專利名稱：：N1,n4-雙(丁-1,3-二烯基)丁-1,4-二胺藥物組合物及其方法關(guān)于政府利益的聲明本發(fā)明在以下機(jī)構(gòu)提供的美國政府支持下作出ARMY/MRMCDAMD17-02-1-0166和NIHDK065303。美國政府對本發(fā)明享有一定權(quán)利。相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2006年5月3日提交的美國專利申請序列號(hào)60/797,142的優(yōu)先權(quán)，該份申請通過引用的方式全文納入本文。
背景技術(shù)：
：晚期激素難治的轉(zhuǎn)移性前列腺癌(advancedhormonerefractorymetastaticprostatecancer)是美國男性的第二大癌癥死因。據(jù)測定，2006年有超過27,000的美國男性死于轉(zhuǎn)移性前列腺癌。目前臨床上使用的大多數(shù)化療劑對治療該疾病作用有限。因此，十分需要治療轉(zhuǎn)移性前列腺癌的新治療劑。最初診斷時(shí)，大多數(shù)前列腺癌患者具有雄激素依賴性腫瘤，這些腫瘤在外科手術(shù)、放療和雄激素消融治療(androgenablationtherapy)后快速消退。然而幾年后，大量這樣的患者中該癌癥復(fù)發(fā)。這種復(fù)發(fā)是以晚期激素難治的轉(zhuǎn)移性癌癥形式出現(xiàn)的。目前沒有治療或預(yù)防該疾病，特別是晚期階段的有效療法。因此，迫切需要開發(fā)能降低前列腺癌的復(fù)發(fā)和進(jìn)展的藥物。有理論認(rèn)為前列腺組織中的氧化應(yīng)激是前列腺癌發(fā)生和進(jìn)展的主要誘因。因此，還迫切需要發(fā)現(xiàn)和開發(fā)能治療性降低氧化應(yīng)激的藥物。出版的流行病學(xué)和生物化學(xué)證據(jù)提示前列腺組織中的氧化應(yīng)激是前列腺癌發(fā)生和進(jìn)展的主要誘因之一，抗氧化劑能降低前列腺癌發(fā)生。還知道雄激素是正常和惡性前列腺細(xì)胞中ROS的主要誘導(dǎo)物。(參見Wilding，G.，EndocrineControlofProstateCancer(前列腺癌的內(nèi)分泌控制)，CancerSurveys，2343-62(1995))。還知道在多胺催化途徑中，乙?；喟费趸?“APAO”)的循環(huán)作用是ROS產(chǎn)生的主要來源。(參見Cohen，S.S.，AGuidetothePolyamines(多胺指南)，牛津大學(xué)出版社，牛津，英國296-319(1998)；Schwartz，B等，ANewModelforDisruptionoftheOrnithineDecarboxylaseGene，SPE1，InSaccharomycesCerevisiaeExhibitsGrowthArrestandGeneticInstabilityattheMATLocus(釀酒酵母中鳥氨酸脫羧酶基因SPE1被破壞后顯示生長停滯和MAT基因座遺傳不穩(wěn)定的新模型)，BiochemJ.，11月15日312(第1章)83-90(1995)；SchipperRG等，AntitumorActivityofthePolyamineAnalogN(1)，N(11)-diethylnorspermineAgainstHumanProstateCarcinomaCells(多胺類似物N(1)，N(11)-二乙基去甲精胺抗人前列腺癌細(xì)胞的抗腫瘤活性)，TheProstate，44(4)313-21(2000)；Casero，RA等，TheRoleofPolyamineCatabolisminAnti-tumourDrugResponse(多胺分解代謝在抗腫瘤藥物應(yīng)答中的作用)，Biochem.Soc.Trans.，4月31(2)361-5(2003)；Ha，HC等，TheRoleofPolyamineCatabolisminPolyamineAnalogue-InducedProgrammedCellDeath(多胺分解代謝在多胺類似物誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡中的作用)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94(21)11557-62(1997)；和Bey，P等，N-2，3-Butadienyl-1，4-butanediamineDerivativesPotentIrreversibleInactivatorsofMammalianPolyamineOxidase(N-2，3-丁二烯基-1，4-丁二胺衍生物哺乳動(dòng)物多胺氧化酶的強(qiáng)效不可逆滅活劑)，J.Med.Chem，28(1)1-2(1985))。發(fā)明概述本發(fā)明一方面是降低男性前列腺中活性氧中間體濃度的方法，包括給予治療量的N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺或其藥學(xué)上合適的鹽或溶劑化物的步驟或行為。在上述方法的示范性實(shí)施方式中，所述治療量是與未治療對照男性中的活性氧中間體的濃度相比，足以將前列腺中一種或多種活性氧中間體的濃度降低至少50％的用量。在上述方法的示范性實(shí)施方式中，該方法還包括通過離體檢測氧化的氫化乙啶(hydroethidine)熒光∶DNA熒光之比來測定降低的活性氧中間體濃度的步驟或行為。在上述方法的另一示范性實(shí)施方式中，該方法還包括通過離體檢測氧化的2′，7′-二氯二氫熒光素二醋酸酯熒光∶DNA熒光之比來測定降低的活性氧中間體濃度的步驟或行為。在上述方法的另一示范性實(shí)施方式中，該方法還包括通過離體檢測氧化的氫化乙啶熒光∶DNA熒光之比來測定降低的活性氧中間體濃度的步驟或行為。在上述任何方法的另一實(shí)施方式中，所述活性氧中間體是過氧化氫、超氧化物(superoxide)、羥自由基(hydroxylradical)和氧化氮中的一種或多種，其中“超氧化物”是額外具有一個(gè)電子的氧分子。例如，超氧化物分子可以是在細(xì)胞線粒體中形成的ROS。本發(fā)明的另一方面是抑制男性前列腺中乙?；喟费趸傅姆椒?，包括給予治療量的N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺或其鹽或溶劑化物的步驟或行為。在另一實(shí)施方式中，與未治療的男性相比，抑制至少50％的所述乙酰基多胺氧化酶。本發(fā)明的另一方面是預(yù)防性治療男性前列腺癌的方法，包括給予治療量的N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺或其藥學(xué)上合適的鹽或溶劑化物的步驟或行為。在上述方法的示范性實(shí)施方式中，所述治療量是與以前診斷出或未診斷出前列腺癌的未治療男性對照相比，足以防止或降低前列腺癌發(fā)生和/或復(fù)發(fā)的用量。本發(fā)明的另一方面是治療男性前列腺癌的方法，包括給予治療量的N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺或其藥學(xué)上合適的鹽或溶劑化物的步驟或行為。在上述方法的示范性實(shí)施方式中，所述治療量是足以終止或降低前列腺癌的進(jìn)展、發(fā)病率和/或死亡率的用量。在上述任一方法的示范性實(shí)施方式中，所述鹽是乙酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、碳酸氫鹽、酒石酸氫鹽、溴化物、乙二胺四乙酸鈣鹽、樟腦磺酸鹽、碳酸鹽、氯化物、檸檬酸鹽、二鹽酸鹽、乙二胺四乙酸鹽、乙二磺酸鹽、月桂酸鹽(estolate)、乙磺酸鹽、延胡索酸鹽、葡庚糖酸鹽(gluceptate)、葡糖酸鹽、谷氨酸鹽、乙醇酰對氨苯基砷酸鹽(glycollylarsanilate)、己基間苯二酚鹽(hexylresorcinate)、海巴明鹽(hydrabamine)、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、羥萘甲酸鹽、碘化物、羥乙基磺酸鹽、乳酸鹽、乳糖醛酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽、甲基溴化物、甲硝酸鹽、甲硫酸鹽、粘酸鹽、萘磺酸鹽、硝酸鹽(mitrate)、雙氫萘酸鹽、泛酸鹽、磷酸鹽、二磷酸鹽、聚半乳糖醛酸鹽、水楊酸鹽、硬脂酸鹽、堿式醋酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、鞣酸鹽、酒石酸鹽、茶氯酸鹽(teoclate)或三乙基碘化物(triethiodide)。在上述任何方法的另一實(shí)施方式中，所述鹽是二鹽酸鹽。在上述任何方法的另一實(shí)施方式中，所述治療量在約1-100mg/kgBW的范圍內(nèi)，所述治療量在每兩周一次到每日一次的范圍內(nèi)給予。在上述任何方法的另一實(shí)施方式中，所述治療量在約10-40mg/kgBW的范圍內(nèi)，所述治療量在每周給予一次。在上述任何方法的另一實(shí)施方式中，所述治療量約25mg/kgBW，所述治療量在每兩周給予一次。本發(fā)明另一方面是包含治療有效量的活性藥物成分和選自藥學(xué)上合適的載體、賦形劑、溶劑、添加劑、運(yùn)載體、穩(wěn)定劑、惰性稀釋劑、粘合劑、崩解劑或粘合劑中一種或多種的口服藥物組合物，所述活性藥物成分含有N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺或其藥學(xué)上合適的鹽或溶劑化物。在口服藥物組合物的示范性實(shí)施方式中，所述鹽是乙酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、碳酸氫鹽、酒石酸氫鹽、溴化物、乙二胺四乙酸鈣鹽、樟腦磺酸鹽、碳酸鹽、氯化物、檸檬酸鹽、二鹽酸鹽、乙二胺四乙酸鹽、乙二磺酸鹽、月桂酸鹽、乙磺酸鹽、延胡索酸鹽、葡庚糖酸鹽、葡糖酸鹽、谷氨酸鹽、乙醇酰對氨苯基砷酸鹽、己基間苯二酚鹽、海巴明鹽、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、羥萘甲酸鹽、碘化物、羥乙基磺酸鹽、乳酸鹽、乳糖醛酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽、甲基溴化物、甲硝酸鹽、甲硫酸鹽、粘酸鹽、萘磺酸鹽、硝酸鹽(mitrate)、雙氫萘酸鹽、泛酸鹽、磷酸鹽、二磷酸鹽、聚半乳糖醛酸鹽、水楊酸鹽、硬脂酸鹽、堿式醋酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、鞣酸鹽、酒石酸鹽、茶氯酸鹽或三乙基碘化物。在口服藥物組合物的示范性實(shí)施方式中，所述組合物是未包衣片劑、包衣片劑、硬明膠膠囊、軟明膠膠囊、粉末劑、膠囊、彈丸劑、溶液劑、混懸劑、酏劑或乳劑等形式。本發(fā)明的另一方面是測定人組織中氧化應(yīng)激的方法，包括離體檢測氧化的2′，7′-二氯二氫熒光素二醋酸酯熒光∶DNA熒光之比的步驟或行為。本發(fā)明的另一方面是測定人組織中氧化應(yīng)激的方法，包括離體檢測氧化的氫化乙啶熒光∶DNA熒光之比的步驟或行為。本發(fā)明的另一方面是測定男性前列腺組織中氧化應(yīng)激的方法，包括離體檢測氧化的2′，7′-二氯二氫熒光素二醋酸酯熒光∶DNA熒光之比的步驟或行為。在上述方法的示范性實(shí)施方式中，所述人組織是獲自腫瘤生物活檢樣品的男性前列腺組織。在上述方法的另一示范性實(shí)施方式中，所述人組織取自除前列腺以外的身體部分的腫瘤生物活檢樣品。本發(fā)明的另一方面是治療雄犬前列腺癌的方法，包括給予該犬治療量的N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺或其藥學(xué)上合適的鹽或溶劑化物的步驟或行為。本發(fā)明的另一方面是降低人組織中活性氧中間體濃度的方法，包括給予該人治療量的N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺或其藥學(xué)上合適的鹽或溶劑化物的步驟或行為。在上述方法的示范性實(shí)施方式中，所述治療量是與未治療的人組織中活性氧中間體的濃度相比，足以將前列腺中一種或多種活性氧中間體的濃度降低至少50％的用量。在上述方法的示范性實(shí)施方式中，所述活性氧中間體是過氧化氫、超氧化物、氫氧自由基和氧化氮中的一種或多種。本發(fā)明的另一方面是離體或體內(nèi)檢測哺乳動(dòng)物細(xì)胞、器官或生物活檢樣品中活性氧中間體濃度的試劑盒，其裝有包含氫化乙啶染料的第一組分和包含活細(xì)胞DNA染色劑的第二組分。在上述試劑盒的示范性實(shí)施方式中，所述活細(xì)胞DNA染色劑包括本發(fā)明的另一方面是利用上述試劑盒離體檢測源自哺乳動(dòng)物細(xì)胞、器官或生物活檢樣品的組織中活性氧中間體濃度的方法，包括以下步驟或行為用氫化乙啶染料染色第一組織以產(chǎn)生第一個(gè)熒光單位數(shù)值，用活細(xì)胞DNA染色劑染色第二組織以產(chǎn)生第二個(gè)熒光單位數(shù)值，和按照所述第二個(gè)熒光單位數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)化所述第一個(gè)熒光單位數(shù)值，從而定量測定活性氧中間體的濃度。在上述方法的示范性實(shí)施方式中，所述活細(xì)胞DNA(染料)包括本發(fā)明的另一方面是離體或體內(nèi)檢測哺乳動(dòng)物細(xì)胞、器官或生物活檢樣品中活性氧中間體濃度的試劑盒，所述試劑盒裝有包含2′，7′-二氯二氫熒光素二醋酸酯染料的第一組分和包含活細(xì)胞DNA染色劑的第二組分。在上述試劑盒的示范性實(shí)施方式中，所述活細(xì)胞DNA(染料)包括本發(fā)明的另一方面是利用上述試劑盒離體檢測源自哺乳動(dòng)物細(xì)胞、器官或生物活檢樣品的組織中活性氧中間體濃度的方法，包括以下步驟或行為用2′，7′-二氯二氫熒光素二醋酸酯染料染色第一組織以產(chǎn)生第一個(gè)熒光單位數(shù)值，用所述活細(xì)胞DNA染色劑染色第二組織以產(chǎn)生第二個(gè)熒光單位數(shù)值，和按照所述第二個(gè)熒光單位數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)化所述第一個(gè)熒光單位數(shù)值，從而定量測定活性氧中間體的濃度。在上述試劑盒的示范性實(shí)施方式中，所述活細(xì)胞DNA(染料)包括示范性附圖簡述圖1是在前列腺細(xì)胞中雄激素誘導(dǎo)的SSAT誘導(dǎo)多胺代謝從而導(dǎo)致多胺氧化和ROS產(chǎn)生的示意圖。圖2是本發(fā)明的N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺化合物在前列腺細(xì)胞中起到乙?；喟费趸?APAO)抑制劑的作用并阻斷雄激素誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生的理論示意圖。圖3顯示了在未處理的LNCaP人前列腺癌細(xì)胞和用0.05nM或1.0nMR1881處理96小時(shí)的細(xì)胞中，按照甘油醛-3-磷酸-脫氫酶mRNA水平標(biāo)準(zhǔn)化的qRT-PCR定量測定的SSATmRNA水平，其中QRT-PCR數(shù)據(jù)顯示1nMR1881(一種合成的雄激素類似物)處理提高了LNCaP細(xì)胞中的SSATmRNA水平。圖4顯示在DU-145人前列腺癌細(xì)胞中用濃度遞增的非雄激素化合物雙乙基去甲精胺(bisethylnorspermine)(“BE-3-3-3”)處理72小時(shí)在LNCaP細(xì)胞中的DCF熒光/DNA熒光，其中數(shù)據(jù)按照未處理對照細(xì)胞的百分比標(biāo)準(zhǔn)化，BE-3-3-3(已知的SSAT誘導(dǎo)劑)能提高DU-145細(xì)胞中的氧化應(yīng)激。圖5A-5E顯示在如下處理的LNCaP人前列腺癌細(xì)胞中的腐胺(Pu)、亞精胺(Sd)、精胺(Sm)、N-乙酰基亞精胺(N-Ac-Sd)和N-乙?；?N-Ac-Sm)水平用25μgN，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺化合物處理120小時(shí)并且用和不用1nMR1881處理96小時(shí)；用25μMN，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺化合物預(yù)處理24小時(shí)，然后用1nMR1881處理96小時(shí)，其中多胺水平表示為納摩爾/106細(xì)胞，利用市售標(biāo)準(zhǔn)品采用HPLC方法(參見Kabra，PM等，Solid-PhaseExtractionandDeterminationofDansylDerivativesofUnconjugatedandAcetylatedPolyaminesbyReverse-PhaseLiquidChromatographyImprovedSeparationSystemsforPolyaminesinCerebrospinalFluid，UrineandTissue(固相提取未偶聯(lián)和乙?；喟返牡Ｑ苌锖屯ㄟ^反相液相層析測定腦脊液、尿和組織中多胺的改進(jìn)分離系統(tǒng))，J.Chromatogr.，1986；380(1)19-32)測定，數(shù)據(jù)顯示用1nMR1881±25μMMDL72，527處理的LNCaP細(xì)胞中的多胺和乙酰基多胺水平。圖6顯示用濃度遞增的R1881處理的LNCaP細(xì)胞中的DCF熒光/DNA熒光，其表示為未處理對照細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，其中數(shù)據(jù)顯示用MDL72，527預(yù)處理有效阻斷LNCaP細(xì)胞中雄激素誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生。圖7A-7D包括處死前1小時(shí)靜脈內(nèi)注射8mg/kgBW氫化乙啶(HEt)的20周齡TRAMPxFVBF1小鼠(雜交小鼠前列腺腔)的前列腺切片照片(其中TRAMP是轉(zhuǎn)基因腺癌的小鼠前列腺模型)，其中圖7A顯示只用運(yùn)載體處理的小鼠前列腺切片的代表性相差顯微鏡照片，圖7B顯示圖7A所示前列腺切片的熒光顯微鏡照片，圖7C顯示給予6次25mg/kgBWN，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺化合物處理后2周處死的小鼠前列腺切片的代表性相差顯微鏡照片，圖7D顯示圖7C所示前列腺切片的HEt熒光顯微鏡照片，其中利用OlympusTMBH-2熒光顯微鏡以20倍放大率獲取所有照片，所述顯微鏡利用480nm激發(fā)/600nm發(fā)射濾光片并耦聯(lián)有索尼DSC-V3數(shù)碼照相機(jī)，所述照相機(jī)設(shè)置為F2.8和30秒，這些照片證明給藥導(dǎo)致氧化應(yīng)激降低，而HEt熒光較低表明用MDL72，527處理的小鼠中氧化應(yīng)激較低。圖8是小鼠存活％與TRAMP雄性小鼠周齡的圖示，其中以兩周一次方案(在標(biāo)有“tx”的周齡時(shí))，用25mg/kgBWN，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺化合物或鹽水運(yùn)載體對照經(jīng)腹膜內(nèi)處理小鼠，追蹤存活率，存活根據(jù)因腫瘤負(fù)荷(tumorburden)而施以安樂死之時(shí)確定，這些數(shù)據(jù)顯示用MDL72，527處理提高了TRAMP小鼠的總體存活率。圖9是小鼠體重(g)與以兩周一次方案(在標(biāo)有“tx”的周齡時(shí))，用25mg/kgBWMDL72，527或鹽水運(yùn)載體和對照處理的TRAMPxFVB小鼠周齡的圖示，數(shù)據(jù)證明通過TRAMPxFVB小鼠的體重變化測定到MDL72，527沒有明顯的毒性作用。圖10是具有清晰可觸及腫瘤的小鼠百分比與小鼠周齡的圖示，其中每兩周(“tx”處)用25mg/kgBWN，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺化合物處理TRAMPxFVB小鼠，數(shù)據(jù)證明MDL72，527處理延遲了TRAMPxFVB小鼠中的腫瘤產(chǎn)生時(shí)間。圖11是TRAMPxFVB雄性小鼠的存活％與周齡的圖示，其中以兩周一次方案(在標(biāo)有“tx”的周齡時(shí))，用25mg/kgBWN，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺化合物或鹽水運(yùn)載體對照經(jīng)腹膜內(nèi)處理小鼠，追蹤存活率，存活率根據(jù)因腫瘤負(fù)荷而施以安樂死之時(shí)確定，這些數(shù)據(jù)顯示用MDL72，527處理提高了TRAMPxFVB小鼠的總體存活率。圖12是蛋白質(zhì)印跡分析，其顯示在TRAMPxFVB小鼠中，給予N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺化合物誘導(dǎo)的雄激素作用被阻斷不是因?yàn)樾奂に厥荏w(“AR”)的下調(diào)。圖13顯示單用載體或用表達(dá)抗SSAT的siRNA(si22)的載體轉(zhuǎn)染的LNCaP細(xì)胞克隆中代表ROS水平的DCF熒光/DNA熒光，其中細(xì)胞未作處理或用1nMR1881處理96小時(shí)，根據(jù)單用載體轉(zhuǎn)染的未處理細(xì)胞的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化所有數(shù)據(jù)，SSAT-沉默LNCaP克隆細(xì)胞(si22)中1nMR1881誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)量明顯降低，數(shù)據(jù)顯示多胺氧化是PCa中的ROS來源。圖14和15顯示存活百分?jǐn)?shù)與TRAMP(圖14)和TRAMPxFVB雄性小鼠(圖15)的周齡的卡普蘭-邁耶存活曲線，其中在箭頭標(biāo)記的周齡時(shí)以兩周一次的方案用25mg/kgBWMDL72，527或鹽水運(yùn)載體對照通過腹膜內(nèi)注射處理小鼠，追蹤存活率，存活率根據(jù)因腫瘤負(fù)荷而施以安樂死之時(shí)確定，其中(如圖14所示)MDL72，527(2周給予1次，共處理3次)提高了TRAMP小鼠的整體存活率，其中(如圖15所示)MDL72，527(2周給予1次，共處理6次)提高了TRAMPxFVB小鼠的整體存活率。圖16顯示在處死其中8只小鼠在顯微鏡下病理學(xué)測定前列腺組織中是否存在前列腺上皮內(nèi)腫瘤(PIN)或癌之前，具有可觸及腫瘤的20周齡小鼠，其中顯示了用MDL72，527以25mg/kgBW每兩周處理一次的TRAMPxFVB中腫瘤產(chǎn)生時(shí)間。圖17顯示在所包括的處理后，外科手術(shù)取出的未治療男性人前列腺腔組織的照片，該組織切成4-5mm厚的切片，在37℃的HEt(8mg/ml)溶液中溫育60分鐘，然后進(jìn)行組織加工(石蠟包埋和切片機(jī)切片以進(jìn)行熒光顯微術(shù))，其中照片以20倍放大率，480nm激發(fā)/595nm發(fā)射波長獲得。圖18顯示圖17所用同一人前列腺腔切片的照片，其中HEt染色顯示上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞之間的差異，其中數(shù)據(jù)證實(shí)只在前列腺上皮細(xì)胞中存在高氧化應(yīng)激。圖19顯示制備N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺的本發(fā)明方法。優(yōu)選實(shí)施方式詳述本發(fā)明涉及N1，N4-雙(丁-1，3-二烯基)丁-1，4-二胺二鹽酸鹽(也稱為MDL72，527和N，N′-二-2，3-丁二烯基-1，4-丁二胺二鹽酸鹽)、或其鹽或溶劑化物，其作為抗氧化劑的應(yīng)用，其在預(yù)防和/或治療男性前列腺癌中的應(yīng)用，及其在降低人前列腺組織或任何其它身體組織中活性氧中間體濃度中的應(yīng)用，和制備該化合物的方法。其它方法包括抑制人前列腺組織或其它人體組織中乙?；喟费趸福▽⒅委熈康腘，N’-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺或其鹽或溶劑化物給予該人；以及測定人前列腺組織或其它人或動(dòng)物身體組織中氧化應(yīng)激的方法，包括離體或體內(nèi)檢測氧化的2’，7’-二氯二氫熒光素二醋酸酯熒光∶DNA熒光和氫化乙啶染料熒光之比。本發(fā)明可離體或體內(nèi)用于任何哺乳動(dòng)物，例如人或犬。本發(fā)明包括特異性降低前列腺組織中氧化應(yīng)激，從而預(yù)防和/或治療前列腺癌進(jìn)展(特別是在高?；颊咧?的化療劑?；钚匝踔虚g體(“ROS”)在前列腺中的產(chǎn)生水平高于其它器官是公認(rèn)的。ROS包括但不限于過氧化氫、超氧化物、氫氧自由基和硝酸。不想局限于任何理論，但有理論認(rèn)為給予該N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺化合物能通過特異性阻斷雄激素誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的生物化學(xué)途徑(即產(chǎn)生ROS)抑制乙?；喟费趸?“APAO”)和多胺氧化酶(PAO)途徑，從而使得抗氧化劑治療靶向前列腺組織。還有理論認(rèn)為給予該N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺化合物對雄激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑?jīng)]有明顯的不利影響。N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺的結(jié)構(gòu)如下所示。優(yōu)選將N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺的游離形式、鹽或溶劑化物給予人或非人哺乳動(dòng)物。所述鹽或溶劑化物形式可以是任何藥學(xué)上合適的鹽或溶劑化物。所述藥學(xué)上合適的鹽形式優(yōu)選N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺·2HCl。所述藥學(xué)上合適的溶劑化物形式優(yōu)選是溶解于藥學(xué)上合適的溶劑，例如極性溶劑，優(yōu)選水中的N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺·2HCl。同樣，在良好接受的、臨床前轉(zhuǎn)基因腺癌的小鼠前列腺(“TRAMP”)模型中給予該N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺化合物成功地延遲前列腺腫瘤產(chǎn)生并提高總體存活率。(參見，例如Garcia，GE等，2-MethoxyestradiolInhibitsProstateTumorDevelopmentinTransgenicAdenocarcinomaofMouseProstateRoleofTumorNecrosisFactor-α-SimulatedGene6(2-甲氧基雌二醇在轉(zhuǎn)基因腺癌的小鼠前列腺模型中抑制前列腺腫瘤產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α-模擬基因6的作用)，ClinCancerRes12(3)(2006年2月1日)。TRAMP模型自發(fā)產(chǎn)生前列腺癌并死于該病。給予該N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺化合物顯著降低了經(jīng)培養(yǎng)的雄激素依賴性人腫瘤細(xì)胞系中和TRAMP小鼠體內(nèi)瘤前病變中的氧化應(yīng)激。還可將該N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺化合物作為輔助治療劑給予以防止以前治療過原發(fā)性前列腺腫瘤的患者復(fù)發(fā)。有報(bào)道說前列腺中的ROS產(chǎn)生水平高于其它器官。ROS通過對DNA的直接誘變作用或通過改變基因表達(dá)而改變生長或凋亡相關(guān)基因。前列腺組織中的高水平ROS在前列腺癌的發(fā)生和進(jìn)展中可能起主要作用。ROS可導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、改變巰基依賴性酶的活性或破壞DNA。低水平ROS用作誘導(dǎo)腫瘤的促分裂原，或者ROS產(chǎn)生所致的氧化還原改變在特定信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起著關(guān)鍵作用。高脂肪飲食增加脂質(zhì)過氧化(從而產(chǎn)生ROS)從而導(dǎo)致工業(yè)化國家中的前列腺癌發(fā)病率比發(fā)展中國家高。公布的數(shù)據(jù)支持，飲食中包括降低細(xì)胞ROS水平的食物抗氧化劑，例如β-胡蘿卜素、β-番茄紅素、維生素E和硒能降低前列腺癌的發(fā)病率。近年來，實(shí)驗(yàn)和臨床證據(jù)直接將氧化應(yīng)激增加與前列腺腫瘤產(chǎn)生的增加相聯(lián)系?，F(xiàn)已采用免疫組織化學(xué)方法檢測外科手術(shù)取出的惡性和正常前列腺組織的存檔石蠟塊中氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的針對DNA堿基的氧化損傷。惡性和轉(zhuǎn)移性人前列腺腫瘤組織顯示ROS誘導(dǎo)蛋白質(zhì)和DNA堿基修飾水平高于正常前列腺組織。免疫組織化學(xué)研究還顯示在TRAMP前列腺中，與毗鄰的正常前列腺組織相比，瘤前病變中針對DNA和蛋白質(zhì)的氧化損傷水平明顯較高。現(xiàn)已將雄激素鑒定為在前列腺組織中誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的天然物質(zhì)。被ROS氧化后氫化乙啶染料發(fā)出熒光?，F(xiàn)已在雄性裸鼠體內(nèi)觀察到LNCaP人腫瘤異種移植物中存在高氧化應(yīng)激。外科手術(shù)閹割除去雄激素的天然來源后，荷瘤小鼠中增加的氧化應(yīng)激水平在72小時(shí)內(nèi)降低。有關(guān)前列腺組織中雄激素誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生的確切分子機(jī)制未知。曾報(bào)道過導(dǎo)致CaP細(xì)胞中ROS產(chǎn)生增加的其它途徑，例如表達(dá)核轉(zhuǎn)錄因子(如缺氧-誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子(“HIF-1α”)、NF-KB、AP-1等)；和抑制谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶表達(dá)(transfereesexpression)從而導(dǎo)致總谷胱甘肽(一種還原劑)水平降低。提出的途徑可能不是互相排斥的。亞精胺和精胺是多胺，其前體二胺腐胺是所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在的有機(jī)陽離子。這種多胺是細(xì)胞生長和增殖必需的。健康男性的精液含有大量主要由前列腺分泌產(chǎn)生的精胺(約3mM)。如圖1所示，產(chǎn)生N-乙酰基多胺的亞精胺/精胺N-乙?；D(zhuǎn)移酶(“SSAT”)途徑驅(qū)動(dòng)多胺分解代謝。組成型酶APAO氧化N-乙酰基多胺。APAO利用可在乙酰基多胺的氧化期間還原成FADH2的FAD。通過產(chǎn)生H2O2(即ROS)，F(xiàn)ADH2經(jīng)循環(huán)重新形成FAD，從而再生活性APAO酶。多胺分解代謝酶的表達(dá)增加(通過誘導(dǎo)特定轉(zhuǎn)錄因子并降低總細(xì)胞谷胱甘肽)可提高多胺分解代謝所致的細(xì)胞氧化應(yīng)激。如圖1所示，SSAT是多胺分解代謝途徑的限速酶。SSAT產(chǎn)生的乙?；喟酚米鰽PAO氧化并伴隨ROS產(chǎn)生的底物。最近的DNA微陣列和qRT-PCR數(shù)據(jù)提示雄激素在雄激素依賴性LNCaP人前列腺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)SSAT基因過表達(dá)30-50倍。本領(lǐng)域公認(rèn)在生理?xiàng)l件下雄激素可在雄激素依賴性前列腺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生。采用2′，7′-二氯二氫熒光素二醋酸酯(DCF)氧化實(shí)驗(yàn)檢測氧化的DCF∶DNA熒光之比，其是前列腺細(xì)胞系中ROS水平的可接受的度量方法。數(shù)據(jù)和結(jié)果示于表1。表1DCFH氧化實(shí)驗(yàn)檢測的前列腺細(xì)胞中的ROSF(5)＝5％胎牛血清F1/C4＝1％胎牛血清+4％脫碳血清(雄激素消除的)在1％FBS和4％脫碳FBS的雄激素-消除培養(yǎng)基(F1/C4)中，存在或不存在1nM合成雄激素類似物R1881時(shí)，用或不用15μM抗氧化劑α-生育酚(維生素E)預(yù)處理，以培養(yǎng)LNCaP人前列腺癌細(xì)胞。顯示用BE-3-3-3(已知的SSAT誘導(dǎo)劑)處理，用或不用25μMMDL72，527處理的LNCaP和DU-145人前列腺癌細(xì)胞的ROS水平。表1的數(shù)據(jù)提示所有前列腺癌細(xì)胞系中的ROS水平高于正常前列腺上皮細(xì)胞中觀察到的那些水平。表1的數(shù)據(jù)還提示LNCaP細(xì)胞的ROS多于DU-145細(xì)胞；1nM濃度(與雄激素的生理水平相當(dāng))的雄激素類似物R1881提高了LNCaP細(xì)胞的ROS水平；亞致死劑量(1μM)的BE-3-3-3提高了兩種細(xì)胞系中的ROS水平；和用維生素E和/或MDL72，527預(yù)處理能逆轉(zhuǎn)/降低/阻止ROS水平升高。如圖1所示，前列腺細(xì)胞中多胺水平異乎尋常地高以及SSAT的高誘導(dǎo)可誘導(dǎo)ROS水平極大增加。利用艾飛麥特里克斯基因芯片陣列(AffymetrixGenechipArray)對未處理的LNCaP對照細(xì)胞和用1nM雄激素類似物R1881處理96小時(shí)的細(xì)胞的基因表達(dá)作DNA微陣列分析，該分析進(jìn)行兩次。在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中，與未處理的對照細(xì)胞相比，在R1881處理的LNCaP細(xì)胞中明確鑒定到過度表達(dá)的SSAT。在過度表達(dá)(比對照高10倍)的基因列表中，SSAT是唯一與ROS-產(chǎn)生途徑有關(guān)的酶。圖3顯示了采用DNA微陣列和qRT-PCR產(chǎn)生的數(shù)據(jù)。各數(shù)據(jù)點(diǎn)是以一式三份重復(fù)兩次定量測定6個(gè)相同處理的孔的讀數(shù)平均值。qRT-PCR數(shù)據(jù)顯示，與未處理的對照細(xì)胞相比，R1881處理的LNCaP細(xì)胞中SSAT基因表達(dá)增加了50倍。還應(yīng)注意，SSAT只在用1nMR1881(誘導(dǎo)氧化應(yīng)激)處理的細(xì)胞，而不在0.05nMR1881處理的細(xì)胞中過度表達(dá)，在后一情況下未觀察到氧化應(yīng)激增加。因此，可以假定雄激素誘導(dǎo)的SSAT基因表達(dá)是雄激素依賴性前列腺癌細(xì)胞中細(xì)胞ROS產(chǎn)生的重要原因。圖4顯示利用二乙基去甲精胺(BE-3-3-3)(研究)SSAT在細(xì)胞ROS產(chǎn)生中的作用。BE-3-3-3已知能在包括雄激素-依賴性LNCaP和雄激素-非依賴性DU-145前列腺癌細(xì)胞在內(nèi)的各種細(xì)胞系中誘導(dǎo)SSAT酶活性。用濃度遞增的BE-3-3-3處理DU-145細(xì)胞72小時(shí)。依據(jù)2’，7’-二氯熒光素二醋酸酯染料(“DCF”)氧化實(shí)驗(yàn)在96-孔板中檢測氧化應(yīng)激。各數(shù)據(jù)點(diǎn)是一式三份重復(fù)兩次定量測定6個(gè)相同處理的孔的平均值。數(shù)據(jù)證明BE-3-3-3(非細(xì)胞毒性劑量，＜1μM)能增加多胺氧化，提高細(xì)胞ROS水平，并且多胺氧化是前列腺細(xì)胞中產(chǎn)生氧化應(yīng)激的重要因素。圖5A-5E顯示用所述N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺化合物預(yù)處理LNCaP細(xì)胞(用和不用R1881處理)對多胺和乙?；喟匪降淖饔?。采用HPLC定量方法來定量測定用1nMR1881±25μMMDL72，527處理的LNCaP細(xì)胞中的多胺和乙?；喟匪?。各數(shù)據(jù)點(diǎn)是從三個(gè)獨(dú)立定量實(shí)驗(yàn)收集的細(xì)胞沉淀物的兩次測定的平均值。圖5A-5E顯示用R1881(終濃度為1nM，處理96小時(shí))處理能顯著增加腐胺和亞精胺水平，降低精胺水平，并提高N-乙酰基亞精胺和N-乙?；匪健D5A-5E支持R1881處理能增加SSATmRNA水平，同時(shí)增強(qiáng)SSAT酶活性這一結(jié)論。在R1881細(xì)胞中，用所述N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺化合物預(yù)處理幾乎完全阻斷腐胺和亞精胺水平的誘導(dǎo)增加(1nMR1881所致)，其導(dǎo)致N-乙?；?亞精胺和N-乙酰基亞精胺水平顯著增加，而不會(huì)明顯改變精胺水平。在用所述N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺化合物處理的細(xì)胞中觀察到N-乙?；?精胺水平略有增加。還觀察到用25μMMDL72，527處理的細(xì)胞高效且有效地阻斷APAO活性。觀察到乙?；喟匪綐O大增加提示給予MDL72，527在雄激素處理的細(xì)胞中對SSAT基因表達(dá)和/或酶活性沒有顯著影響。圖6所示的數(shù)據(jù)證明預(yù)先給予25μMMDL72，527預(yù)處理在LNCaP細(xì)胞中有效阻斷雄激素誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生。采用濃度遞增的R1881處理96小時(shí)(用和不用MDL72，527預(yù)處理)來誘導(dǎo)LNCaP細(xì)胞中的ROS水平。采用DCF氧化實(shí)驗(yàn)方法測定結(jié)果。各數(shù)據(jù)點(diǎn)是一式三份重復(fù)兩次定量測定6個(gè)孔的讀數(shù)平均值。用N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺化合物預(yù)處理細(xì)胞的ROS水平的有關(guān)數(shù)據(jù)根據(jù)單獨(dú)給予MDL72，527的作用標(biāo)準(zhǔn)化。圖6的數(shù)據(jù)提示用MDL72，527(≥1nM)預(yù)處理能有效阻斷R1881-誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生。數(shù)據(jù)還提示利用MDL72，527抑制多胺氧化酶能顯著降低雄激素-依賴性前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞ROS水平，MDL72，527是特異性阻斷雄激素依賴性人前列腺癌細(xì)胞中雄激素-誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生的有效抗氧化劑。圖7A-7D顯示給予N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺化合物能降低TRAMPxFVB動(dòng)物體內(nèi)前列腺組織中的氧化應(yīng)激。將采用氫化乙啶(HEt)染料氧化的方法標(biāo)準(zhǔn)化以觀察體內(nèi)前列腺腫瘤中的氧化應(yīng)激。HEt通過ROS(41)特異性氧化成2-羥基乙啶。2-羥基乙啶在488nm激發(fā)頻率和595nm發(fā)射頻率下發(fā)出熒光。可以在處死前至少1小時(shí)將HEt染料安全地注射入動(dòng)物。在處死前1小時(shí)給20周齡的TRAMPxFVB動(dòng)物注射HEt(8mg/kgBW)。處死后，收集前列腺，用福爾馬林固定并進(jìn)行石蠟包埋。將石蠟塊進(jìn)行顯微切片，使組織脫石蠟，利用熒光顯微鏡觀察并進(jìn)行數(shù)字圖像分析。圖像示于圖7A-7D。圖7A顯示只用運(yùn)載體處理的動(dòng)物的前列腺切片的相差顯微照片。圖7B顯示圖7A所示前列腺切片的熒光顯微照片。圖7C顯示用給予6次25mg/kgBWMDL72，527處理后兩周處死的動(dòng)物的前列腺切片的相差顯微照片。圖7D顯示圖7C所示前列腺切片的HEt熒光顯微照片。利用奧林巴斯BH-2熒光顯微鏡以20倍放大率獲得圖7A-7D所示照片，所述顯微鏡利用480nm激發(fā)/600nm發(fā)射濾光片并與索尼DSC-V3數(shù)碼照相機(jī)耦聯(lián)，所述照相機(jī)設(shè)置為F2.8和30秒曝光時(shí)間。在前列腺腔中普遍觀察到高熒光(HEt氧化所致)，特別是在開始形成前列腺上皮內(nèi)腫瘤(PIN)的侵入細(xì)胞的邊緣。相反，隨后的H&E染色證實(shí)在用MDL72，527處理的前列腺TRAMP小鼠組織中未檢測到染料氧化(參見圖7D)。圖7A-7D所示數(shù)據(jù)提示N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺化合物在體內(nèi)顯著抑制開始形成PIN的TRAMP小鼠前列腺腔內(nèi)的氧化應(yīng)激，從而進(jìn)一步提示多胺氧化是培養(yǎng)的人前列腺細(xì)胞和TRAMP小鼠體內(nèi)前列腺腔中氧化應(yīng)激的重要原因。DCFH氧化實(shí)驗(yàn).利用俄勒岡州尤金市分子探針公司(MolecularProbes，Inc.，Eugene，OR)的染料2′，7′-二氯熒光素二醋酸酯(DCF)檢驗(yàn)96-孔培養(yǎng)物或新鮮切除的動(dòng)物或人組織的完整細(xì)胞中ROS的估算值。用200μLKreb林格緩沖液(116mMNaCl，4.2mMKCl，2.5mMCaCl2，1.6mMNaH2PO4，1.2mMMgSO4，22mMNaHCO3和11mMD-葡萄糖)洗滌切除的組織或細(xì)胞培養(yǎng)物，預(yù)熱至37℃，37℃下在100μL含10μg/mL(終濃度)DCF染料的Kreb林格緩沖液中溫育45分鐘。利用加利福尼亞州福斯特城應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA)的CytoFluor2350TM平板掃描儀，采用485激發(fā)/530發(fā)射頻率掃描各96-孔培養(yǎng)板。掃描各組織樣品。氫化乙啶實(shí)驗(yàn).先將氫化乙啶染料溶解于DMSO(100mg/ml)中，用等滲鹽水稀釋至1mg/ml，再注射?？稍谔幩狼?小時(shí)經(jīng)尾靜脈將該染料靜脈內(nèi)注射入小鼠(體內(nèi))，或者可用等滲PBS洗滌新鮮切除的人和動(dòng)物組織并浸泡在37℃預(yù)熱的Kreb林格緩沖液配制的8mg/ml染料溶液中60分鐘(離體)，再進(jìn)行加工。對于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，對動(dòng)物先施以安樂死，放血，再收集腫瘤和其它組織。將處理后的組織包埋在石蠟塊中。將石蠟塊的顯微切片固定在載玻片上，以488nm激發(fā)/595nm發(fā)射頻率定量測定熒光。DNA實(shí)驗(yàn).將50uL含Hoechst33342染料的Kreb林格緩沖液(40ug/mL)加入各孔孵育45分鐘)，并加入所有組織孵育60分鐘，然后檢測熒光，所述染料含有以360nm激發(fā)/460nm發(fā)射測定DNA熒光。所有DCF或氫化乙啶熒光根據(jù)DNA熒光標(biāo)準(zhǔn)化，以適當(dāng)定量測定氧化應(yīng)激。BD生物圖像儀.利用加利福尼亞州拉格那希爾市BD生物科學(xué)公司(BDBiosciences，LagunaHills，CA)的BD路徑生物圖像儀自動(dòng)、共聚焦、實(shí)時(shí)、單細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和終點(diǎn)成像系統(tǒng)(BDPathwayBioimagerautomated，confocal，real-time，singlecellkineticandendpointimagingsystem)定量測定所有的熒光讀數(shù)。圖8所示數(shù)據(jù)提示給予N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺化合物增加TRAMP小鼠的總存活率(“OS”)。檢測在20-22周齡自發(fā)形成前列腺腫瘤的TRAMP小鼠，這些小鼠大多數(shù)在30-32周齡死于腫瘤負(fù)荷。還檢測了在12-14周齡開始形成前列腺腫瘤的TRAMPxFVB小鼠，這些小鼠大多數(shù)在20-22周齡死于腫瘤負(fù)荷(數(shù)據(jù)示于圖9-11)。如圖9所示，MDL72，527所用的劑量是25mg/kgBW，該劑量耐受良好(即，未觀察到毒性、行為異?；蝮w重降低等明顯跡象)。完全抑制小鼠乙酰基多胺氧化酶需要20mg/kgBW以上的劑量。在TRAMP小鼠研究中，在22周時(shí)給予N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺化合物，其中若干小鼠開始顯示有可觸知的腫瘤。采用每兩周一次的方案，以25mg/kgBW給小鼠(每組5只)腹膜內(nèi)注射3次MDL72，527。OS示于圖8，可以看出與用運(yùn)載體治療的小鼠相比，OS有明顯提高。在利用TRAMPxFVB小鼠的研究中，MDL72，527-治療組中有8只小鼠，運(yùn)載體-治療組中有8只小鼠。由于這些小鼠開始產(chǎn)生前列腺腫瘤的周齡早于TRAMP小鼠，故而在8周齡開始治療。治療包括采用每兩周一次的給藥方案，以25mg/kgBW腹膜內(nèi)注射6次MDL72，527。結(jié)果示于圖11，其提示與用運(yùn)載體對照相比，用MDL72，527治療的小鼠的OS顯著提高。MDL72，527-治療的TRAMPxFVB小鼠有60％以上在治療結(jié)束后存活至少8周，并在運(yùn)載體治療的對照小鼠組全部死亡后存活了至少6周。圖8和9的數(shù)據(jù)顯示TRAMP小鼠的不同品系可再現(xiàn)地顯示與運(yùn)載體治療的小鼠相比，MDL72，527-治療的小鼠有60％以上獲得存活益處。圖10所示數(shù)據(jù)提示給予N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺化合物延遲TRAMPxFVB小鼠的腫瘤產(chǎn)生時(shí)間。每周兩次監(jiān)測可觸知的前列腺腫瘤產(chǎn)生的跡象。MDL72，527-治療(以25mg/kgBW，每兩周給予一次)停止后第11周(29周齡小鼠)，40％以上的治療小鼠的前列腺或任何其它身體部位沒有可觸知腫瘤的跡象。圖1-18顯示的數(shù)據(jù)證明N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺化合物有效阻斷人前列腺癌細(xì)胞中和TRAMP小鼠的前列腺中雄激素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。數(shù)據(jù)還顯示MDL72，527延遲TRAMP小鼠的腫瘤產(chǎn)生時(shí)間，從而導(dǎo)致OS統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著地提高。本發(fā)明的另一方面是改進(jìn)N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺的合成。MDL72，527是哺乳動(dòng)物多胺氧化酶的強(qiáng)效不可逆抑制劑，其抗豬肝多胺氧化酶的Ki為0.9mM。已知的MDL合成方法包括將N-Boc-保護(hù)的炔丙基胺轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的(雙)丙二烯，然后將2當(dāng)量的受保護(hù)丙二烯與1，4-二碘丁烷偶聯(lián)。使得到的N-Boc-保護(hù)的(雙)丙二烯脫保護(hù)產(chǎn)生MDL72，527。已知合成方法的問題在于丙二烯部分的親電性質(zhì)會(huì)在二碘化物的烷化期間產(chǎn)生多種副產(chǎn)物?？偖a(chǎn)率偏低。本發(fā)明制備N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺的方法的產(chǎn)率高。本發(fā)明方法還避免產(chǎn)生不良的副產(chǎn)物。本發(fā)明方法示于圖19。將市售的腐胺1作(雙)-N-Boc保護(hù)以產(chǎn)生化合物2(85.2％產(chǎn)率)。在氫化鈉存在下，用化合物2烷化2當(dāng)量的炔丙基溴以產(chǎn)生化合物3(59.5％產(chǎn)率)。利用1∶5的二甲基甲酰胺(“DMF”)和四氫呋喃(“THF”)的混合物可進(jìn)一步提高該轉(zhuǎn)化率。在CuBr、甲醛和二異丙胺存在下，將化合物3中的炔丙基轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的丙二烯，從而獲得中間體化合物4(38.7％產(chǎn)率)。在HCl存在下使化合物4脫保護(hù)從而獲得所需的靶分子MDL72，527(白色固體，65.8％產(chǎn)率)。標(biāo)準(zhǔn)化定量測定細(xì)胞提取物以及人和動(dòng)物血清中的MDL、天然多胺及其乙?；苌锏腍PLC方法。因此，可以測定MDL72，527的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)特性。所述N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺化合物的鹽可以是藥學(xué)上合適的(即，藥學(xué)上可接受的)鹽，包括但不限于通過將MDL化合物的溶液與藥學(xué)上可接受的酸的溶液混合形成的酸加成鹽。藥學(xué)上可接受的酸可以是鹽酸、甲磺酸、延胡索酸鹽、馬來酸、琥珀酸、乙酸、苯甲酸、草酸、檸檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸。本領(lǐng)域熟知各種藥學(xué)上可接受的鹽，這些鹽可與N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺一起使用，例如以下文獻(xiàn)所述的鹽，這些文獻(xiàn)通過引用的方式納入本文BergeSM等，“PharmaceuticalSalts(藥物鹽)”，J.Pharm.Sci.661-19(1977)和HaynesDA等，“OccurrenceofpharmaceuticallyacceptableanionsandcationsintheCambridgeStructuralDatabase(劍橋結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中藥學(xué)上可接受的陰離子和陽離子的出現(xiàn))”，J.Pharm.Sci.942111-2120(2005)。例如，F(xiàn)DA-批準(zhǔn)的可上市銷售的鹽清單包括乙酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、碳酸氫鹽、酒石酸氫鹽、溴化物、乙二胺四乙酸鈣鹽、樟腦磺酸鹽、碳酸鹽、氯化物、檸檬酸鹽、二鹽酸鹽、乙二胺四乙酸鹽、乙二磺酸鹽、月桂酸鹽、乙磺酸鹽、延胡索酸鹽、葡庚糖酸鹽、葡糖酸鹽、谷氨酸鹽、乙醇酰對氨苯基砷酸鹽(glycollylarsanilate)、己基間苯二酚鹽、海巴明鹽、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、羥萘甲酸鹽、碘化物、羥乙基磺酸鹽、乳酸鹽、乳糖醛酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽、甲基溴化物、甲硝酸鹽、甲硫酸鹽、粘酸鹽、萘磺酸鹽、硝酸鹽(mitrate)、雙氫萘酸鹽、泛酸鹽、磷酸鹽、二磷酸鹽、聚半乳糖醛酸鹽、水楊酸鹽、硬脂酸鹽、堿式醋酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、鞣酸鹽、酒石酸鹽、茶氯酸鹽或三乙基碘化物。可將N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺化合物(或其鹽或溶劑化物)作為口服劑型給藥，口服劑型包括例如未包衣的片劑、包衣片劑、硬或軟明膠膠囊、粉末劑、膠囊、彈丸劑、溶液劑、混懸劑、酏劑或乳劑?？筛鶕?jù)某種給藥方案給予口服劑型以實(shí)現(xiàn)合適的療效?？诜┬瓦€可以限定為含藥學(xué)活性成分(API)和各種藥學(xué)上可接受/合適的載體(水性、非水性溶液、懸浮液或乳液)、賦形劑、溶劑、添加劑、運(yùn)載體、穩(wěn)定劑、惰性稀釋劑、粘合劑(例如，阿拉伯膠、玉米淀粉、明膠)、崩解劑(例如，玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、海藻酸)、潤滑劑(例如，硬脂酸、硬脂酸鎂)等的藥物組合物。例如，藥學(xué)上可接受的水性載體包括但不限于樹膠、淀粉、糖、乳糖、蔗糖、纖維素物質(zhì)、水、醇/水混合物、磷酸鹽緩沖液(0.01-0.1M，或更優(yōu)選0.05M)和0.9％鹽水。非水性溶劑包括但不限于丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如，橄欖油、油酸乙酯等)。還可使用各種藥學(xué)上可接受的、USP批準(zhǔn)的賦形劑，包括但不限于白蛋白、明膠、去垢劑(例如，吐溫20、吐溫80、普流羅尼克F68、膽酸鹽等)、增溶劑(例如，甘油、聚乙二醇等)、抗氧化劑(例如，抗壞血酸、偏亞硫酸氫鈉等)、防腐劑(例如，硫柳汞、芐醇、對羥基苯甲酸酯等)、脂肪酸、蠟、泊洛沙姆、泊洛沙胺(poloxamines)、填充劑或張力修飾劑(例如，乳糖、甘露糖醇等)、用于共價(jià)連接或與金屬離子絡(luò)合的聚合物、聚乳酸、聚乙醇酸、水凝膠劑、脂質(zhì)體、微乳劑、膠束劑、單層劑(milamellaragent)、多層囊泡、血影劑(erythrocyteghostagent)或球形體劑(spheroplastagent)。權(quán)利要求1.一種降低男性前列腺中活性氧中間體濃度的方法，該方法包括給予治療量的N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺或其藥學(xué)上合適的鹽或溶劑化物。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述活性氧中間體是選自下組的一種或多種物質(zhì)過氧化氫、超氧化物、氫氧自由基和氧化氮。3.一種預(yù)防性治療男性前列腺癌的方法，該方法包括給予治療量的N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺或其藥學(xué)上合適的鹽或溶劑化物。4.一種治療男性前列腺癌的方法，該方法包括給予治療量的N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺或其藥學(xué)上合適的鹽或溶劑化物。5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述鹽是二鹽酸鹽。6.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述治療量是約1-100mg/kgBW，所述治療量在每兩周一次到每日一次的范圍內(nèi)給予。7.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述治療量是約10-40mg/kgBW，所述治療量每周給予一次。8.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述治療量是約25mg/kgBW，所述治療量每兩周給予一次。9.一種口服藥物組合物，該組合物包含治療有效量的活性藥物成分，其含有N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺或其藥學(xué)上合適的鹽或溶劑化物，和一種或多種選自下組的藥學(xué)上合適的物質(zhì)載體、賦形劑、溶劑、添加劑、運(yùn)載體、穩(wěn)定劑、惰性稀釋劑、粘合劑、崩解劑或粘合劑。10.如權(quán)利要求9所述的藥物組合物，所述組合物的形式選自未包衣的片劑、包衣片劑、硬明膠膠囊、軟明膠膠囊、粉末劑、膠囊、彈丸劑、溶液劑、混懸劑、酏劑和乳劑。11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括通過離體檢測氧化的2′，7′-二氯二氫熒光素二醋酸酯熒光DNA熒光之比來測定降低的活性氧中間體濃度。12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括通過離體檢測氧化的氫化乙啶熒光DNA熒光之比來測定降低的活性氧中間體濃度。13.一種抑制男性前列腺中乙?；喟费趸傅姆椒?，所述方法包括給予治療量的N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺或其鹽或溶劑化物。14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，與未治療的男性相比，所述乙?；喟费趸副灰种浦辽?0％。15.一種測定人組織中氧化應(yīng)激的方法，所述方法包括離體檢測氧化的2′，7′-二氯二氫熒光素二醋酸酯熒光DNA熒光之比。16.一種測定人組織中氧化應(yīng)激的方法，所述方法包括離體檢測氧化的氫化乙啶熒光DNA熒光之比。17.如權(quán)利要求15或16所述的方法，其特征在于，所述人組織是獲自腫瘤生物活檢樣品的男性前列腺組織。18.如權(quán)利要求15或16所述的方法，其特征在于，所述人組織取自除前列腺以外身體部位的腫瘤生物活檢樣品。19.一種治療雄犬的前列腺癌的方法，所述方法包括將治療量的N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺或其藥學(xué)上合適的鹽或溶劑化物給予該犬。20.一種降低人組織中活性氧中間體濃度的方法，該方法包括將治療量的N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺或其藥學(xué)上合適的鹽或溶劑化物給予該人。21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述活性氧中間體是選自下組的一種或多種物質(zhì)過氧化氫、超氧化物、氫氧自由基和氧化氮。22.一種離體或體內(nèi)檢測哺乳動(dòng)物細(xì)胞、器官或生物活檢物中活性氧中間體濃度的試劑盒，所述試劑盒裝有包含氫化乙啶染料的第一組分，和包含活細(xì)胞DNA染色劑的第二組分。23.一種利用權(quán)利要求22所述試劑盒離體檢測源自哺乳動(dòng)物細(xì)胞、器官或生物活檢樣品的組織中活性氧中間體濃度的方法，所述方法包括用所述氫化乙啶染料染色第一組織以產(chǎn)生第一個(gè)熒光單位數(shù)值，用所述活細(xì)胞DNA染色劑染色第二組織以產(chǎn)生第二個(gè)熒光單位數(shù)值，和按照所述第二個(gè)熒光單位數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)化所述第一個(gè)熒光單位數(shù)值，從而定量測定活性氧中間體的濃度。24.如權(quán)利要求1-4、11-14和19-21中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述鹽選自乙酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、碳酸氫鹽、酒石酸氫鹽、溴化物、乙二胺四乙酸鈣鹽、樟腦磺酸鹽、碳酸鹽、氯化物、檸檬酸鹽、二鹽酸鹽、乙二胺四乙酸鹽、乙二磺酸鹽、月桂酸鹽、乙磺酸鹽、延胡索酸鹽、葡庚糖酸鹽、葡糖酸鹽、谷氨酸鹽、乙醇酰對氨苯基砷酸鹽、己基間苯二酚鹽、海巴明鹽、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、羥萘甲酸鹽、碘化物、羥乙基磺酸鹽、乳酸鹽、乳糖醛酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽、甲基溴化物、甲硝酸鹽、甲硫酸鹽、粘酸鹽、萘磺酸鹽、硝酸鹽(mitrate)、雙氫萘酸鹽、泛酸鹽、磷酸鹽、二磷酸鹽、聚半乳糖醛酸鹽、水楊酸鹽、硬脂酸鹽、堿式醋酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、鞣酸鹽、酒石酸鹽、茶氯酸鹽或三乙基碘化物。25.如權(quán)利要求9或10所述的口服藥物組合物，其特征在于，所述鹽選自乙酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、碳酸氫鹽、酒石酸氫鹽、溴化物、乙二胺四乙酸鈣鹽、樟腦磺酸鹽、碳酸鹽、氯化物、檸檬酸鹽、二鹽酸鹽、乙二胺四乙酸鹽、乙二磺酸鹽、月桂酸鹽、乙磺酸鹽、延胡索酸鹽、葡庚糖酸鹽、葡糖酸鹽、谷氨酸鹽、乙醇酰對氨苯基砷酸鹽、己基間苯二酚鹽、海巴明鹽、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、羥萘甲酸鹽、碘化物、羥乙基磺酸鹽、乳酸鹽、乳糖醛酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽、甲基溴化物、甲硝酸鹽、甲硫酸鹽、粘酸鹽、萘磺酸鹽、硝酸鹽(mitrate)、雙氫萘酸鹽、泛酸鹽、磷酸鹽、二磷酸鹽、聚半乳糖醛酸鹽、水楊酸鹽、硬脂酸鹽、堿式醋酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、鞣酸鹽、酒石酸鹽、茶氯酸鹽或三乙基碘化物。26.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述治療量是與未治療對照男性中的活性氧中間體的濃度相比，足以將前列腺中一種或多種活性氧中間體的濃度降低至少50％的用量。27.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述治療量是與以前診斷出或未診斷出前列腺癌的未治療男性對照相比，足以防止或降低前列腺癌發(fā)生和/或復(fù)發(fā)的用量。28.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述治療量是足以終止或降低前列腺癌的進(jìn)展、發(fā)病率和/或死亡率的用量。29.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述治療量是與未治療人組織中的活性氧中間體的濃度相比，足以將前列腺中一種或多種活性氧中間體的濃度降低至少50％的用量。30.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括通過離體檢測氧化的氫化乙啶熒光∶DNA熒光之比來測定降低的活性氧中間體濃度。31.一種測定男性前列腺組織中氧化應(yīng)激的方法，包括檢測體內(nèi)氧化的2′，7′-二氯二氫熒光素二醋酸酯熒光∶DNA熒光之比。32.如權(quán)利要求22所述的試劑盒，其特征在于，所述活細(xì)胞DNA染色劑包含33.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述活細(xì)胞DNA包含34.一種離體或體內(nèi)檢測哺乳動(dòng)物細(xì)胞、器官或生物活檢物中活性氧中間體濃度的試劑盒，所述試劑盒裝有包含2′，7′-二氯二氫熒光素二醋酸酯染料的第一組分，和包含活細(xì)胞DNA染色劑的第二組分。35.如權(quán)利要求34所述的試劑盒，其特征在于，所述活細(xì)胞DNA包含36.一種利用權(quán)利要求34所述試劑盒離體檢測源自哺乳動(dòng)物細(xì)胞、器官或生物活檢樣品的組織中活性氧中間體濃度的方法，所述方法包括用所述2′，7′-二氯二氫熒光素二醋酸酯染料染色第一組織以產(chǎn)生第一個(gè)熒光單位數(shù)值，用所述活細(xì)胞DNA染色劑染色第二組織以產(chǎn)生第二個(gè)熒光單位數(shù)值，和按照所述第二個(gè)熒光單位數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)化所述第一個(gè)熒光單位數(shù)值，從而定量測定活性氧中間體的濃度。37.如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述活細(xì)胞DNA包含全文摘要本發(fā)明提供了N1，N4-雙(丁-1，3-二烯基)丁-1，4-二胺二鹽酸鹽(也稱為MDL72,527和N，N′-二-2，3-丁二烯基-1，4-丁二胺二鹽酸鹽)或其鹽或溶劑化物，其作為抗氧化劑的應(yīng)用，其在預(yù)防和/或治療男性前列腺癌中的應(yīng)用，及其在降低人前列腺或任何其它身體組織中活性氧中間體濃度中的應(yīng)用，和制備該化合物的方法。其它方法包括抑制人前列腺組織或其它人身體組織中的乙酰基多胺氧化酶，包括將治療量的N，N′-雙(2，3-丁二烯基)-1，4-丁二胺或其鹽或溶劑化物給予該人，和測定人前列腺組織或其他人體或動(dòng)物身體組織中氧化應(yīng)激的方法，包括離體或體內(nèi)檢測氧化的2′，7′-二氯二氫熒光素二醋酸酯熒光:DNA熒光和氫化乙啶染料熒光之比。文檔編號(hào)C07C11/09GK101677975SQ200780021323公開日2010年3月24日申請日期2007年5月3日優(yōu)先權(quán)日2006年5月3日發(fā)明者H·S·巴蘇,D·R·丘奇,P·M·沃斯特,G·維爾丁申請人:威斯康星校友研究基金會(huì),韋恩州立大學(xué)