專利名稱：四肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種新的制備四肽、更準(zhǔn)確地說(shuō)是四肽H-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2或其藥學(xué)上可接受鹽的方法。在其它方面，本發(fā)明也涉及用于該方法中的新的中間體。
背景和現(xiàn)有技術(shù)本發(fā)明涉及一種新的用于制備肽H-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2或其藥學(xué)上可接受的鹽的方法。
WO97/07129公開了一種尤其用于制備肽H-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2的方法。該肽H-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2也公開于WO97/07130中。所述肽顯示出外周止痛活性和對(duì)阿片樣物質(zhì)受體μ亞型的選擇性，并特別適用于疼痛的治療。此外，該肽可以采用根據(jù)本領(lǐng)域中成熟方法的固相合成法制備。固相合成法(一種用于肽合成的常用及成熟的方法)的缺陷在于除了成本昂貴外，難用于大規(guī)模生產(chǎn)。
本發(fā)明方法以與本領(lǐng)域已知方法相比成本更低和對(duì)環(huán)境更有利的方式提供高純度的四肽H-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2。此外，本申請(qǐng)的方法提供更高收率的產(chǎn)品。
因此，本發(fā)明的目地是提供一種適合大規(guī)模合成使用的新方法。本方明的另一個(gè)目地是提供一個(gè)包括盡可能少的反應(yīng)步驟的方法。
本發(fā)明概述本發(fā)明提供一種大規(guī)模地制備肽H-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2的新方法，它是一種如式(Ⅰ)所示的肽或其藥學(xué)上可接受的鹽 根據(jù)本發(fā)明制備如上式(1)化合物的方法包括如下反應(yīng)步驟步驟1(ⅰ)一個(gè)偶合步驟，其中通過(guò)預(yù)先活化步驟或就地產(chǎn)生預(yù)先制備的、活化的p-氟苯丙氨酸衍生物(Ⅲ)與苯丙氨酸的氨基(其中羧基作為酯或酰胺被保護(hù)，即式Phe-R1化合物，其中R1是酯或酰胺殘基)在溶劑的存在下反應(yīng)，得到被保護(hù)的二肽衍生物(Ⅳ)，式(Ⅲ)和(Ⅳ)的結(jié)構(gòu)式如下 其中A是氨基保護(hù)基團(tuán)，和R是活化劑殘基； 其中A是氨基保護(hù)基團(tuán)，和R1是酯或酰胺殘基；(ⅱ)一個(gè)脫保護(hù)步驟，其中在以上步驟中制備的被保護(hù)的二肽衍生物(Ⅳ)，根據(jù)所用的氨基保護(hù)基團(tuán)，通過(guò)催化氫化作用、堿或酸處理來(lái)脫保護(hù)，得到二肽衍生物(5) 其中R1是酯或酰胺殘基；步驟2(ⅰ)一個(gè)偶合步驟，其中通過(guò)預(yù)活化步驟或就地產(chǎn)生預(yù)先制備的活化丙氨酸衍生物(Ⅶ)，與步驟1的產(chǎn)物即二肽衍生物(5)在溶劑的存在下反應(yīng)，得到被保護(hù)的三肽衍生物(Ⅷ)，式(Ⅶ)和(Ⅷ)化合物的結(jié)構(gòu)式如下 其中A是氨基保護(hù)基團(tuán)，和R是活化劑的殘基； 其中A是氨基保護(hù)基團(tuán)，和R1是酯或酰胺殘基；(ⅱ)脫保護(hù)步驟，其中在前面步驟中制備的、被保護(hù)的三肽衍生物(Ⅷ)根據(jù)使用的氨基保護(hù)基，通過(guò)催化氫化作用或酸處理被脫保護(hù)，得到三肽衍生物(9) 其中R1是酯或酰胺殘基；步驟3(ⅰ)一個(gè)偶合步驟，其中通過(guò)預(yù)先活化步驟或就地產(chǎn)生預(yù)先制備的一種活化酪氨酸衍生物(Ⅹ)，在溶劑存在下，與三肽衍生物(9)(步驟2的產(chǎn)物)反應(yīng)，提供保護(hù)的四肽衍生物(Ⅺ)。式(Ⅹ)和(Ⅺ)化合物的結(jié)構(gòu)式如下； 其中A是一種氨基保護(hù)基團(tuán)，R是一種活化劑殘基，和R2是H或類似芐基的基團(tuán)； 其中A是一種氨基保護(hù)基，和R1是一種酯或酰胺殘基；(ⅱ)如果在前面步驟(ⅰ)中制備的被保護(hù)的四肽衍生物(Ⅺ)是一種酯，則進(jìn)行任選的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，其中酯化合物(Ⅺ)在有機(jī)醇中與氨反應(yīng)，優(yōu)選與甲醇中的氨反應(yīng)，提供保護(hù)的二肽衍生物(Ⅻ) (ⅲ)一個(gè)脫保護(hù)步驟，其中被保護(hù)的四肽衍生物(Ⅻ)，根據(jù)所使用的氨基保護(hù)基團(tuán)，通過(guò)催化氫化作用、堿或酸處理而脫保護(hù)，提供最終的四肽(Ⅰ)，其可任選轉(zhuǎn)換為四肽(Ⅰ)的鹽。
如果需要，可以使肽H-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2(Ⅰ)與一種藥學(xué)上可接受的酸如AcOH、磷酸、檸檬酸、乳酸和鹽酸反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明，鹽酸是優(yōu)選使用的酸?？梢允褂玫柠}在S.M.Berge,L.D.Bighley和D.C.Monkhouse,J.Pharmaceut.Sci,66(1977)1-19中描述。
因此，根據(jù)以上敘述的本發(fā)明方法可簡(jiǎn)述為包括下列步驟步驟1(ⅰ)一個(gè)偶合步驟，(ⅱ)一個(gè)脫保護(hù)步驟。步驟2(ⅱ)一個(gè)偶合步驟，(ⅱ)一個(gè)脫保護(hù)步驟。步驟3(ⅰ)一個(gè)偶合步驟，
(ⅱ)一個(gè)任選的轉(zhuǎn)化步驟，(ⅲ)一個(gè)脫保護(hù)步驟。
在以上步驟3(ⅱ)中描述的任選轉(zhuǎn)化步驟可代之以在步驟1或步驟2中偶合步驟(ⅰ)之后進(jìn)行。優(yōu)選該轉(zhuǎn)化步驟在步驟1中的偶合步驟(ⅰ)之后進(jìn)行。因此，進(jìn)行本發(fā)明方法的優(yōu)選方式簡(jiǎn)述為包括以下步驟步驟1(ⅰ)一個(gè)偶合步驟，(ⅱ)一個(gè)任選的轉(zhuǎn)化步驟，(ⅲ)一個(gè)脫保護(hù)步驟。步驟2(ⅰ)一個(gè)偶合步驟，(ⅱ)一個(gè)脫保護(hù)步驟。步驟3(ⅰ)一個(gè)偶合步驟，(ⅱ)一個(gè)脫保護(hù)步驟。
Nα-氨基保護(hù)基可以從適合肽合成的任何保護(hù)基中選擇，例如，叔丁氧基羰基(Boc)或芐氧基羰基(經(jīng)常縮寫為Z-)，僅是提到的兩種可能的氨基保護(hù)基。然而，芐氧基羰基特別優(yōu)選用于本合成，因?yàn)樗菀淄ㄟ^(guò)催化氧化作用去除，與保護(hù)基Boc相反，它不需要中和釋放出的胺。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可了解根據(jù)本發(fā)明可使用的合適的氨基和羧基保護(hù)基。參照J(rèn).Meienhofer in The Peptides，笫1卷，編輯E.Gross& J.Meienhofer,Academic Press,Inc,London,1979,264-309頁(yè)；Thepeptides,1-9卷，E.Gross&J.Meienhofer，編輯，Academic PressInc,London,1979-1987；Houben-Weyl,Methoden der organischenChemie,E.Muller，編輯，15卷，Ⅰ-Ⅱ部分，Thieme,Stuttgart 1974；和M.Bodanszky,Principles of peptide Synthesis,Springer Verlag,Berlin1984。
上述步驟1-3前的預(yù)活化步驟，或就地產(chǎn)生活化的活性氨基酸衍生物，可通過(guò)一種氨基酸在叔胺和有機(jī)溶劑的存在下，與一種活化劑反應(yīng)完成，其中所述氨基酸的氨基官能團(tuán)通過(guò)合適的保護(hù)基保護(hù)，例如叔丁氧基羰基(Boc)或芐氧基羰基(Z)(這些保護(hù)基可以購(gòu)買到或通過(guò)本領(lǐng)域已知技術(shù)獲得)，提供活化的氨基酸衍生物。預(yù)先活化步驟可簡(jiǎn)略表示如下 其中A是一種氨基保護(hù)基，和R是一種活化劑殘基；對(duì)于上述1-3步驟中的偶合步驟而言，只要所述氨基成分為基本上可溶的并可與活化的肽衍生物直接反應(yīng)，可使用各種強(qiáng)的溶劑。用于偶合步驟的合適的溶劑的實(shí)例為丙酮、乙腈、DMF、N-甲基吡咯烷酮(NMP)和EtOAc，或它們的混合物。
這里所用術(shù)語(yǔ)“類似芐基的基團(tuán)”，表示任何取代或未取代的芐基，它們?cè)陬愃频姆磻?yīng)條件下，作為芐氧基羰基被氫解。
術(shù)語(yǔ)“pF”表示對(duì)位氟取代基。
在每個(gè)步驟中可能的以及優(yōu)選的反應(yīng)物和反應(yīng)條件如下。預(yù)活化步驟合適的活化劑可選自那些產(chǎn)生常用的活化氨基酸衍生物的活化劑，包括(但不限于)碳二亞胺、活化酯、疊氮化物或酸酐。氯代甲酸異丁酯(iBuOCOCI)是優(yōu)選的活化劑。當(dāng)氯代甲酸異丁酯(iBuOCOCI)為活化劑時(shí)，活化的肽衍生物具有以下結(jié)構(gòu)，以D-丙氨酸為例 叔胺可選自任何叔胺。然而，優(yōu)選NMM(N-甲基嗎啉)、二異丙基乙胺和三乙胺。另外，也可使用位阻的仲胺。
有機(jī)溶劑可以是本領(lǐng)域中技術(shù)人員所知的在肽化學(xué)中合適的任何有機(jī)溶劑。然而，在預(yù)活化步驟中優(yōu)選乙酸乙酯、乙腈、丙酮和四氫呋喃。偶合步驟步驟1(ⅰ)、步驟2(ⅰ)和步驟3(ⅰ)用于偶合步驟的溶劑可以從許多溶劑中選擇，只要氨基成分基本上可溶和可與活化氨基酸殘基直接反應(yīng)即可。用于偶合步驟合適的溶劑的實(shí)例為丙酮、乙腈、DMF,N-甲基吡咯烷酮(NMP)和EtOAc，或它們的混合物，其中優(yōu)選丙酮、EtOAc、NMP和DMF。
當(dāng)活化氨基酸衍生物不降解或反應(yīng)速度不是太慢時(shí)，任何溫度都可使用。優(yōu)選的溫度范圍是0℃至-20℃，特別優(yōu)選的溫度是從-5℃至-15℃。調(diào)節(jié)加料的速度以便維持優(yōu)選的溫度。脫保護(hù)步驟步驟1(ⅱ)、步驟2(ⅱ)和驟3(ⅲ)用于氫化的催化劑可以從許多本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的催化劑中選擇。然而，優(yōu)選5％的披鈀碳?？梢允褂萌魏沃辽倏扇芙庖恍╇牡娜軇?，除了酮(例如丙酮)或使催化劑中毒的或與反應(yīng)成分起反應(yīng)的溶劑之外。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解溶劑的選擇。DMF是優(yōu)選的溶劑。
只有在步驟3(ⅰ)中制備的保護(hù)的四肽衍生物(Ⅺ)是一種酯的情況下，才需要任選步驟3(ⅱ)因此，如果使用苯丙氨酸的酰胺，步驟3(ⅱ)將從合成流程中省去。
如果使用酸來(lái)除去α-保護(hù)基，則需要等摩爾量的堿，以使肽衍生物的氨基脫質(zhì)子化。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，將保護(hù)的氨基酸(優(yōu)選用芐氧羰基作為Na-氨基保護(hù)基)用異丁氧基碳酰氯或類似類型的氯代甲酸酯以混合酐的形式活化。使用的方法基于J.Meienhofer在下列文獻(xiàn)中所綜述的通用方法The Peptides，第一卷，編輯E.Gross & J.Meienhofer,Academic Press,Inc,London 1979,264-309頁(yè)。
我們已驚奇地發(fā)現(xiàn)，活化時(shí)間在0到-15℃的溫度下可延長(zhǎng)至少30分鐘，而建議的活化時(shí)間在-15℃溫度下為1-2分鐘。我們也發(fā)現(xiàn)盡管其它情況下推薦，嚴(yán)格的無(wú)水條件是不必要的。這使本方法可用于大規(guī)模生產(chǎn)，其中較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間使得可以進(jìn)行安全的和可重復(fù)的過(guò)程。立體化學(xué)的完整性全部保留，化學(xué)純度和收率一般在90％以上。生成的混合酐在約0至-15℃溫度范圍內(nèi)與緩慢加入的氨基成分(氨基酸/肽酰胺或酯)偶合，然后，在產(chǎn)物開始直接從該反應(yīng)混合物中結(jié)晶前，使反應(yīng)混合物在大約30-60分鐘內(nèi)或更長(zhǎng)時(shí)間達(dá)到20-30℃。
我們還驚奇地反現(xiàn)當(dāng)使用本方法時(shí)，如果使用適當(dāng)選擇的溶劑混合物，則不需要結(jié)晶前的單獨(dú)的洗滌步驟。優(yōu)選使用DMF、乙腈、EtOAc和水?？刂平Y(jié)晶，不但可以達(dá)到高度純化，而且還可以在后處理中縮短過(guò)濾或離心的時(shí)間，如果需要干燥的中間產(chǎn)物，還可縮短干燥的時(shí)間。一個(gè)重要的因素是產(chǎn)生足夠量的、不阻塞過(guò)濾裝置或離心布的相對(duì)窄的粒度分布。這尤其對(duì)于產(chǎn)生幾乎不可能過(guò)濾的凝膠或無(wú)定形結(jié)晶的肽是很常見的。
三肽衍生物(9)是一個(gè)用于制備目標(biāo)化合物(Ⅰ)的有用的中間產(chǎn)物 其中R1是一種酯或酰胺殘基。本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明現(xiàn)在通過(guò)下面的實(shí)施例更詳細(xì)地介紹肽H-TyrD-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2或其藥學(xué)上可接受的鹽的制備，然而該實(shí)施例不認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明的限制。另外，以下方案1提供用一種其中羧基作為酯被保護(hù)的苯丙氨酸衍生物制備根據(jù)本發(fā)明的式(Ⅰ)肽的合成途徑的詳細(xì)綜述。以下方案2提供用一種其中羧基作為酰胺被保護(hù)苯丙氨酸衍生物制備根據(jù)本發(fā)明的式(Ⅰ)肽的合成途徑的詳細(xì)綜述。參照以下實(shí)施例詳細(xì)的合成描述中的化合物編號(hào)，與方案1和2中化合物的編號(hào)一致。
方案1
方案1(續(xù))
方案1(續(xù)) 步驟1(ⅰ)Z-Phe(pF)-Phe-OMe(方案1中化合物3)的制備3.5摩爾規(guī)模先將Z-Phe(pF)(化合物1)(1當(dāng)量)溶于丙酮(4.7L/摩爾)中，冷卻，然后加入IBK(0.9-1.2當(dāng)量)(實(shí)際1當(dāng)量)。然后根據(jù)加入NMM(N-甲基嗎啉)(0.9-1.2當(dāng)量)(實(shí)際1當(dāng)量)的速度(約20分鐘)控制反應(yīng)。推薦反應(yīng)溫度為0到-15℃之間(實(shí)際為-9℃到-14℃)，其中加入NMM后立即反應(yīng)，然而防止混合酐迅速分解。
同時(shí)將H-Phe-Ome x HCI(0.9-1.3當(dāng)量)(實(shí)際1.04當(dāng)量)與丙酮(2.6L/摩爾)混合，用NMM(0.9-1.5當(dāng)量)(實(shí)際1.04當(dāng)量)中和，冷卻至0到-20℃(實(shí)際大約-10℃)。在活化完成后，以保持溫度在約-10℃(實(shí)際從-8℃到-13℃)的速度(大約30分鐘)加入該懸浮液。然后加入EtOAc(4L/摩爾)，用水(2×2升/摩爾)洗滌有機(jī)相，然后從ACN中共沸蒸餾，于下一步驟前溶解于MeOH中。在甲醇懸浮液中純度為92％?；瘜W(xué)移位峰裂數(shù)積分(Integral)H8.5 d 17.49d 17.31m 77.24m 57.08m 24.93m 24.5 m 14.26m 13.58s 32.99m 32.67m 1(ⅱ)Z-Phe(pF)-Phe-NH2(方案1中產(chǎn)物4)的制備2.3到3.3摩爾規(guī)模將氨加入在前面步驟中制備的化合物3溶液(大約8升MeOH/摩爾)中，壓力在1到5巴之間，在15-40℃下持續(xù)5個(gè)小時(shí)以上或直到反應(yīng)接近完成為止(實(shí)際轉(zhuǎn)換率99％)。到反應(yīng)完成時(shí)，蒸發(fā)氨，在過(guò)濾或離心前冷卻反應(yīng)物。產(chǎn)物用MeOH洗滌，在20-50℃下真空干燥。由化合物1(Z-Phe(pF)計(jì)算的收率為74％，純度為100％?；瘜W(xué)移位 峰裂數(shù)積分H8.05d 17.49d 17.24m 117.07m 34.94m 24.46m 14.21m 13.00m 12.88m 12.66m 1H-Phe(pF)-Phe-NH2(方案1中產(chǎn)物5)的制備4.3摩爾規(guī)模將在前面步驟中制備的化合物4與DMF(4.2升/摩爾)混合，加入Pd/C催化劑(Pd實(shí)際含量5％)(0.2-10％w/w/LEF-581)(實(shí)際7％)，將得到的混合物在25℃、3巴H2壓力下氫化0.5小時(shí)以上(實(shí)際1.2小時(shí))。然后過(guò)濾反應(yīng)混合物，在下一步驟前冷卻至大約-15℃。在溶液中的純度為99.6％。步驟2(ⅰ)Z-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2(方案1中化合物8)的制備4.4摩爾規(guī)模將Z-D-Ala(化合物6)(1當(dāng)量)溶解在乙腈(ACN)(2.3L/摩爾)中，在加入IBK(0.9-1.2當(dāng)量)(實(shí)用1當(dāng)量)前冷卻。然后以上述的制備化合物3同樣的方式加入NMM(0.9-1.2當(dāng)量)(實(shí)用1當(dāng)量)。在大約30分鐘內(nèi)加入化合物5(24.5升)的溶液，維持溫度在約-10℃(實(shí)際從-8℃到-14℃)。偶合完成后，通過(guò)慢慢加入水(3×3.6升/摩爾+1×1.3升/摩爾)，每次加水間隔時(shí)間為約25分鐘，開始溫度大約為30℃，結(jié)束溫度大約為20℃，從反應(yīng)混合物中結(jié)晶出產(chǎn)物。然后離心結(jié)晶，在20-50℃下真空干燥前用水/乙腈(4∶1)洗滌。收率為90％，純度為99.5％?；瘜W(xué)移位 峰裂數(shù)積分H8.14d 18.05d 17.43d 17.29m 127.05m 25.01m 24.44m 24.01m 12.92m 32.73m 10.96d 3H-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2(方案1中化合物9)的制備將在前面步驟中制備的化合物8與DMF(4.2升/摩爾)混合，加入Pd/C催化劑(Pd實(shí)際含量5％)(0.2-10％w/w/化合物3)(實(shí)際7％)，將得到的混合物在25℃和3巴H2壓力下氫化0.5小時(shí)以上(實(shí)際1.2小時(shí))。然后過(guò)濾反應(yīng)混合物，在下一步驟前冷卻至約-15℃。純度為97％，原料轉(zhuǎn)化率大于98％。步驟3(ⅰ)Z-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2(方案1中化合物12)的制備4.1摩爾規(guī)模使用與前面兩次偶合同樣的方法偶合。將Z-Tyr(化合物10)(1當(dāng)量)溶解于ACN(2.3L/摩爾)中，在加入IBK(0.9-1.2當(dāng)量)前冷卻。然后，以上述化合物3時(shí)同樣的方式加入NMM(0.9-1.2當(dāng)量)。在大約30分鐘內(nèi)加入從前步驟中得到的化合物3的溶液，維持溫度在約-10℃(實(shí)際從-7℃到-14℃)。偶合完成后，通過(guò)緩慢加入乙腈和水(2升/摩爾ACN+0.3升/摩爾25％氨的水溶液)，放置2小時(shí)，加入1.5升/摩爾CAN∶水(1∶1)，放置1小時(shí)，升溫到35℃，加入晶種(大約1％w/w)，放置1小時(shí)，加入1.3L/摩爾CAN∶水(1∶1)，放置1小時(shí)，加入1.2升/摩爾水并在35℃下放置0.5小時(shí)，加入1.2升/摩爾水并在20℃下放置2小時(shí)，加1.2升/摩爾水并在20℃下放置1小時(shí)，加1.2L/摩爾水并在20℃下放置0.5小時(shí)，從反應(yīng)混合物中結(jié)晶出產(chǎn)物。離心，先水洗然后用ACN洗，然后在20-50℃真空干燥。
由化合物8計(jì)算的收率為81％，純度為98.4％?；瘜W(xué)移位 峰裂數(shù)積分H9.18s 18.18d 18.11d 18.05d 17.43d 17.24m 127.04m 46.63d 24.92m 24.45m 24.22m 23.00m 12.83m 12.64m 10.89d 3(ⅱ)H-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2(方案1中化合物1)的制備3.1和3.2摩爾規(guī)模將化合物4與DMF(實(shí)際操作2-2.6升/摩爾)混合，加入5％的Pd/C催化劑(實(shí)際含量)(0.2-10％w/w/化合物3)(實(shí)際6-7％)，將得到的混合物在20-40℃(實(shí)際操作20-25℃)、3巴H2壓力下氫化0.5小時(shí)以上(實(shí)際操作1-2小時(shí))。然后，過(guò)濾反應(yīng)混合物以除去Pd/c，加入EtOAc(一般10升/摩爾)直至使所有物質(zhì)結(jié)晶。經(jīng)過(guò)過(guò)濾或離心作用分離固體，用EtOAc洗滌，在20-50℃下真空干燥。H-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2鹽酸鹽的制備2.1摩爾規(guī)模將游離堿化合物I溶解于加有1當(dāng)量氯化氫的水和丙酮的混合液中并過(guò)濾(在實(shí)際操作中146克/摩爾25％氯化氫/水，2升丙酮/摩爾)。此鹽在丙酮中的溶解度有限，因此，用額外量的丙酮/水(95∶5)的混合液(0.5升/摩爾)洗滌一次。在高速攪拌下，通過(guò)緩慢加入丙酮(3.4升/摩爾)，然后加入至少1％w/w晶種，誘發(fā)結(jié)晶。30分鐘后，緩慢加入第一份MIBK(31/mde)，緩慢攪拌下放置直到配料明顯變稠。分三次再加入MIBK(3升/摩爾)，每次間隔30-60分鐘，同時(shí)維持反應(yīng)器內(nèi)部溫度在約20℃。然后，經(jīng)過(guò)離心或過(guò)濾分離該固體，用MIBK洗滌，然后在20-50℃下真空干燥16小時(shí)以上或直到溶劑含量低于規(guī)定的技術(shù)規(guī)范的要求。
方案2
方案2(續(xù))
方案2(續(xù)) 步驟1(ⅰ)Z-Phe(pF)-Phe-NH2(方案2中化合物13)的制備6.7摩爾規(guī)模首先將Z-Phe(pF)(1當(dāng)量)溶解于乙腈(EtOAc)(1.7升/摩爾)中，在加入氯代甲酸異丁酯(0.9-1.2當(dāng)量)(實(shí)際1.05當(dāng)量)前冷卻。然后，通過(guò)加入N-甲基嗎啉(0.9-2.0當(dāng)量)(實(shí)際1.4當(dāng)量)的速度(大約20分鐘，實(shí)際15分鐘)控制反應(yīng)。推薦反應(yīng)溫度為0到-15℃(實(shí)際從-8℃到-11℃)，其中，加入N-甲基嗎啉后反應(yīng)立即發(fā)生，然而防止混合酐迅速分解。
同時(shí)將H-Phe-NH2x HCI(0.9-1.3當(dāng)量)(實(shí)際1.04當(dāng)量)溶解于DMF(4.0升/摩爾)中，用N-甲基嗎啉(0.9-1.5當(dāng)量)(實(shí)際1.04當(dāng)量)中和并冷卻至0到-20℃(實(shí)際大約-10℃)。在活化完成后，以維持溫度在大約-10℃(實(shí)際從-6℃到-13℃)的速度(大約15分鐘)實(shí)際8分鐘加入該懸漿液。
偶合完成后，通過(guò)緩慢加入50％乙醇/水(3.6升/摩爾)，由反應(yīng)混合物中結(jié)晶出產(chǎn)物。等待30分鐘后，于約20℃下，分三部分加入總量為2.85升/摩爾的水，每次加入間隔大約25分鐘。大約17小時(shí)后，過(guò)濾或離心結(jié)晶，用50％乙醇/水、隨后用若干份的乙腈洗滌，然后在20-60℃下真空干燥。收率為90％，純度為99.9％。H-Phe(pF)-Phe-NH2(方案2中化合物14)的制備6.7摩爾規(guī)模將在前面步驟中制備的Z-Phe(pF)-Phe-NH2與DMF(3.5升/摩爾)混合，加入Pd/C催化劑(Pd實(shí)際含量為5％)(0.2-10％w/w/LEF-582)，在25-30℃、大約3巴H2壓力下氫化得到的混合物0.5小時(shí)以上(實(shí)際1.3小時(shí))。然后過(guò)濾反應(yīng)混合物，在下一步驟前冷卻至約-15℃。在溶液中的純度為99.6％，原料轉(zhuǎn)化率大于99％。步驟2(ⅰ)Z-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2(方案2中化合物15)的制備5.9摩爾規(guī)模將Z-D-Ala-OH(化合物x)(實(shí)用1.03當(dāng)量)溶于乙腈(1.9升/摩爾)中，冷卻，然后加入氯代甲酸異丁酯(0.9-1.2當(dāng)量)(使用1.07當(dāng)量)。以上述的制備Z-Phe(pF)-Phe-NH2的類似方式加入N-甲基嗎啉(0.9-2.0當(dāng)量)(使用1.2當(dāng)量)。然后在大約15分鐘內(nèi)(實(shí)際8分鐘內(nèi))加入H-Phe(pF)-Phe-NH2(25升)溶液，維持溫度在-10℃左右(實(shí)際從-8℃到-11℃)。偶合完成后，通過(guò)于約20℃溫度下緩慢加入水(4×1.9升/摩爾)，每次加入間隔大約15-30分鐘，使產(chǎn)物從混合物中結(jié)晶。然后，過(guò)濾或離心結(jié)晶，用水/乙腈(4∶1)、隨后用乙腈洗滌，然后任選在20-60℃真空干燥。由Z-Phe(pF)-Phe-NH2計(jì)算的收率為93.8％，純度為99.6％。H-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2(方案2中化合物16)的制備5.5摩爾規(guī)模將前面步驟制備的Z-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2與DMF(2.9升/摩爾)混合，加入Pd/C催化劑(Pd實(shí)際含量為5％)(0.2-10％w/w/化合物3)(實(shí)際5％)，在25-35℃及大約3巴H2壓力下，將得到的混合物氫化0.5小時(shí)以上(實(shí)際3小時(shí))。然后過(guò)濾反應(yīng)混合物，在下一步驟前冷卻至約-15℃。純度為99.4％，原料轉(zhuǎn)化率大于99％。步驟3(ⅰ)Z-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2(方案2中化合物17)的制備5.5摩爾規(guī)模使用與前兩次偶合類似的方法偶合。將Z-Tyr(化合物x)(1.05當(dāng)量)溶于MeCN(1.9升/摩爾)中，冷卻，加入氯代甲酸異丁酯(0.9-1.2當(dāng)量)(實(shí)際1.05當(dāng)量)。以上述制備Z-Phe(pF)-Phe-NH2的類似的方式加入N-甲基嗎啉(0.9-2.0當(dāng)量)(實(shí)際1.3當(dāng)量)。在大約20分鐘(實(shí)際6分鐘)內(nèi)加入從前一步驟得到的H-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2溶液，維持溫度在-10℃左右(實(shí)際從-8℃到-9℃)。偶合步驟完成后，通過(guò)緩慢加入乙腈和水(3.4升/摩爾MeCN+0.9升/摩爾15％氨水)，放置5分鐘，加入晶種，放置4-24小時(shí)，然后分四份加入總量為13.9升/摩爾的水，在每次加入之間放置大約30分鐘或以上，使產(chǎn)物從反應(yīng)混合物中結(jié)晶。過(guò)濾或離心，用水洗，然后用MeCN洗滌，任選在20-60℃下真空干燥。由Z-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2的收率為87.7％，純度為95.1％。
經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)加熱反應(yīng)物到大約60℃并加入氨，使pH為9左右2小時(shí)可增加收率及純度。這可以將主要的雜質(zhì)Z-Tyr(O-(異丁氧基羰基))-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物(ⅱ)H-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2(方案2中化合物I)的制備5.4摩爾規(guī)模將Z-Tyr-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2與DMF(實(shí)際操作2.6升/摩爾)混合，加入5％的Pd/C催化劑(實(shí)際含量)(0.2-10％w/w/化合物3)(實(shí)際6.4％)，在20-40℃(實(shí)際操作20-25℃)和大約3巴H2壓力下，氫化得到的混合物0.5小時(shí)以上(實(shí)際操作1.8小時(shí))。過(guò)濾反應(yīng)混合物以除去Pd/C，然后通過(guò)加入EtOAc直到所有物質(zhì)結(jié)晶(一般為約14升/摩爾)為止，使產(chǎn)物結(jié)晶。經(jīng)過(guò)濾或離心分離固體，用EtOAc洗滌，然后在20-50℃下真空干燥。純度為96.7％。原料轉(zhuǎn)化率大于99％。H-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2鹽酸鹽的制備4.6摩爾規(guī)模將游離堿H-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2溶解于加有1當(dāng)量氯化氫的水和丙酮混合液中，過(guò)濾(在實(shí)際操作中146克/摩爾25％氯化氫/水，2升/丙酮/摩爾)。該鹽幾乎不溶于乙酮中，因此，過(guò)濾器用額外量的丙酮/水(95∶5)的混合物(0.5升/摩爾)洗滌一次。通過(guò)高速攪拌下，緩慢加入丙酮(3.4升/摩爾)，然后加入大約1％w/w的晶種，誘發(fā)結(jié)晶。30分鐘后，緩慢加入第一份MIBK(3升/摩爾)，緩慢攪拌下放置直到配料明顯變稠。再分三次加入MIBK(3升/摩爾)，間隔30-60分鐘，同時(shí)維持反應(yīng)器內(nèi)部溫度在大約20℃左右。然后，經(jīng)離心或過(guò)濾使固體分離，用MIBK洗滌，在20-50℃下真空干燥16小時(shí)以上或直到溶劑含量低于規(guī)定的技術(shù)規(guī)范的要求。收率為95.8％，純度為99.8％。后處理沒(méi)有達(dá)到藥用物質(zhì)技術(shù)要求的產(chǎn)物可通過(guò)上述結(jié)晶化合物I同樣方法進(jìn)行重結(jié)晶，但不加入氯化氫。H-Tyr-D-Ala-Phe(F)-Phe-NH2x HCI即化合物I的鹽酸鹽形式的NMR光譜確定36mg所述化合物在大約0.7ml DMSO-d6(99.95％原子-D)中的溶液，在27℃下，在Varian UNITY加400MHz儀上獲得NMR光譜。對(duì)于質(zhì)子光譜化學(xué)位移參考標(biāo)準(zhǔn)為2.49ppm的DMSO-d6的多峰的中間峰值。對(duì)于碳譜化學(xué)位移參考標(biāo)準(zhǔn)為39.5ppm的DMSO-d6的多峰的中間峰值。 在確定中使用的原子編號(hào)是任意的，參考上圖質(zhì)子光譜一維質(zhì)子光譜用于α位質(zhì)子(3.9-4.4ppm)、芐基-CH2(2.6-3.1ppm)、酰胺-NH和酚-OH(8.2-8.5ppm)的以組確定(groupwiseassignment)，也用于Ala-CH3(14-CH3)(0.74ppm)專門確定(specificassignment)。
二維DQFCOSY光譜用干對(duì)每個(gè)氨基酸殘基中自旋糸統(tǒng)(α位、β位和NH質(zhì)子)以組確定，每個(gè)芳環(huán)中的芳基質(zhì)子以組確定。所有Ala殘基中的質(zhì)子也可專門確定。碳譜一維碳譜用于α位碳、芐基-CH2、羰基和芳基碳的組確定，當(dāng)然用于C-14的專門確定。APT譜用于對(duì)每個(gè)碳的CH-峰裂數(shù)的確定。由于C-F偶合引起的譜線裂分用于氟代芳環(huán)中碳的專門確定。二維異型相關(guān)譜二維碳-質(zhì)子相關(guān)譜(HMQC)產(chǎn)生質(zhì)子化的碳與所有直接連接的質(zhì)子間的相關(guān)性。可以專門確定所有Ala殘基中的質(zhì)子化碳。
二維碳-質(zhì)子多鍵相關(guān)譜(HMBC)產(chǎn)生碳與相隔2-3個(gè)鍵的質(zhì)子間的相關(guān)性。這使得借助α氫和以及借助NH和鄰接氨基酸殘基的羰基(三鍵相關(guān))，以及借助NH和鄰接氨基酸殘基(二鍵相關(guān))確定氨基酸順序。類似，芐基-CH2和芳基碳之間以及芳基質(zhì)子和芐基-CH2之間的二-和三-鍵相關(guān)使得可以專門確定各芳香氨基酸的芳基質(zhì)子和碳。
用這種方法，可以以確定的方式專門確定所有四種氨基酸殘基中的所有(不能互換的)質(zhì)子和碳。表1質(zhì)子確定化學(xué)位移(ppm) 積分 峰裂數(shù) 確定9.4 1H s 300H8.481H d 9NH8.371H d 1NH8.351H d 8NH8.262H s7.531H s7.282H m 18H,19H7.262H m 21H,22H7.222H m 6H,7H7.181H m 24H7.121H s7.042H m 10H,11H6.982H m 26H,27H6.682H m 28H,29H4.431H m 1H4.391H m 8H4.261H m 9H3.961H m 20H3.39 HDO3.021H m 12Hb2.991H m 2Hb2.872H m 23Ha,23Hb2.851H m 12Ha2.671H m 2Ha0.743H d 14H表2碳確定化學(xué)位移(ppm) 峰裂數(shù)確定JC-F172.99 s 13171.08 s 5170.81 s 3167.39 s 17162.11 s 15 241Hz159.70 s 15 241Hz156.50 s 30137.98 s 16133.96 s 43.1Hz133.93 s 43.1Hz131.16 d 6.7 8.4Hz131.08 d 6.7 8.4Hz130.46 d 26.27129.26 d 18.19128.09 d 21.22126.30 d 24124.73 s 25115.16 d 28.29114.63 d 10.11 21.3Hz114.41 d 10.11 21.3Hz54.33 d 854.01 d 153.37 d 2047.96 d 937.57 t 1236.83 t 236.17 t 2318.45 q 1權(quán)利要求
1．制備式(Ⅰ)四肽H-Tyr-D-Ala-Phe(F)-Phe-NH2或其藥學(xué)上可接受的鹽的方法，包括以下步驟 (ⅰ)一個(gè)偶合步驟，其中在標(biāo)準(zhǔn)條件下，一種活化酪氨酸衍生物(Ⅹ)，在溶劑存在下，與三肽衍生物(9)反應(yīng)，提供保護(hù)的四肽衍生物(Ⅺ)，式(Ⅹ)、(9)和(Ⅺ)化合物的結(jié)構(gòu)式如下 其中A是一種氨基保護(hù)基團(tuán)，R是一種活化劑殘基，和R2是H或類似芐基的基團(tuán)； 其中R1是一種酯或酰胺殘基； 其中A是一種氨基保護(hù)基，和R1是一種酯或酰胺殘基；(ⅱ)一個(gè)脫保護(hù)步驟，其中被保護(hù)的四肽衍生物(Ⅻ)，在標(biāo)準(zhǔn)條件下，在溶劑存在下，通過(guò)催化氫化作用、堿或酸處理而脫保護(hù)，得到(Ⅰ)。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于包括如下另外的步驟(ⅰ)一個(gè)偶合步驟，其中在標(biāo)準(zhǔn)條件下，一種活化的丙氨酸衍生物(Ⅶ)與二肽衍生物(5)在溶劑的存在下反應(yīng)，得到被保護(hù)的三肽衍生物(Ⅷ)，式(Ⅶ)、(5)和(Ⅷ)化合物的結(jié)構(gòu)式如下 其中A是一種氨基保護(hù)基團(tuán)，和R是一種活化劑的殘基； 其中R1是酯或酰胺殘基； 其中A是一種氨基保護(hù)基團(tuán)，和R1是酯或酰胺殘基；(ⅱ)脫保護(hù)步驟，其中在前面步驟中制備的、被保護(hù)的三肽衍生物(Ⅷ)在標(biāo)準(zhǔn)的條件下，在溶劑存在下，通過(guò)催化氫化作用、堿或酸處理被脫保護(hù)，得到三肽衍生物(9) 其中R1是酯或酰胺殘基。
3．權(quán)利要求2的方法，其特征在于包括如下另外的步驟(ⅰ)一個(gè)偶合步驟，其中在標(biāo)準(zhǔn)的條件下，在溶劑的存在下，活化的p-氟苯丙氨酸衍生物(Ⅲ)與苯丙氨酸的氨基反應(yīng)，其中羧基作為酯或酰胺被保護(hù)，得到被保護(hù)的二肽衍生物(Ⅳ)，式(Ⅲ)和(Ⅳ)化合物的結(jié)構(gòu)式如下 其中A是氨基保護(hù)基團(tuán)，和R是活化劑殘基； 其中A是氨基保護(hù)基團(tuán)，和R1是酯或酰胺殘基；(ⅱ)一個(gè)脫保護(hù)步驟，其中在以上步驟中制備的被保護(hù)的二肽衍生物(Ⅳ)，在標(biāo)準(zhǔn)的條件下，在溶劑的存在下，通過(guò)催化氫化作用、堿或酸處理被脫保護(hù)，得到二肽衍生物(5) 其中R1是酯或酰胺殘基。
4．根據(jù)權(quán)利權(quán)求1-3的方法，其特征在于所述偶合步驟(ⅰ)之一后跟著任選的轉(zhuǎn)化步驟，如果所述氨基酸衍生物的羧基作為酯衍生物被保護(hù)，其中酯化合物在有機(jī)乙醇中與氨反應(yīng)進(jìn)行。
5．根據(jù)權(quán)利權(quán)求1-3的方法，其特征在于在至少一個(gè)偶合步驟中使用的活化氨基酸衍生物選自碳二亞胺、活化酯、疊氮化物或酸酐。
6．根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述活化劑是氯代甲酸異丁酯。
7．根據(jù)權(quán)利要求1-6中任何一項(xiàng)的方法，其特征在于用于至少一個(gè)偶合步驟中的溶劑是丙酮、乙腈、NMP、DMP或EtOAc。
8．根據(jù)權(quán)利要求1-3的方法，其中在偶合步驟中的溶劑是DMF。
9．根據(jù)權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)的方法，其特征在于所述脫保護(hù)步驟使用披鈀木炭進(jìn)行。
10．根據(jù)權(quán)利要求1-9中任何一項(xiàng)的方法，其特征在于至少一個(gè)反應(yīng)是在0℃到-20℃的溫度下進(jìn)行。
11．根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述溫度為從-5℃到-15℃。
12．根據(jù)權(quán)利要求1的方法制備的式Ⅰ肽
13．根據(jù)權(quán)利要求12的肽，為鹽酸鹽的形式。
14．式(9)的肽衍生物 其中R1是一種酯或酰胺殘基。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的和改進(jìn)的制備四肽H－Tyr－D－Ala－Phe(F)－Phe－NH
文檔編號(hào)C07K5/107GK1300293SQ9980607
公開日2001年6月20日 申請(qǐng)日期1999年3月16日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月16日
發(fā)明者H·弗蘭岑 申請(qǐng)人:阿斯特拉曾尼卡有限公司