專利名稱：牛白細(xì)胞干擾素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是涉及一種治療牛病毒性疾病的牛白 細(xì)胞干擾素的制備方法。
技術(shù)背景隨著國(guó)民經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展及農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的科學(xué)調(diào)整，奶牛.業(yè)成了畜牧 業(yè)中發(fā)展速度最快的一個(gè)熱點(diǎn)產(chǎn)業(yè)。在奶牛業(yè)飛速發(fā)展的大好背景下，奶牛 的流動(dòng)性大大增加，奶牛的集約化生產(chǎn)程度和泌乳性能進(jìn)一步提高，奶牛疾 病對(duì)奶生產(chǎn)所造成的影響變得越來(lái)越突出。如何有效防治奶牛疾病、減少經(jīng) 濟(jì)損失，成為大家非常關(guān)心的問(wèn)題之一。病毒傳染病是奶牛的大規(guī)模殺傷性 疾病。病毒傳染病主要包括牛病毒性腹瀉一黏膜病、口蹄疫、牛流行熱、牛 流行熱、藍(lán)舌病、瘋牛病等。例如，牛病毒性腹瀉或稱牛粘膜病是牛的一種 重要的傳染病。以發(fā)熱、白細(xì)胞減少、口腔及消化道粘膜糜爛、壞死和腹瀉 為特征,但大多數(shù)牛是隱性感染。牛病毒性疾病仍是當(dāng)前嚴(yán)重制約養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展的主要傳染病。全國(guó)每 年均有上千萬(wàn)頭牛在不同季節(jié)發(fā)生病毒性傳染病。牛一旦感染發(fā)病，則有起 病急，臨床癥狀嚴(yán)重，極易傳播擴(kuò)散，以及病死率和死亡率均較高的特點(diǎn)， 對(duì)養(yǎng)殖業(yè)危害極大。牛病毒性疾病至今尚無(wú)有效的治療藥物和治療方法。近 年來(lái)曾經(jīng)有人進(jìn)行過(guò)用中草藥制劑預(yù)防和治療牛病毒性疾病的試驗(yàn)，但治愈 率較低?？股丶盎前奉愃幬锘緹o(wú)效。目前，牛干擾素是治療牛病毒性疾病 的有效藥物。干擾素的抗病毒作用并不是直接作用于病毒，而是通過(guò)與細(xì)胞 受體連接，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生另一類蛋白質(zhì)而發(fā)揮效能。這些蛋白質(zhì)又稱抗病毒蛋白。主要包括蛋白激酶、2—5合成酶等。這些酶可以使病毒蛋白合成受抑 制，使病毒降解。干擾素抗病毒具有以下特點(diǎn)1、干擾素抗病毒不是殺滅而是抑制病毒， 一旦招i去干擾素，病毒往往又重新繁殖。只有用足夠濃度的干擾素，長(zhǎng)期使用，才有可能將其徹底消滅。 這就是為什么干擾素需要長(zhǎng)期治療的原因所在。2、 干擾素具有種屬特異性，人干擾素一般只用于治療人的疾病。3、 不同的細(xì)胞種類和不同的動(dòng)物、不同的病毒感染類型對(duì)干擾素的敏感 性不同。所以，各種類型的干擾素臨床療效也有所不同。目前，白細(xì)胞干擾素研發(fā)工作已取得重大突破，現(xiàn)在養(yǎng)殖場(chǎng)和動(dòng)物醫(yī)院廣泛使用有豬細(xì)胞干擾素和禽基因工程干擾素。結(jié)果證明，其療效優(yōu)于市場(chǎng)現(xiàn)有的其它產(chǎn)品的效果。95111427.1提供一種豬白細(xì)胞干擾素注射劑及其制備方法； 02138397.9提供一種重組y -干擾素預(yù)防和治療奶牛隱性乳房炎的方法； 200410065926.5提供一種豬白細(xì)胞干擾素的制備方法； 200610124195.6提供一種豬p干擾素重組腺病毒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用； 200610124194.1提供一種豬a干擾素重組腺病毒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用； 200610130621.7提供一種牛y-干擾素在重組桿狀病毒中的表達(dá)及抗病毒活性的測(cè)定的方法。但有關(guān)利用牛血制備牛白細(xì)胞干擾素的方法還未見報(bào)道。因此，提供一種有效預(yù)防和治療牛病毒性疾病的牛白細(xì)胞干擾素的制備方法，是該技術(shù)領(lǐng)域科研人員急需開發(fā)的新課題之一。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服上述技術(shù)中的不足之處，提供一種牛白細(xì)胞干擾 素的制備方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明所采用的實(shí)施方式如下 一種牛白細(xì)胞干擾素的制備方法，其特征在于具體實(shí)施步驟如下(1) 無(wú)菌采集牛血，加入10pg/ml卡那霉素和適量抗凝劑，4.0。C冰箱放 置；以加004000rpm離心牛血，收集灰黃層，用培制好的培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞沉 淀物，使白細(xì)胞濃度稀釋為每ml含l x 105-1 x 107;(2) 白細(xì)胞懸液中加入少量干擾素，使其最終濃度為100-600單位/ml， 于37。C水浴攪拌培養(yǎng)2-3小時(shí)；(3) 在啟動(dòng)的白細(xì)胞懸液中再加入適量誘生劑新城疫病毒，使其最終濃 度為128-1280血凝單位/ml， 37。C搖床攪拌培養(yǎng)18-24小時(shí)；(4) 待干擾素達(dá)到最高峰時(shí)，離心收集上清，加入鹽酸調(diào)至pH2.0， 4.0 。C，放置l-4天，滅活病毒，再加NaOH調(diào)至pH7.0,即得粗制牛白細(xì)胞干擾素。本發(fā)明的有益效果是豬基因工程干擾素具有制備成本高，在臨床推廣 中受到很到限制。本發(fā)明利用牛血制備牛白細(xì)胞干擾素的方法其具有很多 優(yōu)點(diǎn)制備成本低，使用劑量低，療效好。牛白細(xì)胞干擾素含有a干擾素和卩 干擾素，如果成功地解決了血源來(lái)源和血源污染等問(wèn)題，在保證質(zhì)量的前提 下，利用牛血制備牛白細(xì)胞干擾素能夠降低了藥物的成本。因此該產(chǎn)品具有 巨大市場(chǎng)前景和很好的經(jīng)濟(jì)效益。本產(chǎn)品注入動(dòng)物機(jī)體后，具有療效好、安 全可靠、用量低、無(wú)毒副作用和成本低等優(yōu)點(diǎn)。其功能是作為一種廣譜抗病 毒作用，能夠治療牛病毒性腹瀉，?？谔阋叩炔《拘约膊?。臨床試驗(yàn)總治愈 率為82.2%以上，人工控制治療?？谔阋吆团２《拘愿篂a總治愈率分別為81.3 %和95.2%。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)依據(jù)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式
詳述如下 實(shí)施例1牛白細(xì)胞干擾素的制備方法，具體步驟如下(1) 白細(xì)胞制備無(wú)菌采集牛血，加入抗生素和抗凝劑，4.0。C冰箱放置。以2000-4000rpm 離心牛血，收集灰黃層，用培制好的培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞沉淀物，使白細(xì)胞濃度 稀釋為每ml含1 xio6。白細(xì)胞的分離應(yīng)在采血后48小時(shí)內(nèi)進(jìn)行?；罴?xì)胞數(shù)應(yīng) 達(dá)到90%以上。(2) 誘生病毒采用新城雞瘟病毒(NDV) F抹，血凝效價(jià)達(dá)到適宜滴度方可投產(chǎn)。 (3 )培養(yǎng)液釆用RPMI-1640，內(nèi)含適量牛血清和10)ig/ml卡那霉素或慶大霉素，也可 用其它適宜培養(yǎng)液。(4) 生產(chǎn)用原水應(yīng)符合飲用水標(biāo)準(zhǔn)，直接用于制品的水應(yīng)符合注射用水標(biāo)準(zhǔn)。(5) 粗制干擾素的制備工藝 (5.1 )誘生病毒的制備采用9-10日齡健康雞胚，于每胚的尿嚢腔內(nèi)接種適量新城疫病毒，37。C培 養(yǎng)48-72小時(shí)，雞胚發(fā)育良好，病毒達(dá)到適宜滴度后，收集尿嚢液，并做無(wú)菌 試驗(yàn)，檢驗(yàn)合格后合并，抽樣做效價(jià)測(cè)定，放-2(TC待用。(5.2) 白細(xì)胞懸液用離心法分離血漿，吸取白細(xì)胞層，然后用步驟(3)中配置的培養(yǎng)液稀 釋，以每ml含5xl(^為宜。(5.3) 起動(dòng)與誘生 ，白細(xì)胞懸液中加入少許白細(xì)胞干擾素，使其最終濃度為400-600單位/ml， 于37。C水浴攪拌培養(yǎng)2小時(shí)，再加入512-1026血凝單位/ml新城疫病毒進(jìn)行誘 生，待干擾素達(dá)到最高峰時(shí)，收集上清，將上清經(jīng)酸化和中性化后滅活病毒， 即為粗制牛白細(xì)胞干擾素。(5.4) 待干擾素達(dá)到最高峰時(shí)，離心收集上清，加入鹽酸調(diào)至pH2.0, 4.0 。C,放置2天，滅活病毒，再加NaOH調(diào)至pH7.0,即得粗制牛白細(xì)胞干擾素。(5.5) 離心收集上清即得粗制白細(xì)胞干擾素，放-20。C保存。 實(shí)施例2牛白細(xì)胞干擾素的制備方法，具體步驟如下(l)無(wú)菌采集牛血，加入10pg/ml青霉素、鏈霉素和適量抗凝劑，4.0°C 水箱放置。以2000-4000rpm離心牛血，收集灰黃層，用配置好的1640培養(yǎng)基 稀釋細(xì)胞沉淀物，使白細(xì)胞濃度稀釋為每ml含1 x io7。(2 )在白細(xì)胞懸液中加入4-8%牛血清或血漿，混勻。(3 )在上述白細(xì)胞懸液中加入少許干擾素，使其最終濃度為200-300單位 /ml,于37。C水浴攪拌培養(yǎng)3小時(shí)。(4 )在啟動(dòng)的白細(xì)胞懸液中再加入256-512血凝單位/ml新城疫病毒進(jìn)行 誘生，37。C搖床攪拌培養(yǎng)12-24小時(shí)。(5 )待干擾素達(dá)到最高峰時(shí)，以2000-4000rpm離心，離心收集上清，加 入鹽酸調(diào)至pH2.0, 4.0°C,放置4天，滅活病毒，再加N'aOH調(diào)至pH7.0,即得粗制牛細(xì)胞干擾素。 實(shí)施例3牛白細(xì)胞干擾素的制備方法，具體步驟如下(1) 無(wú)菌采集牛血，加入10iig/ml卡那霉素和適量抗凝劑，4.0。C水箱放 置。以2000-4000rpm離心牛血，收集灰黃層，用培制好的培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞沉 淀物，使白細(xì)胞濃度稀釋為每ml含1 x io5。(2) 白細(xì)胞懸液中加入少許干擾素，使其最終濃度為100-200單位/ml， 于37。C水浴攪拌培養(yǎng)2小時(shí)。(3 )在啟動(dòng)的白細(xì)胞懸液中再加入256-1280血凝單位/ml新城疫病毒進(jìn)行 誘生，同時(shí)在白細(xì)胞懸液中加入含4-8。/。牛血清或血漿的DMEM培養(yǎng)基，37°C 搖床攪拌培養(yǎng)12-24小時(shí)。(4)待干擾素達(dá)到最高峰時(shí)，以2000-4000rpm離心，收集上清即得粗制 牛白細(xì)胞干擾素。實(shí)施例4牛白細(xì)胞干擾素的制備方法，具體步驟如下(1) 培養(yǎng)耀滅菌進(jìn)口罐推入滅菌拒滅菌，國(guó)產(chǎn)罐采用管道通入高壓蒸 汽進(jìn)行滅菌，并先打開排氣閥，使罐體充分預(yù)熱和排盡罐內(nèi)冷空氣，使罐內(nèi) 溫度達(dá)120-125。C,維持30分鐘，可徹底滅菌，然后停氣冷卻。(2) 培養(yǎng)液用RPMI1640并按300mg/L谷氨酰胺，40000單位/L慶大霉 素或卡那霉素，2%( v/v )牛血漿進(jìn)行配制，當(dāng)罐體溫度降至40。C時(shí)，用Millipore 多層膜過(guò)濾器將培養(yǎng)基濾入罐內(nèi)，確保培養(yǎng)基無(wú)菌，開動(dòng)攪拌裝置及恒溫系 統(tǒng)，使轉(zhuǎn)速控制在120r/min,溫度控制在36-37。C。(3) 制備牛白細(xì)胞懸液將9倍體積的0.83。/。冷NH4Cl加入分漿后的血細(xì)胞中，于4。C存放10 ~ 20分 鐘，經(jīng)2000r/min離心10分鐘收集細(xì)胞，再用冷0.83% NH4C1再處理一次，盡量 除去紅細(xì)胞，將收集的白細(xì)胞，用PBS洗兩次，用培養(yǎng)液洗一次后，集中至大瓶中，與連通的導(dǎo)液管導(dǎo)入罐內(nèi)，攪拌20-30分鐘后，準(zhǔn)備好干擾素液 (20000/ml)和NDV-F病毒液及5% NaHC03,分別與進(jìn)樣口的導(dǎo)液管接通。(4) 起動(dòng)誘導(dǎo)先加入IFN-a懸液[按l。/。(v/v)，即100IU/m1],攪拌培養(yǎng)2 小時(shí)，進(jìn)行起動(dòng)誘生。(5) 正式誘導(dǎo)打開病毒導(dǎo)液管，將NDV-F系(1:1280以上)導(dǎo)入罐內(nèi)， 按10%加入，即100-300血凝單位/ml進(jìn)行正式誘生，并用5% NaHC03調(diào)整pH 至7.2-7.4,攪拌培養(yǎng)18-20小時(shí)。(6) 收獲干擾素誘導(dǎo)結(jié)束，由罐底部的排液管放出誘導(dǎo)后的細(xì)胞懸液， 離心后收上清，經(jīng)6N HCL酸化至pH2.0、于4。C存放5天，再用6N NaOH調(diào)回 pH至7.0， 2500r/min離心20分鐘，離心收集上清即得粗制白細(xì)胞干擾素，放-20 。C保存。(7) 除菌后無(wú)菌分裝，冷凍干燥。為預(yù)防及治療牛病毒性傳染性疾病，本發(fā)明提供了一種治療牛病毒性疾 病的牛白細(xì)胞干擾素的制備方法，首先取牛新鮮抗凝全血，無(wú)菌留取灰黃層, 使用雞新城疫病毒作為誘生劑誘導(dǎo)健康豬白細(xì)胞干擾素，其包括有白細(xì)胞懸 液、啟動(dòng)干擾素、病毒液和培養(yǎng)液，經(jīng)原料制備—混和—水浴攪拌、誘導(dǎo)培 養(yǎng)—離心收獲—滅活病毒—解凍除菌—分裝—成品包裝工序制成，制成的牛 白細(xì)胞干擾素。留樣分別作無(wú)菌試驗(yàn)、余毒試驗(yàn)及安全檢驗(yàn)。獲得了高產(chǎn)量 干擾素，干擾素效價(jià)大于10240單位/ml，無(wú)菌試驗(yàn)、余毒試驗(yàn)均陰性，動(dòng)物體 內(nèi)注射后均健康存活，無(wú)不良反應(yīng)。本發(fā)明產(chǎn)品為淺白色海綿狀疏松團(tuán)塊，易脫壁，加注射用水后迅速溶解， 呈均勻的懸液。規(guī)格干擾素含量大于3.0萬(wàn)單位/瓶。其功能是作為一種廣譜 抗病毒生物制品。本發(fā)明制備的牛干擾素具有治療牛病毒性疾病和牛乳房炎 等病毒病作用，同時(shí)對(duì)細(xì)菌性疾病也有治療作用。用于防治牛疾病。如牛病 毒性腹瀉一黏膜病、口^帝疫、牛流行熱、牛流行熱、藍(lán)舌病、瘋牛病白痢、 牛乳房炎等疾病。用法與用量小牛l萬(wàn)-10萬(wàn)單位/頭/天，育牛10萬(wàn)-100萬(wàn)單 位/頭/天。每日注射l次， 一個(gè)療程3次，病重用量略加。本發(fā)明是一種廣i普抗病毒制劑，主要治療牛病毒性疾病，例如牛藍(lán)舌病、牛傳染性鼻氣管炎、牛病毒性腹瀉-黏膜病病毒性和牛輪狀病毒病等。通過(guò)注 射該制劑，使其與周圍細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，從而抑制 病毒的繁殖，起到抗病毒作用。臨床實(shí)-險(xiǎn)i正明利用本發(fā)明研制的牛白細(xì)胞干擾素治療牛藍(lán)舌病、牛傳染性鼻氣管炎、 牛病毒性腹瀉-黏膜病病毒性和牛輪狀病毒病等牛疾病共1824頭，治愈1346 頭，治愈率達(dá)73.8%以上；其中特別是治療黃犢牛輪狀病毒引起的腹瀉有效率 達(dá)95.8%,治愈率高達(dá)91.2%,效果非常顯著。病毒性腹瀉患牛經(jīng)干擾素單獨(dú) 治療后的痊愈率明顯高于未經(jīng)干擾素治療的對(duì)照組。上述參照實(shí)施例對(duì)該牛白細(xì)胞干擾素的制備方法進(jìn)行的詳細(xì)描述，是說(shuō) 明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個(gè)實(shí)施例，因此在不 脫離本發(fā)明總體構(gòu)思下的變化和修改，應(yīng)屬本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1、一種牛白細(xì)胞干擾素的制備方法，其特征在于具體實(shí)施步驟如下(1)無(wú)菌采集牛血，加入10μg/ml卡那霉素和適量抗凝劑，4.0℃冰箱放置；以2000-4000rpm離心牛血，收集灰黃層，用培制好的培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞沉淀物，使白細(xì)胞濃度稀釋為每ml含1×105-1×107；(2)白細(xì)胞懸液中加入少量干擾素，使其最終濃度為100-600單位/ml，于37℃水浴攪拌培養(yǎng)2-3小時(shí)；(3)在啟動(dòng)的白細(xì)胞懸液中再加入適量誘生劑新城疫病毒，使其最終濃度為128-1280血凝單位/ml，37℃搖床攪拌培養(yǎng)18-24小時(shí)；(4)待干擾素達(dá)到最高峰時(shí)，離心收集上清，加入鹽酸調(diào)至pH2.0，4.0℃，放置1-4天，滅活病毒，再加NaOH調(diào)至pH7.0，即得粗制牛白細(xì)胞干擾素。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種治療牛病毒性疾病的牛白細(xì)胞干擾素的制備方法。實(shí)施步驟如下(1)無(wú)菌采集牛血，加入抗生素和抗凝劑，4.0℃冰箱放置；以2000-4000rpm離心牛血，收集灰黃層，用培制好的培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞沉淀物，使白細(xì)胞濃度稀釋為每ml含1×10⁵-1×10⁷；(2)白細(xì)胞懸液中加入少量干擾素，于37℃水浴攪拌培養(yǎng)2-3小時(shí)；(3)在啟動(dòng)的白細(xì)胞懸液中再加入適量誘生劑新城疫病毒，使其最終濃度為128-1280血凝單位/ml，37℃搖床攪拌培養(yǎng)18-24小時(shí)；(4)待干擾素達(dá)到最高峰時(shí)，離心收集上清，加入鹽酸調(diào)至pH 2.0，4.0℃，放置1-4天，滅活病毒，再加NaOH調(diào)至pH7.0，即得粗制牛白細(xì)胞干擾素。本產(chǎn)品注入動(dòng)物機(jī)體后，具有療效好、安全可靠，用量低、無(wú)毒副作用和成本低等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C07K14/555GK101250223SQ20081005265
公開日2008年8月27日 申請(qǐng)日期2008年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月8日
發(fā)明者古長(zhǎng)慶 申請(qǐng)人:天津生機(jī)集團(tuán)股份有限公司