專利名稱：荷葉黃酮的制備方法及其藥物應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物藥用成份的提取和應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及從荷葉中提取分離黃酮類 化合物及其藥物利用。
背景技術(shù)：
葡萄糖激酶(GK)是己糖激酶(///O家族中的一員(7Wny)，有465個(gè)氨基酸， 分子量為50^DG,特異性存在于成熟的肝細(xì)胞和胰島細(xì)胞中。GAT是這兩種細(xì)胞中葡 萄糖代謝的限速酶，在^7P存在下，催化葡萄糖轉(zhuǎn)變成6-磷酸葡萄糖，此反應(yīng)是葡萄 糖代謝的第一步反應(yīng)，也是糖代謝過(guò)程的關(guān)鍵因素。G《的Km值較高，與葡萄糖親和 力低，不受產(chǎn)物6-磷酸葡萄糖的反饋抑制，因而與其它己糖激酶有所不同，能夠保證 生理范圍內(nèi)波動(dòng)的血糖被充分磷酸化而進(jìn)入代謝過(guò)程。胰島^-細(xì)胞中的葡萄糖激酶與 肝臟中的葡萄糖激酶不全相同。胰島/ -細(xì)胞中的葡萄糖激酶受葡萄糖濃度調(diào)節(jié)，當(dāng)血 糖升高時(shí)，該酶活性升高，葡萄糖代謝加速。而肝臟中的葡萄糖激酶受胰島素的調(diào)節(jié)， 當(dāng)血糖升高時(shí)，血漿胰島素水平相應(yīng)升高，葡萄糖激酶活性增強(qiáng)，糖原合成增加。由 于胰島^-細(xì)胞分泌胰島素主要受細(xì)胞內(nèi)葡萄糖代謝的調(diào)節(jié)，故葡萄糖激酶活性改變所 導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)葡萄糖代謝改變，可間接調(diào)節(jié)胰島素分泌，因而該酶也有葡萄糖感受器 之稱。
近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)GK基因突變與某些特殊類型糖尿病的發(fā)病有著密切聯(lián)系。青 年發(fā)病的成年型糖尿病(^TODiO是一種特殊類型的糖尿病(美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)(^04) 糖尿病分型)，主要是由G/C基因突變引起的。大約60。/。的MODr患者中有GK基因 突變，現(xiàn)已證實(shí)GK基因突變是兒童、青少年發(fā)病的MODr中最常見(jiàn)的原因。除此之 外，G《基因變異還易于導(dǎo)致妊娠糖尿病，進(jìn)而造成嬰兒糖尿病。并且對(duì)于一般的糖 尿病患者而言，也普遍存在G《活性下降的現(xiàn)象。
糖尿病是繼腫瘤、心血管病之后第三大嚴(yán)重威脅人類健康的慢性疾病。據(jù)世界衛(wèi) 生組織預(yù)計(jì)，到2025年，全球成人糖尿病患者人數(shù)將增至3億。在糖尿病患者中90 %以上為11型糖尿病，其患者體內(nèi)缺乏胰島素或已有的胰島素不能正常發(fā)揮作用，所 以無(wú)法及時(shí)降解葡萄糖，使血液中葡萄糖含量異常升高，并導(dǎo)致并發(fā)癥。隨著對(duì)II型 糖尿病的發(fā)病機(jī)制進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，G《活性降低可能參與胰島素抵抗機(jī)制，導(dǎo)致血 糖升高，胰島功能受損和胰島素抵抗加重。尋找能增加G尺活性的藥物或措施，以阻
止或延緩疾病的發(fā)展，有可能為早期預(yù)防和治療n型糖尿病開(kāi)辟一條新途徑。由此引
發(fā)的以GK作為靶點(diǎn)來(lái)開(kāi)發(fā)新的藥物將成為研究的熱點(diǎn)，其中以該靶點(diǎn)的小分子活化 劑研究較為活躍。自2001年羅氏公司篩選出第一個(gè)合成的小分子活化及0"28-1675 [3-環(huán)戊基-2- ( 4-甲黃酰基-苯基)-N-噻唑-2-基丙酰胺]以來(lái)，目前報(bào)道的以葡萄糖激酶 為靶點(diǎn)的小分子活性化合物有200余個(gè)，其中大部分是化學(xué)合成的化合物，而從天然 植物中提取分離得到的具有G尺激活作用的物質(zhì)報(bào)道很少。由于化學(xué)合成的激活劑有明顯的藥用局限性，且可能引起低血糖和肝脂肪蓄積等問(wèn)題，所以不可避免地存在一 些安全問(wèn)題。而天然產(chǎn)物普遍具有多種生理活性，且毒性低，應(yīng)用安全，是作為藥物 研發(fā)最具潛力的資源之一。近年來(lái)，許多中外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物具有抗氧化、
抑制a-葡萄糖苷酶、抗病毒、抗血小板凝集和抑制醛糖還原酶等作用，對(duì)糖尿病及其
并發(fā)癥均有一定的防治作用。
荷葉(AWwm6o m/c^ra)為我國(guó)民間常用的中藥材，分布于我國(guó)大部分地區(qū)，主 產(chǎn)于湖南、湖北、浙江、江蘇、江西等地。荷葉味苦，性平，歸肝、脾、胃，具有清 暑利濕、升發(fā)清陽(yáng)、清心去熱、止血利水、降脂減肥等功效。荷葉中的黃酮類化合物 是一類重要的高藥理活性的天然多酚類化合物，近年來(lái)研究表明，荷葉黃酮類化合物 具有降低甘油三酯、降低膽固醇、抗氧化、消除自由基、抑菌、抗病毒和止痙攣等作 用。但是還沒(méi)有關(guān)于荷葉黃酮防治糖尿病的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供荷葉黃酮作為制備預(yù)防和治療與葡萄糖激酶活性介導(dǎo)的疾病藥 物的應(yīng)用，并且提供了一種荷葉黃酮的制備方法。 本發(fā)明所述的黃酮的制備方法具體步驟如下
1、 荷葉黃酮粗提。在反應(yīng)溫度控制在5(TC以下的情況下，按常規(guī)方法粗提荷葉 黃酮并濃縮；
2、 層析。將上述濃縮濾液經(jīng)聚酰胺層析柱層析，用水-乙醇梯度洗脫，收集50% 90%乙醇洗脫部分，溫度控制在50匸以下，在減壓條件下濃縮至干，然后用蒸餾水 溶解，即得具有激活葡萄糖激酶活性的黃酮類化合物。
本發(fā)明所述的聚酰胺以60 - 90目為宜。
本發(fā)明所述的荷葉黃酮的粗提，在粗提溫度控制在50 'C以下的情況下，可以采 用浸提法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法、酶解法、超濾法或超臨界萃取法中的 任一種。
本發(fā)明所述的荷葉黃酮的粗提，可以采用以下工藝將干燥的荷葉粉碎后，以溶 劑/原料的重量比為10 50:1，加入30% 90%的含水乙醇超聲提取，溫度控制在 50 'C以下，重復(fù)提取1 3次，去渣，濾液在減壓條件下濃縮。本工藝所用的提取溶 液是30% 95%的含水乙醇，溶劑/原料的重量比以40: l為最佳；也可以是水、甲醇、 30%~95%含水甲醇、乙醇、丙酮、30% ~95%含水丙酮或乙酸乙酯等。
本發(fā)明所述的預(yù)防和治療葡萄糖激酶介導(dǎo)的病癥的黃酮的應(yīng)用為將得到的黃酮 與藥用載體和/或藥學(xué)上可接受的輔劑組合制成用于治療葡萄糖激酶介導(dǎo)的的病癥的 藥物。該藥物組合物可以口服給藥，例如注射劑、片劑、丸劑、膠囊、糖錠劑、懸浮 劑或者乳劑的形式。給藥也可以通過(guò)直腸進(jìn)行，例如使用栓劑；或者胃腸外給藥，例 如使用可注射溶液的靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下或者經(jīng)皮給藥；或者是舌下給藥或作為氣 溶膠如噴霧劑的形式給藥。
本發(fā)明所述荷葉黃酮的制備方法環(huán)境污染小，所述的黃酮具有激活葡萄糖激酶活性的作用，可用于防治葡萄糖激酶介導(dǎo)的病癥，為荷葉黃酮的藥用提供了一條新途徑，
可使荷葉資源得到更廣泛地利用。


附圖1為本發(fā)明所述制備方法制備的黃酮不同濃度對(duì)葡萄糖激酶(GiO的激活率 的實(shí)驗(yàn)曲線圖。
附圖2為葡萄糖激酶(GiO的活性測(cè)定反應(yīng)路線。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明將通過(guò)以下實(shí)施例將進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例1
取荷葉粉末IO g,加入70%乙醇水溶液400 m丄，超聲提取40 mf",真空抽濾， 濾渣重復(fù)提取2次，合并濾液，在減壓條件下濃縮至干，用25附丄的70%乙醇溶解。 將該濃縮的粗提物過(guò)已處理好的聚酰胺層析柱，釆用水-乙醇梯度洗脫，收集50%~ 90%的乙醇洗脫部分，在減壓條件下將其濃縮至干(低于5(TC),然后用蒸餾水溶解, 即得具有激活葡萄糖激酶活性的黃酮類化合物。
實(shí)施例2
取荷葉粉末5g，加入50%乙醇水溶液200 mL,浸提法提取1 A,真空抽濾，濾 渣重復(fù)提取2次，合并濾液，在減壓條件下濃縮，用10m丄的70%乙醇溶解。將該濃 縮的粗提物過(guò)已處理好的聚酰胺層析柱，釆用水-乙醇梯度洗脫，收集50%~90%的 乙醇洗脫部分，在減壓條件下濃縮至干(低于50 °C),然后用蒸餾水溶解，即得具有 激活葡萄糖激酶活性的黃酮類化合物。
實(shí)施例3
取荷葉粉末10g,加入90y。乙醇水溶液500 m丄，超聲提取30脂'n，真空抽濾， 濾渣重復(fù)提取2次，合并濾液，在減壓條件下濃縮至干，用20 m丄的90。/。乙醇溶解。 將該濃縮的粗提物過(guò)已處理好的聚酰胺層析柱，采用水-乙醇梯度洗脫，收集50%~ 70%的乙醇洗脫部分，在減壓條件下將其濃縮至干(低于5(TC),然后用蒸餾水溶解, 即得具有激活葡萄糖激酶活性的黃酮類化合物。
生物活性實(shí)施例體外葡萄糖激酶活性
葡萄糖激酶(G《)的活性通過(guò)在340 nm下iV^C^的光密度增加來(lái)測(cè)定。GK催 化葡萄糖和Mg-J7P生成葡萄糖-6-磷酸和^DP。葡萄糖-6-磷酸和煙酰胺腺嘌呤二核 苷酸(A^4D)在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6尸Di7)的作用下生成A^4D/f。測(cè)定反應(yīng)路 線如附圖2所示。
G《分析在37 'C下，反應(yīng)的最終培養(yǎng)體積為150/^。培養(yǎng)混合物含有60mM7h's 緩沖液(pH = 7. 0 )， 6. 0 wM》葡萄糖，4. 0 mM爿7P, 0. 9 mM々-A^D尸，2. 0 wMMgC/2， 100 GdPDi/和0. 26 tZ/丄G^7P, / -A^Z)P, G6尸D/f和葡萄糖購(gòu)自美國(guó) 公司，其它試劑為分析純。取IO ,丄溶于蒸餾水的受試化合物稀釋成不同的濃度，并 分別加入到不含G尺的不同的培養(yǎng)混合物中，將混合物亶于紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)中，然后加入5 ^Z的GK開(kāi)始反應(yīng)。
反應(yīng)開(kāi)始后，歷經(jīng)10脂'"的培養(yǎng)期，監(jiān)測(cè)3"鵬處的光密度(OD)的增加并以 此作為G《活性的度量。以含有蒸餾水而不含受試化合物的培養(yǎng)混合物作為空白對(duì)照， 在空白對(duì)照中加入足夠的G尺，以產(chǎn)生歷經(jīng)10 /m'"培養(yǎng)期的ODw的增加。預(yù)實(shí)驗(yàn)已 確定GK反應(yīng)在這段時(shí)間內(nèi)呈線性，甚至在產(chǎn)生G《活性增加IO倍的激活劑存在下亦 如此。比較空白對(duì)照和含受試化合物的G《活性，并計(jì)算產(chǎn)生GX活性增加到50。/。的 激活劑的濃度。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖。釆用<>*' 7.5軟件處理數(shù)據(jù)，使G《活性增加到50y。 的激活劑的濃度，表示為FA.s,即激活GK酶50y。所需的激活劑刺激濃度，其半數(shù)有 效激活濃度i^.5為0.0803 wgw丄—、即尸J"為0. 002 ^M。
權(quán)利要求
1、一種荷葉黃酮的制備方法，其特征是反應(yīng)溫度控制在50℃以下，對(duì)荷葉黃酮粗提并濃縮，然后聚酰胺層析柱層析，用水-乙醇梯度洗脫，收集50％～90％乙醇洗脫部分，在減壓條件下濃縮至干，之后用蒸餾水溶解。
2、 權(quán)利要求1所述的黃酮作為制備治療葡萄糖激酶介導(dǎo)的病癥的藥物的應(yīng)用。
3、 一種用于治療葡萄糖激酶介導(dǎo)的病癥的藥物，其特征是含有權(quán)利要求l所述的 黃酮以及藥學(xué)上可接受的輔助劑。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物，其特征是該藥物作為注射劑、片劑、丸劑、膠囊、 糖錠劑、懸浮劑、乳劑、栓劑或者氣溶膠。
全文摘要
荷葉黃酮的制備方法及其藥物應(yīng)用，反應(yīng)溫度控制在50℃以下，對(duì)荷葉黃酮粗提并濃縮，聚酰胺層析柱層析，用水-乙醇梯度洗脫，收集50％～90％乙醇洗脫部分，減壓條件下濃縮至干，再用蒸餾水溶解，將本發(fā)明制備所得黃酮加入藥用載體和/或藥學(xué)上可接受的輔助劑，作為注射劑、片劑、丸劑、膠囊、糖錠劑、懸浮劑、乳劑、栓劑或者氣溶膠，本發(fā)明所述的黃酮具有激活葡萄糖激酶活性的作用，可用于防治葡萄糖激酶介導(dǎo)的病癥。
文檔編號(hào)C07H17/00GK101423508SQ20081013630
公開(kāi)日2009年5月6日 申請(qǐng)日期2008年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月26日
發(fā)明者何慶華, 吳酬飛, 李燕萍, 楊冀艷, 磊 胡, 楊 許, 勇 陶, 黃志兵 申請(qǐng)人:南昌大學(xué)