專利名稱：：來自絲光綠蠅的胰凝乳蛋白酶及其在治療傷口中的用途的制作方法來自絲光綠蠅的胰凝乳蛋白酶及其在治療傷口中的用途本發(fā)明涉及一種幼蟲酶。更具體地說，本發(fā)明涉及一種或多種可從絲光綠蠅(丄w"7/a化nc^a)獲得的幼蟲酶，所述酶可用于組織再生與傷口愈合。幼蟲侵?jǐn)_對某些傷口的有益效果已在很多年前就被觀察到了。然而，直到對于感染的抗生素抗性菌株的流行成為醫(yī)學(xué)尤其是傷口愈合領(lǐng)域中的問題之前，對該過程涉及的機(jī)理并沒有進(jìn)行進(jìn)一步的研究。之前的研究已經(jīng)看到幼蟲酶作為傳統(tǒng)抗生素的添加劑或輔佐劑(adjuvants)在創(chuàng)口清創(chuàng)中(從傷口去除壞死的、感染的或外來的物質(zhì))，在控制感染中(防止或治療感染)以及最近的在促進(jìn)組織再生從而使傷口處的新組織生長并閉合傷口(愈合)中的作用。所使用的幼蟲酶可以通過清洗幼蟲，去除幼蟲體表的任何排泄或分泌產(chǎn)物，從整個幼蟲的血淋巴或均漿中獲得，這之前進(jìn)行或不進(jìn)行幼蟲的清洗。之前的研究還調(diào)查了在無菌或非無菌狀態(tài)下培養(yǎng)幼蟲的效果，使用均漿、血淋巴或排泄/分泌物的效果，以及幼蟲年齡的效果(新孵化或一齡或二齡)。發(fā)現(xiàn)所有這些因素都能影響獲取自幼蟲的產(chǎn)品的性質(zhì)或活性。本發(fā)明的發(fā)明者最近關(guān)注于幼蟲產(chǎn)物，特別是為幼蟲產(chǎn)物組成部分的酶的傷口愈合特性，所述酶通過促進(jìn)組織生長而促進(jìn)傷口閉合。令人驚訝的是，本發(fā)明的發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在絲光綠蠅幼蟲的排泄/分泌物(表面清洗物)中發(fā)現(xiàn)的一種或多種胰凝乳蛋白酶在組織形成中起關(guān)鍵作用這樣的酶經(jīng)常與組織破裂(breakdown)相聯(lián)系。相應(yīng)地，本發(fā)明提供一種源于昆蟲幼蟲的分離的胰凝乳蛋白酶或其類似物或其合成形式。有利地，本發(fā)明的胰凝乳蛋白酶已經(jīng)表現(xiàn)為發(fā)揮雙重且矛盾的性質(zhì)，其不光在傷口清創(chuàng)中(去除壞死的、感染的或外來的物質(zhì))有作用，這是蛋白酶意料之中的性質(zhì)；還在成纖維細(xì)胞粘連(adhesion)(即組織生長)中有作用，這是蛋白酶完全出乎意料的性質(zhì)。本發(fā)明的胰凝乳蛋白酶具有選擇性活性；其去除或降解某些組織，例如傷口焦痂，但并不去除或降解所有組織，例如健康的或新的組織。有理由預(yù)料這種或每種蛋白酶將降解或去除組織而不管其類型，例如發(fā)生于由銅綠蠅引起的麗蠅皮膚蠅蛆病的情況，其中壞死的和健康的組織被降解。同一種酶的清創(chuàng)和促進(jìn)細(xì)胞生長的雙重特性是不常見的而且對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是驚人的，因為這些特性理應(yīng)是相互矛盾的。本文使用的術(shù)語"焦痂"意在定義任何死亡的組織，其從皮膚的表面脫落，包括在燒傷、壞疽、潰瘍(尤其是壓力性潰瘍)、感染(尤其是真菌感染)、晚期暴露于炭疽或任何壞死的組織之后。昆蟲優(yōu)選的是絲光纟錄蠅(丄wcz/za^ncato)。本發(fā)明的胰凝乳蛋白酶優(yōu)選地獲取于或可獲取于昆蟲幼蟲的排泄/分泌物。然而，相同的成分可能會存在于血淋巴或均漿中，并可以從這些來源中獲取。胰凝乳蛋白酶可以例如通過清洗幼蟲并收集清洗介質(zhì)來獲得。本發(fā)明的發(fā)明者已經(jīng)在之前發(fā)現(xiàn)昆蟲幼蟲的排泄/分泌物(ES)含有組成型表達(dá)的和可誘導(dǎo)的成分，包括酶、激素等。出于這個理由，優(yōu)選的幼蟲的生長狀態(tài)保持為恒定。在本發(fā)明的最優(yōu)選的實施方案中，收集和使用的是生長于無菌狀態(tài)下的新孵化幼蟲的排泄/分泌物。優(yōu)選地，胰凝乳蛋白酶具有如圖1、圖2或圖13中所示的序列，或者其保留天然的或完整的胰凝乳蛋白酶活性的生物活性肽片段，其活性位點(diǎn)在圖1、2和13中一皮明確。優(yōu)選地，該片^R與圖1、2和13中所確定活性位點(diǎn)或者與編碼胰凝乳蛋白酶肽片段的DNA具有高度同源性，例如活性位點(diǎn)同源性應(yīng)至少為90%，優(yōu)選在95%以上，更優(yōu)選具有99%的同源性。理想地，片段應(yīng)與肽活性位點(diǎn)或與編碼胰凝乳蛋白酶肽片l殳的DNA—致。相關(guān)DNA序列示于圖1、2和12中。這些序列的胰凝乳蛋白酶已經(jīng)表現(xiàn)出具有組織再生性質(zhì)和清創(chuàng)活性，但是不降解或消化健康的或活的組織，考慮到其與源自麗蠅皮膚蠅蛆病(一種組織退化過程)的病因體銅綠蠅的胰凝乳蛋白酶(其即使對健康的或活組織也具有眾所周知的組織降解性質(zhì))具有高度同源性，這尤為令人驚奇。這種同源性在圖1和2中進(jìn)行了展示。本發(fā)明的發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ES的組織重塑和再生性質(zhì)在與抑制胰蛋白酶樣和胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶的絲氨酸蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)—起培養(yǎng)后就消失或被抑制了，但是在與僅抑制胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶的4-(脒基苯基)曱烷磺酰氟(APMSF)—起培養(yǎng)后則未消失或被抑制。因此，可總結(jié)出，ES中負(fù)責(zé)胞外基質(zhì)重塑或組織重塑和組織再生活性的重要的甚至核心的成分是胰凝乳蛋白酶或胰凝乳蛋白酶樣酶。這通過在下面將要說明的測序得到了證實，其中測定了具有雙重性質(zhì)的胰凝乳蛋白酶的序列。如實施方案中所示，ES的組織再生性質(zhì)當(dāng)該胰凝乳蛋白酶被去除時消失了，而該胰凝乳蛋白酶清除傷口焦痂，因此相同的胰凝乳蛋白酶具有組織再生和清除的雙重性質(zhì)。本發(fā)明的胰凝乳蛋白酶不僅通過清創(chuàng)或改進(jìn)清創(chuàng)，還通過促進(jìn)成纖維細(xì)胞遷移，基質(zhì)重塑以及改變成纖維細(xì)胞形態(tài)而在治療傷口促進(jìn)其愈合方面有用途。這些相反的效果(蛋白水解和蛋白生成)存在于相同酶中的事實對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是令人驚訝的，且從現(xiàn)有技術(shù)中無法預(yù)見，尤其是考慮到其與來自會引起麗蠅皮膚蠅蛆病(這種病會同時破壞壞死的和活組織)的絲光綠蠅的胰凝乳蛋白酶具有高度同源性，。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了胰凝乳蛋白酶在用于治愈傷口的組合物中的用途。本發(fā)明還提供了胰凝乳蛋白酶在制備用于治愈傷口的藥物中的用途，以及4吏用胰凝乳蛋白酶治療傷口的方法。優(yōu)選地，在組合物或藥物中使用的胰凝乳蛋白酶具有圖1、圖2或圖13中的序列，或由圖1、2或12中的DNA序列編碼?？蛇x地，胰凝乳蛋白酶的活性片段可以用于這樣的組合物或藥物。胰凝乳蛋白酶，或其片段，可以是天然的或合成的。其優(yōu)選地獲取自絲光綠蠅的幼蟲。本發(fā)明的傷口在下面定義，可以;故感染或未感染。優(yōu)選地，傷口是慢性的傷口，并可對傳統(tǒng)治療具有抗性。傷口可以通過促進(jìn)成纖維細(xì)胞的遷移，通過促進(jìn)基質(zhì)重塑或通過改變成纖維細(xì)胞形態(tài)來進(jìn)行治療。優(yōu)選地，傷口通過本發(fā)明的胰凝乳蛋白酶進(jìn)行清創(chuàng)。另一方面，本發(fā)明還提供一種傷口敷料(dressing)，該敷料包含本發(fā)明前面部分所說的胰凝乳蛋白酶。相應(yīng)地，本發(fā)明還包括一種治療傷口的方法，該方法包括在需要治療的傷口上應(yīng)用上述敷料的步驟。本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)將ES與大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)—起孵育，去除了ES增強(qiáng)成纖維細(xì)胞遷移的能力以及其降解胞外基質(zhì)蛋白的能力。相似地，當(dāng)胰凝乳蛋白酶的活性被去除時，雖然如下所述的，6某些胰蛋白酶的活性保留了下來，但其蛋白水解(清創(chuàng))活性改變了。對被STI去除的蛋白進(jìn)行了測序。發(fā)現(xiàn)這些序列是胰凝乳蛋白酶或胰凝乳蛋白酶樣序列，正如圖1、2和13所示的，并且證實了該酶和其同源體與本文所述的活性有關(guān)。相應(yīng)地，本發(fā)明還提供具有如圖1、圖2或圖13中所示序列的胰凝乳蛋白酶。本發(fā)明還提供編碼如圖1、2和13所示的胰凝乳蛋白酶的DNA序列，以及顯示在pBac-3載體多克隆位點(diǎn)DNA序列中絲光綠蠅胰凝乳蛋白酶原序列的DNA序列(圖12)。編碼胰凝乳蛋白酶活性位點(diǎn)(見圖13)的DNA片段也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。本文所使用的術(shù)語"傷口"意在定義任何對皮膚、表皮或結(jié)締組織的損害，不管是損傷或是疾病造成的，包括但不僅限于，割傷、刺傷、手術(shù)切口、潰瘍、壓瘡、灼傷(包括由于熱、冷凍、化學(xué)品、電以及輻射引起的灼傷)、真皮擦傷或擊傷、骨髓炎以及整形外科傷口。傷口可以是被感染的。另外，傷口可以是慢性的或急性的。慢性傷口源自各種狀況并且包含糖尿病腳部潰瘍，靜脈腿部潰瘍，感染的外科切口，整形手術(shù)的傷口，骨髓炎和壓瘡。本發(fā)明的胰凝乳蛋白酶可以是天然的或可以是例如圖13所示的天然酶的合成形式。這些酶的合成形式可以/人給出的序列用傳統(tǒng)方法，例如使用重組質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)或使用任何已知的肽合成方法或者如下述例子中所示的裝置。酶的活性片段，即酶保留酶功能的片段，特別是那些包含圖13中確定的活性位點(diǎn)的，作為編碼它們的DNA片l殳也^皮認(rèn)為是本發(fā)明的一部分。本發(fā)明的胰凝乳蛋白酶可以以提取物使用，其可以是未加工的或提純的或其可以與包含例如溶劑、稀釋劑、緩沖劑、媒介物、穩(wěn)定劑、保濕劑、賦形劑、結(jié)合劑、輔佐劑、防腐劑、抗結(jié)塊劑、酸化劑、膠凝劑、乳化劑、著色劑、芳香劑以及其類似物的，特別是那些用于局部性配方的，傳統(tǒng)添加劑的藥物組合物結(jié)合。在一優(yōu)選實施方案中，胰凝乳蛋白酶將局部性地使用，但并不意味著口服或其它注射給藥模式的施用就被排除在本發(fā)明的范圍外。因此，在優(yōu)選的施用模式中，局部施用，本發(fā)明的胰凝乳蛋白酶可以以沖洗液、懸浮液、清潔劑、乳膏、乳液、凝膠、軟膏、油膏、藥膏、粉劑或固體的或液體的運(yùn)載載體?？蛇x的，胰凝乳蛋白酶可以與適合的能將胰凝乳蛋白酶以緩釋或控制釋放的方式運(yùn)送到傷口的物質(zhì)結(jié)合或制成膠嚢。這種合適的材料的例子之一是聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)顆粒，其可以定制為以一種控制的釋放方式釋放肽。最優(yōu)選地，胰凝乳蛋白酶可以與敷料相結(jié)合應(yīng)用于傷口。這樣的敷料的例子包括結(jié)合了含有胰凝乳蛋白酶的緩釋水狀膠體顆?；蚝幸饶榈鞍酌傅暮＞d的階段性的或分層敷料，可選的用傳統(tǒng)的敷料覆蓋，這些例子的描述見Smithetal2006。目前使用的水狀膠體敷料的類型，例如以"Granuflex"為商標(biāo)出售的，可以進(jìn)行改進(jìn)從而將胰凝乳蛋白酶釋放到傷口處。本發(fā)明的胰凝乳蛋白酶可以是未加工的或可以是使用傳統(tǒng)蛋白提純方法提純過的。胰凝乳蛋白酶可以通過例如COOH的酰胺化，使用非編碼的不規(guī)則氨基酸替換以及/或者用電子等排物(isotere)進(jìn)行CO-NH酰胺鍵替換來保護(hù)其遭受氨基肽酶或其他酶活性。另外，胰凝乳蛋白酶，尤其是合成的或其它初生的胰凝乳蛋白酶可以被羥化、糖基化、硫酸鹽化、磷酸化，或其他二級或三級過程，尤其當(dāng)這樣的二級或三級過程賦予了酶穩(wěn)定性或改進(jìn)了可溶性或其他期望的特性。尤其優(yōu)選的是，酶的合成形式經(jīng)過二級或三級過程而達(dá)到接近天然酶的構(gòu)象，除非這樣做會降低酶活性。另外，本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)昆蟲幼蟲的排泄/分泌產(chǎn)物，尤其是絲光綠蠅的，能用作組織培養(yǎng)或組織基質(zhì)塑造來維持細(xì)胞。也就是說，絲光綠蠅的排泄/分泌產(chǎn)物可以代替例如牛血清的血清使用，來維持細(xì)胞的生存能力。當(dāng)這樣的細(xì)胞將被移植或嫁接到傷口上或中時由于其消除了潛在的感染源這特別重要，例如與克雅病(CJD)有關(guān)的朊蛋白，或通過去除使用血清的需要而消除了疾病傳遞。因此本發(fā)明還提供了一種用于維持活細(xì)胞的媒介，該媒介包含昆蟲幼蟲的排泄/分泌產(chǎn)物。優(yōu)選地，該幼蟲是絲光綠蠅的。代表性地，絲光綠蠅幼蟲或絲光綠蠅蛆;故應(yīng)用到傳統(tǒng)治療失敗的慢性傷口。臨床觀察證明，蛆移除了壞死組織(清創(chuàng))，促進(jìn)消毒以及加速肉芽組織形成(Shermanetal,2000;Wollinaetal，2002)。為了闡明在這些效果之后的機(jī)理，本發(fā)明的發(fā)明者調(diào)查了存在于蛆分泌物和/或排泄物(ES)(這樣稱呼是因為蛆持續(xù)滲出的物質(zhì)可能是源自分泌物和/或排泄物的)中的酶活性正如一單獨(dú)研究所展示的，被釋放進(jìn)傷口(Schmidtchenetal,2003)。絲氨酸蛋白酶，金屬蛋白酶以及天冬酰胺蛋白酶活性的證據(jù)被發(fā)現(xiàn)(Chambersetal,2003)。另外，ES中存在的絲氨酸蛋白酶活性表現(xiàn)出降解多種常見胞外基質(zhì)(ECM)成分(Chambersetal,2003)。外基質(zhì)(ECM)成分之間相互作用的效果(Horobinetal,2003,2005),其中它們在組織形成方面起了關(guān)鍵作用(Eckesetal,2000)。通過與細(xì)胞膜受體結(jié)合(GiancottiandRuoslahti,1999)，ECM為接觸引導(dǎo)提供了腳手架，控制成纖維細(xì)胞粘連以及指導(dǎo)細(xì)胞遷移(Clark，1996;GreilingandClark,1997)。源自包括成纖維細(xì)胞的許多源的蛋白酶，調(diào)節(jié)這樣的相互作用。這可以通過直接活化細(xì)胞表面受體影響成纖維細(xì)胞增殖(Abeetal,2000;DeryandB讓ett,1999)和血管再生(Blairetal,1997)或通過間接的方法，其中ECM成分的蛋白水解降解產(chǎn)物，最明顯的是纖連蛋白，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞遷移和趨藥性(GreilingandClark,1997;Livantetal,2000),上皮再生(Gianellietal,1997)和組織重塑(Gouldetal,1997;Werbetal,1980)。我們的結(jié)果已經(jīng)顯示成纖維細(xì)胞與纖連蛋白和膠原蛋白包裹的表面的粘連在ES的存在下減少了(Horobinetal,2003)。最近，通過使用二維體外分析，我們已經(jīng)展示了成纖維細(xì)胞遷移穿過纖連蛋白—皮存在于ES中的絲氨酸蛋白酶加速(Horobinetal,2005)，例如本發(fā)明的發(fā)明者已經(jīng)將這種酶活性與增強(qiáng)了的穿過平面表面的成纖維細(xì)胞遷移聯(lián)系起來了。然而，證據(jù)表明，正如他們描述的，細(xì)胞在二維中與在他們熟悉的三維活體環(huán)境中表現(xiàn)的不同(Abbott,2003;Cukiermanetal,2001;FriedlandBrScker,2000)。例如，在平面表面上，細(xì)胞表現(xiàn)出一種平的薄層狀外觀。相反，原位觀察到的細(xì)胞呈星形并延伸出樹枝狀突起。它們還表現(xiàn)出對周圍基質(zhì)不同的結(jié)合性，稱為3D基質(zhì)粘連(Cukiermanetal,2001)。在二維中，因為缺乏對在平面表面上前進(jìn)的細(xì)胞體的阻力，因此遷移穿過某表面主要是粘連與去粘連事件的功能。然而在三維中，基質(zhì)障礙強(qiáng)迫細(xì)胞改變其形態(tài)，使其改變形狀以及/或者酶作用降解ECM成分以方便其運(yùn)動。因此本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)展了三維體外分析，在其中觀察應(yīng)答ES的成纖維細(xì)胞的遷移和形態(tài)。這樣，本發(fā)明的發(fā)明者將他們的研究集中于對三維體外分析的研究，在其中觀察應(yīng)答ES的成纖維細(xì)胞的遷移和形態(tài)。建立這樣一個更精確地代表細(xì)胞在活體中存在的微環(huán)境的模型，是為了更好地理解在傷口愈合過程中ECM,常駐細(xì)胞和ES之間相互作用的重要性。它還提供了用于發(fā)展系統(tǒng)的基礎(chǔ)，在其中活動真皮和表皮細(xì)胞包含于支持的，含水的，生物可降解的以及生物活性的類組織基質(zhì)，被運(yùn)送到開放性傷口來幫助愈合。發(fā)展了包含在被認(rèn)為的遷移最佳濃度下，嵌于由膠原蛋白和纖連蛋白形成的膠質(zhì)中的初始人包皮成纖維細(xì)胞(HFF)的分離種群的檢測(GreilingandClark,1997;FriedlandBrScker,2000)。膠原蛋白膠質(zhì)已經(jīng)在類活體細(xì)胞培養(yǎng)中廣泛使用，并且被認(rèn)為代表了真皮的生物物理結(jié)構(gòu)公正的繁殖(FriedlandBrScker,2000)。另外，嵌于膠原蛋白膠質(zhì)的細(xì)胞已經(jīng)表現(xiàn)出采用與類原位形態(tài)學(xué)具有某些相似性的樹枝狀網(wǎng)絡(luò)的延伸(Cukiermanetal,2001)。纖連蛋白被包含在內(nèi)，由于該分子在導(dǎo)向細(xì)胞向傷口空間遷移中起顯著作用(GreilingandClark,1997)。結(jié)果顯示ES通過一種劑量依賴的方式加速成纖維細(xì)胞遷移穿過膠質(zhì)。這可能已經(jīng)通過增強(qiáng)基質(zhì)重塑和引導(dǎo)更良好分散的細(xì)胞形態(tài)得到促進(jìn)。正如將在下面的例子中展示的一樣，與相關(guān)對照相比，ES的濃度為1和5貼/ml時顯著增加了遷移細(xì)胞數(shù)量和其從細(xì)胞小滴移動的距離。ES的這些濃度還誘導(dǎo)了良好分散的細(xì)胞形態(tài)，并且在低種群密度下，5pg/ml的ES促進(jìn)了細(xì)胞間的基質(zhì)原纖維排列。相反，10pg/ml的ES，所測試的最高濃度，抑制細(xì)胞的遷移但確實改變了細(xì)胞的形態(tài)。ES的濃度為0.1(ig/ml時，在培養(yǎng)期間測試時幾乎不表現(xiàn)出效果。通過這些觀測，可以總結(jié)出ES促進(jìn)基質(zhì)重組以及細(xì)胞牽引力的發(fā)揮。在遷移檢測中，牽引的發(fā)揮通過在與含有5|ug/ml的ES的膠質(zhì)分離后以及在膠質(zhì)暴露于10pg/ml的ES的膠質(zhì)的液化過程中細(xì)胞小滴體積的收縮來表征。當(dāng)細(xì)胞在較低接種密度下被觀察時，牽引力的存在是通過直的、排列好的在細(xì)胞之間處于緊繃狀態(tài)的基質(zhì)微纖維的出現(xiàn)而表征的，可能由于相反牽引力的發(fā)揮而這樣安排。它還通過良好分散的細(xì)胞形態(tài)而表征。正如Harris和同事(1981)對嵌于膠原蛋白膠質(zhì)中的成纖維細(xì)胞進(jìn)行觀察，成纖維細(xì)胞牽引"是與像肌肉那樣簡單收縮明顯不同"因為"當(dāng)細(xì)胞壓縮和伸展包圍在它們周圍的膠原蛋白時細(xì)胞延長了而不是縮短了"。通過成纖維細(xì)胞增強(qiáng)了基質(zhì)重塑，并這樣實現(xiàn)遷移促進(jìn)的ES可能通過由Bellowsetal(1981)提出的膠質(zhì)壓縮(compaction)模型得以闡明。通過比較不同類型細(xì)胞收縮和組織膠原蛋白膠質(zhì)的能力，這些研究者確定了如表1所示的一系列按次序的膠質(zhì)壓縮階段。通過我們的觀察，明顯ES啟動了膠質(zhì)壓縮的前三階段，促進(jìn)細(xì)胞附著和分散以及促成基質(zhì)(最像膠原蛋白)纖維的排列。這樣，達(dá)到細(xì)胞遷移到第四階段?；|(zhì)重塑和細(xì)胞遷移之間的聯(lián)系通過Sawhney和Howard(2002)的研究得到了加強(qiáng)，他們發(fā)現(xiàn)形成于嵌于膠原蛋白膠質(zhì)中的細(xì)胞簇(clusters)之間的膠原蛋白"帶(strap)"促成細(xì)胞的前進(jìn)并且指導(dǎo)細(xì)胞向臨近細(xì)胞簇遷移(接觸引導(dǎo))。表1由Bellows等人于1981年建議的膠質(zhì)壓縮的按次序步驟步驟說明1細(xì)胞與膠原蛋白結(jié)合2在膠原蛋白纖維基質(zhì)中細(xì)胞的分散通過細(xì)胞過程膠原蛋白纖維的組織和排列4細(xì)胞遷移細(xì)月包間4妻觸的建立6該排列發(fā)展成三維的，組織樣的蜂窩網(wǎng)。通過這些比較可以清楚，細(xì)胞在ES存在時表現(xiàn)出相似地如被其他研究者所觀察到的嵌于膠原蛋白膠質(zhì)中的細(xì)胞一樣的形態(tài)學(xué)特征以及基質(zhì)重組。其他研究沒有包括源于蛆的產(chǎn)物，因此必須問到為什么這樣的行為在我們沒有ES的對照的細(xì)胞中沒有被觀察到?；卮鹂赡芘c血清有關(guān)，作為檢測中的比較性研究含有血漿，而這里血漿被排除在外。Tomaseketal(1992)提供了血漿促進(jìn)細(xì)胞-基質(zhì)相互作用的證據(jù)，他們發(fā)現(xiàn)在釋放束縛的充滿成纖維細(xì)胞的膠原蛋白膠質(zhì)之前去除血清抑制了隨后駐留細(xì)胞邊的膠質(zhì)收縮的程度。將血清加入膠質(zhì)中，一旦它們被釋放就會引起立即的收縮。其他的研究者也已經(jīng)觀察到基質(zhì)重組對血清的依賴(Steinbergetal,1980;GuidryandGrinnell,1985)。已在血清中發(fā)現(xiàn)了血小板源生長因子(PDGF),貝塔轉(zhuǎn)化生長因子(TGF卩)以及生物活性的脂質(zhì)介質(zhì)磷脂酸(LPA)，并且表明它們參與了刺激基質(zhì)重組(MontesanoandOrci,1988;Gd認(rèn)lletal,1999;Royetal,1999;Toewsetal,2002;Kondoetal,2004)。因此，蛆的ES有可能含有在血清中被發(fā)現(xiàn)的活性成分。其他的可能性是存在于ES中的絲氨酸蛋白酶，其已經(jīng)在之前展示了其加速成纖維細(xì)胞的遷移(Horobinetal,2005),可能通過切斷膜結(jié)合的蛋白酶活化的受體(PARs)而作出貢獻(xiàn)。G蛋白偶聯(lián)受體的一族在通過絲氨酸蛋白酶(例如凝血酶和胰蛋白酶樣酶)的酶裂解之后凈皮活化。這樣的行為暴露了受體連接著的配位體的氮端，其之后將裂解的受體結(jié)合并活化?；罨腜ARs與影響細(xì)胞形狀，分泌物，整合蛋白活化，代謝反應(yīng)，轉(zhuǎn)錄響應(yīng)和細(xì)胞運(yùn)動性的信號傳遞鏈偶聯(lián)(Cottrelletal,2002)。之前的工作已經(jīng)表明凝血酶在小雞胚胎在膠原蛋白膠質(zhì)中的成纖維細(xì)胞中通過蛋白酶活化PAR來促進(jìn)收縮張力的產(chǎn)生(KolodneyandWysolmerski,1992;Pilcheretal,1994;Changetal,2001)。有趣的是，注意到出現(xiàn)在ES中的絲氨酸蛋白酶對凝血酶和纖溶酶底物Tosyl-Gly-Pro-Arg-AMC具有活性(Chambersetal,2003),這意味著ES可能對成纖維細(xì)胞發(fā)揮出類似于對凝血酶一樣的效果。任何類纖溶酶活性也可能是恰當(dāng)?shù)?，因為纖溶酶已經(jīng)表現(xiàn)出活化多種細(xì)胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的酶原前體，從而對定位的基質(zhì)重組作出貢獻(xiàn)(Mignattietal,1996)。蛆ES已經(jīng)表現(xiàn)出對在尿激酶類活性下不穩(wěn)定的肽具有活性。尿激酶是一種又被稱為尿激酶血纖維蛋白活化劑(uPA)的絲氨酸蛋白酶，其將血纖維蛋白轉(zhuǎn)化其活化形式的血纖維蛋白。它還與血纖維蛋白活化劑受體(uPARs)結(jié)合，研究已經(jīng)表明其由成纖維細(xì)胞表達(dá)(Mignattietal,1996;Ellisetal,1993;Behrendtetal,1993)。一旦結(jié)合，uPARs定位于焦點(diǎn)的粘連位點(diǎn)，并調(diào)整整合蛋白調(diào)節(jié)功能(Wangetal,1995;ChapmanandWei,2001;PorterandHogg,1998),從而提供一種引導(dǎo)更多游動細(xì)胞顯型的機(jī)制。確實的，uPAR已經(jīng)被報道稱在細(xì)胞遷移、粘連和趨化作用上具有信號作用(Odekonetal,1992;Waltzetal,1993;Gyetkoetal,1994)。因此有理由推測ES中的類尿激酶活性也會對細(xì)胞行為的變化做出貢獻(xiàn)。ES的其他可能已經(jīng)促進(jìn)了成纖維細(xì)胞-基質(zhì)相互作用的行為可能與其降解膠質(zhì)基質(zhì)成分的能力有關(guān)。據(jù)觀察表明，ES存在的濃度越高，膠質(zhì)越快在其外表發(fā)生變化，成為更加半透明的，并且當(dāng)ES的濃度達(dá)到最高時，變成類似液體狀。在之前的工作中我們還證實了ES中的絲氨酸蛋白酶降解膠原蛋白和纖連蛋白(Chambersetal,2003)。膠質(zhì)的降解可以引起機(jī)械張力的放松，由于基質(zhì)纖維和組織培養(yǎng)皿表面之間的接觸可能已被侵蝕并且微纖維網(wǎng)破裂。一些發(fā)展了張力培養(yǎng)力監(jiān)視器的研究者的很多研究提供了嵌于膠原蛋白膠質(zhì)中的成纖維細(xì)胞能感應(yīng)和對機(jī)械張力作出改變的證據(jù)。他們發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞保持活躍的張力動態(tài)平衡，反應(yīng)以與外部施加壓力相反的方向調(diào)整內(nèi)生基質(zhì)張力(Brownetal,1998;Eastwoodetal,1994)。因此，施加壓力的增加引起細(xì)胞調(diào)整收縮的減少，并且反之亦然。也許這種反應(yīng)歸功于這樣的發(fā)現(xiàn)，即機(jī)械張力影響MMP的生成水平，從而通過釋放蛋白酶來重塑周圍基質(zhì)而允許細(xì)胞進(jìn)行反應(yīng)(Lambertetal,2001)。這樣，月交質(zhì)的蛋白水解降解造成的機(jī)械張力的松弛可能刺激細(xì)胞收縮以及重塑其周圍的基質(zhì)并且采取更易于遷移的形態(tài)。另一結(jié)果可能是生物活性肽從降解了的膠原蛋白和纖連蛋白上釋放，其已經(jīng)表現(xiàn)出會影響成纖維細(xì)胞粘連和遷移(GreilingandClark,1997;Livantetal,2000)。成纖維細(xì)胞能感應(yīng)并對機(jī)械張力的改變作出反應(yīng)，從我們的觀察清楚地表明雖然ES刺激成纖維細(xì)胞重塑基質(zhì)，但可能已引起胞間聯(lián)系的增強(qiáng)。這是因為每個細(xì)胞由于抵抗來自其他細(xì)胞的拉力引起基質(zhì)微纖維的排列而能夠感應(yīng)局部的基質(zhì)機(jī)械應(yīng)力的差異。如此對臨近的，即使是相對遠(yuǎn)距離的，細(xì)胞感知的增加會導(dǎo)致細(xì)胞之間反應(yīng)的協(xié)調(diào)得到改進(jìn)，對增強(qiáng)遷移作出貢獻(xiàn)。確實的，Sheetz,Felsenfeld和Gabraith(1998)提出了相似的協(xié)調(diào)的細(xì)胞遷移基質(zhì)，其中細(xì)胞根據(jù)ECM蛋白纖維的方向和硬度來指示其運(yùn)動。盡管ES在增強(qiáng)遷移和基質(zhì)重塑方面有益處，重要的是存在于ES的蛋白酶活性不是過度的，因為它們的反應(yīng)引起基質(zhì)的全面破裂。為了便于接觸引導(dǎo)與遷移，需要保留足夠的微纖維結(jié)構(gòu)，這由發(fā)明者的對含有濃度為10jig/ml的最濃ES檢測說明。這里，ES不僅抑制了遷移還快速地將膠質(zhì)降解為黏性的、液體狀。清楚的是，存在ES的最佳濃度以促進(jìn)可能為傷口愈合做貢獻(xiàn)的細(xì)胞活性?？偠灾?，我們的結(jié)果表明，第一，ES促進(jìn)成纖維細(xì)胞遷移。第二，當(dāng)無血清時，ES對幫助細(xì)胞維持和延伸良好分散的形態(tài)是必需的。第三，還是當(dāng)無血清時，ES促進(jìn)ECM的重組，尤其是在胞間。第四，ES通過直接對ECM蛋白分解修飾以及/或者通過與細(xì)胞受體相互作用而直接改變成纖維細(xì)胞的表現(xiàn)型來實施這些效果，這樣就取代了對血清的需求。我們具有技術(shù)能力來從ES中分離活性物質(zhì)(Chambersetal,2003;Horobinetal,2003,2005)，并將因此繼續(xù)鑒定這些活性物質(zhì)和其中的機(jī)理。如在實施例II中的數(shù)據(jù)所示，從幼蟲ES中提取的胰凝乳蛋白酶因其溶解傷口焦痂處的蛋白而具有清創(chuàng)活性(見圖21)。通過抑制劑的研究和測序發(fā)現(xiàn)其是一種胰凝乳蛋白酶。現(xiàn)在將描述本發(fā)明的實施例，并用所附附圖進(jìn)行參考和說明。其中圖1和圖2展示了完整的(1)和部分的(2)顯示絲光綠蠅基因序列的序列表，以及蛋白翻譯和與銅綠蠅胰凝乳蛋白酶原的同源性，其中DNA密碼子為小寫字母，蛋白翻譯為大寫字母；有下劃線的大寫字母代表絲光綠蠅序列中當(dāng)與最近的同族銅綠蠅序列比較時獨(dú)有的氨基酸殘基；粗體文本表示活性位點(diǎn)殘基；斜體文本代表信號肽；箭頭代表可能的裂解位點(diǎn)，象征可裂解的信號肽；星號代表終止密碼子；有下劃線的小寫字母代表未翻譯區(qū)域(UTR);粗體帶下劃線的小寫字母代表多嘌呤尾巴，斜體帶下劃線的文字代表多嘌呤信號。圖3說明了三維體外檢測是如何組合的。l.含有1.5mg/ml膠原蛋白和30|ng/ml纖連蛋白的Dulbecco's改進(jìn)的Eagle's(D-MEM)培養(yǎng)基倒入58mm組培亞，在37GC下凝成薄的平整的膠層。2.將含有1x107HFF細(xì)胞/ml的D-MEM/膠原蛋白/纖連蛋白的小滴置于第一膠暴上，并在37QC下凝成膠。3.第二層D-MEM/膠原蛋白/纖連蛋白倒在細(xì)胞小滴上，并在37°。下凝成膠。4.不含F(xiàn)CS的細(xì)胞培養(yǎng)基被倒在膠上。5.完整組合的檢測展示在橫截面上，表明小滴中的所有細(xì)胞是如何完全被基質(zhì)膠體包圍的，因此必須向三維遷移。圖4說明了在三維體外檢測中來自2^1膠質(zhì)小滴的成纖維細(xì)胞遷移是如何從相差微觀圖像進(jìn)行體外定量分析的。l.剛剛檢測組合(0小時培養(yǎng))后的成纖維細(xì)胞接種的小滴。2.24小時培養(yǎng)后的同一小滴。3.在0小時培養(yǎng)中的接種成纖維細(xì)胞的小滴，顏色為對比調(diào)成黑色，疊加在來自24小時培養(yǎng)的圖像上。4.只有那些在24小時中已經(jīng)從小滴中遷移出來的細(xì)胞被顯示，這樣使它們能被計數(shù)。每個細(xì)胞移動的距離通過測量矢量長度來計算，從每個細(xì)胞的前沿畫到疊加的0小時圖像的邊緣。接種成纖維細(xì)胞的小滴在0小時培養(yǎng)上的邊緣距離也被通過在疊加的0小時圖像周圍畫畫而測量。樣￡米桿代表300|im。圖5展示了三維體外檢測中2^1接種了成纖維細(xì)胞的膠質(zhì)小滴在緊跟著分析組合(O小時)的或者在a,不存在ES(OES)或存在O.lpg/mlES(0.1ES)或5|ig/mlES(5ES)，或者b，不存在ES(OES)或存在1pg/mlES(1ES)或10pg/mlES(10ES)的情況下培養(yǎng)24小時或48小時后代表性相差圖像。所有情況下，微米桿代表30(Him。圖6展示了三維體外檢測中2^1接種了成纖維細(xì)胞的膠質(zhì)小滴邊緣的代表性圖像，突顯了細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上的不同。圖像是相差的，除非有其他說明。a.對照組細(xì)胞，其中不存在ES(OES)和暴露于5嗎/mlES(5ES)培養(yǎng)24小時后的細(xì)胞之間的對照；b.對照組細(xì)胞(OES)和暴露于1jxg/mlES(lES)培養(yǎng)48小時后的細(xì)胞之間的對照-共焦的z系列光學(xué)截面的最大強(qiáng)度投影，細(xì)胞用FITC-鬼筆環(huán)肽(肌動蛋白)和碘化吡咬(核)染色；對照組細(xì)胞(OES)和暴露于10pg/mlES(10ES)培養(yǎng)24小時(c)或48小時(d)后的細(xì)胞之間的對照。a.,c,d.中的微米桿代表50pm(上)或20(im(下)，在b.中代表50|im。圖7展示了三維體外檢測中從2^1接種了細(xì)胞的膠質(zhì)小滴成纖維細(xì)胞在24小時的遷移。結(jié)果用小滴的每毫米邊緣遷移的平均數(shù)量±SEM表達(dá)(11=5)。a.不存在ES時(對照)的遷移或存在O.lng/mlES(0.1ES)或者5^g/mlES(5ES)。b.不存在ES時(對照)的遷移或存在1pg/mlES(1ES)或者10pg/mlES(IOES)的遷移。圖8展示了在三維體外檢測中成纖維細(xì)胞從每個2(1l接種了細(xì)胞的小滴遷移的平均移動距離。展示了五重復(fù)小滴的值。固相(實驗l)代表不存在ES時(對照#1)或在存在0.1pg/mlES或5^g/mlES的情況下移動的距離。開放形狀(實馬全2)代表不存在ES時(對照#2)或在存在1^g/mlES或10pg/mlES的情況下移動的距離。圖9展示了代表性的相差圖像，其展示了在接種濃度為3x105細(xì)胞/ml的20jil膠質(zhì)小滴中的成纖維細(xì)胞，緊跟檢測組合(0小時培養(yǎng))之后或在培養(yǎng)24小時或48小時后。細(xì)胞在不存在ES(OES)(對照)或在存在1嗎/mlES(1ES)或5pg/mlES(5ES)下的外觀。黑色箭頭當(dāng)排列好時表示細(xì)胞之間如繩樣的連接性纖維變?yōu)榭梢暤?。在所有的情況下，微米桿代表20^m。圖10是兩張展示在24小時培養(yǎng)后，關(guān)于每種酶濃度的蛋白水解活性的，ES、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶的混合對成纖維細(xì)胞與涂了一層FN的表面粘連的影響的圖。這樣的活性通過監(jiān)測從a.胰蛋白酶或b.胰凝乳蛋白酶的合成肽底物釋放的7-氨基-甲基香豆素(AMC)進(jìn)行評估。細(xì)胞的粘連用以螢火蟲熒光酶素為基礎(chǔ)的三磷酸腺苷(ATP)分析。結(jié)果用對照組的細(xì)胞粘連的平均百分?jǐn)?shù)士1SD(n=3)表示。圖11是纖連蛋白在37。C培養(yǎng)24小時后的凝膠電泳照片。值代表分子量標(biāo)準(zhǔn)(kDa)。l.只有FN。2週+try/勿。3週+勿。4.FN+try。5.FN+ES。每種酶濃度展示出對相關(guān)胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶底物的相同活性水平。Try=0.32ng/ml胰蛋白酶。Chy=0.02|iig/ml胰凝乳蛋白酶。ES,g/ml。圖12是顯示在pBac-3載體多克隆位點(diǎn)DNA序列的絲光綠蠅胰凝乳蛋白酶原序列的DNA序列表，其中pBac-3載體序列加了下劃線。圖13是圖12中的DNA序列預(yù)測的蛋白序列，其中活性位點(diǎn)殘基以黑體表示。圖14是顯示在S300凝膠過濾后胰蛋白酶的/胰凝乳蛋白酶活性的圖。；曰，、'、、、，一、七、，"，,活性峰值的典型的蛋白水解曲線。圖16是顯示在使用Cl合并物(pool)后大豆胰蛋白酶抑制劑瓊脂糖親和色譜的蛋白曲線的圖。圖17是凝膠照片，顯示在使用Cl合并物后蛋白水解活性和與大豆胰蛋白酶抑制劑瓊脂糖結(jié)合的蛋白的抑制劑特性。圖18是顯示在使用T2合并物后大豆胰蛋白酶抑制劑瓊脂糖親和色譜的蛋白曲線的圖。圖19是凝膠照片，顯示在使用T2合并物后蛋白水解活性和與大豆胰蛋白酶抑制劑瓊脂糖結(jié)合的蛋白的抑制劑特性。圖20是顯示2塊凝膠的照片，其展示了在用絲光綠蠅ES產(chǎn)物處理后傷口焦痂的蛋白曲線的潛在變化。變化的潛在區(qū)域被圏出。圖20a顯示未處理焦痂，而圖20b顯示處理過夜的焦痂。圖21是顯示4塊凝膠的照片，其展示了在用絲光綠蠅ES產(chǎn)物治療后傷口焦痂的蛋白曲線的潛在變化。變化的潛在區(qū)域被圏出。圖21a顯示未處理焦痂，20b用胰凝乳蛋白酶峰值(CI)處理，20c用第一胰蛋白酶的峰值(Tl)處理，而20d用第二胰蛋白酶的峰值(T2)。實施例實施例l-組織再生促進(jìn)成纖維粘連絲光綠蠅幼蟲排泄/分泌物收集和表征排泄/分泌物(ES)是從無菌的，新鮮孵化的絲光綠蠅幼蟲(LarvE,ZoobioticLtd,UK)如前所述地收集。簡單地說，四百個活的幼蟲在室溫(RT)下用1ml無菌的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗30分鐘，以獲得ES產(chǎn)物。ES的蛋白濃度和蛋白水解活性分別用Bio-Rad(Hercules,CA)蛋白檢測試劑盒和異硫氰酸熒光素(FITC)-酪蛋白消化檢測進(jìn)行測定(Horobinetal,2003)。這些結(jié)合起來反應(yīng)出蛋白濃度為161.74|ig/ml，特異性活性為每mgES蛋白6.04x106相對熒光素單位。初始人類包皮成纖維細(xì)胞(HFF)細(xì)胞培養(yǎng)HFF細(xì)胞(TCSCellworks,UK)在含有Dulbecco's改良的Eagle's培養(yǎng)基(D-MEM)(Gibco,InvitrogenLtd,UK),10%小牛血清(FCS)(Sigma,UK),抗菌的/抗真菌的溶液(31811^@)(100單元/ml青霉素，lOOpg/ml鏈霉素以及0.25|ig/ml兩性霉素B)已經(jīng)2mML-谷氨酸鹽(Sigma⑧)的T75瓶(Nunc，LifeTechnologiesLtd,UK)中單層培養(yǎng)。細(xì)胞被維持在37QC含有5%C02的潮濕空氣中。三維體外檢測-成纖維細(xì)胞遷移制備含有兩倍于通常細(xì)胞培養(yǎng)濃度(見上文)的D-MEM,抗菌的/抗真菌的以及L-谷氨酸鹽的原液。冷凍之后，原液與含有3mg/ml牛I型膠原蛋白(ICNBiomedicals,Ohio，USA),60貼/ml牛成纖維細(xì)胞(Sigma^^》iES或空白PBS的冷凍溶液以1:1的比例在水上混合。獲得的最終濃度為1xD-MEM,1.5mg/ml膠原蛋白以及30|ig/ml成纖維細(xì)胞。幼蟲ES的最終蛋白濃度，如標(biāo)識所示，為0.1pg/ml,1pg/ml,5pg/ml或10|ig/ml。這些分析如圖3所示的那樣組合并在此說明1000^1的D-MEM-膠原蛋白/成纖維細(xì)胞混合物，如上所述的，被倒入58mm組織培養(yǎng)皿(Nunc,LifeTechnologiesLtd)中，接著在370C凝成平整的，薄的，連續(xù)的膠層。HFF細(xì)胞(6通道)被胰蛋白酶化并懸浮于含10%FCS的D-MEM中來中和胰蛋白酶。它們通過離心而成粒狀，之后再懸浮于不含F(xiàn)CS的D-MEM中。在使用血球計數(shù)器估算細(xì)胞數(shù)量后，細(xì)胞纟皮再次形成粒狀并以1x107細(xì)胞/ml的濃度再懸浮于D-MEM/膠原蛋白/纖連蛋白膠質(zhì)混合物。每滴含有2iil該細(xì)胞懸浮液的五小滴被置于培養(yǎng)皿中凝膠層上，并在37。C培養(yǎng)直至其凝成膠狀。另外1000^1的D-MEM/膠原蛋白/纖連蛋白混合物被倒在細(xì)胞小滴上將其完全覆蓋，并在37^下凝成膠狀。最終，凝膠狀的含有抗菌的/抗真菌的藥物，L-谷氨酸鹽和空白PBS或幼蟲ES的相同濃度的不含F(xiàn)CS的D-MEM被加入到頂層凝膠層。組合的檢測在37QC下在含有5%C02的潮濕空氣中培養(yǎng)一定時間。整個過程保持無菌狀態(tài)。在整個48小時內(nèi)，每個實驗期間都通過反向Leica(UK)DMIRB顯微鏡用相差對細(xì)胞進(jìn)行觀察。顯示包含于每個凝膠的整個區(qū)域的每個細(xì)胞小滴的低倍圖像被用于量化24小時培養(yǎng)后的細(xì)胞遷移。這里，使用了MicrosoftPaintShopPro6來將0小時的每個細(xì)胞小滴的圖像疊加在24小時培養(yǎng)后相同的每個細(xì)胞小滴圖像上。接著使用LeicaQUIPS軟件對這些合成圖像進(jìn)行分析，如圖4所示。首先，計算出0小時時包圍每個細(xì)胞小滴的邊緣的距離。這之后對在24小時培養(yǎng)后已經(jīng)遷移出并離開原始細(xì)胞小滴邊緣的細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行計數(shù)。為了校正變化的小滴邊緣距離，遷移細(xì)胞的數(shù)量用細(xì)胞每亳米原始細(xì)胞小滴界限邊緣來表示。每個細(xì)胞遷移出邊緣的直線距離也進(jìn)行了測量。在48小時培養(yǎng)之后，完整的凝膠用4。/。多聚曱醛(TAAB,Aldermaston,UK)固定20分鐘，之后用含有1%牛血清白蛋白(BSA)(Sigma⑧)的PBS清洗三次。加入用水冷卻的含有20mMN-(2-羥乙基)哌溱-N，-(2-乙磺酸)；4-(2-羥乙基)哌嗪-l-乙磺酸(HEPES),300mM蔗糖，50mM氯化鈉，3mM氯化鎂以及0.5%TritonX-100(所有都來自Sigma)的滲透性溶液(pH7.4)并維持10分鐘。凝膠再用1%BSA清洗。0.08Q/oFITC-鬼筆環(huán)肽(Sigma⑧)溶液(乙醇中)用1%BSA1:100稀釋，之后加入凝膠。30分鐘后，像之前一樣清洗凝膠。加入含有10pg/ml碘化吡啶(PI)(Sigma⑧)的BSA(1%)，并在再次清洗凝膠前保持1分鐘。在FITC-鬼筆環(huán)肽/PI著色后，凝膠:故小心地吸干以移除多余的液體并用Bio-Rad焚光封固劑以及蓋片封固。使用共焦LeicaTCS4D系統(tǒng)加上LeicaDMRBE直立熒光顯微鏡使凝膠顯像。獲取細(xì)胞小滴邊緣的最大強(qiáng)度圖像以觀察遷移的細(xì)胞的形態(tài)。還獲取凝膠的Z系列光學(xué)切片并與在其組合(0小時培養(yǎng))后立即進(jìn)行固定和著色的單獨(dú)檢測獲取的光學(xué)切片對比。這樣做是為了證實來自小滴的細(xì)胞遷移發(fā)生在各個方向。統(tǒng)計分析代表每個細(xì)胞小滴每毫米邊緣遷移細(xì)胞數(shù)量的值在每個處理中都進(jìn)行重復(fù)，并轉(zhuǎn)化成其平方根。這些接著使用GraphPadPrismTM軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)和Dunnett's多重比較檢驗。細(xì)胞達(dá)到的遷移直線距離按每個處理中每個小滴重復(fù)進(jìn)行編制。它們接著^1對數(shù)GraphPadPrism中可用的單因素ANOVA和Dunnett's多重比較檢驗對組合的平均值進(jìn)行分析。對于所有情況，確認(rèn)相同的方差而統(tǒng)計顯著性—皮定義為P^O.05。三維體外檢測-成纖維細(xì)胞形態(tài)和基質(zhì)組織I在一單獨(dú)的實驗中，三維體外檢測按前述進(jìn)行組合，但有微小改動。這里，含有3x105細(xì)胞/ml的較低細(xì)胞密度的20^1小滴成為每次檢測的一部分。檢測用1pg/mlES,5pg/mlES或空白PBS(對照)處理。在0、24、48小時培養(yǎng)后使用相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。也注意凝膠基質(zhì)的外觀。三維體外檢測-成纖維細(xì)胞遷移組合三維體外檢測是為了檢驗成纖維細(xì)胞的遷移。緊接著檢測組合(0小時)后的，或在48小時培養(yǎng)后的凝膠的共焦顯微圖像證實了，第一，在0小時培養(yǎng)時沒有在細(xì)胞小滴外觀察到細(xì)胞以及，第二，48小時后細(xì)胞從細(xì)胞小滴中遷移出來既發(fā)生在水平方向又發(fā)生在垂直方向，這又證實了遷移的三維的本質(zhì)(HorobinAJPhDthesis,2004)。在量化由于幼蟲ES的細(xì)胞遷移時，進(jìn)行了兩個單獨(dú)的實驗。一個比較了0.1|ig/mlES和5|ag/mlES對無ES的對照的效果。另一個檢驗了當(dāng)與另一對照相比時1^g/mlES和10jig/mlES的效果。每個實驗中，使用的是來自相同瓶和傳代的細(xì)胞。獲取圖像以檢驗來自每個細(xì)胞小滴的細(xì)胞遷移。目測顯示在24小時培養(yǎng)后，當(dāng)存在5pg/mlES時的細(xì)胞遷移表現(xiàn)為最廣泛(圖5a)。從且突出更長更多數(shù)量的延伸到周圍凝膠中(圖6a)。通過48小時培養(yǎng):暴露于5pg/mlES的凝膠是透明的并且變得與盤表面分離。細(xì)胞小滴已經(jīng)收縮，將基質(zhì)向內(nèi)拉，從而增加了小滴之間基質(zhì)內(nèi)的張力。到這時，暴露于1|Lig/mlES的凝膠表現(xiàn)出已經(jīng)比各自的對照遷移地更遠(yuǎn)(圖5b)并且已經(jīng)形成良好分散的形態(tài)，以及長度延伸進(jìn)入周圍的凝膠(圖6b)。相比之下，在存在10pg/mlES下的細(xì)胞小滴體積上已經(jīng)變小了，細(xì)胞的有些區(qū)域收縮成緊的黑的物質(zhì)(圖5b)。這已經(jīng)與之前的凝膠狀溶液而目前是清澈l占性液體狀態(tài)聯(lián)系起來。當(dāng)與對照比較時，暴露于10pg/mlES的細(xì)胞的形態(tài)明顯不用。這里，24小時培養(yǎng)后，細(xì)胞表現(xiàn)出很多的細(xì)小延伸，其中有些非常長(圖6c)。48小時培養(yǎng)后，細(xì)胞已經(jīng)收縮了，變成圓形，但它們與其他通過長的細(xì)小的胞間衍生而保持直接物理接觸(圖6d)。使用能觀看每個小滴全部的低倍圖像來對總的從每個小滴的細(xì)胞遷移進(jìn)行定量。24小時培養(yǎng)后，分析證實了與相關(guān)對照相比，5jig/mlES在細(xì)胞遷移的數(shù)量上(PO.Ol)(圖"和移動的距離上(P〈0.001)(圖8)都顯著增加了細(xì)胞的遷移。1pg/ml的ES也在其對照上顯著增加了細(xì)胞遷移(細(xì)胞數(shù)量上P<0.01和運(yùn)動距離上PO.05)(圖7,8)。相比較而言，與其對照相比lO^g/mlES顯著抑制了細(xì)胞遷移(細(xì)胞數(shù)量上P<0.01和運(yùn)動距離上PO.01)(圖7，8)。暴露于0.1pg/mlES表現(xiàn)出輕微地抑制了細(xì)胞遷移到數(shù)量(對對照PO.05)(圖7)。然而，與對照相比0.1pg/mlES對遷移距離沒有顯著影響(P〉0.05)(圖8),其對細(xì)胞形態(tài)也沒有(數(shù)據(jù)未示出)?？梢宰⒁獾綄嶒?中對照的細(xì)胞遷移數(shù)量(圖7a)高于實驗2中對照的(圖7b)。這種實驗之間的差異可能是由于用血球計數(shù)器估算細(xì)胞數(shù)量而引起的不可避免的層次的錯誤帶來細(xì)胞小滴中細(xì)胞濃度的些許差異。然而，這種潛在的源的變化僅存在于實驗之間，而不在實驗中(因為每個實驗中組合每個檢測所使用的是相同計數(shù)塊的細(xì)胞)。因此，在每個實驗中比較結(jié)果而不是實驗之間仍然是有效的。三維體外檢測-成纖維細(xì)胞形態(tài)和基質(zhì)組織II含有較低濃度成纖維細(xì)胞的三維體外檢測被組合是為了檢驗成纖維細(xì)胞的形態(tài)和基質(zhì)的組織。檢測組合后不久存在ES或不存在ES情況下的細(xì)胞看起來是相似的(圖9)。然而，通過24小時的培養(yǎng)，細(xì)胞在存在1i!g/mlES和特別是存在5pg/mlES時與那些不存在ES的細(xì)胞相比已經(jīng)采取了更良好分散的形態(tài)，具有更長的細(xì)胞質(zhì)延伸。當(dāng)存在5嗎/mlES時觀察細(xì)胞間排列好的類似串的連接性基質(zhì)微纖維。48小時培養(yǎng)后，檢測之間的差異變得更加明顯。到這時，當(dāng)不存在ES時細(xì)胞已經(jīng)變得更圓了(圖9)。同時，暴露于1|ig/mlES或5pg/mlES的細(xì)胞保持良好分散的形態(tài)。暴露于5pg/mlES的觀察的細(xì)胞間排列好的類似串的連接性基質(zhì)微纖維已經(jīng)變得更明細(xì)和眾多。另外，基質(zhì)看起來更清澈，微纖維的隨機(jī)網(wǎng)絡(luò)不那么明顯了。比較實施例I本發(fā)明的發(fā)明者進(jìn)行了進(jìn)一步的實驗以比較ES胰凝乳蛋白酶和市售牛胰凝乳蛋白酶的效果。因此ES對成纖維細(xì)胞與纖連蛋白粘連的效果與市售胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶配制劑相比。這是通過在纖連蛋白包裹的表面在各種濃度的ES,市售胰蛋白酶或市售胰凝乳蛋白酶存在的情況下接種成纖維細(xì)胞完成的。在培養(yǎng)長達(dá)48小時后，樣品被吸走所有介質(zhì)，并溫和地清洗，從而移除沒有結(jié)合到表面的細(xì)胞。為了根據(jù)所測ATP濃度來量化保留在表面的細(xì)胞相對數(shù)量而使用三磷酸腺苷(ATP)檢測。在對比ES和含有對胰蛋白酶特異性底物具有相當(dāng)活性水平的胰蛋白酶的效果中，ES對減少成纖維細(xì)胞粘連到表面更有有效。例如，在24小時培養(yǎng)后，5pg/mlES將細(xì)胞粘連降低到對照的16.6%(圖10a)。市售的對胰蛋白酶特性焚光底物Tosyl-Gly-Pro-Arg-AMC具有103.2%ES活性的胰蛋白酶(1.6lag/ml)將細(xì)胞粘連降低到對照的34.9%。在48小時培養(yǎng)后，在5pg/mlES存在下的細(xì)胞粘連已經(jīng)降低到對照的9.3%,而1.6pg/ml市售胰蛋白酶已經(jīng)將細(xì)胞粘連減少到對照的24.7%。市售胰凝乳蛋白酶(O.l|xg/ml),其對胰凝乳蛋白酶特異性熒光底物(Sue-Ala-Ala-Pro-Phe-AMC)表現(xiàn)出94.1%的5^g/mlES活性，沒有表現(xiàn)出改變成纖維細(xì)胞粘連的能力(圖10b)。即使是0.2ng/ml市售胰凝乳蛋白酶，其對胰凝乳蛋白酶特異性底物表現(xiàn)出204.9%的5pg/mlES活性，對成纖維細(xì)胞粘連沒有效果。同時暴露于市售胰蛋白酶和市售胰凝乳蛋白酶的成纖維細(xì)胞沒有表現(xiàn)出任何大于僅暴露于相同濃度市售胰蛋白酶的細(xì)胞的粘連的改變。這些結(jié)果表明存在于ES中的例如胰凝乳蛋白酶的酶比單獨(dú)的市售胰蛋白酶或市售胰凝乳蛋白酶或其組合在改變成纖維細(xì)胞粘連上更有效。之前的研究已經(jīng)顯示ES改變成纖維細(xì)胞粘連的能力是與其通過蛋白水解降解改變纖連蛋白包裹的表面的能力相關(guān)的(Horobinetal2003同上)。那么這些結(jié)果表明ES可能比市售胰蛋白酶或市售胰凝乳蛋白酶在降解胞外基質(zhì)蛋白方面更有效。這用凝膠電泳進(jìn)行了證實。這里，稀釋幼蟲ES，市售胰蛋白酶，市售胰凝乳蛋白酶或者市售胰蛋白酶和市售胰凝乳蛋白酶結(jié)合的樣本以獲得具有對胰蛋白酶特異性或胰凝乳蛋白酶特異性底物相同活性的溶液。牛纖連蛋白(100pg/mll)在溶解于12。/。聚丙烯酰胺凝膠之前在37。C下暴露于這些溶液24小時。如所示的，當(dāng)與市售的兩種酶相比時，ES更廣泛地將纖連蛋白降解為主要的更小的片段(圖11)。另外，存在于ES中的蛋白水解酶已經(jīng)表現(xiàn)出增加了成纖維細(xì)胞的遷移(Horobineta12005同上)。這可以與成纖維細(xì)胞粘連的變化聯(lián)系起來。傷口內(nèi)，成纖維細(xì)胞遷移的加速可促進(jìn)肉芽組織生長到傷口空隙處。這樣，源自ES的酶可能不僅證明是比目前市場上的那些更有效的清創(chuàng)劑，也可能同時增加傷口愈合響應(yīng)。實施例2-清創(chuàng)蛆胰凝乳蛋白酶的純化絲光綠蠅ES產(chǎn)物的SephacrylS:300層析用SephacrylS-300HR填充玻璃層析柱(1.5cmx50cm)并用PBS平衡(流速0.33ml/min)。該柱被校準(zhǔn)并且使用廣泛的凝膠過濾標(biāo)準(zhǔn)物(200-12.5kDa,Sigma)來確定空柱。大約2ml絲光綠蠅ES產(chǎn)物(0.5mg)加入到柱中，接著收集空柱50份(2ml/份)的洗提液，并分別使用熒光底物Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-AMC和Tosyl-Gly-Pro-Arg-AMC檢測胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶活性。見圖14和15,其顯示可S300凝膠過濾后胰凝乳蛋白酶/胰蛋白酶的活性。觀察到典型的3個蛋白水解活性高峰，為胰蛋白酶富集兩個(稱為Tl和T2)以及為胰凝乳蛋白酶活性富集1個(稱為Cl)。圖15還顯示了典型的每個由凝膠SDS-PAGE底物凝膠分析測定的活性高峰的蛋白水解曲線。使用熒光合成肽底物對胰凝乳蛋白酶/胰蛋白酶活性的檢測胰凝乳蛋白酶/胰蛋白酶活性通過監(jiān)測從Suc-Ala-Ala-Pro-Phe畫AMC(胰凝乳蛋白酶)和Tosyl國Gly-Pro-Arg-AMC(胰蛋白酶)中釋放的7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)來估計。每份的50^1與150|il在PBS中稀釋的底物(5pM)—起培養(yǎng)。樣品在37°C下培養(yǎng)30分鐘，之后使用DynexMFX孩￡板熒光計測定其熒光(365nm激發(fā)，465nm發(fā)射檢測)。蛋白水解活性用在減去時間零點(diǎn)讀數(shù)后發(fā)射超過30分鐘的熒光單元數(shù)量表示。使用凝膠底物SDS-PAGE檢測胰凝乳蛋白酶/胰蛋白酶活性使用Kumar&Pritchard(1992)描述的方法進(jìn)行底物SDS-PAGE。制備包含O.l。/0(w/v)明膠溶于膠內(nèi)的12%(w/v)SDS-PAGE膠。該膠加熱到55QC來溶解明膠。每份的10^與相同體積的非還原性樣品緩沖液(0.5MTris,pH6.8,5%SDS(w/v),20%丙三醇(w/v),0.01%溴酚藍(lán))混合并在37GC下培養(yǎng)30分鐘。這些份接著被置于單獨(dú)的形成于層級凝膠上的孔中，樣品在恒定電流20mA下電泳。電泳后，膠在2.5%TritonX-100中室溫下清洗20分鐘來使酶復(fù)性，正如Lacks&Springhorn(1980)所述的。該膠接著在水中清洗20分鐘，最后在37QC下在PBS中培養(yǎng)過夜。蛋白水解活性通過用考馬斯亮藍(lán)R250染色膠而測定，觀察到的是在藍(lán)色背景上的空白區(qū)域。通過大豆胰蛋白酶抑制劑瓊脂糖親和色譜法純化胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶活性的CI合并物的鹽濃度被調(diào)節(jié)到0.5M氯化鈉并用于用PBS，0.5M氯化鈉平衡(流速0.2ml/min)的3ml大豆胰蛋白酶抑制劑瓊脂糖柱。該柱用PBS,0.5M氯化鈉清洗直到通過該柱的緩沖液在280nm處的吸收達(dá)到零。所結(jié)合蛋白用0.7%乙醇胺洗提，1ml部分,皮收集，并立刻用2MTris.CI(1:1v/v)中和，集中并對PBS透析過夜(圖16)。使用熒光底物和明膠SDS-PAGE檢測洗提的蛋白的蛋白水解活性(圖17)。圖17展示了在使用CI合并物后結(jié)合到大豆胰蛋白酶抑制劑瓊脂糖的蛋白的水解活性和抑制劑特性。從大豆胰蛋白酶抑制劑瓊脂糖柱洗提的蛋白裂解底物Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-Arg-AMC并表現(xiàn)出只被PMSF抑制。沒看到對胰蛋白酶底物Tosyl-Gly-Pro-Arg-AMC有活性。當(dāng)用明膠底物SDS-PAGE分析時，觀察到至少3塊蛋白水解活性明顯的區(qū)域(標(biāo)箭頭的)。通過大豆胰蛋白酶抑制劑瓊脂糖親和色譜法純化胰蛋白酶相似的，胰蛋白酶部分的T2合并物流過大豆胰蛋白酶抑制劑柱。從柱上洗提的部分^f皮立即中和，集中以及對PBS透析過夜(圖19)。圖19展示了在使用T2合并物后結(jié)合到大豆胰蛋白酶抑制劑瓊脂糖的蛋白的水解活性和抑制劑特性。從大豆胰蛋白酶抑制劑瓊脂糖柱洗提的蛋白裂解胰蛋白酶底物Tosyl-Gly-Pro-Arg-AMC并表現(xiàn)出被PMSF和APMSF抑制。沒看到對胰凝乳蛋白酶底物Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-Arg-AMC有活性。當(dāng)通過明膠底物SDS-PAGE分析時，觀察到l條蛋白水解活性明顯的帶(標(biāo)箭頭的)。ES產(chǎn)物對傷口焦痂的效果約lmg傷口焦痂與10pg絲光綠蠅ES產(chǎn)物培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)之后處理過的和未處理的焦痂;波溶于Biorad的等電(iso-electric)聚焦再水合(focusingre-hydration)緩沖液(8M尿素，2%CHAPS50mMDTT,0.2%兩性電解質(zhì))。使用Biomd2D蛋白"清潔"試劑盒進(jìn)一步純化蛋白，獲得的顆粒被再溶解于等電聚焦再水合緩沖液。ES產(chǎn)物對傷口焦痂的效果用2D凝膠分析進(jìn)行檢驗。根據(jù)使用手冊的說明使用'ReadyStrip'7cmIPGstripspH3-10(Biorad)聚焦大約100|ig的蛋白于第一維。第二維SDS-PAGE用10%tricenegel進(jìn)行(SchaggerandVonjagow,1987)。凝膠用考馬斯藍(lán)R250染色圖20。胰凝乳蛋白酶/胰蛋白酶合并物對傷口焦痂的效果大約lmg傷口焦痂與100inl絲光綠蠅Cl、Tl或T2合并物培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)后，處理過的和未處理的焦痂如上所述進(jìn)行處理。C1、T1或T2合并物對傷口焦痂的效果接著用2D凝膠分析進(jìn)行檢驗。如上所述大約lOOpg蛋白聚焦于2維。凝膠用考馬斯藍(lán)R250染色圖21。絲光綠蠅胰凝乳蛋白酶基因的克隆絲光綠蠅胰凝乳蛋白酶原的開放閱讀框(ORF)的全長通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增，使用力。上N/colP艮制性位點(diǎn)的正向引物(5'-CTGCCATGGTCATGAAATTCTTAATAGTT-S')和加上Nhe位點(diǎn)的反向引物(5'畫GACGCTAGCATAAGAAATTCCGGTGTG-3')。獲得的片段被克隆進(jìn)pBac-3多角體蛋白啟動子的下游并測序(圖12)并且預(yù)測了氨基酸序列(圖13)。因此可以得出結(jié)論，絲光綠蠅的ES包含具有本文所示的氨基酸和DNA序列的胰凝乳蛋白酶，其通過促進(jìn)成纖維細(xì)胞遷移，通過促進(jìn)基質(zhì)重塑以及通過改變成纖維細(xì)胞的形態(tài)而清創(chuàng)傷口和促進(jìn)傷口愈合。參考文獻(xiàn)AbbottA:Biology'snewdimension.Nature424:870-872，2003AbeM,KurosawaM,IshikawaO,MiyachiY:Effectofmastcell-derivedmediatorsandmastcell-relatedneutralproteasesonhumandermalfibroblastproliferationandtypeIcollagenproduction.JAllergyClinImmunol106Suppl:78-84,2000BehrendtN,PlougM，RonneE,H0yer-HansenG,DanoK:Cellularreceptorforurokinase-typeplasminogenactivator:proteinstructure-MethodsEnzymol223:207-222,1993BellowsCG,MelcherAH,AubinJE:Contractionandorganizationofcollagengelsbycellsculturedfromperiodontalligament,gingivalandbonesuggestfunctionaldifferencesbetweencelltypes.JCellSci50:299-314,1981BlairRJ,MengH,MarchesseMJ，RenSL,SchwartzLB，TonnesenMG,GruberBL:Humanmastcellsstimulatevasculartubeformation.Tryptaseisanovel,potentangiogenicfactor.JCHnInvest99(11):2691-2700,1997BrownRA,PrajapatiR,McGroutherDA,YannasIV,EastwoodM:Tensionalhomeostasisindermalfibroblasts:mechanicalresponsestomechanicalloadinginthree-dimensionalsubstrates.JCellPhysiol75:323-332,1998ChambersL,WoodrowS,BrownAPetal:DegradationofextracellularmatrixcomponentsbydefinedproteasesfromthegreenbottleflylarvaLuciliasericatausedforchemicaldebridementofnon-healingwounds.BrJDermatol148:14-23,2003ChangMC,ChanCP,WuHL,ChenRS,LanWH,ChenYJ,JengJH:Thrombin畫stimulatedgrowth,clusteringandcollagenlatticecontractionofhumangingivalfibroblastsisassociatedwithitsproteaseactivity.JPeriodontal72(3):303-313,2001ChapmanHA,WeiY:Proteasecrosstalkwithintegrins:theurokinasereceptorparadigm.ThrombHaemost86:124-129,2001ClarkRAF:Woundrepair:overviewandgeneralconsiderations.In:ClarkRAF(ed).Themolecularandcellularbiologyofwoundrepair.SecondEdition.NewYork:PlenumPress,1996;p3-50CottrellCS,CoelhoAM,BunnettNW:Protease-activatedreceptors:theroleofcell-surfaceproteolysisinsignalling.EssaysBi.ochem38:169-183,2002CukiermanE,PankovR,StevensDR,YamadaKM:Takingcell-matrixadhesionstothethirddimension.Science294:1708-1712,2001DeryO,BunnettNW:Proteinase-activatedreceptors:agrowingfamilyofheptahelicalreceptorsforthrombin,trypsinandtryptase.BiochemSocTrans27:246-254,1999EastwoodM,McGroutherDA,BrownRA:Acultureforcemonitorformeasurementofcontractionforcesgeneratedinhumandermalfibroblastcultures:evidenceforcell-matrixmechanicalsignalling.BiochimBiophysActa1201:186-192,1994EckesB,ZigrinoP,KesslerD,Holtk0tterO,ShephardP,MauchC,KriegT:Fibroblast-matrixinteractionsinwoundhealingandfibrosis.MatrixBiol19:325-332,2000EllisV,BehrendtN,DanoK:Cellularreceptorforurokinase誦typeplasminogenactivator:functionincell-surfaceproteolysis.MethodsEnzymol223:223-233,1993FriedlP,'BrSckerE-B:Thebiologyofcelllocomotionwithinthree-dimensionalextracellularmatrix.CellMolLifeSci57:41-64,2000GiancottiFG,RuoslahtiE:lntegrinsignalling.Science285:1028-1032,1999GianelliG,Falk-MarzillierJ,SchiraldiO,Stetler-StevensonWG,QuarantaV:Inductionofcellmigrationbymatrixmetalloprotease-2cleavageoflaminin-5.Science277:225-228，1997GouldLJ,YagerDR,CohenIK,DiegelmannRF:Invitroanalysisoffoetalfibroblastcollagenolyticactivity.WoundRepairRegen5:151-8,1997GrielingD,ClarkRAF:Fibronectinprovidesaconduitforfibroblasttransmigrationfromcollagenousstromaintofibrinclotprovisionalmatrix.JCellSci110:861-70,1997GrinnellF,HoC-H,LinY-C,SkutaG:Differencesintheregulationoffibroblastcontractionoffloatingversusstressedcollagenmatrices.JBiolChem274(2):918-923,1999Guidry'C,GrinnellF:Studiesonthemechanismofhydratedcollagengelreorganizationbyhumanskinfibroblasts.JCellSci,79:67-81,1985GyetkoMR,ToddIIIRF,WilkinsonCC,SitrinRG:Theurokinasereceptorisrequiredforhumanmonocytechemotaxisinvitro.JCHnInvest93:1380-1387，1994HarrisAK,StopakD,WildP:Fibroblasttractionasamechanismforcollagenmorphogenesis.Nature290:249-251,1981HorobinAJ,ShakesheffKM,PritchardDl:Maggotsandwoundhealing:aninvestigationoftheeffectsofsecretionsfromLuciliasericatalarvaeuponthemigrationofhumandermalfibroblastsoverafibronectin-coatedsurface.WoundRepairRegen13(4):422-433,2005HorobinAJ,ShakesheffKM,WoodrowS,RobinsonC,PritchardDl:Maggotsandwoundhealing:aninvestigationoftheeffectsofsecretionsfromLuciliasericatalarvaeuponinteractionsbetweenhumandermalfibroblastsandextracellularmatrixcomponents.BrJDermatol148:923-933，2003KolodneyMS,WysolmerskiRB:Isometriccontractionbyfibroblastsandendothelialcellsintissueculture畫aquantitativestudy.JCellBiol117(1):73-82,1992KondoS,KagamiS,UrushiharaMetal:Transforminggrowthfactor隱卩l(xiāng)stimulatescollagenmatrixremodellingthroughincreasedadhesiveandcontractivepotentialbyhumanrenalfibroblasts.BiochimBiophysActa1693(2):91-100,2004Kumar,S.&Pritchard,D.I.(1992)ThepartialcharacterisationofproteasespresentintheExcretory/Secretoryproductsandexsheathingfluidoftheinfective(L3)larvaofNecatoramericanus.InternationalJournalforParasitology,22,563-572.Lacks,S.A.&Springhorn,S.S.(1980)Renaturationofenzymesafterpolyacrylamindegelelectrophoresisinthepresenceofsodiumdodecylsulphate.JournalofBiologicalChemistry,255,7467-7473.LambertCA,ColigeAC,MunautC,LapiereCM,NusgensBV:Distinctpathwaysintheover-expressionofmatrixmetalloproteinasesinhumanfibroblastsbyrelaxationofmechanicaltension.MatrixBiol20:397-408，2001LivantDL,BrabecRK,KurachiKetahThePHSRNsequenceinducesextracellularmatrixinvasionandaccelerateswoundhealinginobesediabeticmice.JCHnInvest105:1537-1545,2000MignattiP,RifkinDB,WelgusHG,ParksWC:Proteinasesandtissueremodelling.In:ClarkRAF(ed).Themolecularandcellularbiologyofwoundrepair.SecondEdition.NewYork:PlenumPress,1996;p427-474MontesanoR,OrciL.Transforminggrowthfactor卩stimulatescollagen-matrixcontractionbyfibroblasts:Implicationsforwoundhealing.ProcNatlAcadSciUSA85:4894-4897,1988OdekonLE,SatoY,RifkinDB:Urokinase-typeplasminogen-activatormediatesbasicfibroblastgrowthfactor-inducedbovineendothelial-cellmigrationindependentofitsproteolyticactivity.JCellPhysiol150(2):258-263,1992PilcherBK,KimDW,CarneyDH,TomasekJJ:Thrombinstimulatesfibroblast-mediatedcollagenlatticecontractionbyitsproteolyticallyactivatedreceptor.ExpCellRes211:368-373,1994PorterJC,HoggN:Integrinstakepartners:cross-talkbetweenintegrinsandothermembranereceptors.TrendsCellBiol8:390-396,1998RoyP,PetrollWM,CavanaghHD,JesterJV:Exertionoftractionalforcerequiresthecoordinatedup-regulationofcellcontractilityandadhesion.CellMotilCytoskeleton43:23-34,1999SawhneyRK,HowardJ:Slowlocalmovementsofcollagenfibersbyfibroblastsdrivetherapidglobalself-organizationofcollagengels.JCellBiol157(6):1083-1091,2002Schagger,H.&Vonjagow,G.(1987)Tricinesodiumdodecyl-sulfatepolyacrylamidegelelectrophoresisfortheseparationofproteinsintherangefrom1-kDato100-kDa.AnalyticalBiochemistry,166(2),368-379.SchmidtchenA,WolffH,RydengardV,HanssonC:DetectionofserineproteasessecretedbyLuciliasericatainvitroandduringtreatmentofachroniclegulcer.ActaDerm-Ven83(4):310-311,2003SheetzMP,FelsenfeldDP,GabraithCG:Cellmigration:regulationofforceonextracellular-matrix-integrincomplexes.TrendsCellBiol8:51-54,1998ShermanRA,HallMJR,ThomasS:Medicinalmaggots:anancientremedyforsomecontemporaryafflictions.AnnuRevEntomol45:55-81,2000SmithAG,PowisRA，PritchardDl,BritlandST:Greenbottle(Luciliasericata)LarvalSecretionsDeliveredfromaPrototypeHydrogelWoundDressingAcceleratetheClosureofModelWounds.Biotechnol.Prog22:1690-1696,2006SteinbergBM,SmithK,ColozzoM,PollackR:Establishmentandtransformationdiminishtheabilityoffibroblaststocontractanativecollagengel.JCellBiol87:304-308,1980ToewsML,EdigerTL,RombergerDJ，RennardSI:Lysophosphatidicacidinairwayfunctionanddisease.BiochimBiophysActa1582(1-3)Sp.Iss:240-250，2002TomasekJJ,HaaksmaCJ,EddyRJ,VaughanMB:Fibroblastcontractionoccursonreleaseoftensioninattachedcollagenlattices:dependencyonanorganizedactincytoskeletonandserum.AnatRec232:359-368,1992<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>權(quán)利要求1.一種源自昆蟲幼蟲的分離的胰凝乳蛋白酶或其合成形式。2.權(quán)利要求1的胰凝乳蛋白酶，其中該胰凝乳蛋白酶具有圖1或圖13中的序列或者由圖1、2或12中的DNA序列編碼。3.—種胰凝乳蛋白酶的片段，其具有與權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的胰凝乳蛋白酶相同的活性。4.權(quán)利要求1至3中任一項的胰凝乳蛋白酶，其中該胰凝乳蛋白酶獲取自絲光綠蠅的幼蟲。5.前述權(quán)利要求中任一項的胰凝乳蛋白酶，其中該胰凝乳蛋白酶來自絲光綠蠅幼蟲的排泄/分泌物。6.前述權(quán)利要求中任一項的胰凝乳蛋白酶，其中幼蟲是新孵化的。7.權(quán)利要求1至5中任一項的胰凝乳蛋白酶，其中幼蟲是一齡的。8.前述權(quán)利要求中任一項的胰凝乳蛋白酶，其中幼蟲生長于無菌環(huán)境。9.一種用于治療傷口的組合物，包含前述權(quán)利要求中任一項的胰凝乳蛋白酶。10.權(quán)利要求1至8中任一項的胰凝乳蛋白酶在制備用于治療傷口的藥物中的用途。11.權(quán)利要求9或10的用途，其中胰凝乳蛋白酶具有圖1、圖2或圖13中的序列或者由圖1、2或12中的DNA序列編碼。12.權(quán)利要求9至11中任一項的用途，其中使用胰凝乳蛋白酶的活性片段。13.權(quán)利要求9至12中任一項的用途，其中胰凝乳蛋白酶是合成的。14.權(quán)利要求9至13中任一項的用途，其中胰凝乳蛋白酶源自絲光綠蠅。15.權(quán)利要求9至14中任一項的用途，其中傷口選自割傷、刺傷、手術(shù)切口、潰瘍、壓瘡、灼傷、真皮擦傷或擊傷、骨髓炎以及整形外科傷口，所述灼傷包括由于熱、冷凍、化學(xué)品、電以及輻射引起的灼傷。16.權(quán)利要求9至15中任一項的用途，其中傷口是感染的。17.權(quán)利要求9至16中任一項的用途，其中傷口是慢性的。18.權(quán)利要求9至17中任一項的用途，其中傷口通過促進(jìn)成纖維細(xì)胞遷移進(jìn)行治療。19.權(quán)利要求9至17中任一項的用途，其中傷口通過促進(jìn)基質(zhì)重塑進(jìn)行治療。20.權(quán)利要求9至17中任一項的用途，其中傷口通過改變成纖維細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行治療。21.權(quán)利要求9至20中任一項的用途，其中傷口用胰凝乳蛋白酶清創(chuàng)。22.—種用于傷口的敷料，該敷料含有權(quán)利要求1至8中任一項的胰凝乳蛋白酶。23.—種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1至8中任一項的胰凝乳蛋白酶。24.—種治療傷口的方法，該方法包括對需要治療的傷口施用權(quán)利要求1至8中任一項的胰凝乳蛋白酶。25.—種治療傷口的方法，該方法包括對需要治療的傷口施用權(quán)利要求22的敷料、權(quán)利要求9的組合物或者權(quán)利要求23的藥物組合物的步驟。全文摘要本文描述了幼蟲酶，特別是胰凝乳蛋白酶的用途。這些酶可用于治療傷口，以進(jìn)行清創(chuàng)和細(xì)胞再生。文檔編號C07K14/415GK101541829SQ200780028559公開日2009年9月23日申請日期2007年5月31日優(yōu)先權(quán)日2006年5月31日發(fā)明者A·J·霍羅賓,A·布朗,D·I·普理查申請人:英國國防部