豬白細胞干擾素的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物制劑【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種豬白細胞干擾素的制備方法,通過加入明膠生理鹽水分層、離心、重懸沉淀，加入氯化銨溶液離心后培養(yǎng)，加入新城疫病毒NDVⅡ旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，再通過NaOH、Hcl調(diào)整PH值，離心去除沉淀后制得豬白細胞干擾素粗制液，將豬白細胞干擾素粗制液先加入滅菌的硫氰酸鉀溶解后再進行酸化處理，離心后的沉淀物用霧化法加入乙醇溶液，離心去除沉淀調(diào)節(jié)PH值后依次加入NaAc、KCNS離心沉淀，將沉淀物加入PBS溶解透析，即制得精制的豬白細胞干擾素，本發(fā)明制得的豬白細胞干擾素活性較高，通過氯化銨溶液裂解使白細胞純度大大提高，NaAc使干擾素提純效果更好，活性回收率更高，同時提高了干擾素的整體產(chǎn)量，降低了干擾素的生產(chǎn)成本。
【專利說明】豬白細胞干擾素的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物制劑【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種能夠有效提高白細胞活力和純度的豬白細胞干擾素的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]干擾素(IFN)是一種廣譜抗病毒劑，并不直接殺傷或抑制病毒，而主要是通過細胞表面受體作用使細胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，從而抑制乙肝病毒的復(fù)制，其類型分為三類，α -(白細胞)型、(成纖維細胞)型和Y-(淋巴細胞)型；同時還可增強自然殺傷細胞(NK細胞)、巨噬細胞和T淋巴細胞的活力，從而起到免疫調(diào)節(jié)作用，并增強抗病毒能力。干擾素于1957年由Issacs和Lindeman首先發(fā)現(xiàn),它是一組具有多種功能的活性蛋白質(zhì)(主要是糖蛋白)，是一種由單核細胞和淋巴細胞產(chǎn)生的細胞因子。1979年Carter從豬白細胞中成功誘導(dǎo)出干擾素，研究表明:豬白細胞干擾素(PLeIFN)是一種小分子蛋白質(zhì)，如同豬的胰島素、促甲狀腺素等小分子多肽，可以作用于動物機體表現(xiàn)出高抗病毒活性而無副作用。PLeIFN作為光譜抗病毒藥物，具有抗病毒、抑制腫瘤細胞生長、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等多種生物學功能，其療效在醫(yī)學臨床已經(jīng)得到普遍肯定。隨著病原菌新菌株、變異株的不斷出現(xiàn)，目前很多藥物對某些畜禽疾病已經(jīng)難以顯示滿意的防治效果，尤其是病毒性疾病的危害日益嚴重。特別是近些年來，豬病毒性傳染病發(fā)病率較高，嚴重地阻礙著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。而PLeIFN作為一種生物制品，不僅治療直接，而且安全有效，同時PLeIFN的使用對目前尚無有效藥物治療的豬病毒性疾病具有重要的臨床意義。然而，在現(xiàn)有的PleIFN制備過程中，由于白細胞活性低、雜蛋白的過多等原因，導(dǎo)致現(xiàn)有豬白細胞干擾素的生產(chǎn)成本過高、產(chǎn)品質(zhì)量難控制以及臨床療效不穩(wěn)定 ，嚴重影響了豬白細胞干擾素的應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足而提供一種能夠有效提高白細胞活力和純度的豬白細胞干擾素的制備方法。
[0004]本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的:一種豬白細胞干擾素的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:
步驟I)、將無菌方法采集的新鮮抗凝血加入到等體積30g/L的明膠生理鹽水中，混合均勻后靜置在37°C恒溫箱中，至分層清楚，取上層液以3000rpm離心15min，棄上清液，重懸沉淀；
步驟2)、取步驟I收集的沉淀按照體積比1:1加入質(zhì)量體積濃度0.83%的氯化銨溶液，混合均勻后以3000rpm離心15min，取第一次離心后的沉淀再次按照1:1的比例加入0.83%的氯化銨溶液，混合均勻后以3000rpm離心15min,將二次離心后的沉淀用Hanks液洗漆三遍,加入原全血液I~1.5倍體積量的含5%豬血清的Eagle’s MEM混合培養(yǎng)液懸浮，根據(jù)細胞計數(shù)的結(jié)果進行稀釋，將豬白細胞數(shù)控制在IX 17個/ml~5X 17個/ml之間；
步驟3)、在已稀釋好的每毫升細胞懸液中加入含100個活性單位的豬白細胞干擾素，置于37°C水浴搖床攪拌培養(yǎng)3h ；
步驟4)、按照每毫升豬白細胞懸液40~80HA NDV II的加入量，在細胞懸液中加入一定量新城疫病毒NDV II，于水浴恒溫振蕩器37°C旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)24h，培養(yǎng)時分別在2? 3Κ6? 71ι期間加入I MNaOH溶液將pH控制在7.3~7.4，培養(yǎng)完成后，用6M Hcl把培養(yǎng)液pH調(diào)至
3.5，在4°C下酸化處理4d，再用質(zhì)量體積濃度6%的NaOH溶液把pH調(diào)至7.4，離心去除沉淀，上清液即為豬白細胞干擾素粗制液；
步驟5)、取步驟4制得的豬白細胞干擾素粗制液樣品作無菌、余毒檢查試驗，陰性者置低溫冰箱儲存?zhèn)溆谩?br> [0005]一種豬白細胞干擾素的制備方法，其特征在于:所述的豬白細胞干擾素粗制液通過以下步驟純化:
①在未經(jīng)酸化處理的豬白細胞干擾素粗制液中加入滅菌的粉末狀的硫氰酸鉀，放入超聲波清洗儀中加速溶解，使硫氰酸鉀最終濃度為0.5M(mol/L)；
溶解后的混合液用6 M Hcl把培養(yǎng)液pH調(diào)至3.5，在4°C靜置過夜；
S.次日以3500 rpm離心30min，沉淀物中用霧化法加入1/5體積量的_20°C預(yù)冷的
95%乙醇溶液，邊加邊搖，待完全溶解后以2000 rpm離心10min，棄去沉淀；
④上清液以IMNaOH溶液調(diào)pH至5.0,以3500 rpm離心30min,收集上清液,用IMNaOH調(diào)pH至5.6,然后以2000 rpm離心1min,棄去沉淀；
⑤用IMNaOH將上清液pH調(diào)至7.6，離心后的沉淀物加入原豬白細胞干擾素粗制液1/10體積的0.1M NaAc溶液溶解，往上述溶液中加入2M KCNS溶液，使其終濃度為0.5M，將pH調(diào)為3.5，置冰箱中過夜，然后以3000 rpm離心15min沉淀；
⑥將步驟⑤制得的沉淀用其5倍體積的0.05M PBS (pH 8.0)進行溶解并在4°C透析3d，每d更換一次透析液，透析脫鹽后，經(jīng)檢測CNS_合格，即為精制豬白細胞干擾素，再以15000rpm高速離心Ih后棄去沉淀，上清液即為純化的豬白細胞干擾素，在_20°C下貯存?zhèn)溆谩?br> [0006]本發(fā)明具有如下積極效果:
1、白細胞活性大大提聞
通過對白細胞計數(shù)，同時對收集到的白細胞進行臺盼藍染色實驗，測定活細胞率。
[0007]實驗原理:細胞損傷或死亡時，臺盼藍染料可以穿過變形的細胞膜，與解體的DNA結(jié)合，使其著色，而活細胞能阻止這類染料進入細胞內(nèi)，借此可以鑒別死細胞和活細胞。
[0008]結(jié)果觀察:鏡下觀察，死細胞被染成淺藍色，而活細胞拒染。
[0009]細胞活力計算:活細胞率(％)=活細胞總數(shù)/ (活細胞總數(shù)+死細胞總數(shù))X 100% 分別在相同條件下做三組白細胞臺盼藍染色實驗，在鏡下觀察細胞染色情況，并對白細胞數(shù)量進行統(tǒng)計，有如下結(jié)果:

【權(quán)利要求】
1.一種豬白細胞干擾素的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟I)、將無菌方法采集的新鮮抗凝血加入到等體積30g/L的明膠生理鹽水中，混合均勻后靜置在37°C恒溫箱中，至分層清楚，取上層液以3000rpm離心15min，棄上清液，重懸沉淀； 步驟2)、取步驟I收集的沉淀按照體積比1:1加入質(zhì)量體積濃度0.83%的氯化銨溶液，混合均勻后以3000rpm離心15min，取第一次離心后的沉淀再次按照1:1的比例加入0.83%的氯化銨溶液，混合均勻后以3000rpm離心15min,將二次離心后的沉淀用Hanks液洗漆三遍,加入原全血液I~1.5倍體積量的含5%豬血清的Eagle’s MEM混合培養(yǎng)液懸浮，根據(jù)細胞計數(shù)的結(jié)果進行稀釋，將豬白細胞數(shù)控制在IX 17個/ml~5X 17個/ml之間； 步驟3)、在已稀釋好的每毫升細胞懸液中加入含100個活性單位的豬白細胞干擾素，置于37°C水浴搖床攪拌培養(yǎng)3h ； 步驟4)、按照每毫升豬白細胞懸液40~80HA NDV II的加入量，在細胞懸液中加入一定量新城疫病毒NDV II，于水浴恒溫振蕩器37°C旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)24h，培養(yǎng)時分別在2h~3h,6h~7h期間加入I MNaOH溶液將pH控制在7.3~7.4，培養(yǎng)完成后，用6M Hcl把培養(yǎng)液pH調(diào)至3.5，在4°C下酸化處理4d，再用質(zhì)量體積濃度6%的NaOH溶液把pH調(diào)至7.4，離心去除沉淀，上清液即為豬白細胞干擾素粗制液； 步驟5)、取步驟4制得的豬白細胞干擾素粗制液樣品作無菌、余毒檢查試驗，陰性者置低溫冰箱儲存?zhèn)溆谩?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬白細胞干擾素的制備方法，其特征在于:所述的豬白細胞干擾素粗制液通過以下步驟純化: ①在未經(jīng)酸化處理的豬白細胞干擾素粗制液中加入滅菌的粉末狀的硫氰酸鉀，放入超聲波清洗儀中加速溶解，使硫氰酸鉀最終濃度為0.5M(mol/L)； S溶解后的混合液用6 M Hcl把培養(yǎng)液pH調(diào)至3.5，在4°C靜置過夜； S次日以3500 rpm離心30min，沉淀物中用霧化法加入1/5體積量的_20°C預(yù)冷的95%乙醇溶液，邊加邊搖，待完全溶解后以2000 rpm離心10min，棄去沉淀； ④上清液以IMNaOH溶液調(diào)pH至5.0,以3500 rpm離心30min,收集上清液,用IMNaOH調(diào)pH至5.6,然后以2000 rpm離心1min,棄去沉淀； ⑤用IMNaOH將上清液pH調(diào)至7.6，離心后的沉淀物加入原豬白細胞干擾素粗制液1/10體積的0.1M NaAc溶液溶解，往上述溶液中加入2M KCNS溶液，使其終濃度為0.5M，將pH調(diào)為3.5，置冰箱中過夜，然后以3000 rpm離心15min沉淀； ⑥將步驟⑤制得的沉淀用其5倍體積的0.05M PBS (pH 8.0)進行溶解并在4°C透析3d，每d更換一次透析液，透析脫鹽后，經(jīng)檢測CNS_合格，即為精制豬白細胞干擾素，再以15000rpm高速離心Ih后棄去沉淀，上清液即為純化的豬白細胞干擾素，在_20°C下貯存?zhèn)溆谩?br> 【文檔編號】C07K1/30GK104072602SQ201410352311
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年7月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月23日
【發(fā)明者】李勉, 張永奎, 郭婧, 賈麗敏 申請人:張永奎