一種制備豬源干擾素-λ3的方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種制備豬源干擾素-λ3（IFN-λ3）蛋白的方法和應(yīng)用，屬于基因工程產(chǎn)品制備領(lǐng)域。包括編碼豬源干擾素-λ3基因的克隆，含不包括信號肽序列的豬源干擾素-λ3基因的原核表達(dá)載體的構(gòu)建，用所述含豬源干擾素-λ3基因的重組原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌和誘導(dǎo)表達(dá)，最佳誘導(dǎo)溫度、時間和IPTG濃度分別為誘導(dǎo)溫度20℃，時間16h，IPTG濃度0.4mM。通過本方法制備的產(chǎn)品為研究豬源干擾素-λ3生物活性及其作用機(jī)理提供了基礎(chǔ)，也可在制備抗豬流行性腹瀉病毒藥物中應(yīng)用。
【專利說明】—種制備豬源干擾素- λ 3的方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程產(chǎn)品制備領(lǐng)域，具體涉及一種制備豬源干擾素-λ 3(IFN-λ 3)蛋白的方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]干擾素(interferon, IFN)是人和動物細(xì)胞受到病毒感染,或者受核酸、細(xì)菌內(nèi)毒素、促細(xì)胞分裂素等作用后，由受體細(xì)胞分泌的一種具有高度生物學(xué)活性的糖蛋白。干擾素具有生物學(xué)活性及其速效多能、無毒害等優(yōu)點(diǎn)，成為預(yù)防和治療豬病毒性疾病的的理想生物制品。干擾素除具有抗病毒活性外，還具有免疫調(diào)節(jié)作用，同時可作為免疫佐劑提高疫苗的免疫活性。根據(jù)干擾素的生物學(xué)活性和抗原活性不同可將其分為三類:IFN-a、IFN_i3、IFN-Y，并將具有共同表面受體的IFN-α和IFN-β歸屬于I型干擾素；而與IFN-α、IFN-β具有不同表面受體的IFN-Y，歸屬于II型干擾素。
[0003]目前，國內(nèi)外學(xué)者對I型和II型IFN生物學(xué)功能和抗病毒作用已經(jīng)進(jìn)行了深入的研究，而對于III型IFN的研究卻相對滯后。III型IFN又稱為IFN-λ，包括IFN-λ 1，IFN-λ 2和IFN-λ 3，由于其基因結(jié)構(gòu)與IL-10相似，所以又稱為IL-29、IL-28A、IL-28B。雖SIFN-X在基因組水平上與IL-10超家族成員具有相似的內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)，但在蛋白質(zhì)水平上與I型IFN關(guān)系更為密切?，F(xiàn)有研究顯示，IFN-λ s與IFN-α有相似的抗病毒、抑制腫瘤細(xì)胞生長以及具免疫調(diào)節(jié)功能等生物學(xué)活性，但由于其骨髓抑制及毒副作用少而生物學(xué)作用具有長效性，且在人醫(yī)臨床試驗(yàn)研究已經(jīng)取得了突破性進(jìn)展，有望在不久的將來成為一個新的基因工程藥物。因此IFN-λ s基因的表達(dá)和應(yīng)用前景成為亟待解決的科研問題。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004]為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種制備豬源干擾素-λ 3 (IFN-λ 3)蛋白的方法，本發(fā)明的方法具體地說是利用RT-PCR技術(shù)克隆豬源IFN-λ 3，并構(gòu)建了原核表達(dá)載體，在原核表達(dá)系統(tǒng)一BL21 (DE3)plysS表達(dá)IFN-λ 3。
[0005]本發(fā)明的另一目的在于提供所述IFN- λ 3的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種在大腸桿菌中表達(dá)豬源IFN-λ 3基因的方法，具體步驟如下:
[0007](I)用 poly (1:C) (polyinosinic-polycytidylie acid,多聚胞苷酸)誘導(dǎo)培養(yǎng)ST細(xì)胞，收獲誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞，用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA ；
[0008](2)設(shè)計擴(kuò)增豬源IFN-λ 3基因全長的特異性引物(SI和S2)，以及擴(kuò)增不含信號肽序列的豬源IFN-λ 3的特異性引物(Pl和P2)，引物如下:
[0009]上游引物S1:5，-ATGGCCCTGGGTGGCTCG-3，；
[0010]下游引物S2:5 ’ -TCAGACACACAGGTCTCC-3 ’ ；
[0011]上游引物P1: 5 ’ -CGGGTACCGTGCCTGTCCCTGAAGCCC-3，引入 Kpn I 酶切位點(diǎn)；[0012]下游引物P2:5’ -CCGCTCGAGGACACACAGGTCTCCACT-3’ 引入 Xho I 酶切位點(diǎn)；
[0013](3)利用引物SI和S2通過RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增豬源IFN-λ 3基因全長，；
[0014](4)將豬源IFN-λ 3基因克隆入pMD-18T載體、進(jìn)行測序鑒定，獲得重組載體PMD-18T-1FN-λ 3 ；
[0015](5)以pMD-18T-1FN-X 3克隆載體為模板，利用引物Pl和P2擴(kuò)增不含信號肽序列的豬源IFN-λ 3的基因，并利用Kpn I和Xho I這兩個多克隆位點(diǎn)，將豬源IFN-λ 3基因定向亞克隆至原核表達(dá)載體pET-32a，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-Po-1FN- λ 3 ；
[0016](6)重組表達(dá)質(zhì)粒 pET-32a-Po-1FN_A3 轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)plysS ；
[0017](7)確定原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)豬源IFN- λ 3的最佳誘導(dǎo)溫度、時間和IPTG濃度； [0018](8)豬源IFN-λ3在大腸桿菌BL21(DE3)plysS中的誘導(dǎo)表達(dá)。
[0019]步驟(7)中所述的最佳誘導(dǎo)溫度、時間和IPTG濃度為誘導(dǎo)溫度為20°C，時間為16h, IPTG 濃度為 0.4mM0
[0020]上述方法獲得的豬源IFN-X3蛋白在制備抗PEDV病毒(豬流行性腹瀉病毒，porcine epidemic diarrhea virus)藥物中的應(yīng)用。
[0021]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:
[0022]①pET載體表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)效率非常高。
[0023]②pET載體表達(dá)系統(tǒng)攜帶His標(biāo)簽，便于純化。
[0024]③在構(gòu)建pET_32a的原核表達(dá)載體時，通過引物設(shè)計將IFN- λ 3的信號肽序列去除，使得構(gòu)建獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-Po-1FN- λ 3具有更高的蛋白表達(dá)效率。
[0025]④將制備獲得的IFN- λ 3應(yīng)用于抗流行性腹瀉病毒，從而為制備抗流行性腹瀉病毒的藥物提供很好的選擇。
[0026]⑤本發(fā)明制備獲得PoIFN- λ 3抗PEDV活性高，能夠達(dá)到5Χ 103U/mg。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1是構(gòu)建含有PoIFN- λ 3基因的重組克隆載體的流程圖；
[0028]圖2是IFN- λ 3的SDS-PAGE電泳圖；其中M:蛋白Markers ; 1:無IPTG誘導(dǎo)對照組(上清)；2:無IPTG誘導(dǎo)對照組(沉淀)；3:0.4mM IPTG20°C過夜誘導(dǎo)(上清)；4:0.4mMIPTG20°C過夜誘導(dǎo)(沉淀);5:0.4mM IPTG25°C過夜誘導(dǎo)(上清);6:0.4mM IPTG25°C過夜誘導(dǎo)(沉淀)；7:0.4mM IPTG30°C過夜誘導(dǎo)(上清)；8:0.4mM IPTG30°C過夜誘導(dǎo)(沉淀)；9:0.4mMIPTG37°C誘導(dǎo) 5h (上清)；10:0.4mM IPTG37°C誘導(dǎo) 5h (沉淀)。
[0029]圖3 是 IFN-λ 3 的 Western-blot 圖。其中，l:pET_32a 空載體；2:pET-32a-Po-1FN-A 3。
【具體實(shí)施方式】
[0030]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0031]實(shí)施例1、豬源IFN-λ 3的制備方法，依次進(jìn)行以下步驟:
[0032](I)構(gòu)建克隆載體:
[0033]①用poly (1:0誘導(dǎo)(1.5呢，211)培養(yǎng)51'細(xì)胞(1\105/1111)，收獲誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞，用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA ；
[0034]②根據(jù)GenBank上發(fā)表的唯——條豬源IFN- λ 3基因序列(GQ996936)設(shè)計特異性的引物，設(shè)計擴(kuò)增豬源IFN-λ 3基因全長的特異性引物(SI和S2)，
[0035]上游引物S1: 5，-ATGGCCCTGGGTGGCTCG-3，
[0036]下游引物S2:5，-TCAGACACACAGGTCTCC-3，；
[0037]③利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增豬源IFN- λ 3基因全長(用PrimeScript RT-PCR Kit進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增)；RT-PCR 的反應(yīng)條件為 50°C 30min ；94°C 3min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 40s,35 個循環(huán)；72°C IOmin ；
[0038]④通過轉(zhuǎn)化ToplO大腸桿菌，將豬源IFN-λ 3基因克隆入pMD-18T載體、進(jìn)行測序鑒定，獲得正確的重組載體PMD-18T-1FN- λ 3。
[0039](2)構(gòu)建表達(dá)載體
[0040] ①設(shè)計擴(kuò)增不含信號肽序列的豬源IFN-λ 3的特異性引物(Pl和Ρ2)，引物如下:
[0041]Pl:5’ -CGGGTACCGTGCCTGTCCCTGAAGCCC-3’(含 Kpn I 酶切位點(diǎn))；
[0042]Ρ2:5’ -CCGCTCGAGGACACACAGGTCTCCACT-3’(含 Xho I 酶切位點(diǎn))；
[0043]豬源IFN- λ 3核苷酸序列如下:
[0044]ATGGCCCTGGGTGGCTCGCTGGTGCTGGTGCTGGTGCTGATGACGGTGGCTCCACCCAGGACAGGAGCGGTGCCTGTCCCTGAAGCCCTCAGGGCCCTCCCAGGAGCAAGGGGCTGCCACTTGGCCCAGTTCAAGTCTCTGTCCCCACAAGCGCTGCAGGCCTTCAAGAGGGCCAAGGATGCCTTTGAAGAGTCCCTCTTGGAGGACTGGAACTGCAGCTCCCGCATCTTCCCCAGGAGCAGGGACCTGAAGCAGCTGCAGGTGTGGGAGCGCCCCGTGGCCTTGGAGGCCGAGGTGGCCCTGACCCTCAGCGTCCTGGGCTCCTTGGCGAACTCATCCCTGCACAGCAGCCTGGACCAGCCCCTTCACACGCTGCGCCACATCCACGCCCAGCTCCAGGCCTGTGTCCCAGCTCAGCCCATGGCAGGCCCCCGGCCCCGGGGCCGCCTCCACCACTGGCTGCACCGGCTCCAGGAGGCCCAGAAGAAGGAGCCCCAGAGCTGCCTGGAAGCCTCTGTCATGTTCAACCTCTTCCGCCTCCTCACCCGGGACCTGAAATGTGTCGCCAGTGGAGACCTGTGTGTCTGA。
[0045]豬源IFN- λ 3氨基酸序列如下(下劃線部分為信號肽序列):
[0046]MALGGSLVLVLVLMTVAPPRTGAVPVPEALRALPGARGCHLAQFKSLSPQALQAFKRAKDAFEESLLEDWNCSSRIFPRSRDLKQLQVWERPVALEAEVALTLSVLGSLANSSLHSSLDQPLHTLRHIHAQLQACVPAQPMAGPRPRGRLHHWLHRLQEAQKKEPQSCLEASVMFNLFRLLTRDLKCVAS⑶LCV。
[0047]②以測序正確的pMD-18T-1FN-λ 3克隆載體為模板，利用Pl和Ρ2擴(kuò)增不含信號肽序列的豬源IFN- λ 3的基因，將擴(kuò)增獲得的目的片段和原核表達(dá)載體pET-32a分別經(jīng)KpnI和Xho I雙酶切后回收進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)plysS，涂布于含IOOyg/ml氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)過夜；取氨芐青霉素LB平板生長的菌落經(jīng)PCR鑒定目的基因，陽性克隆菌質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定為陽性者表示表達(dá)載體pET-32a-PoIFN-A 3構(gòu)建成功；
[0048]其中，pET-32a-PoIFN_A 3重組表達(dá)載體的構(gòu)建過程示意圖見圖1。
[0049](3 )重組蛋白的表達(dá):
[0050]挑取載體構(gòu)建成功的含pET-32a-Po_IFN-λ 3重組表達(dá)菌BL21 (DE3)plysS，于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中加入異丙基硫代半IPTG (異丙基_β -D-硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)表達(dá)，確定原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)豬源IFN-λ 3的最佳誘導(dǎo)溫度、時間(20°C，16h)和IPTG濃度；重組表達(dá)菌大量擴(kuò)增培養(yǎng)3h后，至細(xì)菌到達(dá)對數(shù)生長期，細(xì)菌在0D600值為0.6左右，方加入誘導(dǎo)劑IPTG，IPTG終濃度為0.4mM。
[0051](4)鑒定重組蛋白:
[0052]經(jīng)步驟(3)中IPTG誘導(dǎo)后，菌體蛋白經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳及考馬斯亮藍(lán)染色顯示，其中IFN-λ 3的SDS-PAGE電泳圖見圖2，與轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒的菌相比，在32KDa左右有一條濃染的新增蛋白條帶。經(jīng)Western-blot鑒定(結(jié)果如圖3所示),能與His單抗發(fā)生強(qiáng)陽性反應(yīng)。
[0053](5)純化重組蛋白，得到粗制品干擾素。
[0054]純化重組蛋白的具體步驟為:
[0055]①將載體構(gòu)建成功的含pET-32a_Po-1FN- λ 3重組表達(dá)菌接種到含100 μ g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C 200r/min振搖培養(yǎng)過夜。取過夜培養(yǎng)的新鮮菌液按1: 100接種，37°C振搖培養(yǎng)至0D600nm達(dá)到0.6左右時，以0.2mmol/L的IPTG誘導(dǎo)過夜。4°C 6000r/min離心IOmin收集菌體；棄上清，向菌體沉淀中加入0.01mol/L pH7.4的PBS緩沖液，洗漆菌體；4? 6000r/min離心IOmin ;棄上清，向菌體沉淀中加入適量buffer A裂解液(約500mL菌液用50mL bufferA),小心懸浮菌體；向懸浮的菌體中加入溶菌酶(終濃度為100μ g/mL)，混勻；冰浴裂解30min ;超聲波破碎細(xì)胞(工作時間5s (功率400W)、間隔時間10s、持續(xù)5min,以超聲波儀間歇5min為一個工作循環(huán),重復(fù)3個循環(huán))；4°C 8000r/min離心IOmin離心收集包涵體；
[0056]buffer A:pH8.5 的 PBS (含 10 μ g/mL DNase, 0.5mmol/L PMSF)。
[0057]②將上清液轉(zhuǎn)移到另外一個離心管中，向沉淀中加入包涵體洗滌液(4mol/L的尿素)，洗滌包涵體5min ；4°C 8000r/min離心IOmin離心收集沉淀，將上清液轉(zhuǎn)入另一干凈離心管中；向沉淀中加入適量b`uffer B (約200mL菌液用IOmLbuffer B)，4°C過夜，溶解包涵體。
[0058]buffer B =N1-Denature-GuHCl 含 IOOmM NaH2PO4, 300mM NaCl，4M GuHCl，ρΗ7.0 ；
[0059]③4°C 12000r/min離心lOmin,將上清用0.45 μ m濾膜過濾后，用N1-NTA親和層析柱純化，具體步驟及溶液配制見本上海生工生物工程有限公司N1-NTA純化說明書BSP079-3，收集60-250mM咪唑的洗脫液即為IFN-λ 3重組蛋白。
[0060]④重組蛋白的復(fù)性和濃縮:將洗脫下來的蛋白裝入透析袋中，夾緊透析袋兩端，依次在復(fù)性液1、2、3、4中透析4小時，最后在緩沖液IOMm Tris-Hcl,0.15Μ NaCl (ρΗ9.0)中透析12-24小時，將透析袋放入一大平皿中用PEG-20000中濃縮，收集濃縮好蛋白于_80度保存。
[0061]配復(fù)性液1:1OmMTris-Hcl，0.2M NaCl，8M 尿素，調(diào) pH 至 7.0 后加入 0.5mM 還原型谷胱甘肽,0.2mM氧化型谷胱甘肽；
[0062]配復(fù)性液2:10mMTris-Hcl，(λ 2M NaCl，6M 尿素，調(diào) pH 至 7.0 后加入 0.5mM 還原型谷胱甘肽,0.2mM氧化型谷胱甘肽；
[0063]配復(fù)性液3:10mMTris-Hcl，(λ 2M NaCl，4M 尿素，調(diào) pH 至 7.0 后加入 0.5mM 還原型谷胱甘肽,0.2mM氧化型谷胱甘肽；
[0064]配復(fù)性液4:10mMTris-Hcl，(λ 2M NaCl，調(diào)pH至7.0后加入2mM還原型谷胱甘肽，
0.4mM氧化型谷胱甘肽。
[0065]實(shí)施例2、本發(fā)明實(shí)施例1制備的豬源IFN- λ 3的活性檢定:[0066]用微量細(xì)胞病變抑制法，以MDBK細(xì)胞(MDBK牛腎細(xì)胞)/VSV (水泡性口腔炎病毒)為基本檢測系統(tǒng)。將抑制50%細(xì)胞病變(CPE)的干擾素的最高稀釋度定義為一個干擾素單位(U)?；钚詸z測結(jié)果表明，豬源IFN-λ 3的生物學(xué)活性為2X 103U/mg。目前所有表達(dá)的1、II型干擾素都是以MDBK細(xì)胞/VSV來檢測干擾素的表達(dá)活性，所以我們也先以該系統(tǒng)分析我們表達(dá)的IFN-λ 3是否有生物活性，然后再分析抗其他病毒的活性
[0067]實(shí)施例3、豬源IFN- λ 3蛋白的抗PEDV病毒(豬流行性腹瀉病毒)作用
[0068]在ST細(xì)胞系(ST豬睪丸細(xì)胞)上測定PoIFN-λ 3 (其中，Po為porcine的簡寫)抗PEDV的作用，采用細(xì)胞病變抑制法。將ST細(xì)胞懸液按I X IOVmL密度接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔體積100 μ L，過夜培養(yǎng)；將復(fù)性后的PoIFN- λ 3用含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基以2^28梯度稀釋，每孔加100 μ L,每個梯度8個重復(fù)孔，370C，體積分?jǐn)?shù)5%的CO2誘導(dǎo)培養(yǎng)24h后吸棄培養(yǎng)液，加入IOOTCID5ci的PEDV，24h后開始觀察病變，連續(xù)觀察3天，同時設(shè)細(xì)胞對照和病毒對照；參照病毒毒價計算法，以病變抑制孔代替毒價測定中病變孔，按Reed-Muench法計算PoIFN- λ 3抗PEDV的活性單位，其中PoIFN- λ 3生物活性效價測定結(jié)果見表1。
[0069]表1 PoIFN- λ 3生物活性效價測定
[0070]
【權(quán)利要求】
1.一種在大腸桿菌中表達(dá)豬源IFN-λ 3基因的方法，其特征在于具體步驟如下: (1)用poly(1: C)誘導(dǎo)培養(yǎng)ST細(xì)胞，收獲誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞，用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA ； (2)設(shè)計擴(kuò)增豬源IFN-λ3基因全長的特異性上游引物SI和下游引物S2，以及擴(kuò)增不含信號肽序列的豬源IFN- λ 3的特異性上游引物Pl和下游引物Ρ2，引物如下:
上游引物 S1:5’ -ATGGCCCTGGGTGGCTCG-3’ ；
下游引物 S2:5’ -TCAGACACACAGGTCTCC-3’ ；
上游引物 Pl:5’ -CGGGTACCGTGCCTGTCCCTGAAGCCC-3’ ；
下游引物 Ρ2:5’ -CCGCTCGAGGACACACAGGTCTCCACT-3’ ； (3)利用引物SI和S2通過RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增豬源IFN-λ3基因全長，； (4)將豬源IFN-X3基因克隆入pMD-18T載體、進(jìn)行測序鑒定，獲得重組載體PMD-18T-1FN-λ 3 ； (5)以pMD-18T-1 FN-A3克隆載體為模板，利用引物Pl和P2擴(kuò)增不含信號肽序列的豬源IFN-λ 3的基因，并利用KpnI和XhoI這兩個多克隆位點(diǎn)，將豬源IFN-λ 3基因定向亞克隆至原核表達(dá)載體pET-32a，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-Po-1FN- λ 3 ； (6)重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-Po-1FN-λ3轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)plysS ； (7)確定原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)豬源IFN-λ3的最佳誘導(dǎo)溫度、時間和IPTG濃度； (8)豬源IFN-λ3在大腸桿菌BL21(DE3)plySS中的誘導(dǎo)表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在大腸桿菌中表達(dá)豬源IFN-λ3基因的方法，其特征在于步驟(7)中所述的最佳誘導(dǎo)溫度、時間和IPTG濃度為誘導(dǎo)溫度為20°C，時間為16h，IPTG濃度為 0.4mM。
3.權(quán)利要求1或2所述方法獲得的豬源IFN-λ 3蛋白在制備抗豬流行性腹瀉病毒藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C07K14/57GK103757041SQ201310750013
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】郭鵬舉, 沈海燕, 張春紅, 張建峰, 周恒 , 朱余軍, 劉志成, 孫俊穎 申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所