專利名稱：結(jié)核分歧桿菌復合群的免疫檢出方法
技術領域：
本發(fā)明涉及使用結(jié)核分歧桿菌復合群(Mycobacterium tuberculosis complex) 特異性分泌蛋白MPB64的抗體的免疫檢出方法，并且更具體地涉及夾心免疫測定方法，特 別是免疫色譜測定方法和免疫色譜測試條(test strip)。本發(fā)明涉及檢出方法，該方法對 于通過高靈敏度特異地檢出結(jié)核分歧桿菌復合群來快速、安全和高準度診斷結(jié)核分歧桿菌 復合群感染是有用的。
背景技術：
MPB64是由牛分歧桿菌BCG (Mycobacterium bovis BCG)產(chǎn)生并分泌到細菌細胞外 的分枝桿菌蛋白。另外，MPT64作為由結(jié)核分歧桿菌特異性產(chǎn)生并分泌到細菌細胞外的分 枝桿菌蛋白之一為人們所知。已知MPT64是與MPB64相同的物質(zhì)。這意味著MPB64的抗體 也是MPT64的抗體。因此，通過培養(yǎng)病原性無害牛分歧桿菌BCG、提取并純化培養(yǎng)物中產(chǎn)生的MPB64， 利用MPB64作為抗原獲得抗MPB64抗體，并使用該抗體通過抗原-抗體反應(免疫反應) 檢出樣品中的MPT64，能夠診斷結(jié)核分歧桿菌復合群感染。已知有利用MPB64的抗體(以下，簡寫為“抗MPB64抗體”)通過免疫方法檢出結(jié) 核分歧桿菌的方法(參見專利文獻1)。另外，作為免疫方法還已知使用免疫色譜的測定方 法(參見專利文獻2)。然而，這些已知方法需要在進行免疫測定前，通過培養(yǎng)來增殖樣品中的結(jié)核分歧 桿菌復合群以分泌MPT64，該培養(yǎng)需要大約一周。另外，即使常規(guī)免疫色譜方法與大多數(shù)非結(jié)核性分枝桿菌(NTB)沒有反應性，只 與結(jié)核分歧桿菌復合群具有非常強的反應性，已報道它們?nèi)燥@示與兩株非結(jié)核性分枝桿菌 艮口，海分歧桿菌(Mycobacterium marinum)禾口苦參分歧桿菌(Mycobacterium flavescens) 的交叉反應性(非專利文獻1)。專利文獻1 日本專利特開平07-110332專利文獻2 日本專利特開平11-108931非專禾丨J文獻 1 =ABE C.等，"Simple and Rapid Identification of the Mycobacterium tuberculosis Complex by Immunochromatographic Assay Using Anti-MPB64 Monoclonal Antibodies", Journal of Clinical Microbiology, 1999 11 月，第 3693-3697 頁。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題本發(fā)明的目的是特異性檢出生物試樣中的MPT64抗原，從而能夠以比以前更高的 準確度進行結(jié)核分歧桿菌復合群感染的診斷。另外，本發(fā)明另外的目的是以高靈敏度檢出生物試樣中的MPT64抗原，從而在未經(jīng)培養(yǎng)或在樣品中的結(jié)核分歧桿菌復合群細菌實質(zhì)上開始增殖之前培養(yǎng)一段時間后的情 況下，能夠?qū)ι镌嚇舆M行免疫測定，并能夠比以前更快速和安全地進行結(jié)核分歧桿菌復 合群感染的診斷。用于解決問題的方案本發(fā)明人通過將MPB64作為免疫原免疫小鼠，已成功獲得MPB64的特異性抗原表 位的抗體，并發(fā)現(xiàn)在免疫測定，特別在夾心免疫測定，尤其在免疫色譜測定中，使用上述抗 體能夠更特異地以比以前更高的靈敏度檢出結(jié)核分歧桿菌復合群。由此，完成了本發(fā)明。即，根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供檢出結(jié)核分歧桿菌復合群的方法，該方法包括使用 結(jié)核分歧桿菌復合群特異性分泌蛋白MPB64的抗體的免疫測定，其中所述抗體包括位于 SEQ IDNOS 2-4的任一氨基酸序列的MPB64抗原表位的抗體。并不特別限定用于本檢出方法的免疫測定，但是優(yōu)選夾心免疫測定法、特別是 ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)法和免疫色譜測定法等。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供檢出結(jié)核分歧桿菌復合群的方法，該方法包括 使用結(jié)核分歧桿菌復合群特異性分泌蛋白MPB64的第一和第二抗體的夾心免疫測定，其中 第一和第二抗體的至少之一包括位于SEQ ID NOS 2-4的任一氨基酸序列的MPB64抗原表 位的抗體。另外，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，提供用于檢出結(jié)核分歧桿菌復合群的免疫色 譜測定方法，該方法包括提供膜載體，該膜載體具有在其預定位置通過固定化結(jié)核分歧桿菌復合群特異性 分泌蛋白MPB64的第一抗體形成的捕獲區(qū)(capturing zone)；和在膜載體上向捕獲區(qū)色譜展開含有MPB64的第二抗體和預定量試樣的混合溶液，由此，在捕獲區(qū)捕獲包含于試樣的抗原和第二抗體的復合體，并且其中第一和第 二抗體的至少之一包括位于SEQ IDNOS 2-4的任一氨基酸序列的MPB64抗原表位的抗體。另外，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，提供用于檢出結(jié)核分歧桿菌復合群的免疫色 譜測試條，該免疫色譜測試條至少包括結(jié)核分歧桿菌復合群特異性分泌蛋白MPB64的第一 和第二抗體以及膜載體，其中第一抗體被預先固定化至膜載體的預定位置而形成捕獲區(qū)， 并且用適當?shù)臉擞泟﹣順擞浐驮谶h離捕獲區(qū)的位置來制備第二抗體，以便在膜載體中色 譜展開，其中第一和第二抗體的至少之一包括位于SEQ ID NOS :2-4的任一氨基酸序列的 MPB64抗原表位的抗體。本發(fā)明中必不可少使用的MPB64的抗體是位于SEQ IDNOS 2~4的任一氨基酸序列 的MPB64抗原表位的抗體，可以是多克隆抗體或單克隆抗體，并且從反應特異性角度來說， 優(yōu)選單克隆抗體。同時，SEQ ID NOS :2-4的氨基酸序列構(gòu)成示于SEQ ID N0:1的MPB64整 個氨基酸序列的部分，并且是包含MPB64抗原表位的區(qū)域。在夾心免疫測定如免疫色譜測定的情況中，此處所用的第一和第二抗體可分別是 多克隆或單克隆的，從反應特異性的觀點來看，通常優(yōu)選至少兩種抗體之一為單克隆的，并 特別優(yōu)選兩種抗體都是單克隆的。另外，由于MPB64是單體蛋白，所以優(yōu)選第一和第二抗體 是MPB64不同抗原表位的抗體。本發(fā)明使用的抗體是位于SEQ ID NOS :2_4的任一氨基酸序列的抗原表位的抗體， 其中SEQ ID NOS 2-4的任一氨基酸序列包含于SEQ ID NO 1所示的MPB64的整個氨基酸序列中，因此，該抗體與MPB64或MPT64特異性反應。另外，本發(fā)明的這些抗體與非結(jié)核性 分枝桿菌(NTB)不反應，并進一步與海分歧桿菌和苦參分歧桿菌不反應，因此特異性優(yōu)異。 SEQ ID N0S:2-4的氨基酸序列是包含MPB64抗原表位的區(qū)域。換言之，本發(fā)明使用的抗體 可以是與包含SEQ ID NOS 2-4的氨基酸序列之一的具有12-15個氨基酸殘基的MPB64片 段進行抗原_抗體反應的抗體。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供識別位于SEQ IDNOS 2~4的任一氨基酸序列 的MPB64抗原表位的單克隆抗體。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明，將位于SEQ ID NOS :2_4(所述SEQ ID NOS :2_4氨基酸序列包含于 SEQ ID N0:1所示的MPB64的整個氨基酸序列中)的任一氨基酸序列的抗原表位的抗體用 于免疫測定的檢出方法中，因此能夠以比以前更高的準確度進行結(jié)核分歧桿菌復合群感染 的診斷，并且由于在未經(jīng)培養(yǎng)或在樣品中的結(jié)核分歧桿菌復合群細菌實質(zhì)上開始增殖之前 培養(yǎng)一段時間后的情況下，也能將生物樣品進行免疫測定，所以能夠比之前更快速和安全 地進行結(jié)核分歧桿菌復合群感染的診斷。另外，根據(jù)本發(fā)明的免疫色譜測定和免疫色譜測試條，能夠以比以前更高的準確 度、快速和安全的進行結(jié)核分歧桿菌復合群感染的診斷，而不需要特殊設備和熟練的技術， 并減少二次感染的風險。


圖Ia是免疫色譜測試條的平面圖，圖Ib是圖Ia所示免疫色譜測試條的縱向斷面 圖；以及圖2是顯示實施例8結(jié)果的圖表。
具體實施例方式本發(fā)明中，按照已知免疫技術分別進行抗體的生產(chǎn)、檢出方法的各步驟以及使用 抗體的測定法。本發(fā)明中，可以獲得多克隆抗體，例如通過從編碼SEQ IDNO 1所示的氨基酸序列 的DNA序列，克隆相應于SEQ ID NOS 2~4的氨基酸序列的DNA片段，允許克隆的基因以遺 傳工程方式在宿主如大腸桿菌中表達，提取并純化表達的蛋白質(zhì)，并且用純化的蛋白作為 抗原根據(jù)常規(guī)方法免疫動物，然后從免疫動物的抗血清獲得多克隆抗體。本發(fā)明中，可以獲得單克隆抗體，例如通過用上述純化的蛋白質(zhì)作為抗原免疫動 物如小鼠，將免疫動物的脾細胞與用于細胞融合的骨髓瘤細胞融合，在含HAT的培養(yǎng)基中 篩選由此融合的細胞，并允許其增殖，然后利用上述純化的蛋白質(zhì)通過酶標免疫測定等篩 選增殖的細胞株?？蛇x擇地，能夠獲得單克隆抗體，例如，通過將從牛分歧桿菌BCG的培養(yǎng)上清純化 的MPB64作為抗原來免疫動物，如小鼠，將免疫動物的脾細胞與用于細胞融合的骨髓瘤細 胞融合，在含HAT的培養(yǎng)基中篩選由此融合的細胞，并允許其增殖，然后從增殖細胞株中篩 選與SEQ ID NOS 2-4的多肽有反應性的細胞株。按照已知的免疫色譜測試條的結(jié)構(gòu)能夠容易地實施本發(fā)明的用于檢出試樣中結(jié)核分歧桿菌復合群存在的免疫色譜測定。通常，這樣的免疫色譜測試條至少由第一抗體、第二抗體和膜載體構(gòu)成，其中第一 抗體能夠在抗原的第一抗原決定簇進行抗體_抗原反應，第二抗體被標記，并且能夠在抗 原的第二抗原決定簇進行抗體-抗原反應，膜載體中第一抗體被預先固定化至膜載體的預 定位置以形成捕獲區(qū)，第二抗體在遠離捕獲區(qū)的位置制備，以便在膜載體中色譜展開。前述 第一和第二抗體各自可以是多克隆抗體或單克隆抗體，但優(yōu)選至少之一為單克隆抗體。由 于MPB64是單體蛋白質(zhì)，所以將第一和第二抗體以“異種”組合使用，即，將識別在位置和結(jié) 構(gòu)兩方面不同的各個抗原決定簇的第一和第二抗體組合使用。例如，當將位于SEQ IDNO 2 的氨基酸序列的MPB64的抗原表位的單克隆抗體用作第一抗體時，將位于SEQ ID NO 3或 4的氨基酸序列的MPB64的抗原表位的單克隆抗體用作第二抗體。作為免疫色譜測試條的具體實例，例如可提及如圖1所示的測試條。圖1中，數(shù)字 1表示粘著片(adhesive sheet)、2表示浸漬部件、3表示膜載體、31表示捕獲區(qū)、4表示吸 收部件以及5表示樣品添加部件。如圖所示的實例中，膜載體3由寬度為5mm和長度為36mm的細長帶狀硝化纖維素 膜過濾器組成。膜載體3具有在距色譜展開開始側(cè)上的末端7. 5mm的位置處固定化的第一抗體， 以形成被分析物的捕獲區(qū)31。圖中所示的實例中，將硝化纖維素膜過濾器用作膜載體3。然而，此處可以使用任 何類型的膜載體，只要其能夠色譜展開包含于試樣的被分析物，并將形成捕獲區(qū)31的抗體 固定化即可。因此，也可使用其它類型的纖維素膜、尼龍膜或玻璃纖維膜等。浸漬部件2包括通過浸漬等配置有第二抗體的部件，其中第二抗體能夠與抗原在 第二抗原決定簇進行抗體-抗原反應，所述第二抗原決定簇位于不同于結(jié)合第一抗體的第 一抗原決定簇的位點。用適合的標記劑將第二抗體預先標記。圖中所示的實例中，將具有5mmX 15mm大小的帶狀玻璃纖維無紡布用作浸漬部件 2。然而，浸漬部件2并不限定此，還包括例如，纖維素纖維(cellulose fabrics)(濾紙、硝 化纖維素膜等)、如聚乙烯和聚丙烯等的多孔塑料纖維，以及其它。作為標記第二抗體的標記劑，可使用任何物質(zhì)，只要其在此處可用即可。該標記劑 的實例包括顯色標記劑、酶標劑和放射標記劑。其中，優(yōu)選使用顯色標記劑，因為用肉眼觀察捕獲區(qū)31中的顏色變化能夠使測定 快速和簡單。另外，從提高靈敏度的角度來說，優(yōu)選使用帶有熒光標記劑的熒光免疫色譜儀 進行捕獲區(qū)31的觀察。該顯色標記劑的實例包括金屬膠體顆粒如金膠體顆粒、鉬膠體顆粒和鉬_金復合 體膠體顆粒，合成膠乳顆粒如用紅或藍顏料著色的聚苯乙烯膠乳以及膠乳顆粒如天然橡膠 膠乳。其中特別優(yōu)選金屬膠體顆粒如金膠體顆粒。熒光標記劑的實例包括直接標記劑如FITC和若丹明，以及含熒光化合物的熒光 膠乳顆粒和如量子點(quantum dot)的化合物。其中優(yōu)選含熒光化合物的熒光膠乳顆粒。 另外，不特別限定熒光化合物的激發(fā)波長和熒光波長，但是從測量設備的設定的觀點，優(yōu)先 使用激發(fā)波長遠離測量波長的所謂的斯托克司位移(Stokes shift)大的熒光化合物。浸漬部件2可通過將標記的第二抗體的懸浮液吸附進入部件例如前述玻璃纖維
7無紡布，然后使其干燥來生產(chǎn)。如圖1所示，可以通過以下來生產(chǎn)本發(fā)明的免疫色譜測試條。將膜載體3附著到粘 著片1的中間。在膜載體3的色譜展開開始側(cè)的末端上(即，圖1中的左側(cè)，以下稱為“上 游側(cè)”，而相對側(cè)，即，圖1中右側(cè)，以下稱為“下游側(cè)”)，將浸漬部件2的下游側(cè)末端疊放以 連接它們。將浸漬部件2的上游側(cè)區(qū)域附著到粘著片1。此外，如果需要，樣品添加部件5的下游側(cè)區(qū)域可放置到浸漬部件2的上表面，同 時樣品添加部件5的上游側(cè)區(qū)域還可附著到粘著片1。另外，吸收部件4的上游側(cè)區(qū)域可放 置到膜載體3的下游側(cè)區(qū)域的上表面，同時吸收部件4的下游側(cè)區(qū)域可附著到粘著片1。作為樣品添加部件5，例如，可使用多孔合成樹脂如多孔聚乙烯和多孔聚丙烯的薄 片或膜，或纖維素紙或織物或無紡布如濾紙和棉織物等。吸收部件4可由任何材料制備，只要它能快速吸收并保持液體即可。該材料的實 例包括棉織物、濾紙和由聚乙烯、聚丙烯制造的多孔塑料無紡布等。特別地，濾紙是最佳的。另外，在商購可得的產(chǎn)品的情況下，提供圖1所示的免疫色譜測試條，以使測試條 被放入合適的塑料盒中，該塑料盒具有在樣品添加部件5和捕獲區(qū)31上方分別開口的試樣 注入?yún)^(qū)和測定區(qū)。因此，如果需要的話，將含有生物樣品等的試樣與適當?shù)恼归_溶劑混合，以獲得能 夠色譜展開的混合溶液。隨后，將混合溶液注入圖1所示的免疫色譜測試條的樣品添加部 件5，以使其通過樣品添加部件5并在浸漬部件2與標記的第二抗體混合。在該情況中，如果上述混合溶液中存在被分析物，則由于抗原_抗體反應，形成被 分析物與第二抗體的復合體。該復合體在膜載體3中色譜展開，然后到達捕獲區(qū)31。因此，由于抗原-抗體反 應，由在此固定化的第一抗體捕獲該復合體。在該情況中，如果將如金膠體顆粒的顯色標記劑用作標記劑，基于由顯色標記劑 在捕獲區(qū)31聚集引起的顯色可以立即定性或定量測定被分析物。當將熒光標記劑用作標 記劑時，通過測量設備讀出在捕獲區(qū)31聚集的熒光劑的熒光量，以便能夠定量測量。同時，本發(fā)明中，通過在適當?shù)娜萜髦袃Υ娴诙贵w或含有第二抗體的浸漬部件， 可以制備用于在膜載體中色譜展開的第二抗體，以便在容器內(nèi)將試樣和第二抗體混合后將 抗體注入膜載體，而不是將第二抗體或浸漬部件安置在膜載體上。并不特別限定用于制備試樣的生物樣品，但包含例如從活體采集的體液等，如痰 液、胸膜積液(bronchial secretory)、支氣管分泌液、胃液、血液、脊髓液、尿和糞便，并優(yōu) 選使用痰液。另外，可以將進行呼吸器官檢查時采集的支氣管洗滌液以及從支氣管或肺采 集的組織碎片用作生物樣品。另外，可以采用通過用固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基培養(yǎng)上述采 集的生物樣品獲得的培養(yǎng)物和細菌。此外，可以采用在結(jié)核分歧桿菌復合群細菌實質(zhì)上開 始增殖之前培養(yǎng)生物樣品一段時間的培養(yǎng)物，并且在這種情況下，優(yōu)選將少量液體培養(yǎng)基 用作培養(yǎng)基?？梢詫⑸飿悠吩瓨幼鳛樵嚇?，但可以用適當?shù)南♂寗┤缯归_溶劑稀釋以獲 得試樣。在液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)兩種情況下，可以按照常規(guī)方法進行生物樣品的培養(yǎng)，并 優(yōu)選液體培養(yǎng)，這是因為可以將培養(yǎng)物(即培養(yǎng)液)應用于如免疫色譜測定的免疫測定。并不特別限定用于液體培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基，只要其能夠培養(yǎng)上述生物樣品即可，例如，可以使用分歧桿菌檢查指南中所述的培養(yǎng)基。具體實例包括Middlebrook 7H9肉湯、 Dubos 液體；t音養(yǎng)基(Becton, Dickinson and Company /feFtn ) MGIT (Becton, Dickinson and Company 產(chǎn)品)禾口 BactAlert (bioMerieux 產(chǎn)品)。并不特別限定用于固體培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基，只要它能夠培養(yǎng)上述生物樣品即可， 例如，可以使用分歧桿菌檢查指南所述的培養(yǎng)基。具體實例包括Ogawa培養(yǎng)基和試管中的 Kudo PD斜面培養(yǎng)基(Kyowa Pharmaceutical CO.，Ltd的產(chǎn)品)?？赏ㄟ^用稀釋劑如生理 鹽水和磷酸鹽緩沖液稀釋由固體培養(yǎng)所產(chǎn)生的培養(yǎng)物來用于免疫學測定。液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)兩者的培育溫度優(yōu)選為約37°C。培育時間可以是足以分泌出 可檢出量的用作結(jié)核分歧桿菌標記物的結(jié)核分歧桿菌特異性分泌蛋白的時間，通常為2-10 天，并優(yōu)選2-7天。例如，可以通過在Iml至IOml的培養(yǎng)容器中放入100 μ 1至5ml的液體培養(yǎng)基，并 使其在上述培育時間內(nèi)好氧(aerobically)振動進行液體培養(yǎng)。另外，檢查前可將生物樣品和培養(yǎng)物用適當?shù)姆椒ㄟM行預處理，以抑制結(jié)核分歧 桿菌復合群特異性分泌蛋白的變性并將其置入適于免疫測定的條件中。預處理包括，例如， 結(jié)核分歧桿菌復合群的滅活處理或分散或增溶化處理。結(jié)核分歧桿菌復合群的滅活處理包含，例如熱處理和過濾處理，并優(yōu)選熱處理。并 不特別限定加熱溫度，但通常為50°C -140°C，并優(yōu)選100°C。也不特別限定加熱時間，但通 常為1-60分鐘，并優(yōu)選15-30分鐘?？赏ㄟ^將含有生物樣品的整個容器進行高壓蒸汽滅菌 處理來實施熱處理。結(jié)核分歧桿菌的滅活處理使其可以在不使用安全柜時進行檢查。進行增溶化處理主要是為了降低生物樣品如痰液的粘度，例如，通過向生物樣品 添加能夠增溶化生物樣品的構(gòu)成成分的試劑來進行增溶化處理。該試劑包含例如堿性物 質(zhì)、還原性物質(zhì)、蛋白酶和表面活性劑，并優(yōu)選堿性物質(zhì)、還原性物質(zhì)和蛋白酶。堿性物質(zhì)包含氫氧化鈉，并不特別限定其濃度，但從結(jié)核分歧桿菌特異性分泌蛋 白的變性角度來說，優(yōu)選以0. 5N至2N的濃度使用。還原性物質(zhì)包含例如N-乙?；?L-半胱氨酸(NALC)和二硫蘇糖醇，并不特別限 定其濃度，但優(yōu)選以0. 05%至使用。另外，組合使用堿性物質(zhì)和還原性物質(zhì)更有效。蛋白酶包含，例如半堿性蛋白酶(產(chǎn)品名SPUTAZYME，由KY0KUT0 PHARMACEUTICAL INDUSTRIAL CO.，LTD.制造)。分散處理包含已知的物理處理方法，例如利用渦旋攪拌機等的攪拌操作，優(yōu)選使 用向生物樣品添加有玻璃珠的渦旋攪拌機等進行攪拌?？梢詥为毣蚪M合進行分散處理和增溶化處理。當將全血用作試樣時，如果將顯色標記劑如金膠體顆粒特別用作標記抗體的標記 劑，則優(yōu)選在上述樣品添加部件中配置血球捕獲膜部件。優(yōu)選將該血球捕獲膜部件層壓于 上述浸漬部件和上述樣品添加部件之間。這樣阻止紅血球在膜載體中展開，并因此有利于 確認顯色標記劑在膜載體的捕獲區(qū)聚集。作為該血球捕獲膜部件，可使用羧甲基纖維素 膜。特別地，可以使用可從Advantec Toyo K. K.獲得的離子交換濾紙CM(商品名)、可從 Whatman Japan K. K.獲得的離子交換纖維素紙等。實施例在以下實施例中將更具體地描述本發(fā)明。然而，這些實施例并非意欲限定本發(fā)明的范圍。實施例1 (抗MPB64單克隆抗體的生產(chǎn))通過在Middlebrook 7H11肉湯中培養(yǎng)牛分歧桿菌BCG東京(Tokyo)株獲得培養(yǎng) 上清，從該培養(yǎng)上清中純化MPB64。利用所得的MPB64作為抗原生產(chǎn)該蛋白的單克隆抗體。 根據(jù)常規(guī)方法生產(chǎn)該單克隆抗體。S卩，將IOOyg純化的MPB64與等量的弗氏完全佐劑(Difco)混合。之后，用混合 物免疫小鼠(BALB/c，5周齡，Japan SLC, Inc.) 3次，然后將其脾細胞用于細胞融合。對于 這樣的細胞融合，使用小鼠骨髓瘤細胞Sp2/0-Agl4細胞(Shulman等，1978)。在含HAT的培養(yǎng)基中篩選后，將所得融合細胞進行增殖，最終從增殖的融合細胞 中獲得與MPB64反應的生產(chǎn)單克隆抗體的細胞的3個克隆。下文，將由各個克隆產(chǎn)生的抗 體稱為單克隆抗體TB001、TB002和TB003。實施例2 (抗MPB64抗體的抗原表位測定)通過SPOT肽合成總共生產(chǎn)73個多肽，其中每個多肽由具有從源自結(jié)核分歧桿菌 H37RV株的SEQ ID NO 1的MPB64的氨基酸序列N末端3個氨基酸移碼(frame shift)的12 個氨基酸的單位組成。同時，由于SPOT肽合成的原因，選定各氨基酸序列以使脯氨酸不選 作起始氨基酸。然后，生產(chǎn)其中上述73個多肽被固定化至纖維素膜的SPOT片(SPOT sheet) (由JST和Sigma Aldrich制造)。將SPOT片在振動臺上培育2小時，然后用含有2 μ g/ ml實施例1生產(chǎn)的單克隆抗體的封閉緩沖液(blocking buffer) (50mMTris HCl、140mM NaCl、5mM NaEDTA、0. 05 % NP40 (Fluka)、0. 25 % 明膠(Sigma)、1 % 牛血清白蛋白(Sigma)、 pH 7.4)培育并反應一小時。完全反應后，在振動臺上用PBSdOmM磷酸鹽緩沖液、150mM NaCl, pH 7. 5)洗滌SPOT片三次3分鐘。以1 1000的稀釋度向其添加HRP標記的抗小 鼠免疫球蛋白，然后將反應混合物培育一小時。用PBS(IOmM磷酸鹽緩沖液、150mM NaCl, pH7. 5)洗滌三次3分鐘。然后，將所得物浸入含有顯色物質(zhì)TMBZ的溶液以引起顯色。目視 確認顯色斑，以測定被抗體識別的多肽序列。同時，將上述73個多肽從N端順次稱為多肽 Nos.1-73。對于單克隆抗體TBOOl，確認在多肽Nos. 22-25顯色。從顯色斑，確認它識別相應 于從SEQ ID NO 1的氨基酸序列N端的70至78殘基間的IAQTRDKFL (SEQ ID NO 2)的序 列。對于單克隆抗體TB002，確認在多肽Nos. 32-35顯色。從顯色斑，確認它識別相應 于從SEQ ID NO 1的氨基酸序列N端的103至114殘基間的AIPPRGTQAVVL (SEQ ID NO 2) 的序列。對于單克隆抗體TB003，確認多肽Nos. 59-64顯色。從顯色斑，確認它識別相應于 從SEQ ID NO 1的氨基酸序列N端的184至192殘基間的PVNYQNFAV (SEQ ID NO 3)的序 列。實施例3 (使用抗MPB64類抗體的免疫色譜試劑盒的制備)(1)抗MPB64抗體的制備將實施例1獲得的各克隆接種于小鼠的腹腔內(nèi)，以獲得含有抗MPB64抗體的腹水。 進一步，根據(jù)常規(guī)方法使用G蛋白吸附劑(protein G adsorbent)進行IgG的純化，以獲得 抗MPB64抗體。
(2)金膠體顆粒溶液的制備將Iml (v/w)氯金酸水溶液添加到通過加熱煮沸的99ml超純水中。一分鐘 后，向其進一步添加1. 5ml 1% (v/w)檸檬酸鈉水溶液，然后將混合物加熱并煮沸5分鐘。 之后，室溫靜置該溶液，以使其冷卻。隨后，向該溶液添加200mM碳酸鉀水溶液，以使溶液調(diào) 整為pH 9. 0。之后，向其添加超純水以調(diào)整總量為100ml，由此獲得金膠體顆粒溶液。(3)金膠體顆粒標記的抗MPB64抗體溶液的制備將上述(1)中獲得的抗MPB64抗體用金膠體顆粒通過以下步驟進行標記。將1 μ g蛋白換算重量的抗ΜΡΒ64抗體(以下，當顯示抗體的蛋白換算重量時，它 僅表示為通過其純化蛋白的重量分析得到的重量值)與Iml上述(2)中的金膠體顆粒溶液 混合，然后室溫靜置2分鐘，以允許全部抗體結(jié)合到金膠體顆粒的表面。之后，向金膠體顆 粒溶液添加10%的牛血清白蛋白(以下稱為“BSA”)水溶液以調(diào)整終濃度至1%，并用BSA 將金膠體顆粒的殘余表面全部封閉，以得到金膠體顆粒標記的抗MPB64抗體(以下稱為“金 膠體顆粒標記的抗體”)溶液。將該溶液離心(5600XG，30分鐘)以沉淀金膠體顆粒標記 的抗體。除去上清液，以獲得金膠體顆粒標記的抗體。將該金膠體顆粒標記的抗體懸浮于 含有 10%蔗糖、BSA 和 0. 5% Triton-XlOO 的 50mM Tris-HCl 緩沖液(pH 7. 4)中，以得 到金膠體顆粒標記的抗體溶液。(4)用于MPB64測定的免疫色譜測試條的制備通過以下步驟生產(chǎn)圖1所示的免疫色譜測試條。(4-1)抗MPB64抗體和金膠體顆粒標記的抗體的復合體的捕獲區(qū)將具有5mm寬度和36mm長度大小的細長帶狀硝化纖維素膜制備為色譜介質(zhì)的色 譜展開用膜載體3。將0. 5 μ L含1. Omg/ml抗MPB64抗體的溶液以線狀涂布到距色譜展開用膜載體3 的色譜展開的開始點側(cè)末端7. 5mm處的位置。在室溫下使之干燥，以形成用于捕獲MPB64 蛋白和金膠體顆粒標記的抗體的復合體的捕獲區(qū)31。將單克隆抗體TB003用作抗MPB64抗 體。(4-2)用金膠體顆粒標記的抗體浸漬的浸漬部件的制備將5mmX 15mm尺寸的帶狀玻璃纖維無紡布用37. 5 μ L金膠體顆粒標記的抗體溶液 浸漬，然后，室溫下干燥，以獲得金膠體顆粒標記的抗體浸漬部件2。將標記有金膠體顆粒的 單克隆抗體TBOOl和ΤΒ002用作金膠體顆粒標記的抗體。(4-3)免疫色譜測試條的制備除上述用于色譜展開的膜載體3和上述含有標記的抗體的浸漬部件2外，還制備 作為樣品添加部件5的棉織物和作為吸收部件4的濾紙。然后，利用這些部件制備與圖1 相同的色譜測試條。實施例4(與CAPILIA TB(商品名；由TAUNSLABORATORIES INC.制造)的敏感度 比較)提供實施例3中制備的免疫色譜測試條(其中將固定化至捕獲區(qū)的單克隆抗體 TB003用作抗MPB64抗體，并將單克隆抗體TBOOl用作金膠體顆粒標記的抗體的抗MPB64抗 體)。將牛分歧桿菌BCG東京株培養(yǎng)于Middlebrook 7H11肉湯，并將所得培養(yǎng)上清(與
11McFarland No. 1相當，濃度為lX108cfu/ml)用樣品稀釋劑稀釋以獲得試樣。然后，用微量 吸移管將100 μ L試樣逐滴添加到上述測試條的樣品添加部件5，從而在其中色譜展開。室 溫下將其靜置15分鐘。其后，經(jīng)肉眼觀察通過上述捕獲區(qū)31捕獲的ΜΡΒ64蛋白和金膠體 顆粒標記的抗體的復合體的量。復合體的捕獲量通過以下測定，將隨捕獲量而增減的赤紫 色水平用肉眼分為以下4個等級_(未著色)；士(輕微著色)；+(清晰著色)和++(顯著著色)。將Middlebrook 7Η11肉湯用作陰性對照。作為對照免疫色譜測試條，使用商購可得的免疫色譜測試試劑盒 “CAPILIA TB (商品名；TAUNS LABORATORIES INC.) ”，并進行相同的試驗。結(jié)果如表1所示。表 1 如表1所示，發(fā)現(xiàn)實施例3中生產(chǎn)的測試條具有比對照CAPILIA TB高約四倍的敏感度。實施例5 (交叉反應性試驗)使用實施例3中制備的免疫色譜測試條(將單克隆抗體TB003用作固定化至捕獲 區(qū)的抗MPB64抗體，并將單克隆抗體TB002用作金膠體顆粒標記的抗體的抗MPB64抗體)， 進行結(jié)核分歧桿菌復合群與各種非結(jié)核性分枝桿菌的反應性試驗。用樣品稀釋劑稀釋各 培養(yǎng)的菌株，以制備試樣。然后，逐滴加入100 μ L試樣，以便其色譜展開。室溫下靜置15 分鐘后，進行目測。使用商購可得的免疫色譜測試試劑盒“CAPILIA TB(商品名；由TAUNS LABORATORIES INC.制造”作為對照，進行相同的試驗。結(jié)果如表2所示。表2 如表2所示，實施例3的測試條僅顯示與結(jié)核分歧桿菌復合群即，結(jié)核分歧桿菌、 牛分歧桿菌和牛分歧桿菌BCG-東京株的反應性，但并沒未顯示與在對照CAPILIA TB中證 實的與海分歧桿菌JATA22-01、351-2和329的任何交叉反應性。因此，顯示測試條對生產(chǎn) MPB64的結(jié)核分歧桿菌復合群具有特異性。同樣地，對于將單克隆抗體TB003用作固定化至捕獲區(qū)的抗MPB64抗體，并將單克 隆抗體TB001用作金膠體顆粒標記的抗體的抗MPB64抗體的免疫色譜測試條，也顯示相同 的結(jié)果。實施例6 (使用抗MPB64抗體的熒光免疫色譜測試條的制備)(1)抗MPB64抗體的制備將實施例1獲得的各克隆接種于小鼠的腹腔內(nèi)，以獲得含有抗MPB64抗體的腹水。 另外，根據(jù)常規(guī)方法使用G蛋白吸附劑進行IgG的純化，以獲得抗MPB64抗體。(2)熒光膠乳顆粒標記的抗MPB64抗體溶液的制備將上述(1)中獲得的抗MPB64抗體分別用熒光膠乳顆粒通過以下步驟進行標記。將1 μ g蛋白換算重量的抗ΜΡΒ64抗體(以下，當顯示抗體的蛋白換算重量時，它 僅顯示為通過其純化蛋白的重量分析得到的重量值)與Iml的0. 0002% (g/v)熒光膠乳顆 粒懸浮液混合，然后混合物室溫靜置2分鐘，以允許全部抗體結(jié)合到熒光膠乳顆粒的表面。 之后，向熒光膠乳顆粒懸浮液添加10%的牛血清白蛋白(以下稱為“BSA”)水溶液以調(diào)整 終濃度至1%，并用BSA將熒光膠乳顆粒的殘余表面全部封閉，以得到熒光膠乳顆粒標記的 抗MPB64抗體(以下稱為“熒光膠乳顆粒標記的抗體”)溶液。將該溶液離心(5600XG，30 分鐘)以使熒光膠乳顆粒標記的抗體沉淀。除去上清溶液，以獲得熒光膠乳顆粒標記的抗 體。將該熒光膠乳顆粒標記的抗體懸浮于含有10%蔗糖、BSA和0. 5% Triton-XlOO的 50mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)中，以得到熒光膠乳顆粒標記的抗體溶液。(3)用于MPB64測定的免疫色譜測試條的制備通過以下步驟生產(chǎn)圖1所示的免疫色譜測試條。(3-1)抗MPB64抗體和熒光膠乳顆粒標記的抗體的復合體的捕獲區(qū)
將具有5mm寬度和36mm長度大小的細長帶狀硝化纖維素膜制備為色譜介質(zhì)的色 譜展開用膜載體3。將0. 5 μ L含1. Omg/ml抗MPB64抗體的溶液以線狀涂布到距色譜展開用膜載體3 的色譜展開的開始點側(cè)末端7. 5mm處的位置。室溫干燥，以形成用于捕獲MPB64蛋白和熒 光膠乳顆粒標記的抗體的復合體的捕獲區(qū)31。將單克隆抗體TB003用作抗MPB64抗體。(3-2)用熒光膠乳顆粒標記的抗體浸漬的浸漬部件的制備用37. 5 μ L熒光膠乳顆粒標記的抗體溶液浸漬5mmX 15mm大小的帶狀玻璃纖維 無紡布，然后在室溫下干燥，以獲得熒光膠乳顆粒標記的抗體浸漬部件2。將單克隆抗體 TBOOl用作熒光膠乳顆粒標記的抗體。(3-3)免疫色譜測試條的制備除上述用于色譜展開的膜載體3和上述含有標記的抗體的浸漬部件2外，還制備 作為樣品添加部件5的棉織物和作為吸收部件4的濾紙。然后，利用這些部件制備與圖1 相同的色譜測試條。實施例7 (與CAPILIA TB (商品名；由TAUNSLABORATORIES INC.制造)的敏感度 比較)提供實施例6中制備的熒光免疫色譜測試條(其中將單克隆抗體TB003用作固 定化至捕獲區(qū)的抗MPB64抗體，并將單克隆抗體TBOOl用作熒光膠乳顆粒標記的抗體的抗 MPB64 抗體)。將牛分歧桿菌BCG東京株培養(yǎng)于Middlebrook 7H11肉湯，并將所得培養(yǎng)上清(與 McFarland No. 1相當，濃度為lX108cfu/ml)用樣品稀釋劑稀釋以獲得試樣。然后，用微量 吸移管將100 μ L試樣逐滴加到上述測試條的樣品添加部件5，從而在其中色譜展開。室溫 下將其靜置15分鐘。之后，通過熒光免疫色譜儀(由Hamamatsu Photonics K. K.制造) 測量由上述捕獲區(qū)31捕獲的MPB64蛋白和熒光膠乳顆粒標記的抗體的復合體的量。將 Middlebrook 7H11肉湯用作陰性對照。作為對照免疫色譜測試條，使用商購可得的免疫色 譜測試試劑盒“CAPILIA TB (商品名；TAUNS LABORATORIES INC.) ”，并進行相同的試驗，通 過免疫色譜儀(由Hamamatsu Photonics K. K.制造)測量具有金膠體顆粒標記的抗體的 復合體的捕獲量。比較關于顯示最低檢出靈敏度的樣品的稀釋倍數(shù)的檢出靈敏度。結(jié)果如 表3所示。表3 從表3，CAPILIA TB的檢出限界為3200倍稀釋樣品，而實施例6制備的熒光免疫 色譜測試條的檢出限界為204800倍。因此，發(fā)現(xiàn)實施例6中制備的熒光免疫色譜測試條具 有高于對照CAPILIA TB約32倍的靈敏度。實施例8 (源自結(jié)核病患者痰液的MPT64的測定)從臨床診斷為患結(jié)核病的患者中采集痰液以獲得樣品。將采集的痰液樣品用蛋白 酶進行處理，并用N-乙?；?L-半胱氨酸/氫氧化鈉處理(以下稱為NALC-NaOH法)使其 均勻。將前處理的樣品各自涂布到載玻片以獲得涂片標本。Ziehl-Neelsen染色該涂片標 本并且用顯微鏡觀察?；诜制鐥U菌檢查指南2007進行測定。對于檢出的細菌數(shù)，+表示 1-9 AFB/100顯微視野，2+表示彡10AFB/100顯微視野3+表示彡1OAFB/1顯微視野。對于 ImL由涂片檢查測定的痰液樣品，添加半堿性蛋白酶溶液(商品名SPUTAZYME，由KY0KUT0 PHARMACEUTICALINDUSTRIAL CO. LTD.制造)，并在室溫下處理。離心后，將 NALC-NaOH 溶 液添加到殘渣，通過渦旋攪拌機將混合物混合幾秒，向其添加磷酸鹽緩沖液(PH 7.0)以中 和。離心后，將殘渣懸浮于含0. 1% Tween 80的PBS中和通過添加玻璃珠并攪拌進行物理 處理以獲得試樣。用微量吸移管將100 μ L試樣逐滴添加到實施例6獲得的測試條的樣品添 加部件5，從而在其中色譜展開。室溫下將其靜置15分鐘。之后，通過熒光免疫色譜儀(由 Hamamatsu Photonics K. K.制造)測量由上述捕獲區(qū)31捕獲的MPB64蛋白和熒光膠乳顆 粒標記的抗體的復合體的量。以與上述相同的方式處理從沒有結(jié)核分歧桿病感染的正常人 采集的痰液，并用作陰性對照。作為對照測試條，使用商購可得的免疫色譜測試條“CAPILIA TB (商品名；TAUNS LAB0RAT0RIESINC. ”，并進行相同的試驗。結(jié)果如表4和圖2所示。表 4 如表4和圖2所示，發(fā)現(xiàn)實施例6中制備的熒光免疫色譜測試條具有比對照 CAPILIA TB高的靈敏度。實施例9(利用抗MPB64抗體的鉬-金膠體顆粒標記的免疫色譜測試條的制備)(1)抗MPB64抗體的制備將實施例1獲得的各克隆接種于小鼠的腹腔內(nèi)，以獲得含有抗MPB64抗體的腹水。 另外，根據(jù)常規(guī)方法使用G蛋白吸附劑進行IgG的純化，以獲得抗MPB64抗體。(2)鉬_金膠體顆粒的制備所有待用實驗玻璃器具用王水清洗。將390ml超純水注入燒瓶并煮沸，向沸水中 添加30ml氯金酸溶液(相當于每IL溶液Ig金，由KATAYAMA CHEMICAL INC.制造)。然 后，向其添加60ml 1重量％的檸檬酸鈉溶液，并在6分鐘45秒后，向其添加30ml的氯鉬酸溶 液(相當于每IL溶液Ig鉬，由Wako Pure Chemical Industries, Ltd.制造)。在添加氯 鉬酸溶液5分鐘后，向其添加60mll重量％的檸檬酸鈉水溶液，并還原4小時以獲得鉬-金 膠體顆粒懸浮液。(3)鉬-金膠體顆粒標記的抗MPB64抗體溶液的制備將上述(1)中獲得的抗MPB64抗體用鉬-金膠體顆粒通過以下方法進行標記。將1 μ g蛋白換算重量的抗ΜΡΒ64抗體(以下，當顯示抗體的蛋白換算重量時，它 僅顯示為通過其純化蛋白的重量分析得到的重量值)與Iml上述(2)中的鉬-金膠體顆粒 混合，然后室溫靜置2分鐘，以允許全部抗體結(jié)合到鉬-金膠體顆粒的表面。之后，向鉬-金 膠體顆粒溶液添加10%的牛血清白蛋白(以下稱為“BSA”)水溶液以調(diào)整終濃度至1%，并 用BSA將鉬-金膠體顆粒的殘余表面全部封閉，以得到鉬-金膠體顆粒標記的抗MPB64抗 體(以下稱為“鉬_金膠體顆粒標記的抗體”)溶液。將該溶液離心(5600XG，30分鐘)以 沉淀鉬-金膠體顆粒標記的抗體。除去上清液，以獲得鉬-金膠體顆粒標記的抗體。將該 鉬_金膠體顆粒標記的抗體懸浮于含有10%蔗糖、BSA和0. 5% Triton-XlOO的50mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)中，以得到鉬-金膠體顆粒標記的抗體溶液。(4)用于MPB64測定的免疫色譜測試條的制備通過以下步驟生產(chǎn)圖1所示的免疫色譜測試條。(4-1)抗MPB64抗體和鉬-金膠體顆粒標記的抗體的復合體的捕獲區(qū)
將具有5mm寬度和36mm長度大小的細長帶狀硝化纖維素膜制備為色譜介質(zhì)的色 譜展開用膜載體3。將0. 5 μ L含1. Omg/ml抗MPB64抗體的溶液以線狀涂布到距色譜展開用膜載體3 的色譜展開的開始點側(cè)末端7. 5mm處的位置。在室溫下使之干燥，以形成用于捕獲MPB64蛋 白和鉬_金膠體顆粒標記的抗體的復合體的捕獲區(qū)31。將單克隆抗體TB003用作抗MPB64 抗體。(4-2)用鉬_金膠體顆粒標記的抗體浸漬的浸漬部件的制備將5mmX 15mm尺寸的帶狀玻璃纖維無紡布用37. 5 μ L鉬-金膠體顆粒標記的抗體 溶液浸漬，然后，室溫下干燥，以獲得鉬_金膠體顆粒標記的抗體浸漬部件2。將標記有金膠 體顆粒的單克隆抗體TBOOl和ΤΒ002用作鉬-金膠體顆粒標記的抗體。(4-3)免疫色譜測試條的制備除上述用于色譜展開的膜載體3和上述含有標記的抗體的浸漬部件2外，還制備 作為樣品添加部件5的棉織物和作為吸收部件4的濾紙。然后，利用這些部件制備與圖1 相同的色譜測試條。
實施例10 (與CAPILIA TB (商品名；由TAUNSLABORATORIES INC.制造)的敏感度 比較)(1)免疫色譜測試條提供實施例9中制備的鉬_金膠體顆粒標記的免疫色譜測試條(其中將單克隆抗 體TB003用作固定化至捕獲區(qū)的抗體，并將單克隆抗體TBOOl用作鉬-金膠體顆粒標記的 抗體的抗MPB64抗體)。(2)液體培養(yǎng)基的制備將4. 7gMiddlebrook 7H11 肉湯 Base (由 Difco 制造)溶解于 900ml 含有 0. 5gTween 80的蒸餾水中。在高壓滅菌器中高壓121°C下滅菌10分鐘。冷卻后，向其無菌 地加入IOOml ADCEnrichment (白蛋白-葡萄糖-過氧化氫酶)，并每200 μ L平均分注到 1.5mL 微管中。將 MGIT (由 Nippon Becton Dickinson Company, Ltd.制造)用作對照培養(yǎng)基。(3)生物樣品的培養(yǎng)利用與上述相同的方法制備的Middlebrook 7H11肉湯培養(yǎng)牛分歧桿菌BCG東 京株以獲得細菌細胞。調(diào)整細菌細胞至相當于Mcfarland No. 1 (濃度1 X 108cfu/ml)，以 獲得標準細菌培養(yǎng)物。將該標準細菌培養(yǎng)物添加到從正常人采集的痰液，以調(diào)整終濃度至 104cfu/ml，從而制備假陽性痰液樣品。用NALC-NaOH法處理該假陽性痰液樣品，并離心以 獲得小球(pellets)。將含Tween 80的磷酸鹽緩沖的生理鹽水(以下稱為PBS)添加到小 球，隨后洗滌。通過離心除去上清液，將剩余物在含Tween 80的PBS中再懸浮，并將其中的 100 μ L接種于各培養(yǎng)基。培養(yǎng)數(shù)天后，從各培養(yǎng)基收集上清液以獲得試樣。然后，用微量吸移管向上述測試 條的樣品添加部件5逐滴加入100 μ L試樣，以便在其中色譜展開。室溫下靜置15分鐘。之 后，用肉眼觀察由上述捕獲區(qū)31捕獲的ΜΡΒ64蛋白和金屬膠體顆粒標記的抗體的復合體的 量。通過視覺觀察隨捕獲量而成比例增減的顯色度來測定捕獲量，并將其分為以下4個等 級_(未著色)；士(輕微著色)；+(清晰著色)和++(顯著著色)。結(jié)果如表5所示。
表 5 在對照培養(yǎng)基的MGIT中，即使5天也沒有檢出熒光。由于在10天時的細菌生長 才在其中檢出熒光。從上述結(jié)果看出，在細菌實質(zhì)上開始增殖前短時間培養(yǎng)后，通過根據(jù)本檢出方法 的試驗可以在比常規(guī)方法更短的時間內(nèi)檢出細菌。產(chǎn)業(yè)上的可利用件本發(fā)明提供使用結(jié)核分歧桿菌復合群特異性分泌蛋白MPB64的抗體的免疫測定 方法，更特別涉及夾心免疫測定方法，尤其涉及免疫色譜測定方法和免疫色譜測試條。本發(fā) 明能夠特異性高靈敏度檢出結(jié)核分歧桿菌復合群，因此對于快速、安全和高準度診斷結(jié)核 分歧桿菌復合群的感染是有用的。附圖標記說明1 粘著片2 浸漬部件3 膜載體31 捕獲區(qū)4 吸收部件5 樣品添加部件
權(quán)利要求
一種用于檢出結(jié)核分歧桿菌復合群的方法，其包括利用結(jié)核分歧桿菌復合群特異性分泌蛋白MPB64的抗體的免疫測定，其中所述抗體包括位于SEQ ID NOS2 4的任一氨基酸序列的MPB64的抗原表位的抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢出方法，其中所述抗體為單克隆抗體。
3.一種用于檢出結(jié)核分歧桿菌復合群的方法，其包括利用結(jié)核分歧桿菌復合群特異性 分泌蛋白MPB64的第一和第二抗體的夾心免疫測定，其中所述第一和第二抗體的至少之一 包括位于SEQ ID NOS 2-4的任一氨基酸序列的MPB64的抗原表位的抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢出方法，其中所述第一和第二抗體的至少之一為單克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢出方法，其中任一所述第一和第二抗體固定化至載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢出方法，其中，在未經(jīng)培養(yǎng)或在樣品中的結(jié)核分歧桿菌復 合群細菌實質(zhì)上開始增殖前培養(yǎng)一段時間后的情況下，對生物樣品結(jié)核分歧桿菌復合群進 行所述免疫測定。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢出方法，其中所述生物樣品在進行免疫測定之前進行結(jié)核 分歧桿菌的滅活處理或者通過分散或增溶化的預處理。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢出方法，其中通過分散或增溶化的所述處理通過以下來進 行通過攪拌操作，或者通過向所述生物樣品加入選自由堿性物質(zhì)、還原性物質(zhì)、蛋白酶和 表面活性劑組成的組中的至少之一。
9.根據(jù)權(quán)利要求6至8中任一項所述的檢出方法，其中所述生物樣品為痰液。
10.一種用于檢出結(jié)核分歧桿菌復合群的免疫色譜測定方法，其包括提供膜載體，所述膜載體具有在其預定位置通過固定化結(jié)核分歧桿菌復合群特異性分 泌蛋白MPB64的第一抗體而形成的捕獲區(qū)，在所述膜載體上向所述捕獲區(qū)色譜展開混合溶液，所述混合溶液含有MPB64的第二抗 體和預定量的試樣，由此由所述捕獲區(qū)捕獲包含于所述試樣的抗原和所述第二抗體的復合物， 其中所述第一和第二抗體的至少之一包括位于SEQ IDNOS 2-4的任一氨基酸序列的 MPB64的抗原表位的抗體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的免疫色譜測定方法，其中所述第一和第二抗體的至少之一 為單克隆抗體。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的免疫色譜測定方法，其中，所述試樣包含未經(jīng)培養(yǎng)或在結(jié) 核分歧桿菌復合群細菌實質(zhì)上開始增殖前已培養(yǎng)一段時間的生物樣品。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的免疫色譜測定方法，其中所述生物樣品通過以下來預處 理通過結(jié)核分歧桿菌滅活處理，或者通過分散或增溶化的處理。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的免疫色譜測定方法，其中通過所述生物樣品的分散或增溶 化的所述處理通過以下來進行通過攪拌操作，或通過向所述生物樣品加入選自由堿性物 質(zhì)、還原性物質(zhì)、蛋白酶和表面活性劑組成的組中的至少之一。
15.根據(jù)權(quán)利要求12至14任一項所述的免疫色譜測定方法，其中所述生物樣品為痰 液。
16.根據(jù)權(quán)利要求10所述的免疫色譜測定方法，其中用金屬膠體顆?；蚰z乳顆粒標記所述第二抗體。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的免疫色譜測定方法，其中所述膜載體為硝化纖維素膜。
18.一種用于檢出結(jié)核分歧桿菌復合群的免疫色譜測試條，其至少包括結(jié)核分歧桿菌 復合群特異性分泌蛋白MPB64的第一和第二抗體，和膜載體，其中所述第一抗體被預先固 定化至所述膜載體的預定位置以形成捕獲區(qū)，所述第二抗體被適當?shù)臉擞泟擞洠⒃谶h 離所述捕獲區(qū)的位置制備以在所述膜載體中色譜展開，其中所述第一和第二抗體的至少之 一包括位于SEQ ID NOS :2-4的任一氨基酸序列的MPB64的抗原表位的抗體。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的免疫色譜測試條，其中所述第一和第二抗體的至少之一為 單克隆抗體。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的免疫色譜測試條，其中所述第二抗體用金屬膠體顆粒或膠 乳顆粒標記。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的免疫色譜測試條，其中所述膜載體為硝化纖維素膜。
22.一種單克隆抗體，其識別位于SEQ ID NOS 2-4的任一氨基酸序列的MPB64的抗原表位。
全文摘要
通過在生物樣品中特異性檢出結(jié)核分歧桿菌復合群特異性分泌蛋白MPT64抗原，來比以前更快速、安全和準確地進行結(jié)核分歧桿菌感染的診斷。獲得識別位于SEQ ID NOS2-4的任一氨基酸序列的MPB64的抗原表位的抗體，特別是單克隆抗體。因此，提供使用該抗體的免疫測定方法，特別是使用抗MPB64的第一抗體和第二抗體的夾心免疫測定方法，特別是免疫色譜測定方法和免疫色譜測試條。試樣在未經(jīng)生物樣品培養(yǎng)或短暫生物樣品培養(yǎng)(其中樣品中的結(jié)核分歧桿菌復合群未實質(zhì)上增殖)后的情況下，能夠快速地進行試樣的免疫測定。生物樣品可以通過結(jié)核分歧桿菌的滅活處理或者分散或增溶化處理來進行預處理。
文檔編號C07K16/12GK101925819SQ20088012568
公開日2010年12月22日 申請日期2008年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月28日
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