專利名稱：：一核苷酸序列、包含該序列的表達載體、該載體轉(zhuǎn)化的動物細(xì)胞以及利用該細(xì)胞生產(chǎn)人...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種利用動物細(xì)胞生產(chǎn)分泌型人促卵泡激素(folliclestimulatinghormone,下文稱之為FSH)蛋白的方法，確切地講，本發(fā)明涉及一包含新基因的核苷酸序列，一包含該核苷酸序列的重組表達載體，受到該重組表達載體轉(zhuǎn)化的動物細(xì)胞，以及一種利用該轉(zhuǎn)化后的動物細(xì)胞生產(chǎn)分泌型人FSH的方法，其中該新基因可以編碼與含有a亞單位(CGcc)和P亞單位(FSHP)的天然的人FSH相同的蛋白序列，并可提高該蛋白序列的表達水平。
背景技術(shù)：
：FSH、黃體化激素(luteinizinghormone,下文稱之為LH)和人絨毛膜促性腺激素(h畫nchorionicgonadotropin,下文稱之為hCG)是在生殖機能中起重要作用的生殖相關(guān)的激素。FSH和LH由腦垂體分泌，其產(chǎn)生受到下丘腦表達的促性腺激素釋放激素(gonadotropinreleasinghormone,GnRH)的調(diào)節(jié)。在月經(jīng)初期，相應(yīng)于血液中的FSH水平提高，卵泡的生長和發(fā)育受到激發(fā)。成熟的卯泡分泌出越來越多的雌激素。LH誘導(dǎo)膜細(xì)胞產(chǎn)生雄激素。所得到的雄激素本身具有激素活性，同時可作為顆粒細(xì)胞芳香酶的底物。在月經(jīng)初期，即卵泡期，F(xiàn)SH通過作用于顆粒細(xì)胞促進雌激素的產(chǎn)生。自中卵泡期后由顆粒細(xì)胞誘導(dǎo)的LH受體的表達最終通過促進顆粒細(xì)胞的增殖使得卵泡生長。因此，在這一時期，F(xiàn)SH和LH對卵泡生長和子宮內(nèi)膜發(fā)育具有協(xié)同作用。當(dāng)顆粒細(xì)胞產(chǎn)生的血雌激素的水平達到峰值時，LH突然被分泌。最后，血LH的這種突然增多引發(fā)排卵。排卵后，膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞發(fā)育成黃體。早期妊娠中胎盤產(chǎn)生的hCG不斷刺激孕酮和雌激素的生成，而孕酮和雌激素為維持妊娠所必需。根據(jù)雙細(xì)胞雙促性腺激素理論(Fevold，(1941)，Synergicoffolliclestimulatingandluteinizinghormonesinproducingestrogensecretion.Endocrinology28:33-26;Greepetal.，(1942)Gonadotropinofswinepituitary:variousbiologicaleffectsofpurifiedthykentrin(FSH)andpurematakentrin(ICSH)，Endocrinology30:635-649)，F(xiàn)SH和LH對卵泡生長和卵巢激素的產(chǎn)生都是必要的。除促進卵泡生長外，F(xiàn)SH還增強芳香酶，即細(xì)胞色素P450酶，在顆粒細(xì)胞中的表達(Richards,(1994)Hormonalcontrolofgeneexpressionintheovary.Endocrine.Rev.15:725-751)。同時，LH還可活化膜細(xì)胞中的17-cc-羥化酶，從而促進由膽固醇和孕烯醇酮(pregnenalone)生成雄激素。生成的雄激素#1分散在顆粒細(xì)胞中并被其中的芳香酶轉(zhuǎn)化為雌激素(Ericksonetal.,(1985)Theovarianandrogenproducingcells:areviewofstructure/functionrelationships,Endocrine.Rev.6:371-399;Magoffinetal.，(1990)Insulin—likegrowthfactor—1selectivelystimulatescholesterolside—chaincleavageexpressioninovarianthecal—interstitialcells:Mol.Endocrinol.4:489-496)。雌激素的適當(dāng)生成對于創(chuàng)造成功的受精和植入所必需的環(huán)境極為關(guān)鍵。FSH激活已經(jīng)被基于傳統(tǒng)的內(nèi)分泌學(xué)原理發(fā)展起來的多種分析方法證實，此外，F(xiàn)SH也依靠分析所鑒定的生物學(xué)特征來定義(Jeffcoate，(1994)FromTNAtoDNA:60yearsoffolliclestimulatinghormone(FSH)ingynecology.In:TheYearbookoftheRC0G.RoyalCollegeofObstetriciansandGynecologists,London,chapter6,0055-57)。這些生物學(xué)特征一直以來被用作定義FSH的重要因素。然而，早期發(fā)展起來的生物學(xué)分析具有以下缺點首先，沒有針對FSH的特異性的分析方法；其次，由于沒有標(biāo)準(zhǔn)化所致的定量的困難，沒有辦法比較不同實驗室的結(jié)果。因此，采用早期的測定法只能研究對不同的促性腺要素(gonadotrophicprinciples)的多種生物學(xué)響應(yīng)。此外，當(dāng)時被認(rèn)為具有促性腺活性的提取物乃是多種促性腺素的混合物。但是，隨著物理化學(xué)分析在二十世紀(jì)七十年代的發(fā)展和分子生物學(xué)在二十世紀(jì)八十年代的突破，F(xiàn)SH在分子水平上被更精確地定義。FSH是一種腦垂體中產(chǎn)生的糖蛋白激素，是由oc亞單位和P亞單位非共價互作形成的異質(zhì)二聚體糖蛋白(heterondimetricglycoprotein),雖然在腦垂體產(chǎn)生的LH、TSH(ThyroidStimulatingHormone,促曱狀腺激素)和hCG等不同糖蛋白激素中都有a亞單位，但P亞單位完全不同，因此每個激素具有獨特的功能。維持這兩個亞單位的適當(dāng)二聚體作用對FSH的生物學(xué)功能是關(guān)鍵性的。和每個亞單位結(jié)合的糖結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)、成分和結(jié)合程度都是生物學(xué)功能的性能及穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素。oc亞基蛋白由92個氨基酸組成，其中糖結(jié)構(gòu)(N-糖基化結(jié)構(gòu))結(jié)合在第52位和第78位天冬酰胺上。(3亞基蛋白由111個氨基酸組成，其中糖結(jié)構(gòu)(N-糖基化結(jié)構(gòu))結(jié)合在第7位和第24位天冬酰胺上。在FSH中沒有發(fā)現(xiàn)0-糖基化結(jié)構(gòu)(RecombinanthumanFSHproductdevelopmentGroup,(1998)Recombinantfolliclestimulatinghormone:developmentofthefirstbiotechnologyproductforthetreatmentofinfertility,HumanReproductionUpdate4:862—881)一般的商品化的重組FSH是由通過在中國倉鼠卵巢細(xì)胞基因組中插入人FSH表達基因而得到的永久性表達細(xì)胞系(permanentexpressioncellline)所產(chǎn)生。迄今為止，重組人FSH都采用了含動物來源的血清(animal-derivedserum)的i咅養(yǎng)基進4亍i咅養(yǎng)(RecombinanthumanFSHproductdevelopmentGroup,1998,Wiebe，0.etal.，1996),其中表達細(xì)胞(Chinesehamsterovarycells,CH0，中國倉鼠卵巢細(xì)胞)固定在微載體上。其中所使用的動物來源的血清可能是最終純化產(chǎn)物安全性的一個負(fù)面影響因素。最近，有多個關(guān)于在醫(yī)學(xué)產(chǎn)品生產(chǎn)中利用這類動物來源的血清最纟冬導(dǎo)i丈?！访挎叛蛟庐€病(bovinespongiformencephalopathy)和動物來源的病毒感染人的個案的被報道，這已經(jīng)成為國際性的事件。然而，不在培養(yǎng)中使用動物來源的血清的話，重組FSH的表達率將顯著降低。本發(fā)明就涉及一種采用含有新基因核苷酸序列的動物細(xì)胞表達載體來克服上述采用不含血清的培養(yǎng)基所致的人FSH低表達率的問題的方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是為克服上述問題而提供一段包含一種可在動物細(xì)胞中表達與天然的人FSH相等同的人FSH且可以提高該蛋白表達的新基因的核苦酸序列、包含該核苷酸序列的表達載體，以及轉(zhuǎn)化有該表達載體的轉(zhuǎn)化子。本發(fā)明的另一個目的是提供一種利用這種轉(zhuǎn)化子生產(chǎn)人FSH的方法?，F(xiàn)。、；、、'。、、、、、'，、S'''S為達成本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了包含新基因的核苷酸序列，該新基因可編碼與天然的人FSH相同的蛋白序列并且可以提高該蛋白的表達水平。本發(fā)明還提供了包含該核苷酸序列的重組表達載體。本發(fā)明進一步提供了被該表達載體轉(zhuǎn)化的動物細(xì)胞。本發(fā)明還提供了一種利用該轉(zhuǎn)化后的動物細(xì)胞生產(chǎn)人FSH的方法。在下文中對本發(fā)明進行詳細(xì)描述。本發(fā)明所描述的FSH的結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)是通過分別比較LG-rhFSH(LGrecombinantFSH，LG重組FSH)、uFSH(naturalurinederivedFSH，天然尿來源的促卵泡激素)和Gonal-F(Serono重組促卯泡激素，SeronorecombinantFSH)的結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)來確定的。本發(fā)明提供了一段包含一個可表達與天然的人FSH相同的蛋白序列且能提高該蛋白表達的新基因的核苷S^f列。編碼天然的人FSH的基因由ct亞單位和(3亞單位組成。編碼oc亞單位的CGoc基因作為FSH、LH、TSH和hCG共有的cx亞單位起作用。盡管它作為共有的cc亞單位的功能尚不清楚，人們猜想它作為這些激素共有的cx亞單位的原因可能是在cc亞單位的表達受限制的情況下來控制這些激素的相對水平。這四種激素的P亞單位使它們具有各自特有的功能，其中FSH的P亞單位是FSHP基因。FSH直接作用于卵泡，它在誘導(dǎo)卵泡生長和促進顆粒細(xì)胞中雌激素的合成中起作用。采用PCR合成了編碼CGcx和FSH(3的基因。每個合成基因的核苷酸序列由胞外分泌的天然信號肽和含有編碼天然cx亞單位或P亞單位的新基因的基因序列組成。作為優(yōu)選，編碼CGcc的基因的序列由SEQ.ID.NO:13表示，而編碼FSH(3的基因序列由SEQ.ID.NO:15表示。在編碼CGoc或FSHP的基因的核香S吏序列中的信號肽在完成將每個亞單位引導(dǎo)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能后被去除。去除了信號肽的成熟的oc亞單位和P亞單位將通過二聚體化和適當(dāng)?shù)奶腔环置诘郊?xì)胞外基質(zhì)。作為優(yōu)選，成熟的cc亞單位的序列可由SEQ.ID.NO:14表示，而成熟的(3亞單位的序列可由SEQ.ID.NO:16表示。本發(fā)明還提供了包含編碼CGoc或FSH(3基因的核苷酸序列的重組表達載體。更確切地講，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建含有天然信號肽和能夠促進蛋白在動物細(xì)胞中翻譯的新型FSH基因的核苦酸序列的分泌型動物細(xì)胞表達載體的方法。該重組表達載體的特征在于其含有SEQ.ID.NO:13或SEQ.ID.NO:15所表示的序列。含有SEQ.ID.NO:13所表示的序列的表達載體可以是具有圖2所示的酶切圖譜的BSYH-CGoc-DHFR。含有SEQ.ID.NO:15所表示的序列的表達載體可以是具有圖3所示的酶切圖譜的BSYH-FSH(3-DHFR。此處的表達載體也可以是能夠同時翻譯SEQ.ID.NO:13或SEQ.ID.NO:15表示的序列和一標(biāo)記物以提高FSH蛋白表達的雙順反子表達載體。雙順反子表達系統(tǒng)是一種能夠使將一目的基因和一選擇標(biāo)記連續(xù)轉(zhuǎn)錄至同一mRNA得以實現(xiàn)的表達系統(tǒng)。在本發(fā)明的FSH表達載體中，目的亞單位基因和作為選擇標(biāo)記的二氫葉酸還原酶(dihydrofolatereductase,DHFR)基因在同一連續(xù)的mRNA中表達，這兩個基因由月S心、月幾炎病毒(EncephaloMyocarditisVirus，EMCV)的5'非翻譯區(qū)相互連接，該5'非翻譯區(qū)是一種內(nèi)部核糖體進入位點(internalribosomalentrysite,IRES),這間接表明a亞單位或(3亞單位的翻譯與DHFR的翻譯是獨立進行的。最終，DHFR基因的表達保證了位于DHFR前面的亞單位基因的表達。這種雙順反子表達系統(tǒng)的一個優(yōu)點是可以盡量減少選擇標(biāo)記基因拷貝數(shù)在基因擴增過程中的增加從而獲得高表達的細(xì)胞系。表1描述了該表達載體的元件和它們的功能。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本發(fā)明進一步提供了轉(zhuǎn)化了該表達載體的動物細(xì)胞。為了在動物細(xì)胞中表達血糖蛋白，通常嘗試?yán)媚康牡鞍椎奶烊坏姆置谛盘栯膶⑵浞置诘郊?xì)胞外基質(zhì)。對于FSH,則將含有每一亞單位的天然分泌信號肽的基因轉(zhuǎn)化入動物細(xì)胞。導(dǎo)入細(xì)胞的基因被整合進寄主細(xì)胞的基因組中，從而維持穩(wěn)定的表達。分別表達的oc亞單位和P亞單位經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體，然后進行二聚化和糖基化等翻譯后修飾，從而作為功能蛋白分泌到細(xì)胞外。由于需要進行的二聚化和糖基化導(dǎo)致蛋白的表達率降低，這可能成為商品化的一種經(jīng)濟性障礙?？朔偷鞍妆磉_率的一般方法是利用更強的啟動子來提高mRNA的轉(zhuǎn)錄率。對紅細(xì)胞生成素而言，盡管它需要類似的糖基化，但采用同樣的啟動子時其表達量每升至少可達到毫克級。最終，該先例暗示出，F(xiàn)SH低表達的根本原因并不是翻譯后修飾或者低轉(zhuǎn)錄水平。一種嘗試克服FSH低表達的方法就是通過提高蛋白合成效率來提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中二聚化的效率。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明利用包含編碼FSH的新基因的動物細(xì)胞分泌型表達載體顯著提高了天然人FSH蛋白表達，該基因和有天然核苷酸序列組成的基因相比能提高蛋白合成的效率。這里所用的動物細(xì)胞可選自中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、小鼠細(xì)胞(NIH/3T3cell)、猴細(xì)胞(COS-1cell)和人細(xì)胞(Helacell)。本發(fā)明還提供了一種在動物細(xì)胞中產(chǎn)生人FSH蛋白的方法，該方法包括以下步驟制備含有能提高該蛋白表達的新基因的核苷酸序列，將所得核香酸序列插入一表達載體，用該表達載體轉(zhuǎn)化動物細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子，并從培養(yǎng)物中分離純化該蛋白。借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點如前文所述，根據(jù)本發(fā)明設(shè)計表達載體BSYH/CGcc-DHFR和BSYH/FSH(3-DHFR來表達動物細(xì)胞分泌型人FSH，被該表達載體轉(zhuǎn)化的動物細(xì)胞表達的分泌型重組人FSH蛋白具有同天然的FSH同樣的氨基酸序列，并具有足夠臨床使用的效價，因此適宜商業(yè)化，并可用于有效治療不育癥。上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，而可依照說明書的內(nèi)容予以實施，并且為了讓本發(fā)明的上述和其他目的、特征和優(yōu)點能夠更明顯易懂，以下特舉較佳實施例，并配合附圖，"i羊細(xì)i兌明如下。圖1是BSYH-CGcx-DHFR載體和BSYH-FSHP-DHFR載體構(gòu)建過程的概略圖。圖2是顯示BSYH-CGcc-DHFR載體結(jié)構(gòu)的酶切圖譜。圖3是顯示BSYH-FSHP-DHFR載體結(jié)構(gòu)的酶切圖譜。圖4a和圖4b顯示了同時轉(zhuǎn)化了BSYH-CGoc-DHFR載體和BSYH-FSHP-DHFR載體的動物細(xì)胞所表達和分泌的重組人FSH用反相色譜法得到的肽譜分析的結(jié)果。圖5a和圖5b顯示了同時轉(zhuǎn)化了BSYH-CGcc-DHFR載體和BSYH-FSH(3-DHFR載體的動物細(xì)力包所表達和分泌的重組人FSH的生物效j介(biologicaltiter)。具體實施方式以下例子用來說明本發(fā)明具有實用性的目前優(yōu)選的實施例。但，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的內(nèi)容基礎(chǔ)上，有可能做出不超出本發(fā)明的精神和范圍的修正和改進。例1:人FSH基因的制備蛋白序列通過已知編碼構(gòu)成天然人FSH的oc亞單位和3亞單位的cDNA的4言息子貞溯'J(FiddesandGoodman,(1979)Isolation,cloning,andsequenceanalysisofthecDNAfortheot—subunitofhumanchorionicgonadotropin,Nature281:351-356;FiddesandGoodman,(1981)Thegeneencodingthecommonoc—subunitofthefourhumanglycoproteinhormones,J,Mol.Appl.Genet.1:13-18;Watkinsetal.，(1987)隨sequenceandregionalassignmentofthehumanfolliclestimulatinghormone(3—subunitgenetotheshortarmofhumanchromosome11,DNA6:205-211)。在此基礎(chǔ)上，使用了編碼與由a亞單位(CGa)和P亞單位(FSH(3)構(gòu)成的天然的人FSH相等同的蛋白序列并可促進該蛋白合成效率以使該蛋白在動物細(xì)胞中的表達水平最大化的新基因。制備所得的cc亞單位和P亞單位和天然的人FSH基因中的序列都不同。參考SEQ.ID.NO:14和SEQ.ID.NO:16所示的cc亞單位和(3亞單位的序列，構(gòu)建了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的引物。用于各個亞單位基因合成的Oligo引物序列表示如下?！碈GaPCR克隆的Oligo引物〉CGforl:HindIIIatccaa.gpt.tatggactactaccgcaagtacgccgccatcUcctggtgaccctgagcgtgttcctgcac(70-mer;SEQ.ID.NO:1)CGfor2:gagcgtgttcctgcacgtgctgcacagcgcccccgacgtgcaggactgccccgagtgcactctgcaggagaacccc(76-mer;SEQ.ID.NO:2)CGfor3:ctgcaggagaaccccttcttcagccagcccggcgcccccatcctgcagtgcatgggctgctgcttcagccgcgcc(75_mer;SEQ.ID.NO:3)CGrev4:tcgctggtcacgttcttctgcaccagcatggtcttcttgctgcgcaggggggtggggtaggcgcggctgaagca(74_mer;SEQ.ID.NO:4)CGrev5:accUgaagccgcccatcacggtcacgcggttgtagctcttggccacgcagcaggtgctttcgctggtcacgtt(74-mer;SEQ.ID.NO:5)CGrev6:Xbalgaac幅t地attagctcttgtggtagtagcaggtgctgcagtggcaggcggtgtggttctctaccttgaagccgcc(76-mer;SEQ.ID.NO:6)引物CGforl和CGrev6在各自的5'端添加了HindIII和XbaI限制性酶切位點，以便于將其終產(chǎn)物，即合成CGa基因，容易地插入到表達載體中。合成CGa基因由以下步驟制備第一步用引物CGfor3和CGrev4進行第一步PCR反應(yīng)。第二步用第一步PCR產(chǎn)物和引物CGfor2和CGrev5進行第二步PCR反應(yīng)。第三步用第二步PCR反應(yīng)產(chǎn)物和引物CGforl和CGrev6進行第三步PCR反應(yīng)。〈FSHP的PCR克隆的Oligo引物〉FSHforl:HindIIIcctgaagcttatgaagaccctgcagttcttcttcctgttctgctgctggaaggccatctgctgcaatagctgcgagctgaccaac(85-mer;SEQ.ID.NO:7)FSHfor2:agctgcgagctgaccaacatcaccatcgccatcgagaaggaggagtgccgcttctgcatcagcatcaacaccacctggtgcgcc(84-mer;SEQ.ID.NO:8)FSHfor3:caacaccacctggtgcgccggctactgctacacccgagatctggtgtacaaggaccccgcccgccccaagatccagaagacc(82-mer;SEQ.ID.NO:9)FSHrev4:gagtcggcgtggtgggcgcagccgggcacgcgcacggtctcgt歸ccagctccttgaaggtgcaggtcttctggatcttggg(83-mer;SEQ.ID.NO:10)FSHrev5:gcagtcggtgctgtcgctgtcgcacttgccgcagtggcactgggtggccacggggtaggtgtacagtgagtcggcgtggtgggcg(85_mer;SEQ.ID.NO:11)FSHrev6:XbalcttatctagactactccUcatctcgccgaaggagcagtagctgggccccaggccgcgcacggtgcagtcggtgctgtcgct(82-mer;SEQ.ID.NO:12)引物FSHforl和引物FSHrev6在各自的5'端添加了HindIII和XbaI限制性酶切位點，以便于將其終產(chǎn)物，即合成FSH(3基因，容易地插入到表達載體中。合成FSHP基因由以下步驟制備第一步用引物FSHfor3和FSHrev4進行第一步PCR反應(yīng)。第二步用第一步PCR產(chǎn)物和引物FSHfor2和FSHrev5進行第二步PCR反應(yīng)。第三步用第二步PCR反應(yīng)產(chǎn)物和引物FSHforl和FSHrev6進行第三步PCR反應(yīng)。上文所述的PCR反應(yīng)按下述方法進行。每一DNA模板和引物的濃度為100pmo1,將DNA模板和？1物加入到含有10mMtris-HC1、1.5mMMgCl2、50mMKCl、0.2mMdATP、0.2raMdGTP、0.2mMdTTP、0.2mMdCTP、10%(v/v)二曱亞石風(fēng)(Dimethylsulfoxide)和1單位(unit)taqDNA聚合酶(TaqDNApolymerase)的反應(yīng)混合物中(終體積50|al)，并進行PCR反應(yīng)擴增目標(biāo)DNA片段，其PCR參數(shù)為95'C1分鐘，55°Cl分鐘，72°Cl分鐘，共30個循環(huán)。編碼FSH每個亞單位的基因的核苷酸序列分別由SEQ.ID.NO:13和SEQ.ID.NO:15表示，由核苷酸序列產(chǎn)生的蛋白質(zhì)序列分別由SEQ.ID.NO:14和SEQ.ID.NO:16表示。例2:動物細(xì)胞分泌型表達載體的構(gòu)建pLCED表達載體是pCDM8的變體，在pLCED這一雙順反子表達載體中，已經(jīng)消除了M13起點(origin)并插入了IRES和DHFR基因。rhFSH表達載體的構(gòu)建過程概述如下，并表示如圖1。rhFSH表達載體的構(gòu)建過程1.pLCED的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶麗EI和Sac1I除去pCDM8載體(Invitrogen，Cat.No.V308-20)中的M13起點以構(gòu)建pC匿BS。然后通過限制性內(nèi)切酶XbaI和BamII用pED載體中的EMCV/DHFR/polyA信號序列替代肉瘤病毒40(SV40)內(nèi)含子/polyA信號序列，構(gòu)建得到pLECD。2.BSYH-CGoc-DHFR的構(gòu)建用HindIII和XbaI酶切合成CGccDNA序列，再將其插入pLECD中。所得到的重組載體被命名為"BSYH-CGa-DHFR",并于2006年10月19曰保存于韓國典型菌種保藏中心(KCTC，KoreanCollectionforTypeCultures,52Eoeun-dongYuseong-gu,Daejon，Korea)(保藏號KCTC11005BP)。3.BSYH-FSH(3-DHFR的構(gòu)建用HindIII和XbaI酶切合成FSH(3DNA序列,再將其插入pLECD中。所得到的重組載體被命名為"BSYH-FSHP-DHFR",并于2006年10月19日保存于韓國典型菌種保藏中心(KCTC,KoreanCollectionforTypeCultures,52Eoeun-dongYuseong-gu，Daejon，Korea)(保藏號KCTC11006BP)。\編碼a亞單位的載體BSYH/CGoc-DHFR和編碼(3亞單位的載體BSYH/FSH[3-DHFR的結(jié)構(gòu)分別如圖2和圖3所描述。例3:制備轉(zhuǎn)化了表達載體的動物細(xì)胞采用由敲除了二氫葉酸還原酶的中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO/dhfr-)派生的永久細(xì)胞系UTCCCRL9096)為寄主細(xì)胞。該細(xì)胞系購買自美國模式菌TypeCultureCollection),該細(xì)胞系的生長依賴于脯氨酸，并具有典型的成纖維細(xì)胞的形態(tài)。表達a亞單位的動物細(xì)胞表達載體和表達|3亞單位的動物細(xì)胞表達載體各自獨立構(gòu)建，但它們除了編碼區(qū)不同以外，具有相同的結(jié)構(gòu)。表達FSH的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的制備如下。用于轉(zhuǎn)化的寄主細(xì)胞CHO/dhfr-是用含有10%FBS(GibcoCat.#16000-044，Lot.#1105269)和1xHT混合鹽(HTsupplement,Cat.#111067-030，Lot.#1120062)的IMDM培養(yǎng)基在37°C下含5%C。2空氣中培養(yǎng)2天(第一培養(yǎng))。從該培養(yǎng)物中回收細(xì)胞，以不同的濃度接種到6孔板，在同樣的條件下用同樣的培養(yǎng)基進行24-36小時的第二培養(yǎng)。含有FSHcc亞單位的BSYH-CGcc-DHFR和含有FSH(3亞單位的BSYH-FSH|3-DHFR以5:1的比例混合(總量為1|ug),并將混合物加入到100jaL的IMDM中。力口入6juL的Plusreagent(Invitrogen,Cat.#11514-015，Lot.#10964-021)并混勻,室溫下放置15分鐘，再加入100juL的IM畫和4juLlipofectamine(Invitorogen，Cat.#19324—012)的混合物并混勻，室溫下放置15分鐘得到DNA混合溶液?；蛘呤峭ㄟ^磷酸4丐-應(yīng)A共沉淀制備DNA混合溶液(Wigleretal，1979)。用2mLD-PBS沖洗培養(yǎng)寄主細(xì)胞的6孔板。在每一個孔中加入1mLIMDM，然后將顧A混合溶液加入每個孔中并混勻。然后將含有DNA混合溶液的6孔板放在37°C下5%C02濃度空氣中培養(yǎng)3-12小時(第一培養(yǎng))。往每個孔中加入lmL含有10%FBS(GibcoCat.#16000-044，Lot.#1105269)和1xHT混合鹽(HTsu卯lement，Cat.#111067-030，Lot.#1120062)的IMDM培養(yǎng)基,在37°C下5。/。C02濃度空氣中進行至少3小時的第二培養(yǎng)。一旦培養(yǎng)完成，每孔用2mLD-PBS沖洗。每孔用lmL胰蛋白酶-EDTA(trypsin-EDTA，Gibco,Cat.#25300-054，Lot.#1124774)回收貼壁細(xì)胞，所回收的細(xì)胞用1mLoc-MEM、10%D—FBS(Gibco,Cat.26400-044,Lot.#1103151)和0.25juMMTX的混合物重懸。將每1mL的懸浮液涂布到10cm培養(yǎng)皿上，其中加入9mLct-MEM、10%D-FBS和0.25|iMMTX的混合物達到10mL的終體積，并在37。C下5%CO"農(nóng)度空氣中培養(yǎng)兩周。兩周的培養(yǎng)一結(jié)束，培養(yǎng)皿上產(chǎn)生的菌落用菌落挑取杯(colonyselectioncup)和100|i1胰蛋白酶-EDTA收集，并在含有a-MEM、10%D-FBS和0.25juMMTX的培養(yǎng)基上擴培(expansion)。結(jié)果得到4種單克隆細(xì)胞系，即CD14A、CD14B、CD14C和CD14E。此外，用類似上述的方法但采用不同的MTX濃度得到了40種單克隆細(xì)胞系。并研究了FSH表達和上述44種單克隆細(xì)胞系的表達水平。為此，每個細(xì)胞培養(yǎng)溶液的FSH表達水平都用FSHELISA試劑盒(IBL，Cat.RE52121)測量兩次。結(jié)果CD14B被證實具有最高的FSH生產(chǎn)能力，達到0.0085mlU/細(xì)胞/48小時，因此被選作FSH生產(chǎn)的母種。同時，也使用了含有天然核香酸序列的FSH的cc亞單位和(3亞單位的表達載體，只得到兩種轉(zhuǎn)化子，其表達水平未能達到檢測限。所得到的單克隆細(xì)胞系用混合液重懸浮并保存到液氮罐LN2tank中，所用的混合液含有比例為6:3:1的cc-MEM、D-FBS和匿SO。例4:人FSH在動物細(xì)胞中的分泌及其純化用上述方法得到表達的單克隆母細(xì)胞系(expressionmonoclonalmothercellline)(源于單個細(xì)胞)被處理以適應(yīng)無血清的懸浮培養(yǎng)條件，其適應(yīng)方法如下。將一小瓶保存于液氮中的細(xì)胞系解凍，用無血清的培養(yǎng)基在T-80燒瓶里靜置培養(yǎng)l天。回收并離心細(xì)胞，在攪拌瓶(spinnerflask)中懸浮培養(yǎng)。第一次培養(yǎng)的體積為70ml，第二次培養(yǎng)時用按l:4的比例稀釋(1/4dilution)使細(xì)胞濃度接近1x1Q6cells/ml。培養(yǎng)體積增加到500ml得到原種并培養(yǎng)。在液氮中保存原種。制得的表達細(xì)胞系進行幾次成批的攪拌瓶預(yù)培養(yǎng)，再進行成批的生物反應(yīng)器中的預(yù)培養(yǎng)。當(dāng)生物反應(yīng)器中的細(xì)胞濃度達到目標(biāo)水平時，轉(zhuǎn)為連續(xù)培養(yǎng)，然后進行主培養(yǎng)來表達重組FSH。主培養(yǎng)得到的培養(yǎng)液利用包括親和柱、疏水柱、離子交換樹脂柱及體積排阻色譜柱等不同的分離柱來純化得到純化的重組FSH。例5:動物細(xì)胞分泌型人FSH的鑒定為了鑒定動物細(xì)胞分泌型人FSH，用胰蛋白酶完全降解從培養(yǎng)基中純化得到的蛋白質(zhì)，然后用液質(zhì)聯(lián)用儀(LCmassspectrophotometer)來分析峰的形式。所得到的結(jié)果用來和NCBI和網(wǎng)絡(luò)上提供的胰蛋白酶降解該蛋白的數(shù)據(jù)相比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所得到的純化蛋白質(zhì)與人FSH完全相同，因此該經(jīng)鑒定的蛋白質(zhì)被命名為"LG-rhFSH"。[肽譜]肽鐠是一種通過比較樣品蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的初級結(jié)構(gòu)來鑒定蛋白質(zhì)的代表性方法。進行LG-rhFSH的肽譜分析是為了確認(rèn)重組FSH的oc亞單位和l3亞單位的初級結(jié)構(gòu)是否與理論結(jié)構(gòu)一致。具體而言，在還原條件下打開所有的S-S鍵(二硫鍵)，并烷基化游離的硫基，用胰蛋白酶消化所得的樣品，用反相高效液相色語法(RP-HPLC)分離所得到的肽段，用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-T0F)進行質(zhì)譜分析和氨基酸序列分析。理論推斷得到的LG-rhFSHcc亞單位和P亞單位#_胰蛋白酶降解得到的肽段如表2和表3所示。表2理論推斷得到的LG-rhFSHoc亞單位被胰蛋白酶降解得到的肽段<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>1)T6形成N-52糖肽，而T9形成N-78糖肽。2)m/z表示質(zhì)量/電荷比，在MALDI-TOF中以獨立質(zhì)子化的形式[M+H+]+表示。表中，mi代表單個各向同性質(zhì)量值(singleisotropicmassvalue)，而av代表平均質(zhì)量值(averagemassvalue)。表3理論推斷得到的LG-rhFSH(3亞單位被胰蛋白酶降解得到的肽段<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>1)Tl形成N-7糖肽，而T3形成N-24糖肽。2)ra/z表示質(zhì)量/電荷比，在MALDI-TOF中以獨立質(zhì)子化的形式[M+H丁表示。表中，mi代表單個各向同性質(zhì)量值，而av代表平均質(zhì)量值。LG-rhFSH的a亞單位和P亞單位分別有5個和6個二硫4建。由于DTT和碘乙酸在實驗中被處理了，上表描述了在所有半胱氨酸都被羧曱基化條件下的期望得到的肽片斷。在LG-rhFSH的ot亞單位和|3亞單位的RP-HPLC色譜圖中出現(xiàn)了代表MALDI-TOF所證實的肽和糖肽的峰，結(jié)果如圖4a和圖4b所示。[LG-rhFSH肽譜結(jié)果]LG-rhFSH的oc亞單位中，除了肽T3和糖肽(N-52和兩個N-78),所有肽(Tl、T2、T4+T5、T6和T7)老財皮i正實了。由于肽T3超出了MALDI-TOF的分析量程，因此未能被證實。在某些片段中(T4+T5及兩個N-78)，肽是結(jié)合形式而不是降解形式。已證實糖肽N-52結(jié)合在肽T6上，糖肽N-78以聚糖形式結(jié)合在T9+T10或T8+T9+T10上。符號"+"表示兩個肽聯(lián)結(jié)在一起。在LG-rhFSH的p亞單位中，糖肽N-24以外的所有肽(T4+T5、T6、T7、T8、T9、T8+T9、T9+T10、T8+T9+T10和T11+T12)和糖肽(N-7)都被證實了。在某些片段中(N-7、T4+T5、T9+T10、T8+T9和T11+T12),肽是結(jié)合形式而不是降解形式。已證實糖肽N-7以聚糖形式結(jié)合在Tl+T2上。LG-rhFSH的(3亞單位中的糖肽片段N-24未被證實。圖中的符號"+，'表示兩個肽聯(lián)結(jié)在一起。圖4a顯示了LG-rhFSH的cc亞單位肽"^普。圖中，糖肽類以括號中的文字表示。已證實，N-52糖肽包含肽T6,第一個N-78糖肽包含肽T9+T10,而第二個N-78糖肽包含肽T8+T9+T10。圖4b顯示了LG-rhFSH的(3亞單位肽譜。圖中糖肽類以括號中的文字表示。糖肽N-7包含肽T1+T2，糖肽N-24包含肽T3。例6:采用動物模型測定動物細(xì)胞分泌型人FSH的效價以上制備的動物細(xì)胞分泌型人FSH的效價的測定采用了測量未成熟大鼠的卵巢增重的方法(Steelman-Pohley;Steelman，(1953)assayofthefolliclestimulatinghormonebasedontheargumentationwithchorionicgonadotropinEndocrinology53:604—616)，并同重纟且FSH的國際標(biāo)準(zhǔn)品的效價比較以確認(rèn)生物效價的等值?；铙w生物測定活體生物測定，又稱為Steelman-Pohley測定法(Steelman-Pohleyassay,Steelman,(1953)assayofthefolliclestimulatinghormonebasedontheargumentationwithchorionicgonadotropinEndocrinology53:604-616)，一直被用于測定源自腦垂體或尿的FSH的生物活性，也是迄今為止藥典描述的唯一用作測定治療用FSH效價的方法[請參見歐洲藥典中的尿促卵泡素(urofollitorpin)和尿促性素(menotrophin)和英國藥典中的尿促性素(menotr叩inum)]。這一常規(guī)測定方法測量hCG處理的未成熟大鼠的卵巢增重。目前，已知卵巢生長受到FSH和顆粒細(xì)胞分泌的雌激素的直接激發(fā)。活體生物測定不僅可以用于定量測定FSH的生物活性，也能用來證實FSH的活性。為證實LG-rhFSH的生物學(xué)特征與天然的來自尿的FSH的生物學(xué)特征相同，進行了Steelman-Pohley活體生物測定。以重組FSH國際標(biāo)準(zhǔn)品(NIBSC92/642)為標(biāo)準(zhǔn)。采用并行性分析來度量所測得的生物活性的統(tǒng)計顯著性。如圖5a和圖5b(重組FSH的活體生物測定(NIBSC,n=3;LG-rhFSH,11=4))所示，LG-rhFSH對卯巢生長具有和國際標(biāo)準(zhǔn)品相同的劑量響應(yīng)。該活體生物測定的結(jié)果證明LG-rhFSH具有和重組FSH國際標(biāo)準(zhǔn)品相同的生物特征。此外，用以上描述的方法將LG-rhFSH和商品化的重組FSH(Gonal-F)相比較，結(jié)果顯示這兩種物質(zhì)具有相同的生物學(xué)特征。如前文所述，根據(jù)本發(fā)明設(shè)計表達載體BSYH/CGoc-DHFR和BSYH/FSH(3-DHFR來表達動物細(xì)胞分泌型人FSH，被該表達載體轉(zhuǎn)化的動物細(xì)胞表達的分泌型重組人FSH蛋白具有同天然的FSH同樣的氨基酸序列，并具有足夠臨床使用的效價，因此適宜商業(yè)化，并可用于有效治療不育癥。以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，雖然本發(fā)明已以較佳實施例揭露如上，然而并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)，當(dāng)可利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容作出些許更動或修飾為等同變化的等效實施例，但凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。序列表〈110〉株式會社LG生命科學(xué)<120〉包含一基因的核苷酸序列、包含該序列的表達載體、該表達載體轉(zhuǎn)化的動物細(xì)胞以及利用該細(xì)胞生產(chǎn)分泌型人促卵泡激素的方法<130〉PIY07299WN-KR<160>16<170>Kopatentln1.71<210〉1<211>70<212〉腿<213>人工序列<220><223〉引物1<400〉1atccaagcttatggactactaccgcaagtacgccgccatxttcctggtgaccctgagcgt,60gttcctgcac70<210〉2<211〉76<212>隱<213>人工序列<220〉<223>引物2<400>2gagcgtgttcctgcsdgtgctgcacagcgcccccgacgtgcaggEictgccccgagtgcsc60tctgcaggagaacccc76<210>3<211>75<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223〉引物3<400>3ctgcaggagaaccccttcttcagccagcccggr都ccccatcc,tgcagtgcatgggctgc60tgcttcagccgcgcc75<210><211〉<212〉<213〉〈220〉<223〉474隨人工序列引物4<400〉4tcgctggtcacgttcttctgcaccagcatggtcttcttgctgcgcaggggggtggggtag60gcgcggctgaagca74〈210〉<211>〈212〉<213><220〉<223>574DNA人工序列引物5<400>5accttgaagccgcccatcacggtcacgcggttgtagctcttggccacgcagcaggtgctt60tcgctggtcacgtt74<210>〈211〉<212〉<213〉〈220><223〉676DNA人工序列引物6<400>6gaactctagattagctcttgtggtagtagcaggtgctgcagtggcaggcggtgtggttct60ctaccttgaagccgcc76<210〉7<211〉85<212〉DNA<213〉人工序列<220><223〉引物'<400〉7cctgaagcttatgaagaccctgcagttcttcttcctgttctgctgctggaaggccatctg60ctgcaatagctgcgagctgaccaac85<210>8<211〉〈212〉<213><220><223>84DNA人工序列引物8〈400〉8agctgcgagctgaccaacatcaccatcgccatcgagaaggaggagtgccgcttctgcatc60agcatcaacaccacctggtgcgcc84<210><211〉<212><213><220〉<223〉982DNA人工序列引物9<400>9caacaccacctggtgcgccggctactgctacacccgagatctggtgtacaaggaccccgc60ccgccccaagatccagaagacc82<210〉<211〉<212〉<213〉〈220〉<223〉1083腿人工序列引物10<400>10gagtcggcgtggtgggcgcagccgggcacgcgcacggtctcgtacaccagctccttgaag60gtgcaggtcttctggatcttggg83<210>11〈211〉85<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223>引物ll<400〉11gcagtcggtgctgtcgctgtcgcacttgccgcagtggcactgggtggccacggggtaggt60gtacagtgagtcggcgtggtgggcg85<210>12<211〉82<212〉隨<213〉人工序列<220〉〈223〉引物12<400〉12cttatctagactactccttcatctcgccgaaggagcagtagctgggccccaggccgcgca60cggtgcagtcggtgctgtcgct82〈210>13<211>351<212〉腿<213〉智人〈220〉〈221〉信號肽-肽<222>(1)..(72)<220><221>CDS<222〉(73)..(348)<400>13atggactactaccgcaagtacgccgccatcttcctggtgaccctgagcgtgttcctgcac60gtgctgcacagcgcccccgacgtgcaggactgccccgagtgcact105ctgcaggagaaccccttcttcagecagcccggcgcccccatectgcag153tgcatgggctgctgcttcagecgcgcctaccccacccccctgcgcage201aagaagaccatgctggtgcagaagaacgtgaccagegaaageacctgc249tgcgtggccaagagetacaaccgcgtgaccgtgatgggcggcttcaag297gtagagaaccacaccgcctgccactgcageacctgctactaccacaag345agetaa351<210〉14<211>92<212>PRT<213〉智人<400〉14AlaProAspValGinAspCysProGluCysThrLeuGinGluAsnPro151015PhePheSerGinProGlyAlaProlieLeuGinCysMetGlyCysCys202530PheSerArgAlaTyrProThrProLeuArgSerLysLysThrMetLeu354045ValGinLysAsnValThrSerGluSerThrCysCysVal/UaLysSer505560TyrAsnArgValThrValMetGlyGlyPheLysValGluAsnHisThr65707580AlaCysHisCysSerThrCysTyrTyrHisLysSer8590<210〉<211><212〉<213〉〈220〉<221〉〈222〉<220><221>〈222>15390腿智人信號肽-肽(l)..(54)CDS(55)..(387)<400〉15atgaagaccctgcagttcttcttcctgttctgctgctggaaggccatctgctgc54aatagetgcgagctgaccaacateaccategccategagaaggaggag102tgccgcttctgcateageateaacaccacctggtgcgccggctactgc150tacacccgagatctggtgtacaaggaccccgcccgccccaagatecag198aagacctgcaccttcaaggagctggtgtacgagaccgtgcgcgtgccc246ggctgcgcccaccacgccgacteactgtacacctaccccgtggccacc294cagtgccactgcggcaagtgcgacagegacageaccgactgcaccgtg342cgcggcctggggcccagetactgctecttcggcgagatgaaggagtag387tag390〈210〉16〈211〉111<212〉PRT<213〉智人<400>16AsnSerCysGluLeuThrAsnlieThrlieAlalieGluLysGluGlu151015CysArgPheCyslieSerlieAsnThrThrTrpCysAla.GlyTyrCys202530TyrThrArgAspLeuValTyrLysAspProAlaArgProLyslieGin354045LysThrCysThrPheLysGluLeuValTyrGluThrValArgValPro505560GlyCysAlaHisHisAlaAspSerLeuTyrThrTyrProValAlaThr65707580GinCysHisCysGlyLysCysAspSerAspSerThrAspCysThrVal859095ArgGlyLeuGlyProSerTyrCysSerPheGlyGluMetLysGlu100105110權(quán)利要求1.一種核苷酸序列，其特征在于包含一基因，該基因可以編碼與含有α亞單位和β亞單位的天然的人促卵泡激素相同的蛋白序列，并可提高該蛋白序列的表達水平。2、權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于編碼ot亞單位的基因的序列如SEQ.ID.N0:13所示。3、權(quán)利要求1所述的核苷S交序列，其特征在于編碼P亞單位基因的序列如SEQ.ID.NO:15所示。4、一種用于動物細(xì)胞中表達的表達載體，其特征在于包含權(quán)利要求1所述的人促卵泡激素的核芬酸序列。5、權(quán)利要求4所述的表達載體，其特征在于該表達載體是能夠同時轉(zhuǎn)錄一標(biāo)記物和SEQ.ID.NO:13，或該標(biāo)記物和SEQ.ID.NO:15所表示的序列的雙順反子表達載體。6、權(quán)利要求5所述的表達載體，其特征在于該含有SEQ.ID.NO:13所表示的序列的表達載體具有BSYH-CGcx-DHFR載體結(jié)構(gòu)。7、權(quán)利要求5所述的表達載體，其特征在于該含有SEQ.ID.NO:15所表示的序列的表達載體具有BSYH-FSH(3-DHFR載體結(jié)構(gòu)。8、一種由權(quán)利要求4-7中任一權(quán)利要求所述的表達載體所轉(zhuǎn)化的動物細(xì)胞。9、權(quán)利要求8所述的動物細(xì)胞，其特征在于該動物細(xì)胞選自于中國倉鼠卵巢細(xì)胞、小鼠細(xì)胞、猴細(xì)胞和人細(xì)胞。10、權(quán)利要求9所述的動物細(xì)胞，其特征在于該動物細(xì)胞是中國倉鼠卵巢細(xì)胞。11、一種利用轉(zhuǎn)化的動物細(xì)胞來生產(chǎn)人促卵泡激素的方法，其特征在于其包括以下步驟培養(yǎng)被包含有權(quán)利要求1所述的人促卵泡激素核苷酸序列的表達載體轉(zhuǎn)化的動物細(xì)胞；并從培養(yǎng)液中分離純化人促卵泡激素。12、一種生產(chǎn)人促卵泡激素蛋白的方法，其特征在于其包括以下步驟制備權(quán)利要求1所述的促卵泡激素核苷酸序列；將該核苷酸序列插入一表達載體；用該表達載體轉(zhuǎn)化動物細(xì)胞；培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子，并且從培養(yǎng)液中分離純化該蛋白。全文摘要一種核苷酸序列，其包含一基因，該基因可以編碼與含有α亞單位和β亞單位的天然的人FSH相同的蛋白序列，并可提高該蛋白序列的表達水平。本發(fā)明還公開了包含該核苷酸序列的重組表達載體，受到該重組表達載體轉(zhuǎn)化的動物細(xì)胞，以及一種利用該轉(zhuǎn)化動物細(xì)胞生產(chǎn)分泌型人FSH的方法。根據(jù)本發(fā)明設(shè)計表達載體BSYH/CGα-DHFR和BSYH/FSHβ-DHFR來表達動物細(xì)胞分泌型人FSH，表達的分泌型重組人FSH蛋白具有同天然的FSH同樣的氨基酸序列，并具有足夠臨床使用的效價，因此適宜商業(yè)化，并可用于有效治療不育癥。文檔編號C07K14/435GK101250531SQ200710187379公開日2008年8月27日申請日期2007年11月27日優(yōu)先權(quán)日2006年11月27日發(fā)明者李承遠(yuǎn),李泰昊,金元謙,金炯徹申請人:株式會社Lg生命科學(xué)