列兩端添加組氨酸cDM序列等標(biāo)簽，使用親和層析獲得更高純度
的融合蛋白。
獲得的融合蛋白可直接作為抗菌藥物，以常規(guī)用藥量應(yīng)用于水生生物或其它養(yǎng)殖禽 畜疾病的防治。
7. 融合蛋白在制備具有病害防治功能的水生生物或養(yǎng)殖畜禽飼料中的應(yīng)用由于
酵母含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素及其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此含胞內(nèi)表達(dá)型載體的酵母可以作 為飼料添加劑。按照設(shè)定比例將含胞內(nèi)表達(dá)型載體的酵母添加到水生生物或養(yǎng)殖畜禽飼 料中，在為水生生物或養(yǎng)殖畜禽提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的同時(shí)，提高其病害防御能力。
如應(yīng)用上述方法，使用100L發(fā)酵罐，于3(TC下擴(kuò)大培養(yǎng)基因組中包含有SEQ ID N0:
2所示核苷酸序列的畢赤酵母GS115，通過(guò)發(fā)酵液中添加0. 5%甲醇誘導(dǎo)抗菌融合蛋白基 因的表達(dá)，經(jīng)3_5天培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)濾后，得到大量具有表達(dá)抗菌活性融合蛋白的GS115 酵母，所述酵母菌數(shù)不少于5X104cfu/g，含水量《10%。
以常規(guī)方式選擇玉米粉、糠、麩皮、豆餅、魚(yú)粉、骨粉為水生生物或養(yǎng)殖畜禽的基 礎(chǔ)飼料，將上述獲得的酵母菌作為飼料添加劑，直接添加于上述水生生物或養(yǎng)殖畜禽的 基礎(chǔ)飼料中混合，所述飼料添加劑添加比例量為基礎(chǔ)詞料重量的20% (可相應(yīng)減少魚(yú)粉 或其它蛋白質(zhì)飼料的用量)，使混有添加劑的基礎(chǔ)飼料的最終營(yíng)養(yǎng)成分中粗蛋白>35%、 粗脂肪》3%、粗纖維》3%、粗灰分》15%、鈣》2%、磷》1%、賴氨酸》1.8%，制得 具有病害防治功能的水生生物或養(yǎng)殖畜禽飼料。
或者，以基礎(chǔ)伺料重量5% 25%的添加比例量直接將上述所得發(fā)酵全液用于畜禽和 水產(chǎn)養(yǎng)殖生物的喂養(yǎng)。
進(jìn)一步的，以上述方法將含融合蛋白分泌型表達(dá)載體的酵母，經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)后收集培 養(yǎng)液，再經(jīng)常規(guī)沉淀、離心、脫鹽、層析等步驟得到獸藥級(jí)的含有SEQ ID NO: 1所示 氨基酸序列的融合蛋白。
以常規(guī)方式選擇玉米粉、糠、麩皮、豆餅、魚(yú)粉、骨粉為水生生物或養(yǎng)殖畜禽的基 礎(chǔ)飼料，將上述獲得的融合蛋白作為飼料添加劑，直接添加于上述水生生物或養(yǎng)殖畜禽 的基礎(chǔ)飼料中混合，所述詞料添加劑添加比例量為基礎(chǔ)飼料重量的10%，使混有添加劑 的基礎(chǔ)飼料的最終營(yíng)養(yǎng)成分中粗蛋白>35%、粗脂肪》3%、粗纖維》3%、粗灰分》15 %、鈣》2%、磷》1%、賴氨酸》1.8%，制得具有病害防治功能的水生生物或養(yǎng)殖畜禽 飼料。
序列表
〈110〉國(guó)家海洋局第一海洋研究所
<120>—種具有抗菌功能的融合蛋白及其應(yīng)用
〈141〉2007-9-11
<160〉2
<210〉1
<211>39
〈212>PRT
<213〉人工序列
<400>1
Met Asp Ser His lie Ser Leu Cys Arg Trp Cys Cys Asn Cys Cys 5 10 15
Lys Ala Tyr Lys Gly Cys Gly Phe Cys Cys Arg Phe Gly lie Gly 20 25 30
Lys Phe Leu His Ser Ala Lys Lys Phe 35
<210〉2
〈211>151
<212〉cDNA
<213〉魚(yú)類h印cidinl precursor成熟肽的cDNA序列&編碼兩棲動(dòng)物抗菌肽magainin成
熟肽的cDNA序列
<400〉2
ccctcgaatt cgccgccacc atggacagcc acatctccct ttgccgctgg tgctgcaact 60 gctgcaaggc ctacaagggc tgtggcttct gctgtaggtt cggcattggc aagttcctgc 120 actctgccaa gaagttctga gaattcgcac c 15權(quán)利要求
1.一種具有抗菌功能的融合蛋白，由經(jīng)過(guò)修飾的魚(yú)類抗菌肽hepcidin和兩棲動(dòng)物抗菌肽magainin組成，其特征在于所述融合蛋白是含有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的短肽。
2. 權(quán)利要求1所述融合蛋白的基因，由編碼魚(yú)類h叩cidinl precursor成熟肽的cDNA 序列、編碼兩棲動(dòng)物抗菌肽magainin成熟肽的cDNA序列、限制性內(nèi)切酶EcroR I位點(diǎn) 的cDNA序列以及符合真核生物表達(dá)偏好性的基因序列組成，其特征在于所述融合蛋 白基因的核苷酸序列是SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列。
3. 權(quán)利要求1所述融合蛋白在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。
4. 權(quán)利要求1所述融合蛋白在制備具有病害防治功能的水生生物或養(yǎng)殖畜禽飼料中 的應(yīng)用。
5. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述融合蛋白直接作為免疫添加劑添加 到水生生物或畜禽飼料中，或經(jīng)純化后作為抗菌藥物直接使用或作為飼料添加劑使用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種具有抗菌功能的融合蛋白及其應(yīng)用。所述融合蛋白基因序列組成為克隆得到的hepcidinl precursor抗菌肽基因和人工合成的magainin抗菌肽基因，通過(guò)基因工程手段將二者組成為新型的融合蛋白cDNA并整合在酵母的基因組上，通過(guò)誘導(dǎo)使融合蛋白cDNA在酵母表達(dá)，進(jìn)而通過(guò)酵母發(fā)酵培養(yǎng)獲得大量的融合蛋白。本發(fā)明的融合蛋白經(jīng)檢測(cè)具有明顯的抗菌活性，可以用于水生生物、養(yǎng)殖動(dòng)物的細(xì)菌性疾病的防治，或者將純化的融合蛋白直接作為藥品，替代抗生素用于對(duì)細(xì)菌甚至病毒所引起的疾病的治療。
文檔編號(hào)C07K19/00GK101182360SQ20071011386
公開(kāi)日2008年5月21日 申請(qǐng)日期2007年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月8日
發(fā)明者叢柏林, 劉晨臨, 劉勝浩, 林學(xué)政, 黃曉航 申請(qǐng)人:國(guó)家海洋局第一海洋研究所