專利名稱：與黑麥的cbf轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的調(diào)節(jié)元件的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，更具體而言，涉及植物中基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。
背景技術(shù)：
植物宿主中異源DNA序列的表達(dá)取決于在該植物宿主中有功能的可操作地連接的調(diào)節(jié)元件的存在。調(diào)節(jié)元件的選擇將確定異源DNA序列在有機(jī)體中表達(dá)的時(shí)間和位置。 當(dāng)在整個(gè)植物細(xì)胞和/或整個(gè)發(fā)育中期望連續(xù)表達(dá)時(shí)，使用組成型啟動(dòng)子。相反地，當(dāng)期望 對(duì)刺激應(yīng)答的基因表達(dá)時(shí)，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是調(diào)節(jié)元件的選擇。當(dāng)期望在特定組織或器官中 的表達(dá)時(shí)，可以使用組織特異性或組織優(yōu)選啟動(dòng)子(tissue-preferredpromoters)。S卩，它 們可以專門或優(yōu)選在特定組織或器官中驅(qū)動(dòng)表達(dá)。這些啟動(dòng)子暫時(shí)是組成型或誘導(dǎo)型的。 在任何情況下，可以將核心啟動(dòng)子序列上游和/或下游的其他調(diào)節(jié)序列包括在轉(zhuǎn)化載體的 表達(dá)構(gòu)建體中，以使轉(zhuǎn)基因植物中異源核苷酸序列的表達(dá)水平發(fā)生變化。由于這個(gè)領(lǐng)域的發(fā)展以及可以獲取更多的基因，所以亟需用多基因轉(zhuǎn)化的植物。 這些外源多基因通常需要不同的調(diào)節(jié)序列來(lái)進(jìn)行控制。而且，某些基因需要組成型調(diào)節(jié)，而 其他基因應(yīng)當(dāng)在轉(zhuǎn)基因有機(jī)體的某些發(fā)育階段或位置表達(dá)。因此，亟需具有不同作用的各 種調(diào)節(jié)序列。還亟需多調(diào)節(jié)序列(multiple regulatory sequences)來(lái)避免利用相同的調(diào)節(jié)序 列來(lái)控制多于一個(gè)基因所導(dǎo)致的不期望的分子相互作用。與非生物應(yīng)激應(yīng)答相關(guān)的早期感知基因(sensing genes)和信號(hào)基因的轉(zhuǎn)基因 調(diào)節(jié)要求轉(zhuǎn)基因暴露于應(yīng)激早期時(shí)表達(dá)且以中等水平表達(dá)。此外，需要在應(yīng)激暴露的較晚 階段關(guān)閉這類轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，從而避免下游靶標(biāo)的連續(xù)誘導(dǎo)，這是一種容易導(dǎo)致產(chǎn)量損失 (penalty)的方案。本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)序列，其可用來(lái)早期表達(dá)和嚴(yán)緊調(diào)節(jié)用于植物應(yīng)激耐 性的轉(zhuǎn)基因調(diào)節(jié)的信號(hào)基因與感知基因。本發(fā)明人在本文中公開(kāi)了與應(yīng)激相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的啟動(dòng)子的分離和表征，該啟 動(dòng)子能夠充當(dāng)分離的感興趣的核苷酸序列表達(dá)的調(diào)節(jié)元件，借此影響植物的各種性狀?？?選擇地或另外地，該啟動(dòng)子可用于驅(qū)動(dòng)可評(píng)分的標(biāo)志物。發(fā)明概述本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄且響應(yīng)非生物應(yīng)激而被誘導(dǎo)的植物啟動(dòng)子。在某些實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子以應(yīng)激應(yīng)答的方式驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄，其中所述啟動(dòng)子包 含選自以下的核苷酸序列a)與編碼黑麥(黑麥(Secale cereale))的CBF31轉(zhuǎn)錄因子的DNA天然相關(guān)并調(diào) 節(jié)其表達(dá)的序列；b) SEQ ID NO 1所列的核苷酸序列；c)包含SEQ ID NO=I所列核苷酸序列的片段的序列；以及d)具有與SEQ ID NO :1足夠的同一性以作為應(yīng)激應(yīng)答啟動(dòng)子發(fā)揮功能的核苷酸 序列。其他實(shí)施方案涉及包含上述核苷酸序列的表達(dá)盒、轉(zhuǎn)化載體、植物、植物細(xì)胞和植物部分。本發(fā)明還涉及在植物和植物細(xì)胞中使用所述序列的方法。本發(fā)明的實(shí)施方案還包 括可操作地連接至可檢測(cè)標(biāo)志物的上述核苷酸。附圖簡(jiǎn)述

圖1是表示在黑麥的秧苗芽(seedling shoots)中的ScCBF31的基因表達(dá)的RNA 印跡(Northern blot)，如實(shí)施例4所述，對(duì)該黑麥進(jìn)行了時(shí)程(time-course)的冷誘導(dǎo)。圖2表示ScCBF31的調(diào)節(jié)序列(1949個(gè)堿基對(duì))。標(biāo)記了推斷的順式作用元件，其 包括CAAT盒與TATA盒(雙下劃線)、CRT/DRE共有序列(方框和粗體)以及myc結(jié)合序列 (方框)。粗體和下劃線表示翻譯起始位點(diǎn)ATG，其后是一部分編碼序列。在序列表中的SEQ ID NO 1也表示了調(diào)節(jié)區(qū)的全部特征。包括圖2中所示的部分編碼區(qū)，作為SEQ ID NO :6。發(fā)明詳述本文所引用的全部公開(kāi)都通過(guò)引用并入。除非另外定義，本文中所用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人 員通常理解的具有相同的含義。除非另有指出，本文所用或包括的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員 熟知的常規(guī)方法。材料、方法和實(shí)例僅作為示例而不是限制。植物通過(guò)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)來(lái)適應(yīng)環(huán)境應(yīng)激，例如，寒冷、干旱和鹽度。應(yīng)激誘導(dǎo)基 因的啟動(dòng)子區(qū)可以包含順式作用元件，其是反式作用因子所識(shí)別的DNA片段。反式作用因 子包括植物激素刺激的蛋白，例如脫落酸(ABA)，已證實(shí)ABA結(jié)合ABA應(yīng)答元件(ABRE)；參 見(jiàn)，例如 Yamaguchi-Shinozaki，et al. ， (2005) Trends in Plant Science 10(2) :88_94。 其他反式作用因子包括能夠結(jié)合調(diào)節(jié)DNA并與其他分子相互作用的核蛋白，特別是DNA聚 合酶III，以起始可操作地連接至所述調(diào)節(jié)DNA的DNA的轉(zhuǎn)錄。這些轉(zhuǎn)錄因子可以作為共 享DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的相關(guān)蛋白的家族存在。轉(zhuǎn)錄因子基因自身可以被應(yīng)激誘導(dǎo)。而且，順 式調(diào)節(jié)的基因的下游靶標(biāo)可以是轉(zhuǎn)錄因子，從而產(chǎn)生基因應(yīng)答級(jí)聯(lián)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。DRE/CRT(脫水應(yīng)答元件/C-重復(fù))順式元件對(duì)應(yīng)激應(yīng)答而起作用，并且在許 多植物物種中得到了鑒定，例如擬南芥、大麥、蕓苔、柑桔、棉、桉樹(shù)、玉米、甜瓜、胡椒、水 稻、大豆、煙草、番茄和小麥。DRE/CRT元件包含核心結(jié)合位點(diǎn)即A/GCCGAC，其被稱為 DREBl (DRE-結(jié)合)和CBF(C-重復(fù)結(jié)合因子)的反式作用因子識(shí)別。接近順式元件和/或 多順式因子的次級(jí)結(jié)構(gòu)看起來(lái)是應(yīng)激誘導(dǎo)表達(dá)所需的其他成分。(綜述參見(jiàn)，Agarwal，et al.，(2006)Plant Cell Rep 25 :1263_1274 ；Yamaguchi-Shinozakiand Shinozaki,(2005) Trends in Plant Science 10(2) :88_94)。CBF/DREB基因的啟動(dòng)子區(qū)可以包含順式作用 元件，例如 ICErl 和 ICEr2(Zarka，et al.，(2003) Plant Physiol. 133 910-918 ；Massari and Murre, (2000)Mol. Cell. Bio. 20 429-440)。其他轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)MYC和MYC樣蛋白(參見(jiàn)，例如，Zhu, et al.，(2003) J. Biol. Chem. 278(48) :47803_47811)。本發(fā)明提供的核苷酸序列使得能調(diào)節(jié)對(duì)應(yīng)激應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明的序列包含與應(yīng) 激應(yīng)答多核苷酸相關(guān)的調(diào)節(jié)元件。因此，本發(fā)明的組合物包含與編碼ScCBF31的核苷酸序 列天然相關(guān)的植物調(diào)節(jié)元件的新核苷酸序列。已經(jīng)公開(kāi)了黑麥CBF31編碼區(qū)的序列(SEQ ID NOS 121和122，美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2003/0233680，其中該序列被稱為CBF7)。ScCBF31屬于DREBl類型的轉(zhuǎn)錄因子，其在暴露于生物應(yīng)激早期而被誘導(dǎo)，例如寒 冷、干旱和鹽。已知擬南芥CBF3基因的啟動(dòng)子含有5個(gè)myc-結(jié)合位點(diǎn)，并且結(jié)合稱為ICEl的堿性螺旋-環(huán)-螺旋蛋白(CBF表達(dá)的誘導(dǎo)物)，其是CBF的上游調(diào)節(jié)蛋白。ScCBF31的 調(diào)節(jié)區(qū)的鑒定將(a)使得其用于早期感知基因和信號(hào)基因的應(yīng)激誘導(dǎo)表達(dá)和嚴(yán)緊調(diào)節(jié)，以 及(b)有助于通過(guò)酵母單雜交篩查來(lái)鑒定ICEl轉(zhuǎn)錄因子的直系同源物，或有助于確認(rèn)通過(guò) 利用電泳遷移率變動(dòng)分析的序列同源性所鑒定的直系同源物的功能。將ScCBF31調(diào)節(jié)元件可操作地連接至感興趣的序列，這將提供植物表型的修飾。 這種修飾包括調(diào)節(jié)內(nèi)源產(chǎn)物有關(guān)量、相對(duì)分布等的產(chǎn)生，或者提供新功能或表達(dá)產(chǎn)物。例 如，這種啟動(dòng)子用于調(diào)節(jié)編碼包括其他轉(zhuǎn)錄因子在內(nèi)的應(yīng)激誘導(dǎo)的蛋白的序列的表達(dá)。另外，將應(yīng)激誘導(dǎo)的啟動(dòng)子與標(biāo)志物連接，特別是與可視的標(biāo)志物連接，可用于追蹤所連接的 感興趣的基因的表達(dá)。
本發(fā)明提供了利用本文所公開(kāi)的調(diào)節(jié)序列在植物中表達(dá)分離的核苷酸序列的方 法。所述方法包括用包含可操作地連接至本發(fā)明的植物調(diào)節(jié)序列的分離的核苷酸序列的轉(zhuǎn) 化載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，并由轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物。以這種方式，所述調(diào)節(jié)序 列用于以應(yīng)激誘導(dǎo)的方式，控制內(nèi)源以及外源產(chǎn)物的表達(dá)。通常，期望在有機(jī)體的組織中，或在某些環(huán)境條件下優(yōu)選表達(dá)DNA序列。例如，可 通過(guò)下述方式增強(qiáng)植物的昆蟲(chóng)攻擊抗性對(duì)植物的基因組進(jìn)行遺傳操作以包含可操作地連 接至異源殺蟲(chóng)基因的組織特異性啟動(dòng)子，從而在易感植物的組織中特異性地表達(dá)阻止昆蟲(chóng) (insect-deterring)的物質(zhì)。可通過(guò)下述方式增加對(duì)非生物應(yīng)激的耐性對(duì)植物的基因組 進(jìn)行遺傳操作以包含可操作地連接至植物激素的生物合成或調(diào)節(jié)基因的應(yīng)激誘導(dǎo)的啟動(dòng) 子，從而特異性地合成激素或者在應(yīng)激條件下調(diào)節(jié)其合成。異源核苷酸序列在合適的組織 或在合適條件下的優(yōu)選表達(dá)，減少了植物資源的消耗(drain)，當(dāng)組成型啟動(dòng)子在整個(gè)植物 細(xì)胞和/或在全部條件下起始異源核苷酸序列轉(zhuǎn)錄時(shí)，發(fā)生該消耗。或者，期望抑制植物組織中DNA序列的表達(dá)，以獲得期望的表型。例如，包含全部 或部分ScCBF31啟動(dòng)子的發(fā)夾構(gòu)型可用于下調(diào)天然應(yīng)激應(yīng)答的ScCBF31。當(dāng)應(yīng)激應(yīng)答的多 核苷酸的這種下調(diào)被合適地靶向時(shí)，例如，通過(guò)生殖組織優(yōu)選啟動(dòng)子，某些植物組織可以避 免應(yīng)激的不良影響。表達(dá)盒被設(shè)計(jì)為表達(dá)與其自身雜交的RNA分子以形成包含單鏈環(huán)區(qū)域 和堿基配對(duì)莖的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。該堿基配對(duì)莖區(qū)域包含對(duì)應(yīng)于啟動(dòng)子的所選區(qū)域的正義序列， 以及與該正義序列完全或部分互補(bǔ)的反義序列。發(fā)夾的表達(dá)使得可操作地連接至所述選擇 的啟動(dòng)子的編碼序列沉默。參見(jiàn)，例如，Mette，et al.，(2000)EMBO J 19(19) :5194_5201。 所述可操作地連接的編碼序列可以是天然的或異源的。在另一實(shí)例中，將ScCBF31啟動(dòng)子可操作地連接至反義核苷酸序列或部分或全長(zhǎng) 的編碼序列的發(fā)夾構(gòu)型，從而該反義序列或該發(fā)夾構(gòu)型的應(yīng)激誘導(dǎo)的表達(dá)，在全部植物細(xì) 胞或其子集中，產(chǎn)生干擾相應(yīng)DNA序列的mRNA的翻譯的RNA轉(zhuǎn)錄物。因此，分子的堿基配 對(duì)莖區(qū)通常決定RNA干擾的特異性。發(fā)夾方法在抑制靶基因的表達(dá)中非常有效。參見(jiàn)，Waterhouse andHelliwell, (2003)Nat. Rev. Genet. 4 =29-38,以及本文所引用的參考文獻(xiàn)。定義對(duì)于本發(fā)明的目的，除非另外指明或從上下文顯而易見(jiàn)，“個(gè)體植物”或“個(gè)體植物 細(xì)胞”是已實(shí)施了有關(guān)感興趣的基因的諸如轉(zhuǎn)化的遺傳改變的“個(gè)體植物”或“個(gè)體植物細(xì) 胞”，或者是來(lái)源于被如此改變的植物或植物細(xì)胞且包含所述改變的植物或植物細(xì)胞?！皩?duì)照”或“對(duì)照植物”或“對(duì)照植物細(xì)胞”提供測(cè)量個(gè)體植物或植物細(xì)胞的變化的參考點(diǎn)。對(duì)照植物或?qū)φ罩参锛?xì)胞可包含，例如，(a)野生型植物或植物細(xì)胞，即，與遺傳改 變的起始材料相同的導(dǎo)致個(gè)體植物或個(gè)體植物細(xì)胞的表型；(b)與起始材料的表型相同的 植物或植物細(xì)胞，但是已經(jīng)用空構(gòu)建體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化(即，用不含對(duì)感興趣的特征具有已知 效果的構(gòu)建體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，例如，含有標(biāo)志基因的構(gòu)建體)；(c)植物或植物細(xì)胞，其是個(gè)體植 物或個(gè)體植物細(xì)胞的后代之間的未轉(zhuǎn)化的分離子(segregant) ； (d)與所述個(gè)體植物或個(gè) 體植物細(xì)胞基因相同的植物或植物細(xì)胞，但是其沒(méi)有暴露于誘導(dǎo)感興趣的基因表達(dá)的條件 或刺激物；或者(e)處于感興趣的基因未被表達(dá)的條件下的所述個(gè)體植物或個(gè)體植物細(xì)胞 自身。“應(yīng)激誘導(dǎo)的”旨在表示在植物的應(yīng)激的條件下優(yōu)選的表達(dá)，特別是非生物應(yīng)激， 例如，干旱、含量、高溫或高鹽度條件?！罢{(diào)節(jié)元件”旨在表示負(fù)責(zé)相關(guān)的編碼序列表達(dá)的序列，包括但不限于啟動(dòng)子、終 止子、增強(qiáng)子、內(nèi)含子等?！敖K止子”旨在表示使RNA聚合酶從DNA脫離的DNA的調(diào)節(jié)區(qū)，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的終止?！皢?dòng)子”旨在表示DNA的調(diào)節(jié)區(qū)，其能夠調(diào)節(jié)與其連接的序列的轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子通 常包含能夠指導(dǎo)RNA轉(zhuǎn)錄酶II在特定編碼序列的合適轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)起始RNA合成的TATA盒.啟動(dòng)子還可以包含通常位于TATA盒的上游或5’的其他識(shí)別序列，稱為上游啟動(dòng) 子元件，其影響轉(zhuǎn)錄起始速率并且還包括影響連接的核苷酸序列的空間和時(shí)間表達(dá)的元 件。已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，對(duì)于本文公開(kāi)的啟動(dòng)子區(qū)已經(jīng)鑒定的核苷酸序列，分離和鑒定本文所鑒定 的特定啟動(dòng)子區(qū)的5’上游區(qū)域其他調(diào)節(jié)元件在現(xiàn)有技術(shù)范圍內(nèi)。因此，本文所公開(kāi)的啟動(dòng) 子區(qū)可以包含上游調(diào)節(jié)元件，例如負(fù)責(zé)編碼序列的組織和時(shí)間表達(dá)的上游調(diào)節(jié)元件，并且 可以包含增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的DNA應(yīng)答元件、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄開(kāi)始和終止序列、 翻譯開(kāi)始和終止序列、激活序列等。以同樣的方式，能夠鑒定、分離允許應(yīng)激條件下表達(dá)的啟動(dòng)子元件，并且該啟動(dòng)子 元件能夠與其他核心啟動(dòng)子一起使用。核心啟動(dòng)子表示起始轉(zhuǎn)錄所需的最小序列，例如稱 為TATA盒的序列，其為編碼蛋白的基因的啟動(dòng)子所共有。因此，ScCBF31的上游啟動(dòng)子能 夠任選地與其自身或其他來(lái)源的核心啟動(dòng)子協(xié)同使用。在發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子的細(xì)胞中，啟動(dòng)子可 以是天然的或非天然的。能夠修飾本發(fā)明的分離的啟動(dòng)子序列，以提供分離的核苷酸序列的一定范圍的表 達(dá)水平。能夠使用小于全部的啟動(dòng)子區(qū)，并且保持驅(qū)動(dòng)應(yīng)激誘導(dǎo)的表達(dá)的能力。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí) 至|J，能夠用啟動(dòng)子序列部分的特定缺失來(lái)調(diào)節(jié)HiRNA的表達(dá)水平。因此，能夠?qū)?dòng)子修飾 為弱啟動(dòng)子或強(qiáng)啟動(dòng)子。通常，“弱啟動(dòng)子”旨在表示以低水平驅(qū)動(dòng)編碼序列的表達(dá)的啟動(dòng) 子?！暗退健敝荚诒硎炯s1/10，000的轉(zhuǎn)錄至約1/100，000的轉(zhuǎn)錄至1/500，000的轉(zhuǎn)錄。 相反地，強(qiáng)啟動(dòng)子以高水平或約1/10的轉(zhuǎn)錄至約1/100的轉(zhuǎn)錄至約1/1，000的轉(zhuǎn)錄來(lái)驅(qū)動(dòng) 編碼序列的表達(dá)。通常，用分離的啟動(dòng)子的至少約20個(gè)核苷酸驅(qū)動(dòng)核苷酸序列的表達(dá)。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，為了增加轉(zhuǎn)錄水平，增強(qiáng)子能夠與本發(fā)明的啟動(dòng)子區(qū)聯(lián)合使用。增強(qiáng) 子是起增加啟動(dòng)子區(qū)表達(dá)的作用的核苷酸序列。增強(qiáng)子是本領(lǐng)域已知的，并且包括SV40增強(qiáng)子區(qū)域、35S增強(qiáng)子元件等。本發(fā)明的啟動(dòng)子能夠分離自其天然編碼區(qū)的5’區(qū)域或5’未翻譯區(qū)域(5’ UTR)。 同樣，終止子能夠分離自位于其各自終止密碼子側(cè)翼的3’區(qū)域。術(shù)語(yǔ)“分離的”意指諸如 核酸或蛋白的材料，(1)其基本上或?qū)嵸|(zhì)上不含某種組分，該組分通常伴隨在天然存在的環(huán) 境中發(fā)現(xiàn)的材料或與該材料相互作用，或者，(2)如果所述材料處在其天然的環(huán)境中，則該 材料的組成已經(jīng)被故意的人為介入改變和/或被置于細(xì)胞中的位置而不是該材料天然的 位置。分離啟動(dòng)子區(qū)的方法在本領(lǐng)域是已知的。黑麥CBF31啟動(dòng)子列于SEQ ID NO 1中，并且長(zhǎng)度為1949個(gè)核苷酸。在ScCBF31啟動(dòng)子中鑒定的基序示于圖2和序列表中?？梢愿鶕?jù)基于序列同源性的已知技術(shù)，從其他植物分離啟動(dòng)子序列。在這些技術(shù) 中，將全部或部分編碼序列用作探針，該探針與存在于來(lái)自所選的有機(jī)體的克隆的基因組 DNA片段(即，基因組文庫(kù))的群體中的其他序列選擇性雜交。用于核酸序列雜交的方法 在本領(lǐng)域可容易地獲得。在下述文獻(xiàn)中可找到核酸雜交的廣泛指導(dǎo)=Tiissen, Laboratory Techniquesin Biochemistry and Molecular BioloRY—Hybridization with Nucleic AcidProbes, Part I, Chapter 2 (生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)-核酸探針的雜交， 第一部分，第二章)“Overview of principles of hybridization and thestrategy of nucleic acid probe assays (核酸探針測(cè)定的雜交和策略的指導(dǎo)綜述)”，Elsevier, New York (1993)禾口 Current Protocols in Molecular BioIory, Chapter 2 (現(xiàn)代分子生物 學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，第二章)，Ausubel，et al.，Eds. (Ausubel 等編輯)，Greene Publishing and ffiley-Interscience, New York (1995)。調(diào)節(jié)序列的“功能性變體”也包括在本發(fā)明的組合物中。功能性變體包括，例如， 本發(fā)明的天然調(diào)節(jié)序列，其具有一個(gè)或多個(gè)核苷酸取代、缺失或插入，并且在類似于天然啟 動(dòng)子具有活性的條件的條件下驅(qū)動(dòng)可操作地連接的序列的表達(dá)。本發(fā)明的功能性變體可通 過(guò)定點(diǎn)誘變、誘導(dǎo)突變來(lái)產(chǎn)生，或者可以作為等位基因變體存在(多態(tài)性)。如本文所用，“功能性片段”是通過(guò)較大的調(diào)節(jié)元件的一個(gè)或多個(gè)缺失形成的 截短的調(diào)節(jié)序列。例如，如 Opsahl-Sorteberg，H-G.，et al.，(2004) "Identification of a 49-bp fragment of the HvLTP2 promoter directingaleurone cell specific expression (指導(dǎo)糊粉細(xì)胞特異性表達(dá)的HvLTP2啟動(dòng)子的49_bp片段的鑒定)”Gene 341 49-58所述，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的啟動(dòng)子的5’部分，一直到TATA盒，可以缺失而不完全破 壞啟動(dòng)子活性。這類片段應(yīng)當(dāng)保持啟動(dòng)子活性，特別是驅(qū)動(dòng)應(yīng)激誘導(dǎo)的表達(dá)的能力。能 夠通過(guò)RNA印跡分析、利用轉(zhuǎn)錄融合物時(shí)的報(bào)道基因活性測(cè)量等來(lái)測(cè)量活性。參見(jiàn)，例如， Sambrook, et al.，(1989)Molecular CloninR :A LaboratoryManual (分子克隆實(shí)驗(yàn)室手 冊(cè))(2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY),在此處通過(guò)應(yīng) 用將其并入。能夠通過(guò)下述方法來(lái)獲得功能性片段使用限制性內(nèi)切核酸酶切割本文公開(kāi)的天 然存在的調(diào)節(jié)元件核苷酸序列；通過(guò)從天然存在的DNA序列合成核苷酸序列；或通過(guò)使用 PCR 技術(shù)獲得。參見(jiàn)，特別是，Mullis, etal.，(1987)Methods Enzymo 1. 155 :335_350，和 Erlich (1989)編輯的 PCRTechnology (PCR 技術(shù))(Stockton Press, New York)。例如，去除部分DNA序列的常規(guī)方式是使用外切核酸酶聯(lián)合DNA擴(kuò)增來(lái)產(chǎn)生雙鏈DNA克隆的單向嵌套缺失。用于此目的的商業(yè)試劑盒以Ex0-SizeTM(NeW England Biolabs, Beverly, Mass.)商品名銷售。簡(jiǎn)言之，這種方法需要將外切核酸酶III與DNA—起孵育， 以便逐步地以3’至5’的方向去除DNA模板的5’突出端、平末端或缺口的核苷酸。然而， 外切核酸酶不能去除3’，4堿基突出端的核苷酸。用這種酶定時(shí)消化克隆，產(chǎn)生單向嵌套缺 失。完全的啟動(dòng)子序列或其部分可以用作能夠與基因組DNA中相應(yīng)啟動(dòng)子序列特異性地雜交的探針?；蛘?，所述探針代表與啟動(dòng)子序列天然相關(guān)的編碼序列的片段。為了實(shí)現(xiàn) 在各種條件下的特異性雜交，這種探針包含獨(dú)特的序列，并且長(zhǎng)度優(yōu)選為至少約10個(gè)核苷 酸，并且長(zhǎng)度最優(yōu)選為至少約20個(gè)核苷酸。這種探針能夠用于通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 的熟知方法來(lái)從所選的有機(jī)體中擴(kuò)增相應(yīng)的序列。這種技術(shù)能夠用于從期望的有機(jī)體分離 其他啟動(dòng)子序列，或者用作確定有機(jī)體中啟動(dòng)子序列存在的診斷測(cè)定。實(shí)例包括平板DNA 文庫(kù)(plated DNA libraries)的雜交篩查(噬斑或菌落；參見(jiàn)，Innis，et al.，(1990)PCR Protocols, A Guide toMethods and Applications (PCR 方法，方法禾口應(yīng)用指導(dǎo))，eds.， AcademicPress)。當(dāng)本發(fā)明公開(kāi)的應(yīng)激誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)元件及其變體和片段與分離的感興趣的核苷酸 序列可操作地連接時(shí)，本發(fā)明公開(kāi)的應(yīng)激誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)元件及其變體和片段在任何植物的遺 傳操作中是有用的，所述分離的核苷酸序列的表達(dá)受到控制以實(shí)現(xiàn)期望的表型應(yīng)答?！翱刹僮鞯剡B接”旨在表示啟動(dòng)子與第二序列間的功能性連接，其中啟動(dòng)子序列起 始并介導(dǎo)對(duì)應(yīng)于第二序列的DNA序列的轉(zhuǎn)錄。表達(dá)盒包括可操作地連接至至少一種感興趣 的序列的本發(fā)明的調(diào)節(jié)序列。在一典型的實(shí)施方案中，在過(guò)量表達(dá)盒的環(huán)境中，可操作地連接表示，被連接的核 苷酸序列是相鄰的，并且當(dāng)需要連接兩個(gè)或更多個(gè)蛋白編碼區(qū)時(shí)，被連接的核苷酸序列是 鄰接的并且處在相同的讀框中。當(dāng)表達(dá)盒在相同的讀框中含有以鄰接的方式連接的兩個(gè)或 更多個(gè)蛋白編碼區(qū)的情況下，本文將編碼的多肽定義為“嵌合多肽”或“融合多肽”。表達(dá)盒 還可以含有待共轉(zhuǎn)化至有機(jī)體的至少一種另外的編碼序列。或者，所述另外的編碼序列能 夠在多表達(dá)盒上提供。本發(fā)明的調(diào)節(jié)元件能夠以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的幾種方法中的任何方法可操作 地連接至分離的感興趣的核苷酸序列。能夠利用如美國(guó)專利6，187，994號(hào)所述的位點(diǎn)特異 性性整合，將分離的感興趣的核苷酸序列插入基因組中本發(fā)明啟動(dòng)子的3’的位點(diǎn)，在此將 該專利通過(guò)引用并入。本發(fā)明的調(diào)節(jié)元件能夠和分離的感興趣的核苷酸序列一起可操作地連接在表達(dá) 盒中，以用于植物中的表達(dá)。這種表達(dá)盒提供了多個(gè)限制性位點(diǎn)，用于在調(diào)節(jié)元件的轉(zhuǎn)錄控 制之下插入感興趣的核苷酸序列。通過(guò)本發(fā)明的調(diào)節(jié)元件表達(dá)的分離的感興趣的核苷酸，能夠用于指導(dǎo)植物組織中 序列的表達(dá)。這能夠通過(guò)增加內(nèi)源或外源產(chǎn)物的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。或者，結(jié)果能夠通過(guò)提供一種 或多種內(nèi)源產(chǎn)物，特別是酶或輔因子表達(dá)的減少來(lái)實(shí)現(xiàn)。這種下調(diào)能夠通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人 員已知的許多不同方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，該方法包括反義、共抑制、使用發(fā)夾形成或其他以及下文討 論的。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，調(diào)節(jié)元件可以與其天然編碼序列或其他編碼序列一起使用，來(lái)增強(qiáng)或減 少轉(zhuǎn)化的植物或種子中可操作地連接的序列的表達(dá)。
用于本發(fā)明目的感興趣的基因的一般種類，包括例如，與如鋅指形成相關(guān)的基因； 與聯(lián)系相關(guān)的基因，如激酶；以及與持家相關(guān)的基因，如熱激蛋白。更具體的轉(zhuǎn)基因的種類 包括編碼農(nóng)學(xué)、昆蟲(chóng)抗性、抗病性、除草劑抗性的重要性狀以及谷物特征的基因。轉(zhuǎn)基因仍 然的其他種類包括誘導(dǎo)外源產(chǎn)物的合成的基因，所述外源產(chǎn)物如酶、輔因子和來(lái)自植物及 其他真核或原核有機(jī)體的激素。影響谷物性狀的修飾包括，增加油酸的含量，或改變飽和及不飽和脂肪酸的水平。 同樣，能夠提高蛋白的水平，特別是可以改善植物營(yíng)養(yǎng)值的修飾的蛋白的水平。這通過(guò)表達(dá) 具有氨基酸含量增加的這類蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)。期望增加賴氨酸和含硫氨基酸的水平以及修飾種子中淀粉的類型和含量。1997年 4月10日提交的WO 9416078、1997年3月26日提交的WO 9638562、1997年3月26日提交 的WO 9638563以及1997年12月30日授權(quán)的美國(guó)專 利5，703，049號(hào)描述了 Hordothionin 的修飾。另一實(shí)例是1996年3月20日提交的WO 9735023所述的由大豆2S白蛋白編碼的 富含賴氨酸和/或硫的根蛋白，和來(lái)自大麥的糜蛋白酶抑制劑，WilliamS0n，et al.，(1987) Eur.J. Biochem. 165 :99_106。能夠通過(guò)改變下述基因的表達(dá)改善農(nóng)學(xué)性狀在環(huán)境應(yīng)激期間影響根、植物或種 子生長(zhǎng)和發(fā)育應(yīng)答的基因，Cheikh-N，et al.，(1994) PlantPhysiol. 106(1) :45_51 ；和玉米 中控制碳水化合物代謝以減少谷粒敗育(abortion)的基因，Zinselmeier，et al. , (1995) Plant Physiol. 107(2) :385_391。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，能夠?qū)ㄌ烊痪幋a序列在內(nèi)的任何感興趣的基因可操作地連接至 本發(fā)明的調(diào)節(jié)元件，并在植物中表達(dá)。作為示例，而不是意圖限制，下文是能夠與本發(fā)明的調(diào)節(jié)序列聯(lián)合使用的基因類 型的實(shí)例。1.賦予昆蟲(chóng)抗性或抗病性的轉(zhuǎn)基因，并且其編碼(A)植物抗病性基因。植物防御通常由植物中抗病性基因(R)的產(chǎn)物與病原 體中相應(yīng)無(wú)毒性(Avr)基因產(chǎn)物之間的特異性相互作用激活。能夠用克隆的抗性基 因轉(zhuǎn)化植物品種來(lái)改造抵抗特定病原株的植物。參見(jiàn)，例如，Jones，et al. , (1994) Science 266 :789 (cloning of the tomato Cf-9 genefor resistance to Cladosporium fulvum(用于抵抗黃枝孢菌的番茄Cf-9基因的克隆))；Martin, et al.，(1993) Science 262 1432 (tomato Pto gene forresistance to Pseudomonas syringae pv.tomato encodes a protein kinase (抵抗番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌的番茄Pto基因編碼蛋白激酶))； Mindrinos, et al. , (1994)Cell 78 1089 (Arabidopsis RSP2 gene for resistance to Pseudomonassyringae (抵抗丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)的擬南芥 RSP2 基 因))；McDowell and ffoffenden,(2003)Trends Biotechnol. 21(4) 178-83 andToyoda,et al.，(2002) Transgenic Res. 11(6) :567_82。抵抗疾病的植物與野生型植物相比，更加抵抗 病原體。(B)蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)蛋白、其衍生物或模擬其合成 的多肽。參見(jiàn)，例如，Geiser，et al.，(1986)Gene 48 :109，其公開(kāi)了 Bt δ內(nèi)毒素基因 的克隆和核苷酸序列。而且，編碼δ內(nèi)毒素基因的DNA分子可以購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中 心(Rockville，MD)購(gòu)買，例如，ATCC 登錄號(hào)為 40098、67136、31995 和 31998。其他基因工程蘇云金芽孢桿菌轉(zhuǎn)基因的實(shí)例參見(jiàn)下列專利或?qū)＠暾?qǐng)，且為了本發(fā)明的目的，將其 在此通過(guò)引用并入美國(guó)專利 5，188, 960,5, 689, 052,5, 880, 275, PCT 申請(qǐng) WO 91/14778、 WO 99/31248、WO 01/12731、WO 99/24581、W097/40162 及美國(guó)專利申請(qǐng)系列 10/032,717、 10/414，637 及 10/606，320。(C)昆蟲(chóng)特異性激素或信息素，如蛻皮激素、保幼激素、其變體、其類似物，或其拮 抗劑或激動(dòng)劑。參見(jiàn)，例如，Hammock，et al. , (1990) Nature 344 :458公開(kāi)了桿狀病毒表達(dá) 的克隆保幼激素酯酶，其是保幼激素滅活劑。(D)表達(dá)時(shí)破壞了受影響的害蟲(chóng)的生理學(xué)的昆蟲(chóng)特異肽。例如，參見(jiàn)公開(kāi)的 Regan, (1994) J. Biol. Chem. 269 :9 (表達(dá)克隆產(chǎn)出編碼昆蟲(chóng)利尿激素受體的DNA) ；Pratt, et al. , (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 163 1243 (在 Diploptera puntata 中鑒定 了 咽側(cè)體 Φ制激素(allostatin)) ；Chattopadhyay, et al.，(2004)Critical Reviews inMicrobiology 30(1) 33-54 ；Zjawiony, (2004) J Nat Prod 67(2) 300-310 ；Carlini and Grossi-de-Sa, (2002)Toxicon 40(11) 1515-1539 ；Ussuf, et al. , (2001)Curr Sci. 80(7) :847-853 以及 Vasconcelos and Oliveira(2004)Toxicon 44(4) :385_403。也 可參見(jiàn)Tomalski等的美國(guó)專利5，266，317號(hào)，其公開(kāi)了編碼昆蟲(chóng)特異性毒素的基因。(E)負(fù)責(zé)單萜、倍半萜、類固醇、桂皮酸、苯丙型衍生物或另一個(gè)具有殺蟲(chóng)活性的非 蛋白分子的超積累的酶。(F)與生物活性分子的修飾有關(guān)的酶，包括翻譯后修飾；例如，糖酵解酶、蛋白 水解酶、脂解酶、核酶、環(huán)化酶、轉(zhuǎn)氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、 彈性蛋白酶，幾丁質(zhì)酶或葡聚糖酶，無(wú)論是天然的或合成的。參見(jiàn)，Scott等的PCT申請(qǐng) W093/02197，公開(kāi)了過(guò)氧化氫酶基因的核苷酸序列?？梢垣@得含有編碼幾丁質(zhì)酶序列的DNA 分子,例如，從ATCC登錄號(hào)39637和67152獲得。也可參見(jiàn)，Kramer，et al.，(1993) Insect Biochem. Molec. Biol. 23 :691，其講解了編碼鉤蟲(chóng)煙草幾丁質(zhì)酶的cDNA的核苷酸序列；以 ^Kawalleck, et al.，(1993) Plant Molec. Biol. 21 673 ；Kawalleek et al.，(1993) Plant Molec. Biol. 21 :673，其提供了香菜ubi4_2多聚遍在蛋白基因的核苷酸序；美國(guó)專利申請(qǐng) 系列 10/389，432、10/692，367 及美國(guó)專利 6，563，020 號(hào)。(G)刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子。例如，參見(jiàn) Botella，et al.，(1994)PlantMolec. Biol. 24:757公開(kāi)的綠豆鈣調(diào)蛋白cDNA克隆的核苷酸序列；及Griess，et al. , (1994) Plant Physiol. 104 :1467，其提供了玉米鈣調(diào)蛋白cDNA克隆的核苷酸序列。(H)疏水矩肽(hydrophobic moment peptide) 參見(jiàn)，PCT 申請(qǐng) W095/16776 及美 國(guó)專利5，580，852 (公開(kāi)了抑制植物真菌病原體的鱟素肽衍生物)及PCT申請(qǐng)WO 95/18855 和美國(guó)專利5，607，914 (講述了賦予抗病性的合成抗微生物肽)。(I)膜透性酶，通道形成劑或通道阻斷劑。例如，參見(jiàn)Jaynes，et al. , (1993) Plant Sci. 89:43，其公開(kāi)了抗菌肽-β溶肽類似物的異源表達(dá)，產(chǎn)生抗青枯假單胞菌 (Pseudomonas solanacearum)白勺胃—因 ^ ·。(J)病毒侵襲蛋白或由其衍生的復(fù)合毒素。例如，通過(guò)，在轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中積累 病毒外殼蛋白賦予對(duì)衍生外殼蛋白基因的病毒以及相關(guān)病毒的所招致的抗病毒感染和/ 或疾病發(fā)生。參見(jiàn)，Beachy，et al. , (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28 4510 賦予轉(zhuǎn)化植物 對(duì)抗苜?；ㄈ~病毒、黃瓜花葉病毒、煙草條紋病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、煙草蝕紋病毒，煙草脆裂病毒和煙草花葉病毒外殼蛋白介導(dǎo)的抗性，同上。(K)昆蟲(chóng)特異性抗體或由其衍生的免疫毒素。因此，靶向昆蟲(chóng)腸中的關(guān)鍵代謝功能 的抗體將失活受影響的酶，從而殺死昆蟲(chóng)。Cf.，Taylor，etal.，#497摘要，Seventh Int' 1 Symposium on Molecular Plant-microbelnteractions (第七屆國(guó)際分子植物微生物相互 作用研討會(huì)，Edinburgh, Scotland, 1994)(轉(zhuǎn)基因煙草中通過(guò)產(chǎn)生單鏈抗體片段的酶促失 活)。(L)病毒特異性抗體。例如，參見(jiàn) Tavladoraki，et al. (1993)，Nature366 :469， 其表明，表達(dá)重組抗體基因的轉(zhuǎn)基因植物免于病毒的攻擊。(M)由病原體或寄生蟲(chóng)自發(fā)產(chǎn)生的發(fā)育抑制蛋白(developmental-arrestive protein) 0因此，真菌內(nèi)切α-1，4D-多聚半乳糖醛酸酶通過(guò)溶解植物細(xì)胞壁高-α _1， 4D-半乳糖醛酸酶促進(jìn)真菌建群和植物營(yíng)養(yǎng)釋放。參見(jiàn)，Lamb，et al. , (1992)Bio/ Technology 10:1436。編碼抑制豆多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶蛋白的基因的克隆和表征，由 Toubart, et al.，(1992)Plant J. 2 367 做了描述。
(N)由植物自發(fā)產(chǎn)生的發(fā)育抑制蛋白。例如，Logemann，et al.，(1992)Bio/ Technology 10:305已證明，表達(dá)失活大麥核糖體基因的轉(zhuǎn)基因植物增加了抗真菌病的抗性。(0)與系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)應(yīng)答相關(guān)的基因和/或發(fā)病相關(guān)的基因。Briggs， (1995)Current Biology,5 (2) 128-131 ；Pieterse and Van Loon(2004)Curr. Opin. Plant Bio. 7(4) :456-64，以及 Somssich，(2003) Cellll3 (7) :815_6。(P)抗真菌基因(Cornelissen and Melchers, (1993)PI. Physiol. 101 :709_712 ； Parijs, et al.，(1991)Planta 183 :258_264 ；以及 Bushnell，et al.，(1998)Can. J. of Plant Path. 20 (2) : 137-149。也可參見(jiàn)美國(guó)專利申請(qǐng) 09/950，933。(Q)脫毒基因，如伏馬毒素、白僵菌素、串珠鐮刀菌素和玉米赤霉烯酮及其結(jié)構(gòu)相 關(guān)衍生物的脫毒基因。例如，參見(jiàn)美國(guó)專利5，792，931號(hào)。(R)半胱氨酸蛋白酶抑制劑和半胱氨酸蛋白酶抑制劑。參見(jiàn)，美國(guó)專利申請(qǐng) 10/947，979。(S)防衛(wèi)素基因。參見(jiàn)，PCT申請(qǐng)WO 03/000863及美國(guó)專利申請(qǐng)系列10/178,213號(hào)。(T)賦予線蟲(chóng)抗性的基因。參見(jiàn)，PCT 申請(qǐng) WO 03/033651 及 Urwin，et al.，(1998) Planta 204:472-479 ；WiIliamson(1999)Curr Opin PlantBio. 2(4) :327_31。(U)賦予疫霉根腐病(Phytophthora Root Rot)抗性的基因，如 Rpsl、Rps l_a、 Rps l_b、Rps l_c、Rps l_d、Rps l_e、Rps l_k、Rps 2、Rps 3_a、Rps 3_b、Rps 3_c、Rps 4、Rps 5、Rps 6、Rps 7 及其他 Rps 基因。參見(jiàn),例如，Shoemaker, et al. , Phytophthora Root Rot ResistanceGene Mapping in Soybean (^^ΜΦ^^^^ ^βΙ^^Ι^Η ), PlantGenome IV Conference (植物基因組第四次大會(huì))，San Diego，CA (1995)。(V)賦予大豆莖褐腐病(Brown Stem Rot)抗性的基因，如美國(guó)專利5，689，035號(hào) 所述。2.賦予除草劑抗性的轉(zhuǎn)基因，例如(A)抑制生長(zhǎng)點(diǎn)或分生組織的除草劑，例如咪唑啉酮或磺酰尿。這一種類的示例性基因分別編碼例如，如 Lee，et al.，(1988)EMBO J. 7:1241 ；and Miki, et al.，(1990) Theor. Appl. Genet. 80 449所述的突變體ALS和AHAS酶。還參見(jiàn)，美國(guó)專利5,605,011、 5，013，659、5，141，870、5，767，361、5，731，180、5，304，732,4, 761，373、5，331，107、 5，928，937 和 5，378，824 號(hào)以及 PCT 申請(qǐng) WO 96/33270。(B)草甘膦(分別由突變的5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸合酶合酶(EPSP)基 因和aroA基因所賦予的抗性)，和諸如草胺膦(glufosinate)的其他膦?；衔?膦 絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)基因和吸水鏈霉菌(Str印tomyces hygroscopicus)膦絲菌素 乙酰轉(zhuǎn)移酶(bar)基因)，及吡啶氧基或苯氧基丙酸和環(huán)異己酮(cycloshexone) (ACC酶 抑制劑編碼基因)。例如，參見(jiàn)Shah，et al.的美國(guó)專利4，940，835號(hào)，其公開(kāi)了能夠 賦予草甘膦抗性的EPSPS形式的核苷酸序列。Barry，et al.的美國(guó)專利5，627，061號(hào) 也描述了編碼EPSPS酶的基因。還參見(jiàn)，美國(guó)專利6，566，587,6, 338，961,6, 248，876B1、 6，040，497,5，804，425,5，633，435,5，145，783,4，971，908,5，312，910,5，188，642, 4，940，835,5，866，775,6，225，114,6，130，366,5，310，667,4，535，060,4，769，061, 5，633，448,5, 510，471、Re. 36，449,RE 37，287 E 和 5，491，288 號(hào)以及國(guó)際公開(kāi) EP1173580、 WO 01/66704、EP1173581和EP1173582。還可將草甘膦抗性賦予表達(dá)編碼草甘膦氧化還原 酶基因的植物，更詳細(xì)描述于美國(guó)專利5，776，760及5，463，175號(hào)中。另外，能夠通過(guò)編 碼草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因的過(guò)量表達(dá)來(lái)賦予植物草甘膦抗性。參見(jiàn)，例如美國(guó)專利 申請(qǐng)序號(hào)10/427，692。編碼突變的aroA基因的DNA分子能夠以ATCC登錄號(hào)39256獲得， 并且Comai的美國(guó) 專利4，769，061號(hào)公開(kāi)了突變基因的核苷酸序列。Kumada，et al.的 歐洲專利申請(qǐng)0 333 033號(hào)和Goodman，et al.的美國(guó)專利4，975，374號(hào)公開(kāi)了谷氨酰 胺合酶基因的核苷酸序列，其賦予除草劑如L-膦絲菌素抗性。Leemans，et al.的歐洲專 利0 242 246和0 242 236號(hào)提供了膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序列。De Greef, et al. , (1989)Bio/Technology 7 :61描述了編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的嵌合bar基 因的轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生。還參見(jiàn)，美國(guó)專利5，969，213,5, 489，520,5, 550，318,5, 874，265、 5，919，675,5, 561，236,5, 648，477,5, 646，024,6, 177，616 和 5，879，903 號(hào)。賦予諸如稀禾 定(Sethoxydim)和吡氟氯禾靈(haloxyfop)的苯氧基丙酸和環(huán)己酮抗性的示例性基因是 Marshall，et al.，(1992)Theor. Appl. Genet. 83 435 所述的 Accl-Sl、Accl_S2 和 Accl_S3 基因。(C)抑制光和作用的除草劑，例如三嗪(psbA和gs+基因)和芐腈(腈水解酶基 因)。Przibilla, et al.，(1991)Plant Cell 3 :169 描述了用編碼突變的 psbA 基因的質(zhì) 粒轉(zhuǎn)化衣藻(Chlamydomonas)。Stalker的美國(guó)專利4，810，648號(hào)公開(kāi)了腈水解酶基因的 核苷酸序列，并且以ATCC登錄號(hào)53435、67441和67442可獲得含有這些基因的DNA分子。 Hayes, et al.，(1992) Biochem. J. 285 173描述了編碼谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的DNA分子的克 隆和表達(dá)。(D)被導(dǎo)入各種植物的乙酰羥酸合酶，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其使得表達(dá)這種酶的植物抵抗多 種類型的除草劑(參見(jiàn)，例如Hattori，et al.，(1995)Mol GenGenet 246:419)。賦予除草 劑抗性的其他基因包括編碼大鼠細(xì)胞色素P4507A1和酵母NADPH-細(xì)胞色素P450氧化還 原酶的嵌合蛋白的基因(Shiota,et al.，(1994) Plant Physiol. 106 17)，編碼谷胱甘肽還 原酶和超氧化物岐化酶的基因(Aono，et al.，(1995)Plant Cell Physiol 36:1687)，以及編碼各種磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因(Datta, et al.，(1992) Plant Mol Biol 20 :619)。(E)葉綠素的產(chǎn)生所必需的原卟啉原氧化酶(原卟啉原氧化酶(protox))，其對(duì)于 所有植物的成活是必需的。原卟啉原氧化酶充當(dāng)各種除草化合物的靶標(biāo)。這些除草劑還抑 制全部存在的不同種類植物的生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致其徹底摧毀。開(kāi)發(fā)含有改變的原卟啉原氧化 酶活性的植物，其能抗這些除草劑，描述于美國(guó)專利6，288，306,6, 282，837及5，767，373號(hào) 及國(guó)際申請(qǐng)WO 01/12825中。3.賦予或促進(jìn)改變的谷粒特征的轉(zhuǎn)基因，例如(A)改變的脂肪酸，例如，通過(guò)(1)下調(diào)硬脂酰-ACP去飽和酶，增加植物的硬脂酸含量。參見(jiàn)，KnultZOn，et al.， (1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :2624 和 PCT 申請(qǐng)?zhí)?WO 99/64579 (改變谷物脂質(zhì)特征 的去飽和酶基因)，(2)通過(guò)FAD-2基因修飾增加油酸和/或通過(guò)FAD-3基因修飾減少亞麻酸(參見(jiàn)， 美國(guó)專利 6，063，947,6, 323，392,6, 372，965 號(hào)以及 PCT 申請(qǐng)?zhí)?WO 93/11245)，(3)改變共軛亞麻酸或亞油酸含量，例如PCT申請(qǐng)?zhí)朩001/12800，(4)改變 LEC1、AGP、Dekl、Superall、milps、各種 Ipa 基因，例如 IpaU lpa3、 hpt 或 hggt。例如，參見(jiàn) PCT 申請(qǐng)?zhí)?WO 02/42424、WO 98/22604、WO 03/011015、美國(guó) 專利6，423，886號(hào)、美國(guó)專利6，197，561號(hào)、美國(guó)專利6，825，397號(hào)、美國(guó)專利申請(qǐng)公 開(kāi)號(hào) 2003/0079247、美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào) 2003/0204870、PCT 申請(qǐng)?zhí)?WO 02/057439、WO 03/011015 以及 Rivera-Madrid，et. al.，(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92 :5620_5624。(B)改變的磷含量，例如，通過(guò)(1)導(dǎo)入肌醇六磷酸酶編碼基因。這將增強(qiáng)肌醇六磷酸的分解，從而使轉(zhuǎn)化的植物 增加更多的游離磷酸。例如，參見(jiàn)，Van Hartingsveldt, et al.，(1993)Gene 127 :87公開(kāi) 了黑曲霉(Aspergillus niger)肌醇六磷酸酶基因的核苷酸序列。(2)上調(diào)減少肌醇六磷酸含量的基因。例如，在玉米中，能夠通過(guò)如在Raboy，et al. , (1990)Maydica 35 :383中，克隆然后再導(dǎo)入與一個(gè)或多個(gè)等位基因相關(guān)的DNA來(lái)完 成這個(gè)目的，該等位基因例如在特征為低水平的肌醇六磷酸的玉米突變體中鑒定的LPA等 位基因；和/或通過(guò)改變肌醇激酶活性，如在PCT申請(qǐng)?zhí)朩O 02/059324、美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi) 號(hào)2003/0009011、PCT申請(qǐng)?zhí)朩O 03/027243、美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2003/0079247、PCT申請(qǐng) 號(hào)WO 99/05298、美國(guó)專利6，197，561號(hào)、美國(guó)專利6，291，224號(hào)、美國(guó)專利6，391，348號(hào)、 PCT申請(qǐng)?zhí)朩O 2002/059324、美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2003/0079247、PCT申請(qǐng)?zhí)朩O 98/45448、 W099/55882.W0 01/04147 中。(C)改變的碳水化合物，例如通過(guò)改變影響淀粉的分支模式的酶的基因，或硫氧還蛋白的基因所致。(參見(jiàn)，美國(guó)專利6，531，648號(hào))。參見(jiàn)，Shiroza，et al. , (1988) J. Bacteriol. 170 :810(變形鏈球菌(Sti^ptococcusmutans)果糖基轉(zhuǎn)移酶基因的核苷 酸序列)；Steinmetz, et al.，(1985)Mol. Gen. Genet. 200 :220 (枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因的核苷酸序列)；Pen，et al.，(1992)Bio/Technology 10: 292 (表達(dá)地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) α -淀粉酶的轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生)； Elliot, et al.，(1993)Plant Molec. Biol. 21 515 (番茄轉(zhuǎn)化酶基因的核苷酸序列)； S0gaard, et al.，(1993) J. Biol. Chem. 268 :22480(大麥 α -淀粉酶基因的定點(diǎn)誘變)；以及 Fisher，et al.，(1993) Plant Physiol. 102 1045 (玉米胚乳淀粉分支酶 II)，WO 申請(qǐng)?zhí)?99/10498 (通過(guò)修飾UDP-D-木糖4-差向異構(gòu)酶、Fragile 1和2、Ref 1、HCHL, C4H改進(jìn)消 化性和/或淀粉提取)；美國(guó)專利6，232，529號(hào)(通過(guò)修飾淀粉水平產(chǎn)生高油種子的方法 (AGP))。上文所述的脂肪酸修飾基因還可以通過(guò)淀粉和油途徑的相互關(guān)系來(lái)用于影響淀粉 含量和/或組成。(D)改變的抗氧化劑含量或組成，例如生育酚或生育三烯酚的改變。例如，參見(jiàn)美 國(guó)專利6，787，683號(hào)，美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?004/0034886以及PCT申請(qǐng)?zhí)朩O 00/68393，其涉 及通過(guò)改變植物異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶(phytlprenyl transferase) (ppt)來(lái)控制抗氧化劑水 平，WO申請(qǐng)?zhí)?3/082899，其通過(guò)改變尿黑酸香葉基香葉基轉(zhuǎn)移酶(hggt)來(lái)控制抗氧化劑 水平。 (E)改變的必需種子氨基酸。例如，參見(jiàn)，美國(guó)專利6，127，600號(hào)(增加種子中必 需氨基酸的積累的方法)，美國(guó)專利6，080，913號(hào)(增加種子中必需氨基酸的積累的二元方 法(binary method))，美國(guó)專利5，990，389號(hào)(高賴氨酸)、PCT申請(qǐng)?zhí)朩O 99/40209 (改 變種子中氨基酸組成)、PCT申請(qǐng)?zhí)朩O 99/29882(改變蛋白的氨基酸含量的方法)，美國(guó) 專利5，850，016號(hào)(改變種子中氨基酸組成)，PCT申請(qǐng)?zhí)朩O 98/20133 (增強(qiáng)水平的必 需氨基酸的蛋白質(zhì))，美國(guó)專利5，885，802號(hào)(高甲硫氨酸)，美國(guó)專利5，885，801號(hào)(高 蘇氨酸)，美國(guó)專利6，664，445號(hào)(植物氨基酸生物合成酶)，美國(guó)專利6，459，019號(hào)(增 加的賴氨酸和蘇氨酸)，美國(guó)專利6，441，274號(hào)(植物色氨酸合酶β亞基)，美國(guó)專利 6，346，403號(hào)(甲硫氨酸代謝酶)，第5，939，599號(hào)美國(guó)專利(高硫)，美國(guó)專利5，912，414 號(hào)(增加的甲硫氨酸)，PCT申請(qǐng)?zhí)朩O 98/56935 (植物氨基酸生物合成酶)，PCT申請(qǐng)?zhí)朩O 98/45458 (具有高百分比的必需氨基酸的改造的種子蛋白)，PCT申請(qǐng)?zhí)朩O 98/42831 (增加 的賴氨酸)，美國(guó)專利5，633，436號(hào)(增加硫氨基酸含量)，美國(guó)專利5，559，223號(hào)(具有 含有可編程水平的必需氨基酸的定義的結(jié)構(gòu)以改進(jìn)植物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的合成儲(chǔ)存蛋白質(zhì))， PCT申請(qǐng)?zhí)朩O 96/01905 (增加的蘇氨酸)，PCT申請(qǐng)?zhí)朩O 95/15392 (增加的賴氨酸)，美 國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2003/0163838，美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2003/0150014，美國(guó)專利申請(qǐng)公 開(kāi)號(hào)2004/0068767，美國(guó)專利6，803，498號(hào)，PCT申請(qǐng)?zhí)朩O 01/79516，和PCT申請(qǐng)?zhí)朩O 00/09706 (Ces A 纖維素合酶)，美國(guó)專利6，194，638號(hào)(半纖維素)，美國(guó)專利6，399，859 號(hào)和美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2004/0025203 (UDPGdH)，美國(guó)專利6，194，638號(hào)(RGP)。4.控制雄性不育的基因有幾種賦予遺傳雄性不育的方法，例如，如Brar等的美國(guó)專利4，654，465和 4，727，219號(hào)所公開(kāi)的，在孵育雄性不育的基因組中分離位置的多個(gè)突變基因，和如 Patterson在美國(guó)專利3，861，709和3，710，511號(hào)中所述的染色體易位。除了這些方法以 夕卜，Albertsen等的美國(guó)專利5，432，068號(hào)描述了核雄性不育系統(tǒng)，其包括鑒定對(duì)雄性可 育關(guān)鍵的基因；沉默這個(gè)對(duì)雄性可育關(guān)鍵的天然基因；從該必需的雄性可育基因去除天然 啟動(dòng)子并用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子代替；將這種遺傳改造的基因插入回植物；因而產(chǎn)生雄性不育的 植物，因?yàn)樵撜T導(dǎo)型啟動(dòng)子沒(méi)有“打開(kāi)”從而獲得沒(méi)有被轉(zhuǎn)錄的雄性可育基因。通過(guò)導(dǎo)入或 “打開(kāi)”該啟動(dòng)子恢復(fù)可育，這從而允許賦予雄性可育的基因的轉(zhuǎn)錄。(A)在絨氈層特異性表達(dá)啟動(dòng)子控制下及應(yīng)用化學(xué)的N-Ac_PPT(PCT申請(qǐng)WO 01/29237)下導(dǎo)入脫乙?；富?。
(B)導(dǎo)入各種雄蕊特異性啟動(dòng)子(PCT申請(qǐng)?zhí)朩O 92/13956, W092/13957) ο(C)導(dǎo)入 barnase 及 barstar 基因(Paul，et al.，(1992)Plant Mol. Biol. 19 611-622)。對(duì)于核雄性和雌性不育系統(tǒng)和基因的其他實(shí)例，還參見(jiàn)美國(guó)專利5，859，341 號(hào)、美國(guó)專利6，297，426號(hào)、美國(guó)專利5，478，369號(hào)、美國(guó)專利5，824，524號(hào)、美國(guó)專利 5，850，014號(hào)以及美國(guó)專利6，265，640號(hào)。5.為位點(diǎn)特異性DNA整合創(chuàng)建位點(diǎn)的基因這包括導(dǎo)入可用于FLP/FRT系統(tǒng)的FRT位點(diǎn)和/或用于Cre/Loxp系統(tǒng)的Lox位 點(diǎn)° 例如，參見(jiàn)，Lyznik, et al. , (2003) "Site-SpecificRecombination for Genetic Engineering in Plants (用于植物基因工程的位點(diǎn)特異性重組)” Plant Cell Rep 21: 925-932和PCT申請(qǐng)?zhí)朩O 99/25821，其在此處通過(guò)引用被并入。其他可用的系統(tǒng)包括噬 菌體 Mu 的 Gin 重組酶(Maeser，et al.，(1991)Mol Gen Genet. 230(1-2) 170-6) ；Vicki Chandler, TheMaize Handbook (玉米手冊(cè))ch. 118 (Springer-Verlag 1994)，大腸桿菌 (E. coli)的 Pin 重組酶(Enomoto, et al.，1983)以及 pSRl 質(zhì)粒的 R/RS 系統(tǒng)(Araki, et al.，(1992) J Mol Biol. 225(1) :25_37)。6.影響非生物應(yīng)激抗性的基因(包括但不限于開(kāi)花的調(diào)節(jié)，抽穗和種子發(fā)育，氮 利用效率的增強(qiáng)，改變的氮應(yīng)答性，抗旱性或耐旱性，抗寒性或耐寒性以及抗鹽性或耐鹽 性)和增加應(yīng)激下產(chǎn)量。例如，參見(jiàn)，PCT申請(qǐng)?zhí)朩O 00/73475，其中通過(guò)改變蘋果酸鹽/酯改變水利用 效率；美國(guó)專利5，892，009號(hào)、美國(guó)專利5，965，705號(hào)美國(guó)專利、5，929，305號(hào)、美國(guó)專 利5，891，859號(hào)、美國(guó)專禾Ij 6，417，428號(hào)、美國(guó)專利6，664，446號(hào)、美國(guó)專利6，706，866 號(hào)、美國(guó)專利6，717，034號(hào)、美國(guó)專利6，801，104號(hào)、PCT申請(qǐng)?zhí)朩O 2000/060089、WO 2001/026459、W02001/035725、WO 2001/034726、WO 2001/035727、WO 2001/036444、WO 2001/036597、WO 2001/036598、WO 2002/015675、WO 2002/017430、WO 2002/077185、WO 2002/079403、WO 2003/013227、WO 2003/013228、WO 2003/014327、WO 2004/031349、WO 2004/076638、WO 98/09521和WO 99/38977所描述的基因，其包括CBF基因和有效地緩解 冷凍、高鹽度和干旱對(duì)植物的不良影響以及賦予植物表型其他有利影響的轉(zhuǎn)錄因子；美國(guó) 專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2004/0148654和PCT申請(qǐng)?zhí)朩O 01/36596，其中改變了植物中的脫落酸 從而獲得改進(jìn)的植物表型，如產(chǎn)量增加和/或增強(qiáng)的對(duì)非生物應(yīng)激的耐性；PCT申請(qǐng)?zhí)朩O 2000/006341、WO 04/090143、美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0/817，483和美國(guó)專利6，992，237號(hào)，其中 改變了細(xì)胞分裂素從而獲得應(yīng)激耐性增加的植物，如耐旱性和/或增加產(chǎn)量。還參見(jiàn)，PCT 申請(qǐng)?zhí)?WO 02/02776,WO 2003/052063、JP 2002281975，美國(guó)專利 6，084，153 號(hào)，PCT 申請(qǐng)?zhí)?WO 0164898，美國(guó)專利6，177，275號(hào)，以及美國(guó)專利6，107，547號(hào)(氮利用的增強(qiáng)和改變的 氮應(yīng)答性)。對(duì)于乙烯改變，參見(jiàn)，美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)20040128719、美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào) 20030166197和PCT申請(qǐng)?zhí)朩O 2000/32761。對(duì)于植物轉(zhuǎn)錄因子或非生物應(yīng)激的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié) 子，參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2004/0098764或美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2004/0078852?？梢詫⒂绊懼参锷L(zhǎng)和農(nóng)學(xué)性狀，如產(chǎn)量、開(kāi)花、植物生長(zhǎng)和/或植物結(jié)構(gòu)、營(yíng) 養(yǎng)吸收，特別是植物的氮吸收、氮利用效率；耐旱性和水利用效率；根強(qiáng)度和根倒伏抗性； 土壤害蟲(chóng)控制、玉米根蟲(chóng)抗性的其他基因和轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入或基因滲入植物中，參見(jiàn)，例如PCT 申請(qǐng)?zhí)?W097/49811(LHY)、WO 98/56918 (ESD4)、WO 97/10339 和美國(guó)專利 6，573，430 號(hào)(TFL)，美國(guó)專利 6，713，663 號(hào)(FT)，PCT 申請(qǐng)?zhí)?WO 96/14414 (CON)、WO 96/38560、 WO 01/21822(VRNl)、WO 00/44918(VRN2)、WO 99/49064 (GI)、WO 00/46358(FRI)、WO 97/29123，美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?6，794，560,6, 307，126 (GAI)，PCT 申請(qǐng)?zhí)?WO 99/09174 (D8 和 Rht)和 W02004/076638 和 WO 2004/031349 (轉(zhuǎn)錄因子)。能夠通過(guò)表達(dá)改變用于產(chǎn)生紙、織物、乙醇、聚合物或具有商業(yè)用途的其他材料的 淀粉或蛋白質(zhì)的基因來(lái)創(chuàng)造植物的商業(yè)性狀。增加或抑制蛋白的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，作為示例，該方法包括轉(zhuǎn)基 因表達(dá)、反義抑制、共抑制方法，其包括但不限于RNA干擾、利用轉(zhuǎn)錄因子和/或阻遏物的 基因激活或抑制，誘變，其包括轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽、定點(diǎn)和位點(diǎn)特異性誘變、染色體工程(參見(jiàn)， Nobrega，et. al.，(2004)Nature 431 :988_993)、同源重組、TILLING(定向誘導(dǎo)基因組局部 病變(Targeting Induced Local Lesions In Genomes)) ；McCallum, et al. , (2000) Nature Biotechnol. 18 455-457)以及操縱蛋白表達(dá)的生物合成競(jìng)爭(zhēng)。用于基因沉默的許多技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，其包括但不限 于敲除，例如通過(guò)插入轉(zhuǎn)座元件，如Mu, Vicki Chandler, The MaizeHandbook ch. 118(Springer-Verlag 1994)，或其他遺傳元件，如FRT、Lox或其他位點(diǎn)特異性整合 位點(diǎn)；RNA 干擾(Napoli, et al.，(1990)Plant Cell2 :279_289 ；美國(guó)專利 5，034，323 號(hào)，Sharp (1999)Genes Dev. 13 :139_ 141，Zamore, et al.，(2000)Cell 101 25~33 禾口 Montgomery, et al.，(1998)PNASUSA 95 15502-15507)；病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Burton， et al.，(2000)PlantCell 12 :691_705，和美國(guó)專利 6，635，805 號(hào)(1999)Curr. Op. Plant Bio. 2 109-113)；靶 RNA 特異性核酶(Haseloff，et al.，(1988)Nature334 585-591)； 發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Smith, et al.，(2000) Nature 407 :319_320 ；PCT 申請(qǐng)?zhí)?WO 99/53050 和 WO 98/53083)；微 RNA(Aukerman and Sakai (2003)Plant Cell 15:2730-2741)；核酶 (Steinecke, et al. ， (1992)EMBO J. 11 1525, and Perriman, et al. ， (1993)Antisense Res. Dev. 3 253)；寡核苷酸介導(dǎo)的靶向修飾(例如，PCT申請(qǐng)?zhí)朩O 03/076574和WO 99/25853)；鋅指靴向的分子(例如，PCT申請(qǐng)?zhí)朩O 01/52620、WO 03/048345和WO 00/42219)；以及對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他方法或上述方法的組合。增加或抑制感興趣的基因的表達(dá)的任何方法，都可以用于本發(fā)明中。下文更詳細(xì) 地列出了一些作為示例目的的實(shí)例。可操作地連接至本文所公開(kāi)的調(diào)節(jié)元件的核苷酸序列可以是靶基因的反義序列 (參見(jiàn)，例如，Sheehy，et al.，(1988)PNAS USA 85 :8805_8809 ；和美國(guó)專利 5，107，065、 5，453，566和5，759，829號(hào))?！胺戳x序列”旨在表示序列，其方向與該核苷酸序列的5，至 3’的正常方向相反。當(dāng)被遞送至植物細(xì)胞時(shí)，反義DNA序列的表達(dá)防止靶基因的DNA核苷 酸序列的正常表達(dá)。反義核苷酸序列編碼RNA轉(zhuǎn)錄物，該RNA轉(zhuǎn)錄物與靶基因的DNA核苷 酸序列的轉(zhuǎn)錄所產(chǎn)生的內(nèi)源信使RNA(mRNA)互補(bǔ)并且能夠與其雜交。在這種情況下，抑制 了靶基因所編碼的天然蛋白的產(chǎn)生，獲得期望的表型應(yīng)答。因此，本文所公開(kāi)的調(diào)節(jié)序列可 以可操作地連接至反義DNA序列，來(lái)減少或抑制植物中天然蛋白的表達(dá)。如所指出的，影響植物中蛋白的表達(dá)的其他潛在方法包括，常規(guī)的共抑制，S卩，通 過(guò)由轉(zhuǎn)化導(dǎo)入的相同結(jié)構(gòu)的基因或基因片段的表達(dá)來(lái)抑制內(nèi)源基因的表達(dá)(Goring，etal.，(1991)Proc. Natl. Acad Sci. USA88 :1770-1774 共抑制；Taylor (1997)Plant Cell 9 1245 Jorgensen(1990)Trends Biotech. 8(12) 340-344 ；Flavell(1994)PNAS USA 91: 3490-3496 ；Finnegan, et al.，(1994)Bio/Technology 12 :883_888 ；以及 Neuhuber, et al.，(1994)Mol. Gen. Genet. 244 230-241)。在一實(shí)例中，共抑制能夠通過(guò)將啟動(dòng)子與DNA 片段連接來(lái)實(shí)現(xiàn)，從而該片段的轉(zhuǎn)錄物以正義方向產(chǎn)生并且當(dāng)該轉(zhuǎn)錄物與感興趣的內(nèi)源基 因的轉(zhuǎn)錄物具有至少65%的序列同一性時(shí)，借此抑制了所述植物細(xì)胞中內(nèi)源基因的表達(dá)。 (參見(jiàn)，美國(guó)專利5，283，184號(hào))。靶向共抑制的內(nèi)源基因可以是編碼在感興趣的植物物種 中積累的任何蛋白的基因。例如，當(dāng)靶向共抑制的內(nèi)源基因是50kD Y-玉米蛋白基因時(shí)， 利用包含50kD Y-玉米蛋白基因序列或其變體或片段的表達(dá)盒實(shí)現(xiàn)共抑制。共抑制的其他方法在本領(lǐng)域是已知的，并且能夠類似地應(yīng)用于本發(fā)明。這些方 法包括通過(guò)剪接的發(fā)夾RNA和稱為RNA干擾的類似方法以及啟動(dòng)子沉默來(lái)沉默靶基因 (Smith, et al. , (2000)Nature 407 319-320, Waterhouse and Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4 29-38 ；ffaterhouse, et al. , (1998)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13959-13964 ；Chuang and Meyerowitz (2000)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 4985-4990 ； Stoutjesdijk, et al.，(2002)Plant Physiol. 129 1723-1731 ；和 PCT 申請(qǐng)?zhí)?WO 99/53050、WO 99/49029、WO 99/61631、WO 00/49035 和美國(guó)專利 6，506，559 號(hào))。對(duì)于miRNA干擾，將表達(dá)盒設(shè)計(jì)為表達(dá)模擬內(nèi)源基因的RNA分子。miRNA分子編碼 形成含有22-核苷酸序列的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA，該22-核苷酸序列與內(nèi)源基因(靶序列)互 補(bǔ)。miRNA分子高度效抑制內(nèi)源基因的表達(dá)，并且該miRNA分子誘導(dǎo)的RNA干擾被植物隨后 的世代繼承。在一實(shí)施方案中，待導(dǎo)入植物的多核苷酸包含抑制序列，其編碼結(jié)合基因的鋅 指蛋白，從而導(dǎo)致該基因表達(dá)的減少。在具體的實(shí)施方案中，鋅指蛋白結(jié)合本發(fā)明的調(diào) 節(jié)區(qū)。在另外的實(shí)施方案中，鋅指蛋白結(jié)合編碼蛋白的信使RNA并防止其翻譯。選擇鋅 指蛋白靶向位點(diǎn)的方法描述于例如美國(guó)專利6，453，242號(hào)中，并且例如美國(guó)專利公開(kāi)號(hào) 2003/0037355，描述了利用鋅指蛋白抑制植物中基因表達(dá)的方法。表達(dá)盒還可以在分離的感興趣的核苷酸序列的3’末端包括在植物中有功能的轉(zhuǎn) 錄和翻譯終止區(qū)域。終止區(qū)域可以是與本發(fā)明的啟動(dòng)子核苷酸序列天然存在的，可以是與 感興趣的DNA序列天然存在的或者可以源自其他來(lái)源。任何常規(guī)終止區(qū)域都可以與本發(fā)明的啟動(dòng)子聯(lián)合使用，并且可以獲得自根癌 農(nóng)桿菌(A. tumefaciens)的Ti-質(zhì)粒，例如，章魚(yú)堿合酶和胭脂氨酸合酶終止區(qū)域。還 參見(jiàn)，Guerineau，et al.，(1991)Mol. Gen. Genet. 262 141-144 ；Proudfoot (1991) Cell 64 671-674 ；Sanfacon, et al.，(1991)Genes Dev. 5 :141_149 ；Mogen, et al.，(1990) Plant Cell 2 1261-1272 ；Munroe, et al.，(1990)Gene 91 151-158 ；Ballas, et al.， (1989)Nucleic Acids Res. 17 :7891_7903 Joshi, et al.，(1987)Nucleic Acid Res. 15 9627-9639。表達(dá)盒還可以含有5’前導(dǎo)序列。這類前導(dǎo)序列可以起增強(qiáng)翻譯的作用。翻譯前 導(dǎo)區(qū)在本領(lǐng)域是已知的，并且包括微小RNA病毒前導(dǎo)區(qū)，如EMCV前導(dǎo)區(qū)(腦心肌炎5’非編 碼區(qū))，Elroy-Stein，et al.，(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :6126_6130 ；馬鈴薯 Y 病 毒組前導(dǎo)區(qū)，如TEV前導(dǎo)區(qū)(煙草蝕紋病毒)，Allison，et al.，(1986) "The NucleotideSequence of the CodingRegion of Tobacco Etch Virus Genomic RNA :Evidence for the Synthesis ofa Single Polyprotein(煙草蝕紋病毒基因組RNA編碼區(qū)的核苷酸序 列合成單個(gè)多蛋白的證據(jù))”，Virology 154 9-20 ；MDMV前導(dǎo)區(qū)(玉米矮縮花葉病毒)； 人免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BiP)，Macejak, et al.，(1991)Nature353 :90_94 ；來(lái)自苜蓿 花葉病毒外殼蛋白mRNA的未翻譯的前導(dǎo)區(qū)(AMVRNA 4)，Jobling, et al.，(1987)Nature 325:622-625)；煙草花葉病毒前導(dǎo)區(qū)(TMV), Gallie, et al.，(1989)Molecular Biology of RNA, pages 237-256 ；以及玉米褪綠斑駁病毒前導(dǎo)區(qū)(MCMV)，Lommel, et al.，(1991) Virology81 :382_385。
# H， Della—Cioppa， et al. , (1987)Plant Physiology 84 965-968。表達(dá)盒還可以含有增強(qiáng)翻譯和/mRNA穩(wěn)定性的序列，如內(nèi)含子。在當(dāng)期望具有針對(duì)特定的細(xì)胞器，特別是質(zhì)體、造粉體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分離的核苷酸序列的表達(dá)產(chǎn)物，或在細(xì)胞表面或細(xì)胞外的分泌產(chǎn)物時(shí)，表達(dá)盒還可以含有轉(zhuǎn)運(yùn)肽的編碼 序列。這類轉(zhuǎn)運(yùn)肽在本領(lǐng)域是已知的，并且包括但不限于酰基載體蛋白、RUBIS⑶小亞基、 植物EPSP合酶等。在制備表達(dá)盒時(shí)，可以操作各種DNA片段，從而提供合適方向的，以及視情況而定，合適讀框的DNA序列。所以，可以使用連接物(adapter)或連接體(linker)來(lái)連接DNA 片段，或者包括其他操作來(lái)提供常規(guī)的限制性位點(diǎn)、去除多余的DNA、去除限制性位點(diǎn)等。為 此目的，可以包括體外誘變、引物修復(fù)、限制性消化、復(fù)性和再取代，如轉(zhuǎn)換和顛換。如本文所指出，本發(fā)明提供能夠在本發(fā)明的調(diào)節(jié)元件的控制下表達(dá)感興趣的基 因的載體。通常，載體在植物細(xì)胞內(nèi)應(yīng)當(dāng)是有功能的。有時(shí)，優(yōu)選具有在大腸桿菌中有功 能(例如，產(chǎn)生增強(qiáng)抗體、DNA序列分析、插入的構(gòu)建、獲得核酸的量的蛋白)的載體。在 Sambrook, et al.(見(jiàn)上文)中討論了用于在大腸桿菌中克隆和表達(dá)的載體和程序。轉(zhuǎn)化載體還可以含有要待共轉(zhuǎn)化于有機(jī)體中的基因的至少一個(gè)另外的核苷酸序 列，所述轉(zhuǎn)化載體包含可操作地連接至表達(dá)盒中分離的核苷酸序列的本發(fā)明的調(diào)節(jié)序列。 或者，所述另外的序列可以在另外的轉(zhuǎn)化載體上提供。在植物中有功能的載體可以是源自農(nóng)桿菌(Agrobacterium)的二元質(zhì)粒(binary plasmid)。這類載體能夠轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。這類載體含有整合入宿主(植物)染色體所需的 左和右邊界序列。至少，這些邊界序列之間是要在本發(fā)明的調(diào)節(jié)元件的控制下表達(dá)的基因。 在一實(shí)施方案中，還包括了可選的標(biāo)志物和報(bào)道基因。為了容易地獲得足夠量的載體，可以 使用允許在大腸桿菌中復(fù)制的細(xì)菌來(lái)源。轉(zhuǎn)化載體可以包括報(bào)道基因。合適的報(bào)道基因的實(shí)例在本領(lǐng)域中是已知的，并 且可以在下述文獻(xiàn)中找到，例如，Jefferson, et al.，(1991) in PlantMolecular Biology Manual, ed. Gelvin, et al. , (Kluwer Academic Publishers), pp. 1-33 ；Deffet, et al., (1987)Mol.Cell. Biol. 7:725_737 ；Goff, et al.，(1990)EMBO J. 9 :2517_2522 ；Kain, et al.，(1995) BioTechniques 19 :650_655 ；以及 Chiu，et al.，(1996) Current Biology 6 325-330。轉(zhuǎn)化載體可以包含用于選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織的可選的標(biāo)志基因。這些可選的標(biāo) 志基因包括賦予抗生素抗性或除草劑抗性的基因。合適的可選的標(biāo)志基因的實(shí)例包括但不 限于編碼氯霉素抗性的基因，HerreraEstrella，et al.，(1983)EMBO J. 2 :987_992 ；編碼 甲氨蝶呤抗性的基因，Herrera Estrella, et al.，(1983)Nature 303 209-213 ；Meijer,et al.，(1991)Plant Mol. Biol. 16 807-820 ；編碼潮霉素抗性的基因，ffaldron, et al.， (1985)Plant Mol. Biol. 5 103-108,Zhijian,et al.，(1995)Plant Sciencel08 :219_227 ； 編碼鏈霉素抗性的基因，Jones, et al.，(1987)Mol. Gen. Genet. 210 :86_91 ；編碼大觀霉素 的基因，Bretagne-Sagnard，et al.，(1996)Transgenic Res. 5 :131_137 ；編碼博來(lái)霉素 抗性的基因，Hille，et al.，(1990)Plant Mol. Biol. 7 :171_176 ；編碼磺胺抗性的基因， Guerineau, et al.，(1990) Plant Mol. Biol. 15 :127_136 ；編碼溴苯腈(bromoxynil)抗性 的基因，Stalker, et al.，(1988) Science 242 :419_423 ；編碼草甘膦抗性的基因，Shaw, et al.，(1986) Science 233 :478_481 ；編碼膦絲菌素抗性的基因，DeBlock，et al.，(1987) EMBO J. 6 :2513-2518。而且，當(dāng)將本發(fā)明的啟動(dòng)子與編碼可檢測(cè)的蛋白的核苷酸序列連接時(shí)，可以追蹤 連接的序列的應(yīng)激誘導(dǎo)的表達(dá)，借此提供有用的所謂可篩查或可評(píng)分標(biāo)志物?？梢詸z測(cè) 連接的蛋白的表達(dá)，而不需要破壞組織。最近，對(duì)于可篩查或可評(píng)分標(biāo)志物的興趣增加 了。作為示例而不是限制，可將啟動(dòng)子連接至可檢測(cè)的標(biāo)志物，該標(biāo)志物包括，葡糖 醛酸糖苷酶或UidA基因(⑶S)，其多種生色素物質(zhì)因其編碼的酶而知名(Jefferson，et al.，(1986)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8447-8451)；氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶；堿性磷酸 酶；R-基因座基因，其編碼調(diào)節(jié)植物組織中花青苷色素(紅色)產(chǎn)生的產(chǎn)物(Dellaporta， et al. , (1988) in Chromosome Structure andFunction(染伊‘體結(jié)構(gòu)與功倉(cāng)κ )，Kluwer Academic Publishers, Appels andGustafson eds. , pp.263-282 ；Ludwig, et al. , (1990) Science 247 449) ；ρ-內(nèi)酰胺酶(Sutcliffe, (1978)Proc. Nat' 1. Acad. Sci. U. S. Α. 75 3737)，其多種產(chǎn)色素底物因其編碼的酶而知名(例如，PADAC，產(chǎn)色素頭孢菌素)；xylE基因 (Zukowsky, et al.，(1983) Proc. Nat' 1. Acad. Sci. U. S. A. 80 :1101)，其編碼能夠轉(zhuǎn)化生 色的兒茶酚的 兒茶酚雙加氧酶；α-淀粉酶基因(Ikuta, et al. , (1990) Biotech. 8 241)； 酪氨酸酶基因(Katz, et al.，(1983) J. Gen. Microbiol. 129 :2703)，其編碼能夠?qū)⒗野彼?氧化成DOPA和多巴醌(dopaquinone)的酶，該多巴醌隨后縮合形成容易檢測(cè)的化合物黑 色素；綠色熒光蛋白(GFP)基因(Sheen, et al.，(1995)Plant J. 8 (5) :777_84)；發(fā)光酶 基因(lux gene)，其編碼熒光素酶，該熒光素酶的存在可以利用，例如X射線膜、閃爍計(jì)數(shù) (scintillation counting)、熒光分光光度法、低光攝影機(jī)(low-light videocamera)、光 子計(jì)數(shù)攝像機(jī)(photon counting camera)或多孔發(fā)光測(cè)定法(multiwell luminometry) 來(lái)檢測(cè)(Teeri, et al.，(1989)EMBO J. 8 343) ；DS-RED EXPRESS (Matz, et al.，(1999) Nature Biotech. 17 969-973,Bevis,et al. ， (2002)Nature Biotech 20 83-87, Haas,et al.，(1996)Curr. Biol. 6 315-324)；紐扣珊瑚(Zoanthus sp)黃色熒光蛋白(ZsYellow), 其已經(jīng)被改造為更亮的熒光(Matz，et al.，(1999)Nature Biotech. 17 :969_973，可購(gòu)自 BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, USA, catalog no. K6100-1)；以及青色熒光蛋白 (CYP) (Bolte，et al.，(2004)J.Cell Science 117 :943_54 andKato，et al.，(2002)Plant Physiol 129:913-42)。包含本發(fā)明的具體調(diào)節(jié)序列的轉(zhuǎn)化載體，可用于轉(zhuǎn)化任何植物，該調(diào)節(jié)序列操作 地連接至表達(dá)盒中分離的感興趣的核苷酸序列。以這種方式，可以獲得基因修飾的植物、 植物細(xì)胞、植物組織等。轉(zhuǎn)化方法根據(jù)植物或植物細(xì)胞類型而不同，即，轉(zhuǎn)化所靶向的單子 葉植物或雙子葉植物。轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的合適方法包括顯微注射，CroSSWay，et al. , (1986)Biotechniques 4 :320_334 ；電穿孔，Riggs，et al. , (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 5602-5606 ；農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，參見(jiàn)，例如Townsend等的美國(guó)專利5，563，055號(hào)；直接基 因轉(zhuǎn)化，Paszkowski，et al.，(1984)EMBO J. 3 :2717_2722 ；以及彈道粒子加速(ballistic particle acceleration)，參見(jiàn)，例如 Sanford 等的美國(guó)專利 4，945，050 號(hào)，Tomes，et al.， (1995) in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture fundamental Methods (才直·_■、 組織和器官培養(yǎng)基礎(chǔ)方法)，ed. Gamborg and Phi 11 ips (Springer-Verlag, Berlin)； 禾口 McCabe, et al.，(1988)Biotechnology 6 :923_926。還參見(jiàn)，ffeissinger, et al.， (1988)Annual Rev. Genet. 22 :421_477 ；Sanford,et al., (1987)ParticulateScience and Technology 5:27_37(洋蔥)；Christou, et al.，(1988)Plant Physiol. 87 :671_674(大 豆)；McCabe, et al.，(1988) Bio/Technology 6 :923_926(大豆)；Datta, et al.，(1990) Bio/Technology 8 :736_740 (水稻)；Klein, et al. , (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4305-4309 (玉米)；Klein, et al.，(1988) Biotechnology 6 :559_563 (玉米)；Klein, et al.，(1988) Plant Physiol. 91 :440_444 (玉米)；Fromm, et al.，(1990) Biotechnology 8 833-839 ；Hooydaas-Van Slogteren, et al.，(1984)Nature(London) 311 :763_764 ； Bytebier, et al.，(1987)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 :5345_5349(百合)；Deffet 等
(1985)在G.P. Ghapman等編H白勺The Experimental Manipulationof Ovule Tissues ( 組織實(shí)驗(yàn)操作)(Longman, New York)，第 197-209 頁(yè)(花粉)中；Ka 印 pler，et al.，(1990) Plant Cell Reports 9:415-418;禾口 Ka印pier，et al. , (1992) Theor. Appl. Genet. 84 560-566 (晶須(whisker)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)；D. Halluin, et al.，(1992) Plant Cell 4 1495-1505 (電穿孔)；Li, et al.，(1993)Plant Cell Reports 12 :250_255 和 Christou, et al. , (1995) Annals of Botany75 :407_413 (/K 稻)；Osjoda, et al. , (1996) Nature Biotechnology 14 745-750 ((Agrobacterium tumefaciens)白勺 )?？梢愿鶕?jù)常規(guī)方法使已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在植物中生長(zhǎng)。參見(jiàn)，例如McCormick，et al.,
(1986)PlantCell Reports 5:81-84。然后，可以使這些植物生長(zhǎng)并用相同的轉(zhuǎn)化株或不 同株授粉。然后可以鑒定具有期望的表型特征的應(yīng)激誘導(dǎo)表達(dá)的所得的植物?？梢陨L(zhǎng)兩 代或更多代，以確保期望表型特征的應(yīng)激誘導(dǎo)表達(dá)穩(wěn)定地保持并繼承。如美國(guó)專利申請(qǐng)公 開(kāi)2003/00221212所述的功能分析系統(tǒng)可以用于有效地評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因品系。作為示例而不是作為限制，提供下文的實(shí)施例。
實(shí)施例實(shí)施例1 黑麥CBF31啟動(dòng)子的分離利用設(shè)計(jì)為針對(duì)擬南芥和玉米CBF蛋白中的保守AP2結(jié)構(gòu)域的正向引物(SEQ ID NO :2和3)及為dT17連接物引物的反向引物(SEQ ID NO :4)，從冬黑麥分離和克隆 ScCBF31的編碼區(qū)的部分序列。將因此獲得的編碼區(qū)的部分序列用作探針，來(lái)確定黑麥 CBF31基因的冷誘導(dǎo)表達(dá)(圖1)。在鑒定冷誘導(dǎo)時(shí)程中基因的嚴(yán)緊調(diào)節(jié)時(shí)，分離了該基 因的5’調(diào)節(jié)區(qū)。對(duì)于這個(gè)調(diào)節(jié)區(qū)的分離，從黑麥制備了 GenomeWalke/IClontech)文 庫(kù)。通過(guò)GenomeWalker (Clontech)文庫(kù)，利用位于部分編碼序列中的基因特異性引物和 GenomeWalker 試劑盒所提供的連接物引物(SEQ ID NO :5)來(lái)分離該5，調(diào)節(jié)區(qū)。將該分 離的5’調(diào)節(jié)區(qū)克隆并測(cè)序。分析分離的啟動(dòng)子區(qū)的順式元件，并與擬南芥、玉米和水稻CBF啟動(dòng)子進(jìn)行比較(圖2和表1)。
表1.擬南芥、水稻和黑麥之間CBF/DREB啟動(dòng)子的比較 實(shí)施例2通過(guò)粒子轟擊轉(zhuǎn)化玉米。
用含有表達(dá)盒的質(zhì)粒轟擊來(lái)自溫室供體植物的未成熟的玉米胚，該表達(dá)盒包含 可操作地連接至感興趣的基因的ScCBF31啟動(dòng)子。該質(zhì)粒還包含可選的標(biāo)志基因，例如 PAT (ffohlleben, et al.，(1988)Gene 70 :25_37)，其賦予除草劑雙丙氨磷(bialaphos)抗 性?；蛘?，在分離的質(zhì)粒上提供可選的標(biāo)志基因。按照如下步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)化。培養(yǎng)基配方提 供如下。將谷穗剝皮，并在30% Clorox 漂白劑加0. 5% Micro除垢劑中進(jìn)行表面滅菌20 分鐘，然后用無(wú)菌水漂洗兩次。將該未成熟的胚切下，胚軸朝下(胚盤向上朝上)，每板25 個(gè)胚，在560Y培養(yǎng)基中放置5小時(shí)，然后排列在2. 5cm靶區(qū)內(nèi)準(zhǔn)備轟擊。制備質(zhì)粒載體，其包含可操作地連接至感興趣的基因的ScCBF31啟動(dòng)子序列。利 用如下的CaCl2沉淀步驟，將這種質(zhì)粒DNA加含有PAT可選的標(biāo)志物的質(zhì)粒DNA沉淀在 1. 1 μ m(平均直徑)小鎢球上100 μ 1在水中制備的鎢顆粒；10 μ 1 Tris EDTA緩沖液中的 DNA(1 μ g) (1μ g 總 DNA) ； 100 μ 1 2. 5Μ CaCl2 ；以及 10 μ 1 0. IM 亞精胺。在復(fù)式管旋流器(multitube vortexer)上保持時(shí)，將每種試劑順序地添加至鎢顆 粒懸浮液中。將最終混合物短暫地進(jìn)行超聲處理并在恒定渦旋下孵育10分鐘。沉淀完畢 后，將離管短暫地離心，去除液體，用500mll00%的乙醇洗滌，并離心30秒。再次去除液體， 并向最終鎢顆粒團(tuán)添加105μ 1 100%乙醇。為了進(jìn)行粒子槍轟擊，將鎢/DNA顆粒短暫地進(jìn) 行超聲處理，并將10 μ 1涂至每個(gè)大載體(macrocarrier)的中心，在轟擊前干燥2分鐘。將樣品板在粒子槍#HE35_1或#HE35_2中，以#5級(jí)進(jìn)行轟擊。全部樣品接收了 650PSI的單次射擊，并且從每管制備的顆粒/DNA中取出總共10個(gè)等份。轟擊后，將胚保持在560Y培養(yǎng)基中2天，然后轉(zhuǎn)移至含有3mg/升雙丙氨磷的560R 選擇培養(yǎng)基中，并每?jī)芍芾^代培養(yǎng)。約10周的選擇后，將抗選擇的胼胝體克隆轉(zhuǎn)移至288J 培養(yǎng)基中以起始植物再生。體細(xì)胞胚成熟(2至5周)后，將充分發(fā)育的體細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)移 至用于發(fā)芽的培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)室。約7-10天后，將發(fā)育的苗轉(zhuǎn)移至管中的不含 272V激素的培養(yǎng)基，保持7至10天，直至苗充分形成。然后將植物轉(zhuǎn)移至含有盆栽土的平 板(flat)中的墊塊(insert)中(相當(dāng)于2. 5”的盆)，并使其在溫室中生長(zhǎng)1周，隨后在溫 室中生長(zhǎng)另外的1-2周，然后轉(zhuǎn)移至標(biāo)準(zhǔn)的600盆(1.6加侖)，并生長(zhǎng)至成熟。監(jiān)測(cè)植物， 在各種條件下進(jìn)行評(píng)分，并與對(duì)照植物相比較。觀察到標(biāo)志基因的表達(dá)，以證實(shí)轉(zhuǎn)化。監(jiān)測(cè) 到表型的改變，這反映了感興趣的基因的表達(dá)。轟擊培養(yǎng)基(560Y)包含5.0g/l N6 基鹽(SIGMA C-1516)、1. Oml/lEriksson 維生 素混合物(Eriksson's Vitamin Mix) (1000X SIGMA-1511)、0· 5mg/l 鹽酸硫胺素(thiamine HCl)、120. 0g/l 蔗糖、1. 0mg/l 2，5_D 和 2. 88g/lL_ 脯氨酸(用 KOH將 pH調(diào)至 5. 8 后，用 D-I H2O定容)；2.0g/l Gelrite 膠凝劑(用D-I H20定容后添加)；以及8. 5mg/l硝酸銀(將培 養(yǎng)基滅菌并冷卻至室溫后添加)。選擇培養(yǎng)基(560R)包含5. 0g/l N6基鹽(SIGMAC-1516)、 1. 0ml/l Eriksson 維生素混合物(1000X SIGMA-1511)、0· 5mg/l 鹽酸硫胺素、30. 0g/l 蔗糖 和 2.0mg/l 2，5-D (用 KOH 將 pH 調(diào)至 5. 8 后，用 D-I H2O 定容)；3. 0g/l Gelrite 膠凝劑 (用D-I H20定容)后添加)；以及0. 85mg/l硝酸銀和3. 0mg/l雙丙氨磷(均在將培養(yǎng)基 滅菌并冷卻至室溫后添加)。植物再生培養(yǎng)基(288J)含有5. 3g/l MS 鹽(GIBC0 11117-075)、5. 0ml/lMS 維生 素儲(chǔ)備溶液(0. IOOg煙酸、0. 02g/l鹽酸硫胺素、0. 10g/l鹽酸吡哆醇(pyridoxine HCL)和 0. 50g/l 甘氨酸，用精制的(polished)D-I H2O 定容)(Murashige and Skoog(1962) Physiol. Plant. 15 573)、100mg/l 肌醇、0. 5mg/l 玉米素、60g/l 蔗糖和 1. Oml/1 的 0. ImM脫 落酸(將PH調(diào)至5. 6后用精制的D-I H2O定容)；3.0g/l Gelrite 膠凝劑(用D-I H2O 定容后添加)；以及1. Omg/1吲哚乙酸和3. Omg/1雙丙氨磷(將培養(yǎng)基滅菌并冷卻至60°C 后添加)。不含激素的培養(yǎng)基(272V)包含5. 3g/L MS鹽(GIBC011117-075)、5. Oml/1 MS維 生素儲(chǔ)備溶液(0. 100g/l煙酸、0. 02g/l鹽酸硫胺素、0. 10g/l鹽酸吡哆醇和0. 50g/l甘氨 酸，用精制的D-I H2O定容)、0· lg/Ι肌醇和50. Og/Ι蔗糖(將pH調(diào)至5. 6后用精制的D-I H2O定容)；以及6g/l Bacto -瓊脂固化劑(用精煉的D-I H2O定容后添加)，滅菌并冷卻 至 60°C。實(shí)施例3 通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和再生玉米胼胝體用可操作地連接至目標(biāo)基因的ZmCBFl或ZmCBF2啟動(dòng)子序列(SEQ ID NO :1)進(jìn)行玉米的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，采用趙(Zhao)的方法(美國(guó)專利5981840號(hào)、PCT專利公開(kāi) W098/32326，在此將其通過(guò)引用并入)。在具有選擇性試劑的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)未成熟的 胚，從而獲得轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的選擇性生長(zhǎng)。然后將胼胝體再生成植物，并且將生長(zhǎng)在選擇培養(yǎng) 基上的胼胝體在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)以再生植物。當(dāng)與合適的對(duì)照植物進(jìn)行比較時(shí)，監(jiān)測(cè)植物的表型調(diào)節(jié)。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的細(xì)節(jié)如下文所列或?qū)Ρ绢I(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。農(nóng)桿菌懸浮液的制備從-80°C冷凍的等份試樣中，將農(nóng)桿菌移取至含有PHI-L培養(yǎng)基的平板上，并 在28 °C下避光培養(yǎng)3天。PHI-L培養(yǎng)基包含25ml/l儲(chǔ)備溶液A、25ml/l儲(chǔ)備溶液B、 450. 9ml/l儲(chǔ)備溶液C和大觀霉素(SigmaChemicals)，將其向滅菌的ddH20中添加至濃度 為 50mg/l (儲(chǔ)備溶液 A :K2HP04 60. Og/1、NaH2P04 20. Og/1、用 KOH 將 pH 調(diào)至 7. 0 并高 壓滅菌；儲(chǔ)備溶液 B :NH4C1 20. Og/1、MgS04. 7H20 6. Og/1、KCl 3. 0g/l、CaC12 0. 20g/l、 FeS04. 7H20 50. Omg/1,高壓滅菌；儲(chǔ)備溶液 C 葡萄糖 5. 56g/l、瓊脂 16. 67g/l (#A-7049, Sigma Chemicals, St. Louis, M0)并高壓滅菌)。將平板保存在4°C，通常使用約一個(gè)月。從主板(master plate)挑取單個(gè)菌落 并移取至含有PHI-M培養(yǎng)基[酵母提取物(Difco) 5. Og/Ι ；蛋白胨(Difco) 10. Og/Ι ；NaCl 5. Og/Ι ；瓊脂(Difco) 15. Og/Ι ；pH 6. 8，含有50mg/L大觀霉素]的平板，并在28°C下避光孵 育2天。將5ml PHI 基礎(chǔ)培養(yǎng)基體系的 PHI-A[CHU(N6)基鹽(Sigma C-1416)4. 0g/l， Eriksson 維生素混合物(1000X, Sigma-1511) 1. 0ml/l ；鹽酸硫胺素 0. 5mg/l (Sigma)； 2，4-二 氯苯氧基乙酸(2,4-D, Sigma) 1. 5mg/l ； L-脯氨酸(Sigma)O. 69g/l ；蔗糖 (Mai linckrodt) 68. 5g/l ；葡萄糖(Mallinckrodt) 36. Og/Ι ；pH 5. 2]，或 PHI 組合培養(yǎng)基體 系的 PHI-I [MS 鹽(GIBC0 BRL) 4. 3g/l ；煙酸(Sigma)O. 5mg/l ；鹽酸吡哆醇(Sigma)O. 5mg/ 1 ；鹽酸硫胺素1. Omg/1 ；肌醇(Sigma)O. 10g/l ；維生素測(cè)定酪蛋白氨基酸(Difco Lab) lg/ 1 ；2,4-Dl. 5mg/l ；蔗糖68. 50g/l ；葡萄糖36. Og/Ι ；用KOH將pH調(diào)至5. 2并過(guò)濾滅菌]和 5ml 100mM(3，-5，- 二甲氧基-4，-羥基苯乙酮，Aldrich chemicals)添加至遮光罩中 的14ml Falcon管中。從平板收集約3滿環(huán)(環(huán)大小為5mm)的農(nóng)桿菌，并懸浮于管中，然 后將該管渦流震蕩以制備均勻的懸浮液。將Iml懸浮液轉(zhuǎn)移至分光光度計(jì)管中，對(duì)于約0.5xl09cfu/ml至lX109cfu/ml的農(nóng)桿菌的濃度，通過(guò)添加更多農(nóng)桿菌或更多相同的懸浮 液培養(yǎng)基將550nm處的OD調(diào)至0. 72。將最終的農(nóng)桿菌懸浮液等分至2ml微量離心管，每管 含有Iml懸浮液。然后盡可能快地使用懸浮液。胚分離、感染和共培養(yǎng)將約1. 8ml用作農(nóng)桿菌懸浮液的相同培養(yǎng)基(在此處為PHI-A或PHI-I)添加至 2ml微量離心 管中。從滅菌的穗用滅菌的刮刀(BaxterScientific Products S1565)分離 未成熟的胚，并直接滴入管內(nèi)的培養(yǎng)基中。將總共約100個(gè)胚置于管中。胚的最佳大小為約
1.Omm至1. 2mm。然后合上管的蓋子，并將該管用渦流混合器(Baxter Scientific Products S8223-1)以最高速渦流震蕩5秒。去除培養(yǎng)基，添加1.8ml新鮮培養(yǎng)基并再次渦流震蕩。 倒出全部培養(yǎng)基，向胚添加Iml農(nóng)桿菌懸浮液，并將管渦流震蕩30秒。將管在遮光罩中放 置5分鐘。將農(nóng)桿菌的懸浮液與胚倒入皮氏培養(yǎng)皿(Petri plate)中，該皮氏培養(yǎng)皿含有 PHI 基礎(chǔ)培養(yǎng)基體系的 PHI-B 培養(yǎng)基[CHU (N6)基鹽(Sigma C_1416)4. Og/1 ；Eriksson 維 生素混合物(1000X, Sigma-1511) 1. Oml/1 ；鹽酸硫胺素 0. 5mg/l ；2. 4-D 1. 5mg/l ；L-脯氨 酸 0. 69g/l ；硝酸銀 0. 85mg/l ；Gelrite 膠凝劑(Sigma) 3. Og/1 ；蔗糖 30. Og/1 ；乙酰丁香 酮IOOmM ；pH5. 8]，或PHI組合培養(yǎng)基體系的PHI-J培養(yǎng)基[MS鹽4. 3g/l ；煙酸0. 50mg/l ； 鹽酸吡哆醇 0. 50mg/l ；鹽酸硫胺素 1. Omg/1 ；肌醇 100. Omg/1 ；2,4-D 1. 5mg/l ；蔗糖 20. Og/ 1 ；葡萄糖 10. Og/Ι ；L-脯氨酸 0. 70g/l ；MES (Sigma)O. 50g/l ；8. Og/Ι 瓊脂(Sigma A-7049， 純化的)和IOOmM乙酰丁香酮，最終pH為5.8]。利用滅菌的刮刀，將留在管中的任何胚轉(zhuǎn) 移至平板中。倒出農(nóng)桿菌懸浮液，并將胚以軸側(cè)向下置于培養(yǎng)基上。將板用Parafilm 軟 帶或塔式植物組合帶(Pylon VegetativeCombine Tape)(產(chǎn)品名“Ε. G. CUT”，并且可用的為 18mmx50m部分；Kyowa Ltd.，Japan)，并在23°C至25°C下，避光孵育，以進(jìn)行約3天的共培 養(yǎng)。休眠、選擇和再生步驟對(duì)于休眠步驟，將全部胚轉(zhuǎn)移至新的平板中，該平板含有PHI-C培養(yǎng)基[CHU (N6) 基鹽(Sigma C-1416)4. Og/1 ；Eriksson 維生素混合物(1000XSigma-1511) 1. 0ml/l ； 鹽酸硫胺素 0. 5mg/l ；2. 4-D 1. 5mg/l ；L-脯氨酸 0. 69g/l ；蔗糖 30. Og/Ι ；MES 緩沖液 (Sigma)O. 5g/l ；瓊脂(Sigma A-7049,純化的)8. 0g/l ；硝酸銀 0.85mg/l ；羧芐青霉素 100mg/l ；pH 5. 8]。將該平板用Paraf iIm 或塔式植物組合帶密封，并在28°C下避光孵育 3至5天。較長(zhǎng)的共培養(yǎng)時(shí)間段可以補(bǔ)償休眠步驟的缺乏，因?yàn)樾菝卟襟E和共培養(yǎng)步驟一 樣，提供了胚在缺乏選擇性試劑的情況下的培養(yǎng)時(shí)間段。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地測(cè)試 共培養(yǎng)與休眠時(shí)間的組合來(lái)優(yōu)化或改善轉(zhuǎn)化。對(duì)于選擇，然后將全部胚從PHI-C培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至新的平板中，該平板含有作為選 擇培養(yǎng)基的PHI-D培養(yǎng)基[CHU (N6)基鹽(SIGMA C-1416) 4. 0g/l ；Eriksson維生素混合物 (1000X, Sigma-1511) 1. 0ml/l ；鹽酸硫胺素 0. 5mg/l ；2. 4-D 1. 5mg/l ；L-脯氨酸 0. 69g/l ； 蔗糖 30. Og/Ι ；MES 緩沖液 0. 5g/l ；瓊脂(Sigma A-7049，純化的)8. Og/Ι ；硝酸銀 0. 85mg/l ； 羧節(jié)青霉素(ICN，Costa Mesa, CA) 100mg/l ；雙丙氨磷(Meiji Seika K. K.，Tokyo, Japan) 前兩周為1. 5mg/l，剩余的時(shí)間為3mg/l ；pH 5. 8]，并且每個(gè)板放置約20個(gè)胚。將板如上文所述地密封，并在28°C下避光孵育選擇的前兩周。以2周的時(shí)間間隔，將胚轉(zhuǎn)移至新鮮的選擇培養(yǎng)基。通過(guò)轉(zhuǎn)移至新鮮的選擇培養(yǎng)基，將組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)約2 個(gè)月。然后通過(guò)在相同的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)另外的2周使抗除草劑的胼胝體的體積變大(bulk up)，直至胼胝體的直徑為約1. 5cm至2cm。對(duì)于再生，然后將胼胝體在PHI-E培養(yǎng)基[MS鹽4. 3g/l ；肌醇0. lg/Ι ；煙酸 0. 5mg/l，鹽酸硫胺素0. lmg/1，鹽酸吡哆醇0. 5mg/l，甘氨酸2. Omg/1，玉米素0. 5mg/l，蔗 糖 60. Og/Ι,瓊脂(Sigma，A_7049)8. Og/1,吲哚乙酸(IAA，Sigma) 1. Omg/1,脫落酸(ABA， Sigma) 0. ImM，雙丙氨磷3mg/l，羧芐青霉素100mg/l將pH調(diào)至5. 6]中，在28°C下避光培養(yǎng)1 至3周，以允許體細(xì)胞胚成熟。然后將胼胝體在PHI-F培養(yǎng)基上(MS鹽4. 3g/l ；肌醇0. Ig/ 1 ；鹽酸硫胺素0. lmg/1，鹽酸吡哆醇0. 5mg/l，甘氨酸2. Omg/1，煙酸0. 5mg/l ；蔗糖40. Og/ 1 ；Gelrite 膠凝劑 1. 5g/l ；pH 5. 6]中，于 25°C下，以 16 小時(shí)光照(270uE m-2sec_l)和 8小時(shí)黑暗的日光方案，進(jìn)行培養(yǎng)，直至產(chǎn)生芽和根。然后將每個(gè)小苗轉(zhuǎn)移至含有PHI-F的 25x150mm管，并在相同的條件下再生長(zhǎng)約1周。將植物移植至溫室中裝有土壤混合物的盆 中。在胼胝體階段或再生階段確定轉(zhuǎn)化事件。ScCBF31啟動(dòng)子在玉米中驅(qū)動(dòng)表達(dá)的能力，通過(guò)植物組織中標(biāo)志基因的檢測(cè)來(lái)證 實(shí)。實(shí)施例4 黑麥CBF31啟動(dòng)子的冷誘導(dǎo)性在最適溫度(23°C/20°C日/夜溫度，并且16小時(shí)/8小時(shí)日/夜方案)下，使 黑麥秧苗生長(zhǎng)至3葉階段。在播種后的第10天，當(dāng)秧苗處于3至4葉階段時(shí)，使其經(jīng)受6°C 的冷應(yīng)激。在暴露至冷應(yīng)激的0小時(shí)、15分鐘、1小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)和24小時(shí)，并且還在 最適溫度下從冷應(yīng)激恢復(fù)48小時(shí)后，收集完整芽組織。將該組織在液氮中碾磨并提取RNA0 將RNA用于RNA印跡來(lái)確定黑麥CBF31基因的表達(dá)水平，并且用黑麥CBF31的部分序列作 為探針。結(jié)果(參見(jiàn)，圖1)顯示了黑麥CBF31基因快速和強(qiáng)烈的冷誘導(dǎo)，并且表明了黑麥 CBF31啟動(dòng)子的冷誘導(dǎo)性。盡管為了清楚理解的目的，已經(jīng)通過(guò)說(shuō)明和實(shí)施例的方式詳細(xì)描述了上述發(fā)明， 但是，顯然可以在所附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)實(shí)施某些變化和修飾。將所引的全部參考文獻(xiàn) 通過(guò)引用并入本文。
權(quán)利要求
分離的核酸分子，其包含多核苷酸，所述多核苷酸在植物細(xì)胞中起始轉(zhuǎn)錄并包含選自以下的序列a)SEQ ID NO1；b)SEQ ID NO1的至少500個(gè)連續(xù)核苷酸。
2.表達(dá)盒，其包含可操作地連接至感興趣的多核苷酸的權(quán)利要求1所述的多核苷酸。
3.載體，其包含權(quán)利要求2所述的表達(dá)盒。
4.植物細(xì)胞，其具有穩(wěn)定地并入其基因組的權(quán)利要求2所述的表達(dá)盒。
5.如權(quán)利要求4所述的植物細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞來(lái)自單子葉植物。
6.如權(quán)利要求5所述的植物細(xì)胞，其中所述單子葉植物是玉米、大麥、小麥、燕麥、黑 麥、高粱或水稻。
7.植物，具有穩(wěn)定地并入其基因組的權(quán)利要求2所述的表達(dá)盒。
8.如權(quán)利要求7所述的植物，其中所述植物是單子葉植物。
9.如權(quán)利要求8所述的植物，其中所述單子葉植物是玉米、大麥、小麥、燕麥、黑麥、高 粱或水稻。
10.權(quán)利要求7所述的植物的轉(zhuǎn)基因種子。
11.如權(quán)利要求7所述的植物，其中所述感興趣的多核苷酸編碼賦予干旱、寒冷和/或 鹽條件耐性的基因產(chǎn)物。
12.如權(quán)利要求7所述的植物，其中所述感興趣的多核苷酸編碼與營(yíng)養(yǎng)吸收、氮利用效 率、根強(qiáng)度、根倒伏抗性、土壤害蟲(chóng)控制、玉米根蟲(chóng)抗性、碳水化合物代謝、蛋白質(zhì)代謝、脂肪 酸代謝或植物激素合成相關(guān)的多肽。
13.在植物中表達(dá)第一多核苷酸的方法，所述方法包括將包含啟動(dòng)子和與所述啟動(dòng)子 可操作地連接的第一多核苷酸的表達(dá)盒導(dǎo)入植物，其中所述啟動(dòng)子包含起始植物中可操作 地連接的多核苷酸的轉(zhuǎn)錄的第二多核苷酸，并且其中所述第二多核苷酸包含選自以下的序 列a)SEQ ID NO 1或其互補(bǔ)物；和b)SEQID NO 1的至少500個(gè)連續(xù)核苷酸。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述植物是玉米、大麥、小麥、燕麥、黑麥、高粱或 水稻。
15.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述第一多核苷酸編碼賦予耐旱性、耐寒性和/或 耐鹽性的基因產(chǎn)物。
16.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述第一多核苷酸編碼與營(yíng)養(yǎng)吸收、氮利用效率、 根強(qiáng)度、根倒伏抗性、土壤害蟲(chóng)控制、玉米根蟲(chóng)抗性、碳水化合物代謝、蛋白質(zhì)代謝、脂肪酸 代謝或植物激素生物合成相關(guān)的基因產(chǎn)物。
17.在植物細(xì)胞中表達(dá)第一多核苷酸的方法，所述方法包括將包含啟動(dòng)子和與所述啟 動(dòng)子可操作地連接的第一多核苷酸的表達(dá)盒導(dǎo)入植物細(xì)胞，其中所述啟動(dòng)子包含起始植物細(xì)胞中可操作地連接的多核苷酸的轉(zhuǎn)錄的第二多核苷酸，并且其中所述第二多核苷酸選 自a)包含SEQID NO 1中所列序列或其互補(bǔ)物的多核苷酸；和b)包含SEQID NO 1中所列序列的至少500個(gè)連續(xù)核苷酸的多核苷酸。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述植物細(xì)胞來(lái)自玉米、大麥、小麥、燕麥、黑麥、 高粱或水稻。
19.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述第一多核苷酸編碼賦予干耐旱性、耐寒性和/ 或耐鹽性的基因產(chǎn)物。
20.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述第一多核苷酸編碼與營(yíng)養(yǎng)吸收、氮利用效率、 根強(qiáng)度、根倒伏抗性、土壤害蟲(chóng)控制、玉米根蟲(chóng)抗性、碳水化合物代謝、蛋白質(zhì)代謝、脂肪酸 代謝或植物激素生物合成相關(guān)的基因產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)植物中異源核苷酸序列表達(dá)的組合物和方法。組合物是與黑麥CBF31編碼區(qū)內(nèi)源地相關(guān)的應(yīng)激誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的新核苷酸序列。本發(fā)明提供了利用本文所公開(kāi)的調(diào)節(jié)序列在植物或植物細(xì)胞中表達(dá)異源核苷酸序列的方法。所述方法包括轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，使其含有可操作地連接至本發(fā)明的調(diào)節(jié)序列的異源核苷酸序列，并且任選地由轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物。
文檔編號(hào)C07K14/415GK101849011SQ200880112814
公開(kāi)日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2008年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月23日
發(fā)明者索巴·希瓦薩恩卡爾 申請(qǐng)人:先鋒國(guó)際良種公司