專利名稱：表沒食子兒茶素沒食子酸酯全取代乙酰化物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以表沒食子兒茶素沒食子酸酯為原料制備其全取代乙酰 化物的方法。
背景技術(shù)：
天然兒茶素是茶葉中最重要的生理活性物質(zhì)，主要包括表兒茶素(EC)、 表沒食子兒茶素(EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)和表沒食子兒茶素沒食 子酸酯(EGCG) 4種物質(zhì)，約占茶多酚總量的60%-80%。其中又以EGCG含量 最高，活性作用最強(qiáng)，近年來以其研究最引人矚目。現(xiàn)代科學(xué)研究表明EGCG 具有顯著的抗氧化、抗突變、防輻射、抗菌消毒作用，能夠增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功 能，抑制脂肪和膽固醇的增長(zhǎng)，抑制腫瘤的生長(zhǎng)，對(duì)心血管病和艾滋病等有 預(yù)防作用。
EGCG獨(dú)特而廣泛的生理活性是其應(yīng)用的基礎(chǔ)，但就其應(yīng)用而言依然存在 以下問題1、 EGCG的水溶性限制了其在脂類產(chǎn)品中的應(yīng)用，特別是作為油脂 類的抗氧化劑；體內(nèi)由于脂溶性差不易透過雙脂層細(xì)胞膜，難以達(dá)到靶向作 用點(diǎn)而大大降低其應(yīng)有的活性作用。2、 EGCG在生物體內(nèi)易發(fā)生各種代謝反 應(yīng)，還有就是在體內(nèi)生理環(huán)境下穩(wěn)定性差導(dǎo)致其生物利用度不高。針對(duì)目前 存在的EGCG的生物利用度低、部分產(chǎn)品活性低、產(chǎn)品種類不夠豐富、無更新 替代產(chǎn)品等諸多問題，開展EGCG衍生化、高效利用與新產(chǎn)品成為了研究的熱 點(diǎn)。
近年來，美國(guó)和日本的科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)EGCG經(jīng)乙?；罂捎行岣咂渖锢枚?、增強(qiáng)其生物活性作用，從而提高利用價(jià)值。這對(duì)充分利用茶葉資源、提高茶葉資源的附加值、豐富茶葉功能性成分的產(chǎn)品種類等都具有深遠(yuǎn)的意義。
但目前，國(guó)外EGCG乙?；锏难芯窟€處于實(shí)驗(yàn)室研究中，得到的產(chǎn)品
仍以實(shí)驗(yàn)室的活性和作用機(jī)理研究為主，其中以其抑制蛋白酶體活性、抗癌
抗腫瘤活性、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等方面的研究較多，已被證實(shí)是一種潛在的抗癌前體藥物。但所涉及的乙?；镞€停留在試驗(yàn)階段且缺乏其它生理活性的研
究，有關(guān)其合成或制備未見系統(tǒng)的研究與報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種高純度、高收率EGCG全取代乙?；锏闹苽浞椒?，為其進(jìn)一步的研究和應(yīng)用提供方便。
為此，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案表沒食子兒茶素沒食子酸酯全取代
乙?；锏闹苽浞椒?，其步驟如下以表沒食子兒茶素沒食子酸酯和乙?；噭榉磻?yīng)底物，在有機(jī)溶劑和催化劑吡啶存在的條件下進(jìn)行乙?；磻?yīng)，
控制表沒食子兒茶素沒食子酸酯與乙?；噭┑哪柋仍?:80-200，反應(yīng)得到表沒食子兒茶素沒食子酸酯的全取代乙?；铮摦a(chǎn)物再進(jìn)行純化處理。
在采用化學(xué)合成法制備EGCG乙?；锏倪^程中，除全取代的目標(biāo)產(chǎn)物外，其產(chǎn)物中還有反應(yīng)中生成的EGCG部分取代乙?；铩?br> EGCG乙?；锏慕Y(jié)構(gòu)式如下
OR
5其中EGCG全取代乙酰化物的結(jié)構(gòu)式如下:
在影響反應(yīng)的諸多因素如時(shí)間、乙?；噭⑷軇?、催化劑用量和底物摩爾比等，以底物(EGCG與乙酸酐)摩爾比對(duì)反應(yīng)產(chǎn)率、產(chǎn)物的種類、組成和含量變化影響最大，主要通過控制底物比來進(jìn)行不同取代度直至全取代的EGCG乙酰化物的合成?？刂艵GCG與乙?；噭┑哪柋仍?:80-200，反應(yīng)得到的只有全取代乙酰產(chǎn)物；EGCG與乙?；噭┑哪柋仍?:80以下，反應(yīng)得到EGCG的全取代和部分取代乙?；?。
上述的制備方法，反應(yīng)原料為高純度的EGCG (純度90%以上)，反應(yīng)的有機(jī)溶劑為乙酸乙酯、二硫化碳、四氫呋喃、鹵代烴等溶劑，優(yōu)選氯仿、二氯乙烷或乙酸乙酯；乙酰化試劑為乙酸、乙酰氯、乙酸酐等乙?；墓w試劑，優(yōu)選乙酸酐；反應(yīng)時(shí)間3-20小時(shí)，優(yōu)選5小時(shí)，攪拌轉(zhuǎn)速為100-700rpm。
上述的制備方法，所述的純化處理采用溶劑洗滌處理、柱層析純化中的任一種或二種的組合，優(yōu)選的純化處理采用先溶劑洗滌處理、干燥濃縮，后柱層析純化處理。
所述的溶劑洗滌處理過程如下反應(yīng)液經(jīng)水洗、稀酸洗、堿洗和鹽洗等處理，每次處理洗滌液的體積為反應(yīng)液體積的1/10~1，其中以l/2為宜，3-7次重復(fù)，洗至反應(yīng)液無明顯的乙酸酐和吡啶味，所用的稀酸為HC1或H2S04等的水溶液，體積濃度小于20%，所用的堿為飽和NaHC03或質(zhì)量濃度小于20。/。的NaOH、 KOH等的水溶液，所用鹽為飽和的NaCl、 Na2S04或K2S04等的溶液。洗滌后的反應(yīng)液干燥采用無水MgS04、 Na2S04等除水劑，干燥后的反應(yīng)液可采用旋轉(zhuǎn)真空濃縮，溫度控制在30-8(TC，真空度》0.09MPa。
所述的柱層析純化處理層析柱填料為80—300目的硅膠，裝柱可采用濕法和干法兩種方式，濕法可用石油醚、氯仿等溶劑成勻漿裝柱，硅膠裝柱前須經(jīng)預(yù)處理，上樣的EGCG乙酰化物的溶解可用醇類、酮類或酯類等有機(jī)溶劑。洗脫劑應(yīng)選擇極性較大和極性小溶劑的組合，極性較大的溶劑可選擇甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯等，極性小的溶劑可為正己垸、苯和石油醚等，優(yōu)選的洗滌劑為正己烷與乙酸乙酯的混合液，其體積比為1:1-1:10，優(yōu)選l:l。層析柱的平衡處理流速為1.5-2柱床體積/小時(shí)，洗脫劑的流速為1-1.5柱床體積/小時(shí)，洗脫液的液壓可在一定的范圍內(nèi)變化，增加壓力加速洗脫過程，快速通過色譜柱。硅膠填料使用后，可用有機(jī)溶劑單獨(dú)或組合洗滌或先采用5-10體積的1%的氫氧化鈉煮沸半小時(shí)，水洗再以3-6體積的1%的鹽酸煮沸半小時(shí)，水洗至中性110。C活化硅膠供重復(fù)使用。
上述的制備方法，得到的EGCG乙酰化物為白色粉末狀物質(zhì)，洗滌處理后所得產(chǎn)物的純度在80%以上，再經(jīng)柱層析處理后純度在90%以上(高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定)。
本發(fā)明提供的反應(yīng)條件溫和，通過控制反應(yīng)條件制得高收率、高純度的EGCG全取代乙?；?純度90%以上)；在維持天然兒茶素本身生理特性的同時(shí)具有更高的穩(wěn)定性和生物利用度，方便了其進(jìn)一步的研究和應(yīng)用。
下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。


圖1為實(shí)施例5中得到的EGCG全取代乙?；顰CEGCG的液相分析圖譜。圖2為實(shí)施例6中得到的EGCG全取代乙?；顰CEGCG的液相分析圖譜。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l
稱取EGCG樣品0. 46g于100ml氯仿溶液中，加入8ml乙酸酐和1ml吡啶(底物EGCG與乙酸酐比為1:80以上)，室溫下于磁力攪拌器上攪拌反應(yīng)5h后，轉(zhuǎn)速為300rpm，反應(yīng)結(jié)束時(shí)加入lOmL蒸餾水終止反應(yīng)體系，得到EGCG全取代乙?；铮浜窟_(dá)95.60%以上。
實(shí)施例2
稱取EGCG樣品0. 46g于100ml氯仿溶液中，加入15ml乙酸酐和lml吡啶(底物EGCG與乙酸酐比為1:159.0)，室溫下于磁力攪拌器上攪拌反應(yīng)5h后，轉(zhuǎn)速為400rpm，反應(yīng)結(jié)束時(shí)加入lOmL蒸餾水終止反應(yīng)體系，得到EGCG全取代乙?；?，其中EGCG的轉(zhuǎn)化率達(dá)98.20%。
實(shí)施例3
稱取EGCG樣品0. 46g于100ml氯仿溶液中，加入20ml乙酸酐和lml吡啶(底物EGCG與乙酸酐比為1:200以上)，室溫下于磁力攪拌器上攪拌反應(yīng)5h后，轉(zhuǎn)速為300rpm，反應(yīng)結(jié)束時(shí)加入lOmL蒸餾水終止反應(yīng)體系，制備得到EGCG全取代乙?；?，其含量達(dá)98.50%以上。
實(shí)施例4
稱取EGCG 4.6g于1000ml氯仿溶液中，加入100ml乙酸酐和10ml吡咬(底物EGCG與乙酸酐比為1:106.0)，室溫下于磁力攪拌器上攪拌反應(yīng)5h后，轉(zhuǎn)速為500rpm，反應(yīng)結(jié)束時(shí)加入lOOmL蒸餾水終止反應(yīng)體系來進(jìn)行EGCG全取代乙酰化物的合成，其中EGCG的轉(zhuǎn)化率可達(dá)98%以上。 實(shí)施例5
實(shí)施例4反應(yīng)結(jié)束后的混合液，在40'C，真空度^0.09MPa條件下，濃 縮至200ml左右，然后分別以100ml水洗滌反應(yīng)液7次，再以70ml的飽和碳 酸氫鈉溶液洗滌5次，最后以50ml的飽和NaCl溶劑洗滌處理反應(yīng)液2次， 所得到的有機(jī)相加入無水Na2S04靜置除水后，在4(TC，真空度X).09M Pa 條件下旋轉(zhuǎn)濃縮，得到EGCG全取代乙酰化物6.15g，為白色粉未狀物質(zhì)，得 率為77.21%,純度為89.53%。
實(shí)施例6
將硅膠80-160目用濃鹽酸浸泡(過夜)，然后用蒸餾水洗滌硅膠多次后， 將其進(jìn)行減壓抽濾，后不斷加蒸餾水沖洗至抽濾的水呈中性，晾干后，在ll(TC 烘箱中活化2小時(shí)即可。
將預(yù)處理過的硅膠材料裝填于直徑為1.6 cm，長(zhǎng)度為40 cm的試驗(yàn)規(guī)模 柱中，填料高度為35.9cm，以乙酸乙酯/正己烷=1:1的洗脫液平衡層析柱2-3 個(gè)柱床體積。
稱取實(shí)施例5得到的EGCG乙?；飈.Og溶于3ml乙酸乙酯溶液中，作 為柱層析的上樣液。加載上樣液于層析柱頂部，在室溫下以1BV (柱床體積) /小時(shí)的恒定流速將乙?；飶膶游鲋邢疵摮鰜?，根據(jù)冼脫曲線的主峰位合 并收集液，在4(TC，真空度^0.09MPa條件下濃縮干燥，便可得到高純度的 EGCG全取代乙酰化物，共回收得到0.85g粉未狀物質(zhì)，檢測(cè)純度為96.04%。
本發(fā)明的保護(hù)范圍并不只限于以上實(shí)施例，凡與本發(fā)明的技術(shù)方案相同 或等同的內(nèi)容均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1、表沒食子兒茶素沒食子酸酯全取代乙?；锏闹苽浞椒ǎ洳襟E如下以表沒食子兒茶素沒食子酸酯和乙?；噭榉磻?yīng)底物，在有機(jī)溶劑和催化劑吡啶存在的條件下進(jìn)行乙?；磻?yīng)，控制表沒食子兒茶素沒食子酸酯與乙?；噭┑哪柋仍?∶80-200，反應(yīng)得到表沒食子兒茶素沒食子酸酯的全取代乙?；铮摦a(chǎn)物再進(jìn)行純化處理。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的乙?；噭橐?酸、乙酰氯或乙酸酐。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的有機(jī)溶劑為乙酸 乙酯、鹵代烴、二硫化碳、四氫呋喃中的任一種或二種以上的混合物。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述的有機(jī)溶劑為氯仿、 二氯乙烷或乙酸乙酯溶液。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的純化處理采用溶 劑洗漆處理、柱層析純化中的任一種或二種的組合。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述的純化處理采用先 溶劑洗滌處理、干燥濃縮，后柱層析純化處理。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于洗滌后的反應(yīng)液先采用 無水Na2S04除水干燥，接著采用旋轉(zhuǎn)真空濃縮的方式，條件為30-80'C，真 空度^0.09M Pa。
8、 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的制備方法，其特征在于所述的溶劑洗滌處 理，其選用的洗滌液為水、稀酸、堿和飽和鹽溶液，所述的稀酸為HC1或H》04 的水溶液，其濃度小于20%，所述的堿為飽和NaHCO3或濃度小于20Q/o的 NaOH、 KOH水溶液，所述的鹽為飽和的NaCl、 Na2S04或K2 S04溶液；所述的柱層析純化處理，其選用的填料為80-300目的硅膠，洗脫劑為正己垸和 乙酸乙酯的混合液，體積比為1:1-1:10。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于在室溫下攪拌反應(yīng)，反 應(yīng)時(shí)間為3-20小時(shí)。
10、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于在室溫下攪拌反應(yīng)， 反應(yīng)時(shí)間為5小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以表沒食子兒茶素沒食子酸酯為原料制備其全取代乙?；锏姆椒ā，F(xiàn)有方法得到的表沒食子兒茶素沒食子酸酯乙?；镉胁煌〈戎敝寥〈〈阴；锏募兌鹊?，不利于對(duì)其作進(jìn)一步研究和應(yīng)用。本發(fā)明以表沒食子兒茶素沒食子酸酯和乙酰化試劑為反應(yīng)底物，在有機(jī)溶劑和催化劑吡啶存在的條件下進(jìn)行乙?；磻?yīng)，控制表沒食子兒茶素沒食子酸酯與乙酰化試劑的摩爾比在1∶80-200，反應(yīng)得到表沒食子兒茶素沒食子酸酯的全取代乙酰化物，該產(chǎn)物再進(jìn)行純化處理。本發(fā)明得到高純度的全取代乙?；铮奖懔似溥M(jìn)一步的研究和應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07D311/00GK101519395SQ20081012163
公開日2009年9月2日 申請(qǐng)日期2008年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月16日
發(fā)明者劉曉輝, 張建勇, 江和源, 袁新躍 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所