專利名稱：高純度辣椒堿單體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及逆流色譜制備分離方法，具體地說(shuō)是關(guān)于高速逆流色譜法(HSCCC)從辣椒總生物堿粗提物中分離制備高純度辣椒堿單體的方法。
背景技術(shù)：
辣椒Capsicum frutescens L var. condodies Bailey 是茄科辣椒屬多年生草本植物，其果實(shí)除了用作食用辛香料外，還可用作藥物。中醫(yī)認(rèn)為，辣椒具 有通經(jīng)活絡(luò)、活血化瘀、驅(qū)風(fēng)散寒、開(kāi)胃健胃、補(bǔ)肝明目、溫中下氣、抑菌止 氧和防蟲(chóng)蝕等功效。所以常將它稱為"紅色藥材"，用來(lái)預(yù)防和治療某些多發(fā) 病和常見(jiàn)病。如傷風(fēng)感冒、脾胃受寒、消化不良、關(guān)節(jié)疼痛、腳手凍傷等。
辣椒的主要的活性成分為辣椒堿、二氫辣椒堿與降二氫辣椒堿。動(dòng)物藥理 研究表明，辣椒堿能減輕嗎啡類(lèi)藥物的戒斷綜合癥，可防止阿司匹林對(duì)胃道的 損傷和出血副作用，能促進(jìn)經(jīng)皮膚藥物的吸收，可用于治療以疼痛為主要癥狀 的綜合癥，如嚴(yán)重難治性帶狀皰疹后神經(jīng)痛，重癥風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，乳腺癌和肺 癌切除手術(shù)后的疼痛等。
已有研究表明，不同產(chǎn)地和品種的辣椒中含有的辣椒堿各組分的絕對(duì)含量 和相對(duì)含量都有差異，各組分不能準(zhǔn)確定量，質(zhì)量難以控制，這導(dǎo)致辣椒生物 堿在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用受到限制。另外由于辣椒生物堿各組分之間的結(jié)構(gòu)非常相 似，其中辣椒堿和二氫辣椒堿只是碳鏈第6位單雙鍵的差別，常規(guī)的分離方法 無(wú)法將其分開(kāi)。中國(guó)專利CN1153711A、 CN1267666A、 CN1392135A等中描述的 技術(shù)得到的產(chǎn)品均是不同純度的辣椒總生物堿，專利CN1915967A得到的只是 一種辣椒生物堿單體，目前尚未見(jiàn)到同時(shí)制備出三種高純度辣椒生物堿單體的 報(bào)道。
辣椒堿單體是作用于C感覺(jué)神經(jīng)元上的P物質(zhì)，通過(guò)與受體結(jié)合影響P物 質(zhì)的釋放合成和貯存，使局部P物質(zhì)減少，阻止外周神經(jīng)的感覺(jué)傳導(dǎo)。這種特 性使得辣椒生物堿被國(guó)際上廣泛應(yīng)用作為研究神經(jīng)系統(tǒng)的工具藥和用于研究 與P物質(zhì)機(jī)理有關(guān)的疾病。但辣椒生物堿粗品在臨床上不能誘導(dǎo)神經(jīng)肽活性， 因?yàn)榇制分械囊恍┓宇?lèi)物質(zhì)能拮抗辣椒堿對(duì)神經(jīng)肽的作用，加劇疼痛和炎癥， 因此必須將辣椒生物堿提純，才能發(fā)揮作用。目前國(guó)內(nèi)的醫(yī)學(xué)研究單位所用的 單體辣椒堿全部由國(guó)外進(jìn)口，價(jià)格非常昂貴。由于辣椒生物堿具有重要的生理活性，因此，需要更多的純品來(lái)用于進(jìn)一步的活性研究；也需要多個(gè)純品，來(lái) 控制辣椒生物堿制劑或產(chǎn)品的質(zhì)量。
基于上述情況，我們發(fā)明了高純度辣椒堿單體的分離制備技術(shù)，利用高速 逆流色譜技術(shù)一步分離就可得到辣椒堿、二氫辣椒堿、降二氫辣椒堿三種高純 度辣椒堿單體，純度均在98%以上。以下為辣椒堿、二氫辣椒堿與降二氫辣椒 堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)式
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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從辣椒生物堿粗提物中快速分離純化高純度辣 椒堿單體的方法，該方法工藝簡(jiǎn)便，效率高，產(chǎn)品純度大于98%。
本方案是通過(guò)如下技術(shù)措施來(lái)實(shí)現(xiàn)的，它包括如下步驟用于分離制備高
純度辣椒堿單體的溶劑系統(tǒng)是鹵代烷烴、醇和水，其用量體積比為(1-5) : (1-4):
(l-2);將上述溶劑系統(tǒng)配置于分液漏斗中充分振搖后靜置12小時(shí)，分層， 取上相作為固定相，下相作為流動(dòng)相；
采用的逆流色譜儀由柱塞泵、進(jìn)樣閥、紫外檢測(cè)儀、記錄儀和色譜分離柱 等部分組成，它的連接順序?yàn)橹靡弧M(jìn)樣閥—色譜分離柱—紫外 檢測(cè)儀~-記錄儀；首先使進(jìn)樣閥處于進(jìn)樣狀態(tài)，將固定相用泵以一定流速 灌滿半制備型逆流色譜儀的色譜分離柱，開(kāi)啟速度控制器，使色譜儀的色譜分 離柱正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速達(dá)800r/min時(shí)，設(shè)置流動(dòng)相流速為0. 5_2. OmL/min，開(kāi)始泵流 動(dòng)相，待流動(dòng)相流出色譜分離柱時(shí)，稱取一定量辣椒總生物堿提取物放入上相、 下相的混合液中溶解，用注射器注入逆流色譜儀進(jìn)樣閥的貯液管中，旋轉(zhuǎn)進(jìn)樣 閥為接柱狀態(tài)，使樣品進(jìn)入色譜分離柱；根據(jù)檢測(cè)器紫外光譜圖，對(duì)分離的每
個(gè)峰進(jìn)行收集，用高效液相色譜(HPLC)測(cè)定純度，分別收集不同成分；減壓 濃縮，峰A為二氫辣椒堿，峰B為辣椒堿，峰C為降二氫辣椒堿。
本方案的具體特點(diǎn)還有，所述鹵代烷烴可分別為四氯化碳、三氯甲垸、二 氯甲垸之一或任意兩個(gè)的混合物。所述溶劑系統(tǒng)中的四氯化碳、三氯甲烷、乙 醇和水的體積比為3:1:4:2。所述溶劑系統(tǒng)中的二氯甲垸、甲醇和水的體積比 為4:3. 5:2。
所述逆流色譜儀為半制備型逆流色譜儀或者制備型逆流色譜儀或者分析 型逆流色譜儀。所述逆流色譜儀采用北京新技術(shù)應(yīng)用研究所生產(chǎn)的GS10A2型 半制備型逆流色譜儀。所述色譜分離柱由聚四氟乙烯管多層纏繞形成的螺旋管 柱，容量為230ml。
所述辣椒總生物堿粗提物的制備方法辣椒樣品粉碎后、醇提，過(guò)濾，濾 液減壓濃縮至近干，加入體積比為O. 1-1:1的乙醚與石油醚混合液重結(jié)晶，放 置，得到辣椒總生物堿粗提物。所述醇提為用50% — 100%乙醇提取3次。
分離溶劑系統(tǒng)的選擇根據(jù)各種溶劑的極性、粘性、比重、溶解度等因素， 設(shè)計(jì)一系列溶劑系統(tǒng)，然后按溶劑系統(tǒng)的比例，配置20ml溶劑，分別吸取上 下相各lml，加入樣品lmg，充分振搖，靜置分層，分取上下層溶液，用高效 液相色譜法測(cè)定上下層所含辣椒堿、二氫辣椒堿與降二氫辣椒堿濃度，即可求 得三者在該溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)(K)， K =Cs/Cm (Cs表示溶質(zhì)在上相的質(zhì) 量濃度，Cm表示溶質(zhì)在下相的質(zhì)量濃度)。選取K值在0. 5—2. 0范圍內(nèi)的溶劑 系統(tǒng)作為分離制備系統(tǒng)。
HPLC分析及HSCCC峰的鑒定利用高效液相色譜(HPLC)分析提取物。高 效液相色譜條件島津Shim pack VP-0DS柱(4. 6畫(huà)X250mm)，紫外檢測(cè)波長(zhǎng) 278歷，柱溫25°C，流速O. 8ml/min，進(jìn)樣量10 ul，流動(dòng)相甲醇水(含 0.55%磷酸)=70:30。
HSCCC峰的鑒定應(yīng)用Agilent 5973N質(zhì)譜儀和Varian 600 MHz核磁共 振波譜儀分別進(jìn)行MS， W-麗R和"C-NMR譜的測(cè)定。
本方案的有益效果可根據(jù)對(duì)上述方案的敘述得知，由于采用高速逆流色譜 分離制備高純度辣椒堿單體，只需一步就從辣椒總生物堿粗提物中分離制備出 三種辣椒堿單體，純度在98%以上，具有分離時(shí)間短、樣品無(wú)損失、回收率高、 分離環(huán)境緩和、節(jié)約溶劑等特點(diǎn)。因此本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，實(shí)現(xiàn)了技術(shù)目 的。


下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)地描述。
圖1實(shí)施例1辣椒總生物堿的高速逆流色譜分離的色譜圖，分離溶劑系統(tǒng)為四氯化碳三氯甲烷乙醇水為3: 1: 4: 2;其中A為二氫辣椒堿， B為辣椒堿，C為降二氫辣椒堿。
圖2實(shí)施例2辣椒總生物堿的高速逆流色譜分離的色譜圖，分離溶劑系 統(tǒng)為二氯甲烷甲醇水為4: 3.5: 2;其中A為二氫辣椒堿，B為辣椒堿， C為降二氫辣椒堿。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l:取辣椒3000g粉碎后用80。/。乙醇回流提取3次(每次lh)，抽 濾，濾液減壓至接近干燥，加入體積比為l: 6的乙醚與石油醚混合液重結(jié)晶， 放置，得到辣椒總生物堿粗提物9. 3g，用本發(fā)明的方法分離制備高純度辣椒堿單體。
采用半制備型高速逆流色譜儀，溶劑選用四氯化碳、三氯甲烷、乙醇和水 體系從辣椒總生物堿中分離制備高純度辣椒堿單體。首先將四氯化碳、三氯甲 烷、乙醇和水以3:1:4:2的體積比將上述溶劑體系配置于分液漏斗中，搖勻后 靜置分層，待平衡一段時(shí)間后將上下兩相分開(kāi)，取上相為固定相，下相為流動(dòng) 相，取150mg辣椒總生物堿溶解于5ml上相和5ral下相的混合物中待用。采用 北京新技術(shù)應(yīng)用研究所生產(chǎn)的GS10A2型半制備型逆流色譜儀，它是由柱塞泵、 進(jìn)樣閥、紫外檢測(cè)儀、記錄儀和色譜分離柱(由聚四氟乙烯管多層纏繞形成的 螺旋管柱，容量為230mL)等組成，首先使進(jìn)樣閥處于進(jìn)樣狀態(tài)，將固定相用 泵以一定流速灌滿色譜分離柱，停泵。開(kāi)啟速度控制器，使半制備型逆流色譜 儀的色譜分離柱正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速達(dá)800r/min時(shí)，設(shè)置流動(dòng)相流速為1. OmL/min，開(kāi) 始泵流動(dòng)相，待流動(dòng)相流出色譜分離柱時(shí)，將溶解好的樣品用注射器注入逆流 色譜儀進(jìn)樣閥的貯液管中，旋轉(zhuǎn)進(jìn)樣閥為接柱狀態(tài)，使樣品進(jìn)入色譜分離柱。 然后根據(jù)檢測(cè)器紫外光譜圖(圖l)接收目標(biāo)成分，分別收集對(duì)應(yīng)的流份，HPLC 測(cè)定純度，減壓濃縮，峰A得到無(wú)色結(jié)晶38mg，峰B得到無(wú)色結(jié)晶78mg，峰C 得無(wú)色結(jié)晶3mg，經(jīng)質(zhì)譜、核磁、HPLC分析鑒定峰A為二氫辣椒堿，純度98. 9%， 峰B為辣椒堿，純度99.9%，峰C為降二氫辣椒堿，純度為98.5%。
利用HPLC分析分離物。HPLC條件島津Shim pack VP-ODS柱 (4.6mmX250mm)，柱溫25。C，流速0.8ml/min，進(jìn)樣量10yL，流動(dòng)相 甲醇-0. 55%磷酸(70:30)，檢測(cè)波長(zhǎng)278nm。
實(shí)施例2:取辣椒3000g粉碎后用60%乙醇回流提取3次(每次lh)，抽濾，濾液減壓至接近干燥，加入體積比為1: 6的乙醚與石油醚混合液重結(jié)晶， 放置，得到辣椒總生物堿粗提物8. 5g，用本發(fā)明的方法分離制備高純度辣椒堿 單體。
采用半制備型高速逆流色譜儀，溶劑選用二氯甲垸、甲醇和水體系從辣椒總堿中分離制備高純度辣椒堿單體。首先將二氯甲烷、甲醇和水以4:3.5:2的 體積比將上述溶劑體系配置于分液漏斗中，搖勻后靜置分層，待平衡一段時(shí)間 后將上下兩相分開(kāi)，取上相為固定相，下相為流動(dòng)相，取120mg辣椒總生物堿 溶解于3ml上相和3ml下相的混合物中待用。采用北京新技術(shù)應(yīng)用研究所生產(chǎn) 的GS10A2型半制備型逆流色譜儀，它是由柱塞泵、進(jìn)樣閥、紫外檢測(cè)儀、記 錄儀和色譜分離柱(由聚四氟乙烯管多層纏繞形成的螺旋管柱，容量為230mL) 等組成，首先使進(jìn)樣閥處于進(jìn)樣狀態(tài)，將固定相用泵以一定流速灌滿色譜分離 柱，停泵。開(kāi)啟速度控制器，使半制備型逆流色譜儀的色譜分離柱正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速 達(dá)800r/min時(shí)，設(shè)置流動(dòng)相流速為2. OmL/min，開(kāi)始泵流動(dòng)相，待流動(dòng)相流出 色譜分離柱時(shí)，將溶解好的樣品用注射器注入逆流色譜儀進(jìn)樣閥的貯液管中， 旋轉(zhuǎn)進(jìn)樣閥為接柱狀態(tài)，使樣品進(jìn)入色譜分離柱。
然后根據(jù)檢測(cè)器紫外光譜圖(圖2)接收目標(biāo)成分，分別收集對(duì)應(yīng)的流份， HPLC測(cè)定純度，減壓濃縮，峰A得到無(wú)色結(jié)晶31mg，峰B得到無(wú)色結(jié)晶63mg， 峰C得無(wú)色結(jié)晶2.4mg，經(jīng)質(zhì)譜、核磁、HPLC分析鑒定峰A為二氫辣椒堿，純 度98.5%，峰B為辣椒堿，純度99.3%，峰C為降二氫辣椒堿，純度為98.2%。
利用HPLC分析分離物。HPLC條件島津Shim pack VP-ODS柱 (4.6mmX250腿)，柱溫25。C，流速0.8ml/min，進(jìn)樣量10uL，流動(dòng)相 甲醇-O. 55°/。磷酸(70:30),檢測(cè)波長(zhǎng)278nm。
實(shí)施例3:分離所選溶劑系統(tǒng)為四氯化碳二氯甲烷甲醇水為3: 1: 1: 2，其余試驗(yàn)步驟同實(shí)施例l。得到純度為98.4%的二氫辣椒堿35 mg，純 度為99. 3%的辣椒堿74 mg，純度為98. 2%的降二氫辣椒堿2. 61mg。
實(shí)施例4:分離所選溶劑系統(tǒng)為三氯甲垸二氯甲垸乙醇水為0. 5:
3.5: 3: 2，其余試驗(yàn)步驟同實(shí)施例1。得到純度為98.6X的二氫辣椒堿36mg， 純度為99. 5%的辣椒堿74 mg，純度為98. 4%的降二氫辣椒堿2. 78mg。
實(shí)施例5:分離所選溶劑系統(tǒng)為三氯甲烷甲醇水為4: 4: 1.5，其余
試驗(yàn)步驟同實(shí)施例2。得到純度為98.5X的二氫辣椒堿30mg，純度為99. 1% 的辣椒堿60mg，純度為98. 2。^的降二氫辣椒堿2. 25mg。
實(shí)施例6:分離所選溶劑系統(tǒng)為四氯化碳乙醇水為4: 4: 2，其余試
驗(yàn)步驟同實(shí)施例2。得到純度為98.5X的二氫辣椒堿31mg，純度為99.0%的辣椒堿60mg，純度為98. 0%的降二氫辣椒堿2. 32mg。
雖然本發(fā)明已經(jīng)通過(guò)選用的實(shí)施例及其附圖進(jìn)行描述并完全公開(kāi)，但是對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不超出本發(fā)明實(shí)質(zhì)的情況下，任何改變和變化都屬于 本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1、一種高純度辣椒堿單體的制備方法，其特征是它包括如下步驟用于分離制備高純度辣椒堿單體的溶劑系統(tǒng)是鹵代烷烴、醇和水，其用量體積比為(1-5)∶(1-4)∶(1-2)；將上述溶劑系統(tǒng)配置于分液漏斗中充分振搖后靜置12小時(shí)，分層，取上相作為固定相，下相作為流動(dòng)相；采用的逆流色譜儀由柱塞泵、進(jìn)樣閥、紫外檢測(cè)儀、記錄儀和色譜分離柱等組成，它的連接順序?yàn)橹谩M(jìn)樣閥→色譜分離柱→紫外檢測(cè)儀→記錄儀；首先使進(jìn)樣閥處于進(jìn)樣狀態(tài)，將固定相用泵以一定流速灌滿半制備型逆流色譜儀的色譜分離柱，開(kāi)啟速度控制器，使色譜儀的色譜分離柱正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速達(dá)800r/min時(shí)，設(shè)置流動(dòng)相流速為0.5-2.0mL/min，開(kāi)始泵流動(dòng)相，待流動(dòng)相流出色譜分離柱時(shí)，稱取一定量辣椒總生物堿粗提物放入上相、下相的混合液中溶解，用注射器注入逆流色譜儀進(jìn)樣閥的貯液管中，旋轉(zhuǎn)進(jìn)樣閥為接柱狀態(tài)，使樣品進(jìn)入色譜分離柱；根據(jù)檢測(cè)器紫外光譜圖，對(duì)分離的每個(gè)峰進(jìn)行收集，用高效液相色譜測(cè)定純度，分別收集不同成分；減壓濃縮，峰A得到無(wú)色結(jié)晶二氫辣椒堿，峰B得到無(wú)色結(jié)晶辣椒堿，峰C得無(wú)色結(jié)晶降二氫辣椒堿。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度辣椒堿單體的制備方法，其特征是所述鹵 代烷烴可分別為四氯化碳、三氯甲垸、二氯甲院之一或任意兩個(gè)的混合物。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的高純度辣椒堿單體的制備方法，其特征是所述醇 為甲醇或者乙醇。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的高純度辣椒堿單體的制備方法，其特征是所述溶 劑系統(tǒng)中的二氯甲烷、甲醇和水的體積比為4:3. 5:2。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的高純度辣椒堿單體的制備方法，其特征是所述溶 劑系統(tǒng)中的四氯化碳、三氯甲垸、乙醇和水的體積比為3:1:4:2。
6、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的高純度辣椒堿單體的制備方法，其特征是所述逆 流色譜儀為半制備型逆流色譜儀或者制備型逆流色譜儀或者分析型逆流色譜 儀。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度辣椒堿單體的制備方法，其特征是所述逆 流色譜儀流動(dòng)相的流速為2. Oml/min。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度辣椒堿單體的制備方法，其特征是所述逆 流色譜儀流動(dòng)相的流速為1.0ml/min。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度辣椒堿單體的制備方法，其特征是所述辣 椒總生物堿粗提物的制備方法是將辣椒樣品粉碎后、醇提，過(guò)濾，濾液減壓濃縮至接近干燥，加入體積比為(0. 1-1) :1的乙醚與石油醚混合液重結(jié)晶，放置， 得到辣椒總生物堿粗提物。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的高純度辣椒堿單體的制備方法，其特征是所述 醇提為用50% —100%乙醇提取3次。
全文摘要
一種高純度辣椒堿單體的制備方法。分離溶劑系統(tǒng)由鹵代烷烴、醇、水等組成。將溶劑體系置于分液漏斗中充分振搖后靜置分層，取上相為固定相，下相為流動(dòng)相。稱取一定量樣品溶于上相和下相的混合溶液中。首先將固定相用泵以一定流速灌滿色譜分離柱，然后將柱的首端與六通進(jìn)樣閥相接。開(kāi)啟速度控制器，使轉(zhuǎn)速達(dá)800r/min時(shí)，開(kāi)始以2.0mL/min流速泵入流動(dòng)相，待流動(dòng)相流出色譜柱時(shí)，上樣，對(duì)分離的每個(gè)峰都進(jìn)行收集，用高效液相色譜法測(cè)定純度，得到高純度的二氫辣椒堿、辣椒堿、降二氫辣椒堿三種單體。此法適用于對(duì)各種途徑獲得的辣椒堿粗提物制備三種高純度辣椒堿單體，操作簡(jiǎn)便，生產(chǎn)成本低，無(wú)有機(jī)溶劑殘留，可作為高純度辣椒堿單體制備的方法推廣。
文檔編號(hào)C07C233/00GK101200433SQ200710114310
公開(kāi)日2008年6月18日 申請(qǐng)日期2007年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月8日
發(fā)明者劉建華, 李福偉, 曉 王, 王岱杰, 耿巖玲 申請(qǐng)人:山東省分析測(cè)試中心