專利名稱：特異性雙鏈rna結(jié)合蛋白嵌合體及其在病毒感染性疾病中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雙鏈RNA結(jié)合蛋白嵌合體在治療或預(yù)防病毒感染性疾病中的應(yīng)用，特別是涉及四 種由雙鏈RNA感受器序列NF卯、PACT、 ADAR1和PKR組成的蛋白嵌合體在治療和預(yù)防病毒感 染性疾病中的一種或多種應(yīng)用。
背景技術(shù)：
病毒感染是威脅人類生命健康的常見疾病。隨著分子病毒學(xué)的發(fā)展，雖然對(duì)病毒感染的機(jī)制有 了深入的認(rèn)識(shí)，但在臨床上由于病毒種類繁多和診斷技術(shù)的限制，只有少部分病毒感染能得到確診 和有針對(duì)性的治療。 一些嚴(yán)重的病毒感染，如艾滋、SARS、禽流感與Prion病毒感染(海綿樣腦 病)等，目前缺乏特異性的治療手段。因此，如能開發(fā)研究一種廣譜的抗病毒藥物，對(duì)拯救這部分 病人的生命，甚至如艾滋病等會(huì)很有價(jià)值。
雙鏈RNA (dsRNA)是所有病毒復(fù)制過(guò)程的一個(gè)顯著特征。 一般來(lái)說(shuō)，雙鏈RNA在哺乳動(dòng)物 細(xì)胞復(fù)制中不表達(dá)，只有在細(xì)胞感染病毒后才表達(dá)。所以，雙鏈RNA是病毒感染哺乳細(xì)胞的分子 標(biāo)記，它代表著病毒感染的一種早期危險(xiǎn)信號(hào)。研究證實(shí)，人類和所有脊椎動(dòng)物都存在針對(duì)雙鏈 RNA的先天免疫系統(tǒng)。 一般來(lái)說(shuō)，超過(guò)30個(gè)堿基對(duì)的雙鏈RNA就能有效的與其受體(雙鏈RNA 結(jié)合蛋白，DRBP)作用，弓l起細(xì)庫(kù)的抗病毒反應(yīng)。首先，雙鏈RNA與分布在被激活的雙鏈RNA 蛋白激酶(PKR)上的免疫反應(yīng)性干擾素(IFN)效應(yīng)蛋白作用，激活I(lǐng)FN介導(dǎo)的抗病毒通路，該 通路與PACT/RAX、 TRBP、 2'， 5'寡腺苷酸合成酶、雙鏈RNA特異的腺苷脫氨酶(ADAR)和核 閑于90 (NF卯)等DRBP的作用有關(guān)。通過(guò)這個(gè)機(jī)制雙鏈RNA能誘導(dǎo)快速抗病毒反應(yīng)，導(dǎo)致蛋 白翻譯抑制或凋亡。其次，細(xì)胞內(nèi)雙鏈RNA可與RNA解旋酶RIG-I和MDA-5結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄蛋 白如干擾素調(diào)節(jié)因子3 (IRF3)和NF-kB等，這種激活作用對(duì)于RNA病毒誘導(dǎo)的干擾素的產(chǎn)生非 常關(guān)鍵。第三，細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的雙鏈RNA可與Toll樣受體3(TLR3)結(jié)合，通過(guò)IRF3和NF-kB 激活I(lǐng)FN轉(zhuǎn)錄。總之，宿主細(xì)胞可通過(guò)一系列的DRBP在病毒感染早期偵測(cè)到細(xì)胞內(nèi)外雙鏈RNA 的存在，并通過(guò)不同的機(jī)制引起先天免疫應(yīng)答。
雖然在進(jìn)化過(guò)程中人類已形成了對(duì)細(xì)胞內(nèi)、外雙鏈RNA應(yīng)答的先天免疫系統(tǒng)，但病毒也進(jìn)化 出了一種回避雙鏈RNA誘導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)的途徑。為了存活病毒必須在被感染的宿主中成功復(fù)制。研究證實(shí)，病毒已經(jīng)進(jìn)化形成了多種通路，用來(lái)抑制IFN的合成、結(jié)合并使分泌的IFN分子失活、 阻斷IFN活化信號(hào)和破壞IFN誘導(dǎo)的抗病毒蛋白的作用。因?yàn)殡p鏈RNA是IFN反應(yīng)的一個(gè)早期信 號(hào)，很多病毒已經(jīng)進(jìn)化能夠編碼其自身的DRBP以競(jìng)爭(zhēng)宿主中的雙鏈RNA受體，如流感病毒的 NS1、呼吸道腸道病毒的RS3和痘苗病毒的E3L能有效的競(jìng)爭(zhēng)PKR或其它雙鏈RNA受體，阻斷 雙鏈RNA誘導(dǎo)的IFN產(chǎn)生的抗病毒反應(yīng)；腺病毒和EB病毒都可產(chǎn)生抑制性RNA分子，結(jié)合PKR 并使其失活。因此，無(wú)論宿主或病毒都可通過(guò)各種途徑對(duì)雙鏈RNA產(chǎn)生應(yīng)答，掲示了雙鏈RNA 介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)作用在病毒感染期間的重要性。由此推測(cè)雙鏈RNA介導(dǎo)的信號(hào)應(yīng)該是成功預(yù)防和 治療病毒感染的首要目標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種將蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，雙鏈RNA感受器和細(xì)胞凋亡信號(hào)通過(guò)DNA重組 的方法按以上順序連接起來(lái)，組成特異性雙鏈RNA結(jié)合蛋白嵌合體，并分別在原核和真核細(xì)胞中 表達(dá)的方法。
提供一種涉及四種不同雙鏈RNA感受器的特異性雙鏈RNA結(jié)合蛋白嵌合體。其中雙鏈RNA 感受器可以分別是NF90, PACT, ADAR1或PKR中的任一種，可以是其部分或全部雙鏈RNA結(jié)
合區(qū)域。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是所述蛋白嵌合體用于制備抗病毒的藥物。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是特異性雙鏈RNA蛋白嵌合體在治療和預(yù)防病毒感染性疾病中的應(yīng)用。 本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，特異性雙鏈RNA結(jié)合蛋白嵌合體，其特征在于將蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，
雙鏈RNA感受器和細(xì)胞凋亡信號(hào)通過(guò)DNA重組的方法按以上順序連接起來(lái),組成特異性雙鏈RNA
結(jié)合蛋白嵌合體，并分別在原核和真核細(xì)胞中表達(dá)。
所述涉及四種不同雙鏈RNA感受器的特異性雙鏈RNA結(jié)合蛋白嵌合體,其中雙鏈RNA感受
器可以分別是NF90， PACT, ADAR1或PKR中的任一種，可以是其部分或全部雙鏈RNA結(jié)合區(qū)域。
所述包含蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)、細(xì)胞凋亡信號(hào)和不同雙鏈RNA感受器序列，特異性雙鏈RNA結(jié)合 蛋白所組成的嵌合體，其cDNA和氨基酸序列如下 No.l dsCARE (PKR) cDNA序列
ATGTACGCCCGTGCCGCCGCCCGTCAGGCCCGTGCCAGTGGTCTCGAGATGGCTGGTGAT CTTTCAGCAGGTTTCTTCATGGAGGAACTTAATACATACCGTCAGAAGCAGGGAGTAGTA CTTAAATATCAAGAACTGCCTAATTCAGGACCTCCACATGATAGGAGGTTTACATTTCAAGTTATAATAGATGGAAGAGAATTTCCAGAAGGTGAAGGTAGATCAAAGAAGGAAGCAAAA
AATGCCGCAGCCAAATTAGCTGTTGAGATACTTAATAAGGAAAAGAAGGCAqiTAGTCCT
TTATTATTGACAACAACGAATTCTTCAGAAGGATTATCCATGGGGAATTACATAGGCCTTAT
CAATAGAATTGCCCAGAAGAAAAGACTAACTGTAAATTATGAACAGTGTGCATCGGGGGT
GCATGGGCCAGAAGGATTTCATTATAAATGCAAAATGGGACAGAAAGAATATAGTATTGGT
ACAGGTTCTACTAAACAGGAAGCAAAACAATTGGCCGCTAAACTTGCATATCTTCAGATAT
TATCAGAAGAAACCTCAGTGAAATCTGACTACCTGTCCTCTGGTTCCGGTACCATGGATGC
AAAAGCTCGAAATTGTTTGCTTCAACATAGAGAAGCTCTGGAAAAGGACATCAAGACAT
CCTACATCATGGATCACATGATTAGTGATGGATTTTTAACAATATCAGAAGAGGAAAAAGT
AAGAAATGAGCCCACTCAACAGCAAAGAGCAGCTATGCTGATTAAAATGATACTTAAAAA
AGATAATGATTCCTACGTATCATTCTACAATGCTCTACTACATGAAGGATATAAAGATCTTG
CTGCCCTTCTCCATGATGGCATTCCTGTTGTCTAA
蛋白序列
MYARAAARQARASGLEMAGDLSAGFFMEELNTYRQKQGVVLKYQELPNSGPPHDRRFTFQVIID
GREFPEGEGRSKKEAKNAAAKLAVEILNKEKKAVSPLLLTTTNSSEGLSMGNYIGLINRIAQKKRL
TVNYEQCASGVHGPEGFHYKCKMGQKEYSIGTGSTKQEAKQLAAKLAYLQILSEETSVKSDYLS
SGSGTMDAKARNCLLQHREALEKDKTSYIMDHMISDGFLTISEEEKVRNEPTQQQRAAMLIKMI
LKKDNDSYVSFYNALLHEGYKDLAALLHDGIPVV
No2. dsCARE (ADAR1) cDNA序列
atgtacgcccgtgccgccgcccgtcaggcccgtgccagtggtctcgagaagaaccccatcag
cgggctgttagaatatgcccagttcgctagtcaaacctgtgagttcaacatgatagagcagag
tggaccaccccatgaacctcgatttaaattccaggttgtcatcaatggccgagagtttccccq
agctgaagctggaagcaagaaagtggccaagcaggatgcagctatgaaagccatgacaattc
tgctagaggaagccaaagccaaggacagtggaaaatcagaagaatcatcccactattccaca
gagaaagaatcagagaagactgcagagtcccagacccccaccccttcagccacatccttctt
ttctgggaagagccccgtcaccacactgcttgagtgtatgcacaaattggggaactcctgcg
aattccgtctcctgtccaaagaaggccctgcccatgaacccaagttccaatactgtgttgcag
tgggagcccaaactttccccagtgtgagtgctcccagcaagaaagtggcaaagcagatggcc
gcagaggaagccatgaaggccctgcatggggaggcgaccaactccatggcttctgataacca
gcctgaaggtatgatctcagagtcacttgataacttggaatccatgatgcccaacaaggtcag
gaagattggcgagctcgtgagatacctgaacaccaaccctgtgggtggccttttgoagtacg
cccgctcccatggctttgctgctrt3aattcaagttggtcgaccagtccggacctcctcacgagc
ccaagttcgtttaccaagcaaaagttgggggtcgctggttcccagccgtctgcgcacacagc
aagaagcaaggcaagcaggaagcagcagatgcggctctccgtgtcttgattggggagaacg
gtaccatggatgcaaaagctcgaaattgtttgcttcaacatagagaagc:tctqgaaaaggaca
tcaagacatcctacatcatggatcacatgattagtgatggatmtaacaatatcagaagagga
aaaagtaagaaatgagcccactcaacagcaaagagcagctatgctgattaaaatgatacttaa
aaaagataatgattcctacgtatcattctacaatgctctactacatgaaggatataaagatcttg
ctgcccttctccatgatggcattcctgttgtctaa
蛋白序列 '
MYARAAARQARASGLEKNPISGLLEYAQFASQTCEFNMEQSGPPHEPRFKFQVVINGREFPPAEA GSKKVAKQDAAMKAMTILLEEAKAKDSGKS鵬SHYSTEKESEKTAESQTPTPSATSFFSGKSPVT
8TLLECMHKLGNSCEFRLLSKEGPAHEPKFpYCVAVGAQTFPSVSAPSKKVAKQMAAEEAMKALH
GEATNSMASDNQPEGMISESLDNLESMMPNKVRKIGELVRYLNTNPVGGLLEYARSHGFAAEFKL
VDQSGPPHEPKFVYQAKVGGRWFPAVCAHSKKQGKQEAADAALRVLIGENGTMDAKARNCLLQ
HREALEKDIKTSYIMDHMISDGFLTISEEEKVRNEPTQQQRAAMLIKMILKKDNDSYVSFYNALL
HEGYKDLAALLHDGIPW
No3. dsCARE(PACT) cDNA序列
ATGTACGCCCGTGCCGCCGCCCGTCAGGCCCGTGCCAGTGGTCTCGAGAGCGATTACGACATC
CCCACTACTGAGAATCTTTATTTTCAGGGATCCTCCCAGAGCAGGCACCGCGCCGAGGCCCCG
CCGCTGGAGCGCGAGGACAGTGGGACCTTCAGTTTGGGGAAGATGATAACAGCTAAGCCAGG
GAAAACACCGATTCAGGTATTACACGAATACGGCATGAAGACCAAGAACATCCCAGTTTATGA
ATGTGAAAGATCTGATGTGCAAATACACGTGCCCACTTTCACCTTCAGAGTAACCGTTGGTGA
CATAACCTGCACAGGTGAAGGTACAAGTAAGAAGCTGGCGAAACATAGAGCT|3CAGAGGCTG
CCATAAACATTTTGAAAGCCAATGCAAGTATTTGCTTTGCAGTTCCTGACCCCTTAATGCCTGA
CCCTTCCAAGCAACCAAAGAACCAGCTTAATCCTATTGGTTCATTACAGGAATTGGCTATTCAT
CATGGCTGGAGACTTCCTGAATATACCCTTTCCCAGGAGGGAGGACCTGCTCATAAGAGAGAA
TATACTACAATTTGCAGGCTAGAGTCATTTATGGAAACTGGAAAGGGGGCATCAAAAAAGCAA
GCCAAAAGGAATGCTGCTGAGAAATTTCTTGCCAAATTTAGTAATATTTCTCCAGAGAACCAC
ATTTCTTTAACAAATGTAGTAGGACATTCTTTAGGATGTACTTGGCATTCCTTGAGGAATTCTCC
TGGTGAAAAGATCAACTTACTGAAAAGAAGCCTCCTCAGTATTCCAAATACAGATTACATCCA
GCTGCTTAGTGAAATTGCCAAGGAACAAGGTnTAATATAACATATTTGGATATAGATGAACTG
AGCGCCAATGGACAATATCAATGTCTTGCTGAACTGTCCACCAGCCCCATCACAGTCTGTCAT
GGCTCCGGTATCTCCTGTGGCAATGCACAAAGTGATGCAGCTCACAATGCTTTGCAGTATTTAA
AGATAATAGCAGAAAGAAAGGGTACCATGGATGCAAAAGCTCGAAATTGTTTGCTTCAACATA
GAGAAGCTCTGGAAAAGGACATCAAGACATCCTACATCATGGATCACATGATTAGTGATGGAT
TTTTAACAATATCAGAAGAGGAAAAAGTAAGAAATGAGCCCACTCAACAGCAAAGAGCAGCT
ATGCTGATTAAAATGATACTTAAAAAAGATAATGATTCCTACGTATCATTCTACAATGCTCTACT
ACATGAAGGATATAAAGATCTTGCTGCCCTTCTCCATGATGGCATTCCTGTTGTCTAA
蛋白序列
MYARAAARQARASGLESDYDIPTTENLYFQGSSQSRHRAEAPPLEREDSGTFSLGKMnAKPGKT
PIQVLHEYGMKTKNIPVYECERSDVQIHVPTFTFRVTVGDITCTGEGTSKKLAKHRAAEAAINILK
ANAS1CFAVPDPLMPDPSKQPKNQLNPIGSLQELAIHHGWRLPEYTLSQEGGPAHKREYTTICRLES
FMETGKGASKKQAKRNAAEKFLAKFSNISPENHISLTNWGHSLGCTWHSLRNSPGEKINLLKRS
LLSlPNTOYIQLLSEIAKEQGFNITYLDEDELSANGQYQCLAELSTSPITVCHGSGISCGNAQSDAAri
NALQYLKHAERKGTMDAKARNCLLQHREALEKDKTSYIMDHMISDGFLTISEEEKVRNEPTQQ
QRAAMLIKMILKKDNDSYVSFYNALLHEGYKDLAALLHDGIPVV
No4. dsCARE(NF90) CDNA序列
ATGTACGCCCGTGCCGCCGCCCGTCAGGCCCGTGCCAGTGGTCTCGAGATGAATGCCCTGATG CGGTTGAACCAGCTGAAGCCAGGGCTGCAGTACAAGCTGGTGTCCCAGACTGGGCCCGTCCA TGCCCCCATCTTTACCATGTCTGTGGAGGTTGATGGCAATTCATTCGAGGCCTCTGGGCCCTCC AAAAAGACGGCCAAGCTGCACGTGGCCGTTAAGGTGTTACAGGACATGGGCTTGCCGACGGG<formula>formula see original document page 10</formula>
蛋白序列
myaraaarqarasglemnalmrlnqlkpglqyklvsqtgpvhapiftmsvevdgnsfeasgps
kktaklhvavkvlqdmglptgaegrdsskgedsaeeteakpawapapweavstpsaafpsdat
aenvkqqgpiltkhgkSipvmelnekrrglkyelisetggshdkrfvmevevdgqkfqgagsnk
kvgtmdakarncllqhrealekdiktsyimdhmisdgfltiseeekvrneptqqqraamlikmil
kkdndsyvsfynallhegykdlaallhdgipvv
本發(fā)明的目的可以按照如下的方法實(shí)現(xiàn)，所述蛋白嵌合體的制備方法，將蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，雙鏈 RNA感受器和細(xì)胞凋亡信號(hào)通aDNA重組的方法按以上順序連接起來(lái)，組成特異性雙鏈RNA結(jié)合 蛋白嵌合體的重組DNA，克隆在合適的真核或原核表達(dá)載體上，例如，pRSETB表達(dá)載體，克隆步 驟為先把pRSETB和結(jié)合蛋白嵌合體的重組DNA用相同的內(nèi)切酶酶切，再用T4DNA連接酶把它 們按照不同的比例進(jìn)行連接，最后用酶切和PCR的方法進(jìn)行鑒定。
上述表達(dá)載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，合適的載體實(shí)例，見例如Donnelly et al, Ann.Rev. Immunol.(1997)15:617所述，包括但非限于pcDNA3和pcCMV。
所述雙鏈RNA結(jié)合蛋白嵌合體，NF90, PACT, ADAR1和PKR的序列可以得自任何哺乳動(dòng) 物和脊椎動(dòng)物。
所述將特異性雙鏈RNA結(jié)合蛋白嵌合體的重組DNA轉(zhuǎn)化各種原核和真核細(xì)胞表達(dá)體系進(jìn)行 表達(dá)，并將所表達(dá)蛋白通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法制備成針劑、片劑、口服劑、膠囊或噴劑等的抗病毒 的藥物。
所述特異性雙鏈RNA蛋白嵌合體用于在病毒感染性疾病中的治療和預(yù)防，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞水 平上作為蛋白藥物治療工具。
本發(fā)明的雙鏈RNA結(jié)合蛋白嵌合體及其藥物可用于增加人或動(dòng)物免疫系統(tǒng)對(duì)抗病毒的能力。 特別的，其可用于給予人或動(dòng)物對(duì)象。所述雙鏈RNA結(jié)合蛋白嵌合體及其藥物優(yōu)選非腸iH&予， 例如通過(guò)靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)或損害內(nèi)(intralesional)途徑注射或灌注、或噴灑或軟裔制劑外 用。所述藥物可以通過(guò)本領(lǐng)域己知的常規(guī)技術(shù)與藥物可接受的介質(zhì)或者輸送載體組合。制備可非腸 道給予的組合物的方法為本領(lǐng)域熟知，并在各個(gè)資料中有更詳細(xì)的描述，包括例如Remington'sPharmaceutical Sciences, Ed.AR Gennaro， 20* edition, 2000， Williams & Wilkins， PA, USA.。所述藥物 優(yōu)選以治療有效量給予，即增加人或動(dòng)物免疫系統(tǒng)對(duì)抗病毒的能力的劑量。
雙鏈RNA結(jié)合蛋白嵌合體的重組DNA可以是適于蛋白質(zhì)表達(dá)的任何DNA,例如cDNA或 dsDNA,但非基因組DNA或ssDNA。
本發(fā)明所產(chǎn)生的蛋白嵌合體具有抗病毒感染性疾病作用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是其使得可以制備廣 譜抗病毒藥物。而我們選擇的實(shí)例是病毒性腦炎。目前該疾病主要通過(guò)藥物來(lái)控制的，但效果非常 差，死亡率高達(dá)95%。
本發(fā)明還可以治療腸道病毒、呼吸道病毒、單純皰疹病毒、EB病毒感染等和不太常見的麻疹、 艾滋、SARS、禽流感與Prion等病毒導(dǎo)致的病毒感染性疾病。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，包含 一種蛋白嵌合體組成的單獨(dú)藥物，也包含兩到四種蛋白嵌合體相互搭配的組合藥物。
另一方面，本發(fā)明提供了通過(guò)治療性藥物的功能而預(yù)防病毒感染的方法。在感染和疾病之間 有一定的時(shí)間段。在這種情況中，所述藥物作為藥理學(xué)免疫產(chǎn)物起作用，其通過(guò)在宿主中激發(fā)抵御 所述感染的病理學(xué)作用的免疫應(yīng)答治療疾病。治療性藥物和預(yù)防性藥物的不同之處在于治療性藥物 在已經(jīng)感染或患病的患者體內(nèi)產(chǎn)生保護(hù)作用。


圖1是由雙鏈RNA、 ADAK1、 PKR和NF卯形成的蛋白嵌合體。 圖2是證明四種不同蛋白嵌合體具有很好的活性和純度。
(a) :四種不同蛋白嵌合體的結(jié)構(gòu)。
(b) :四種不同蛋白嵌合體的純度。用蛋白電泳的試驗(yàn)方法證實(shí)這四種不同蛋白嵌合體具有 很好的純度。
(c) :四種不同蛋白嵌合體的活性。用實(shí)例3的試驗(yàn)方法證實(shí)這四種不同蛋白嵌合體具有很 好的活性。
圖3是在用不同劑量的純化的包含序列PKR蛋白嵌合體dsCARE(PKR)治療腺病毒感染的 293T細(xì)胞的抗病毒作用示意圖。
(a)、 (b)、 (c):分別將0,0.2,0.4， 1.0， 2.0,4.0，或8 ug/ml的提純蛋白和MOI的GFP+ 陽(yáng)性的腺病毒同時(shí)處理細(xì)胞，在第7天，對(duì)照組與各治療組的抗病毒結(jié)果顯著不同(P<0.001)。
(d) 、 (e):分別將2 ug/ml的dsCARE或100 ug/ml的BSA加入293T細(xì)胞中培養(yǎng)7天后， 再加入1(^M01的GFP+陽(yáng)性的腺病毒，在第10天，對(duì)照組和治療組的預(yù)防性抗病毒結(jié)果顯著不 同(PO.001),
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1:雙鏈RNA-ADAR1-PKR-NF90復(fù)合物的抗病毒作用的研究 (一)ADAR1與雙鏈RNA-PKR信號(hào)結(jié)合時(shí)的作用 1 、 ADAR1編輯雙鏈RNA與雙鏈RNA-PKR信號(hào)調(diào)節(jié)之間的關(guān)系
1) ADARl+/+、 ADARl+Z-和ADARW-神經(jīng)元細(xì)胞的培養(yǎng)孕11-12 dADARl+/+、 ADAR1+/-和ADARIV-小鼠，常規(guī)麻醉，無(wú)菌狀態(tài)下取出胎鼠。小心剝離小腦皮層，去除腦膜及血管組織， 切成lmm大小的組織塊后加入0.125%胰蛋白酶37"消化30 min。加入含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液終止消化10min，用移液管吹打成細(xì)胞懸液，接種至多聚賴氨酸包被的細(xì)胞培養(yǎng)板。離體培 養(yǎng)7d后進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。
2) 構(gòu)建pENTR/U6(MS2-雙鏈RNA)表達(dá)載體先PCR擴(kuò)增出小鼠Alu樣基因，克隆到pCRII TA克隆載體中，從兩個(gè)方向鑒定帶有插入片段的克隆，從而使正義鏈和反義鏈RNA都進(jìn)行對(duì)照； 再用EcoRI酶切這個(gè)插入片斷進(jìn)行鑒定,然后片段和載體比為10:1再次把它連接到相同的載體中， 從而產(chǎn)生一個(gè)反復(fù)制基因；接著用限制性內(nèi)切酶鑒定反復(fù)制基因，通過(guò)測(cè)序證實(shí)；最后用T7和SP6 引物擴(kuò)增正義鏈、反義鏈和反復(fù)制基因，再克隆到pENTR/U6載體中。同時(shí)把MS2RNA序列增加 到SP6引物的后面，因此每個(gè)插入片段的結(jié)尾都帶有MS2的結(jié)合位點(diǎn)，把T7和SP6序列分別放 在.5'和3'末端將有利于轉(zhuǎn)錄物的檢測(cè)。在細(xì)胞核中的插入片段將受到U6RNA啟動(dòng)因子的控制， 同時(shí)也被RNA多聚酶ni轉(zhuǎn)錄。載體構(gòu)建完成后，轉(zhuǎn)染>^^111+/+和>^ ^1-/-神經(jīng)元。
3 )轉(zhuǎn)染神經(jīng)元細(xì)胞用Lipofectamine 2000將6嗎的pENTR/U6 (MS2-雙鏈RNA)載體導(dǎo)入準(zhǔn) 備好的ADARI+/+、 ADARI+Z-和ADARl-Z-神經(jīng)元細(xì)胞中。
4) Western blotting檢測(cè)PKR和elF2a磷酸化轉(zhuǎn)染48小時(shí)后裂解細(xì)胞，將裂解上清液加入樣 品緩沖液，95"C加熱3min,電泳，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，用特異性抗體檢測(cè)，定量分析。
5) RT-PCR檢測(cè)RNA編輯的發(fā)生轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，提取培養(yǎng)細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA,. 再進(jìn)行序列測(cè)定，最后觀察cDNA中A到G的突變。
2、應(yīng)激誘導(dǎo)的雙鏈RNA產(chǎn)生與ADAR1和結(jié)合它的PKR抑制作用相關(guān)
1) 建立神經(jīng)元應(yīng)激模型把ADARW-和ADAR1+/+神經(jīng)元細(xì)胞種植到6>cm的培養(yǎng)皿中用 10%FCS的普通培養(yǎng)基培養(yǎng)7天；然后用不含Ca2+ZMg2+的PBS洗細(xì)胞，最后用無(wú)血清培養(yǎng)基0、 1、 2、 4、 8和12小時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)。
2) 細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的雙鏈RNA定量第一步，模型細(xì)胞先用PBS洗兩次，再用Buffer A (10mM HEPES pH 7.9, lOmMNaCI, 1.5mMMgC12, 0.5mMDTT, 5 mM p-硫氣基乙醇)洗一次；接 著用2倍體積含有l(wèi)外NP40的2x體積的BufferA溶解細(xì)胞，同時(shí)用玻璃杵進(jìn)行敲擊；冰浴20分 鐘；離心后浮在上層的就是細(xì)胞質(zhì)部分，收集上清，用Trizo1法提取細(xì)胞質(zhì)RNA。下層的細(xì)胞核 用Buffer C (20 mM HEPES pH7.9, lOmMNaC, 1,5mMMgC12， 0,2mMEDTA, 25%甘油，0.5 mM DTT， 5mMp-硫氫基乙醇，lmMPMSF, ly。NP-40)洗一次，再用Trizol法提取細(xì)胞核RNA。第 二步，將上步得到的總RNA取大約50 ug，放到400 ul含有0.1單位RNaseI和DnaseIAil的消化 buffer中，37 °C孵化2小時(shí)。被消化的RNA混合液通過(guò)瓊脂糖G-50除去鹽分，再通過(guò)核苷酸去 除劑去除小的寡核糖核苷酸(<20 bps)。最后用UV光譜測(cè)定法對(duì)Rnase耐受的RNA定量。
3) 免疫共沉淀檢測(cè)ADAR1-PKR-NF90復(fù)合物與雙鏈RNA的作用在上步得到的細(xì)胞質(zhì)部分 中加入30嗎的適當(dāng)抗體，4t搖動(dòng)免疫沉淀物lh ;加入0.9 ml的蛋白質(zhì)A-S印harose懸液，4*C 搖動(dòng)免疫沉淀物30 min;接著用含卯O mmol/LNaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，重復(fù)洗 5次，最后一次用NETN洗，吸出混合物的液體部分；然后加入8(KHd的lxSDS膠加樣緩沖液到球 珠中，煮沸4min,將樣品加入到大孔的不連續(xù)SDS-PAGE梯度膠中，在10 mA的恒定電流下電泳 過(guò)夜；再通過(guò)考馬斯藍(lán)染色觀察蛋白質(zhì)泳帶，從膠上切下目標(biāo)帶，將其放到微量離心管中，用lml 5()0/o乙腈洗兩次，每次3min;最后用胰蛋白酶消化膠中的蛋白質(zhì)，再將肽電洗脫，通過(guò)窄孔髙效 液相色譜分離肽，將收集的肽在ABI477A或494A機(jī)器上進(jìn)行自動(dòng)Edman降解測(cè)序。
4) TLC檢測(cè)RNA編輯先用乙醇沉淀10嗎的細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)RNA:接著用含有5個(gè)單位 RNaseT2的10jJ RN助e T2 buffer重懸后37°C孵化6小時(shí)；再通過(guò)加入3ji1的伊ma-32P-ATP (3000 Ci/mmol)、 1.5jil的T4酶buffer和1 jil的T4多核苷酸激酶來(lái)標(biāo)記3'NTP:然后加入2 的細(xì)胞核 PI buffer (25 mM醋酸鈉，pH 5.3,含有5個(gè)單位的細(xì)胞核Pl)混合后37aC消化2小時(shí)；再通過(guò) TLC在纖維素PEl培養(yǎng)板上分析標(biāo)記有32p的5'-IMP和5，-AMP。這個(gè)顯影劑由飽和的 (NH4)S04、 lOOmM醋酸鈉(pH 6.0)和丙醇(79:19:2)組成。放射自顯影后，可以鑒別出5，-IMP， 用20jil水重懸纖維素再用TLC分析5^il的上清液再次放射自顯影后，利用液體閃爍計(jì)數(shù)器 通過(guò)被切斷TLC點(diǎn)的放射性強(qiáng)度的測(cè)定來(lái)定量每一個(gè)點(diǎn)的強(qiáng)度.
3、 ADAR1與PKR的結(jié)合在雙鏈RNA誘導(dǎo)激活方面的相互作用
1) ADARl+/+、 ADAR1+A和ADARW-神經(jīng)元細(xì)胞的培養(yǎng)方法同前。
2) 轉(zhuǎn)染神經(jīng)元細(xì)胞用pENTR/U6 (MS2-雙鏈RNA)載體轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備好的ADARl+/+、 ADAR1+A 和ADAR卜A神經(jīng)元細(xì)胞中。
3) 免疫共沉淀檢測(cè)PKR或NF卯方法同前。4) 構(gòu)建MS2蛋白的表達(dá)載體通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增細(xì)菌MS2外殼蛋白的cDNA，在CMV啟動(dòng) 因子的控制下把這個(gè)cDNA克隆到pLenti6/V5載體中，從而構(gòu)建出MS2蛋白的表達(dá)載體。
5) pENTR/U6(MS2-雙鏈RNA)和plenty/V5 (MS2蛋白)共轉(zhuǎn)染神經(jīng)元細(xì)胞方法同前。
6) 免疫共沉淀的方法檢測(cè)MS2:方法同前。
7) Western blotting檢測(cè)ADAR1、 PKR、 NF90和pPKR的表達(dá)對(duì)2)和5)的細(xì)胞收集蛋白
進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)。
(二) 研究NF90在結(jié)合ADAR1調(diào)節(jié)的PKR激活中的作用
1、 NF卯在PKR介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)中的作用
1) NF90+/+、 NF9047-和NF90-Z-神經(jīng)元細(xì)胞的培養(yǎng)從孕11-12 dNF90+/+、 NF9(HV-和NFM-/-小鼠中取原代神經(jīng)元細(xì)胞，具體同前。
2) Western blotting檢測(cè)PKR、 elF2a、 MAPKp38和JNK:方法同前。
2、 NF90與ADAR1結(jié)合介導(dǎo)PKR抑制
1) RT-PCR檢測(cè)MS2-雙鏈RNA編輯的發(fā)生方法同前。
2) TLC檢測(cè)雙鏈RNA編輯方法同前。
3) pENTR/U6(MS2-雙鏈RNA僻染神經(jīng)元細(xì)胞方法同前。
4) 免疫共沉淀檢測(cè)PKR和ADAR1:方法同前。
5) Western blotting檢測(cè)PKR、 ADAR1和磷酸化PKR:方法同前。
3、 NF90促進(jìn)雙鏈RNA輸出和它在ADAR1結(jié)合雙鏈RNA-PKR信號(hào)中的作用
1) 構(gòu)建GFP-MS2的表達(dá)載體先從pEGFP載體中擴(kuò)增GFP的cDNA,在CMV啟動(dòng)因子的 控制下把MS2和GFP的cDNA連接到pLenti6/V5載體中。
2) 轉(zhuǎn)染神經(jīng)元細(xì)胞用MS2-雙鏈RNA和\182"0^ 的表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備好的自0-/-、 NF卯+AK ADAR1-/-或>^3八111+/+神經(jīng)元細(xì)胞。
3) 實(shí)時(shí)成像:轉(zhuǎn)染4小時(shí)后，在熒光顯微鏡下使GFP的分布型式顯影，每小時(shí)一次，直到12 小時(shí)；然后每4小時(shí)一次，直到48天，
(三) 細(xì)胞的雙鏈RNA介導(dǎo)ADAR1調(diào)節(jié)PKR激活
1 、內(nèi)源性雙鏈RNA與ADAR1-PKR-NF卯復(fù)合物(見圖1所示)有關(guān)。 1 )ADAR1 p 150或ADAR1 p抑表達(dá)載體轉(zhuǎn)染神經(jīng)元細(xì)胞帶雙標(biāo)的ADAR1 p 150或ADAR1 p80表達(dá)載體轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備好的神經(jīng)元細(xì)胞。
142) ADAR1復(fù)合物免疫共沉淀方法同前。
3) 提純雙鏈RNA:把上一部得到的合成物在蛋白酶K混合物(5ug/ral ， 500mMNaC1， 10mM TrisHClpH7， 0.2 WSDS)中重懸并在55°C消化2小時(shí)，從而去除蛋白部分。再次離心柱子，用石 碳酸提取上層懸液，雙鏈RNA部分用2.5體積的乙醇沉淀。得到得沉淀物包含有相關(guān)雙鏈RNA。
4) 雙鏈RNA的微點(diǎn)陣篩選用Cy3熒光染料標(biāo)記來(lái)自于被ADAR1 p150轉(zhuǎn)染細(xì)胞的實(shí)驗(yàn) RNA ;用Cy5熒光染料標(biāo)記來(lái)自于被ADAR1 p80轉(zhuǎn)染細(xì)胞的對(duì)照RNA。用隨機(jī)引物通過(guò)反轉(zhuǎn)錄 來(lái)完成標(biāo)記。觀察特殊的雙鏈RNA標(biāo)記用隨機(jī)引物與雙鏈RNA部分混合，在94。C加熱2分鐘 后快速放到冰上，從而使變性RNA在一個(gè)較短的隨機(jī)引物時(shí)有一個(gè)較好得退火。通過(guò)CHROMA SPIN-200 column純化標(biāo)記的cDNA， 68。C變性10分鐘，再用中和液68 。C中和20分鐘。在Yale Keck Microarray FaciHties中使標(biāo)記的cDNA雜交，然后掃描并獲得陽(yáng)性基因的強(qiáng)度數(shù)據(jù)。來(lái)自神 經(jīng)元細(xì)胞的探針將與人的15K cDNA微陣點(diǎn)進(jìn)行雜交。用Blast和RT-PCR分析陽(yáng)性基因。通過(guò) RT-PCR進(jìn)一步鑒定不同基因的表達(dá)特征。
5) 雙鏈RNA的直接克隆用T4多核苷酸激酶標(biāo)記雙鏈RNA部分，用8-15% PAGE監(jiān)測(cè)數(shù) 跫。使用T4 RNA把由T7啟動(dòng)因子序列的反義鏈和一個(gè)poly(dA)尾p-T7>(A)17-NH2組成的寡聚 核苷酸與雙鏈RNA連接。在連接時(shí)，3'末端有NH2的將不會(huì)與寡聚核苷酸連接。用PCR克隆片 段純化試劑盒去除游離的寡聚核苷酸。用oligopoly(dT)18引物與cDNA結(jié)合。純化的cDNA加到 含有50 mM TriS"HCl pH 7.5、 100 mM NaCl、 10 mM MgC12和1 mM DTT的緩沖液中加熱到80。C 退火5分鐘。再在65°C孵化16小時(shí)，最后30°C冷卻超過(guò)3小時(shí)。PCR擴(kuò)增前用幻e加w是兩 端線性化。為了擴(kuò)增不同大小的cDNA可以使用T7引物。再把cDNA克隆到pENTR/U6載體中， 并在測(cè)序后與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)。
6) RT-PCR和測(cè)序來(lái)確定序列中A到I的突變。 2、被鑒定轉(zhuǎn)錄物在雙鏈RNA-PKR信號(hào)中的特征
1) MFOLD軟件分析被鑒定轉(zhuǎn)錄物的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
2) 被鑒定轉(zhuǎn)錄物的pENTR/U6載體轉(zhuǎn)染神經(jīng)元細(xì)胞方法同前。
3) Northern blotting檢測(cè)被鑒定轉(zhuǎn)錄物用Trizol提取總RNA。為了分析雙鏈RNA部分，取 50 ug的RNA與乙醉沉淀,然后用400 ul含有0.1單位/ul RNase I和DNase I (Sigma)的消化buffer 重懸，37°C2小時(shí)；再用瓊脂糖G-50除去鹽分，用核苷酸去除試劑盒去除小的寡核糖核苷酸。
4) RNase VI消化:用含有0.4單位/jil RNase VI的RNase VI buffer重懸Rnase耐受的RNA， 37°C 、 25分鐘，在通過(guò)離心使其快速破裂。
5) 熒光顯微鏡觀察熒光體PKR:在2)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中通過(guò)熒光顯微鏡觀察熒光體PKR。3、 被鑒定轉(zhuǎn)錄物補(bǔ)充形成ADAR1-PKR-NF卯復(fù)合物
1) 被鑒定轉(zhuǎn)錄物的pENTR/U6載體轉(zhuǎn)染神經(jīng)元細(xì)胞方法同前。
2) PKR免疫共沉淀得到的ADAR卜PKR-NF卯復(fù)合物重懸在200 ul包含10ug/ml蛋白酶 K的蛋白酶K緩沖液中50。C， l小時(shí)；收集上清液石炭酸抽提后與乙醇沉淀。
3) RT-PCR檢測(cè)被鑒定轉(zhuǎn)錄物對(duì)上步得到的沉淀物進(jìn)行被鑒定轉(zhuǎn)錄物的RT-PCR。
4、 被鑒定轉(zhuǎn)錄物在應(yīng)激誘導(dǎo)雙鏈RNA-PKR信號(hào)中的作用
1) 神經(jīng)元應(yīng)激模型的建立方法同前。
2) Northern blotting檢測(cè)被鑒定轉(zhuǎn)錄物方法同前。
3) Western blotting檢測(cè)熒光體PKR^n熒光體elF2a:方法同前。 以上試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了雙鏈RNA-ADAR1-PKR-NF90復(fù)合物具有明顯的抗病毒作用。
實(shí)施例2:構(gòu)建包含有不同雙鏈RNA感受器序列、細(xì)胞調(diào)亡信號(hào)和蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域的蛋白嵌合體的 表達(dá)載體并抽提蛋白
1、 四種不同蛋白嵌合體的構(gòu)建四種不同蛋白嵌合體的雙鏈RNA感受器序列分別為NF90、 PACT、 ADAR1和PKR (見圖2所示)。具體連接方法如下先通過(guò)RT-PCR的方法從人類cDNA 基因庫(kù)中擴(kuò)增出NF90、 PACT、 ADAR1和PKR的cDNA，再經(jīng)過(guò)PCR在這四種不同的雙鏈RNA 感受器序列上增加X(jué)hol和Kpnl的酶切位點(diǎn)；同時(shí)在細(xì)胞調(diào)亡信號(hào)上也加入Xhol和Kpnl的酶切 位點(diǎn)；兩種寡核苷酸agctlggitQQtacgcccgtgccgocgcccgtcaggcccgtgccagtggt和ccatctcaaaa ccactggcacgggcctg通過(guò)PCR擴(kuò)增后用BamHI和Xhol進(jìn)行雙酶切得到蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域的cDNA編 碼序列i用atatggi^scatggtctagccagcttgggtotccct和aatca加ctt咖3c咖33cte3totcag3a為弓| 物對(duì)pcDNA3載體(lnvitrogen, CA)進(jìn)行擴(kuò)增得到一個(gè)BamHI-Hindlll序列在pcDNA3的CMV 啟動(dòng)子的作用下通過(guò)BamHI-Xhol-Kpnl-Hindlll連接上面得到的cDNA:最后通過(guò)酶切和測(cè)序進(jìn) 行鑒定。
2、 真核表達(dá)方法按以上方法將四種不同蛋白嵌合體的基因分別連接到表達(dá)載體pcDNA3.1 中。通過(guò)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞(ATCC, USA)、考馬斯亮藍(lán)染色和Western blotting的方法檢測(cè) 四種不同蛋白嵌合體的表達(dá)。
3、 原核表達(dá)按以上方法將四種不同蛋白嵌合體的基因分別與pRSET(lnvitrogen, CA)載體 連接，16。C連接過(guò)夜后，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，并挑克隆搖菌，提質(zhì)粒；PCR及測(cè)序鑒定， 在表達(dá)蛋白嵌合體之前，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞37C搖菌過(guò)夜后，按Qiagen (Qiagen, USA)提供的Ni-NTA蛋白純化技術(shù)從細(xì)菌裂解業(yè)中抽提蛋白。蛋白的純度見圖2所示。實(shí)施例3:四種不同蛋白嵌合體對(duì)腺病毒感染HEK293細(xì)胞的抑制作用
1、 腺病毒感染HEK293或293T細(xì)胞在六孔板上生長(zhǎng)8小時(shí)后，用帶有熒光標(biāo)記的重組腺 病毒進(jìn)行感染30-60min，用溫的PBS洗脫兩遍后繼續(xù)用含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng) 12h。熒光顯微鏡觀察病毒感染后的細(xì)胞，通過(guò)病毒梯度稀釋的方法觀察感染病毒的293T的滴 度，感染24h后熒光顯微鏡下數(shù)GFP陽(yáng)性細(xì)胞(見圖3所示)。
2、 體外抗病毒分析上述四種不同的蛋白嵌合體純化出的抗病毒蛋白分別在病毒感染前， 感染時(shí)或感染后加入到培養(yǎng)液中，分別于感染2天、 一周和10天后在熒光顯微鏡下跟蹤觀察病 毒的感染情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療組的細(xì)胞在病毒感染10天后仍是正常的(見圖3所示)。
實(shí)施例4:蛋白嵌合體對(duì)腺病毒感染神經(jīng)元細(xì)胞的抑制作用
1、 胎鼠腦皮層神經(jīng)元體外培養(yǎng)孕11-12 d小鼠，常規(guī)麻醉，無(wú)菌狀態(tài)下取出胎鼠。小心 剝離小腦皮層，去除腦膜及血管組織，切成lmm大小的組織塊后加入0.125。/。胰蛋白酶37TC消化 30min。加入含10。/。胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化10min，用移液管吹打成細(xì)胞懸液，接 種至多聚賴氨酸包被的細(xì)胞培養(yǎng)板。離體培養(yǎng)7d后進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。
2、 表達(dá)載體轉(zhuǎn)染神經(jīng)元細(xì)胞利用Lipofectamine2000將6嗎的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到1準(zhǔn)備好的細(xì) 胞中。
3、 腺病毒感染這些細(xì)胞用PBS把密度為1 x 109的腺病毒液取10 jxl分別稀釋到密度為 lxio4， lxl05, lxl()S的液體，取lml加入轉(zhuǎn)染后的神經(jīng)元中，再取lml的PBS作為陰性對(duì) 照，把病毒液加入到未轉(zhuǎn)染的神經(jīng)元中做陽(yáng)性對(duì)照。
4、 熒光顯微鏡觀察感染情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。
結(jié)果表明，與未轉(zhuǎn)染雙鏈RNA復(fù)合體質(zhì)粒的神經(jīng)元相比，在所有情況中給予每種雙鏈RNA 復(fù)合體質(zhì)粒的神經(jīng)元，在不同濃度腺病毒感染后，神經(jīng)元存活率增強(qiáng)、平均存活時(shí)間增長(zhǎng)、細(xì)胞 流式儀檢測(cè)分析死亡細(xì)胞減少，凋亡細(xì)胞增多(見圖3所示)。表現(xiàn)出明顯的抗病毒作用，特別 的包含PKR序列表達(dá)載體的質(zhì)?？共《咀饔米蠲黠@。
實(shí)施例5:觀察這些蛋白對(duì)病毒性感染動(dòng)物模型的治療效果
1、 這些蛋白皮下注射的毒性試驗(yàn)不同劑量蛋白皮下注射觀察皮下結(jié)節(jié)，小鼠飲食及體重 變化情況。
2、 腺病毒接種鼠腦的半數(shù)致死量的測(cè)定用Hanks緩沖液將病毒懸液(TCID5(M05)稀釋為10-5-10-1五個(gè)稀釋度；取3周齡小鼠40只，隨機(jī)分成5組，每稀釋度一組，每組8只用lml注射器于 右側(cè)鼠腦接種O. 05ml/只，左側(cè)不接種；觀察10d,每天觀察記錄小鼠的發(fā)病與死亡情況。
3、 這些蛋白對(duì)抗腺病毒腦炎小鼠半數(shù)有效量的測(cè)定取3周齡小鼠250只，隨機(jī)分成25組， 每組10只，以103TCID50病毒懸液接種0.05ml/只；從第2天開始，以6種不同濃度的各種蛋 白皮下注射治療，生理鹽水0.1/(kg'd);各種蛋白0.88、 1.67、 3.3、 4.9、 6.6、 13.2g/(kg-d)。 觀察10d,每日記錄小鼠發(fā)病與死亡情況。
4、 通過(guò)局部接種的方法把腺病毒注入到小鼠腦內(nèi)建立病毒性感染的動(dòng)物模型lml注射器 每只小鼠分別注射O.lml病毒懸液注射到右側(cè)腦室，觀察記錄10天小鼠的死亡和發(fā)病情況。
5、 通過(guò)蛛網(wǎng)膜下腔注射、靜脈注射和鼻內(nèi)給藥三種途徑把這些蛋白注入到小鼠體內(nèi)觀察蛋 白的治療效果小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、蛛網(wǎng)膜下腔注射組、靜脈注射組、募內(nèi)給藥組和空白對(duì) 照組；各蛋白治療l、 3、 5、 7、 14天后分別于治療后1、 3、 5、 7、 14天，每組處死6只，于無(wú) 菌條件下取出腦組織，每次所取的標(biāo)本一部分放入10%福爾馬林溶液中，留做病理組織切片用 —部分用來(lái)體外培養(yǎng)神經(jīng)元，熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析其余放入-70"C超低溫冰 箱保存?zhèn)溆酶鲗?shí)驗(yàn)組留20只觀察存活率和平均存活時(shí)間?？瞻叻y(cè)病毒滴度將標(biāo)本置入勻 漿器中反復(fù)研磨，低速離心后，將上清液用Hanks緩沖液連續(xù)作10倍稀釋，接種長(zhǎng)成單層的24 孔板，加入瓊脂培養(yǎng)基，2天后，加入含中性紅的瓊脂，記數(shù)空斑.
結(jié)果如下，存活率和平均存活時(shí)間上治療組明顯比假手術(shù)組和空白對(duì)照組增強(qiáng)(P<0.01), 而蛛網(wǎng)膜下腔注射組與靜脈注射組和鼻內(nèi)給藥組相比較作用更明顯(P<0.05);細(xì)胞流式儀檢測(cè)、 免疫組化半定量、病毒滴度檢測(cè)等都提示四種不同的蛋白嵌合體有明顯的抗病毒作用，其中包含 PKR序列表達(dá)載體的質(zhì)?？共《咀饔米蠲黠@。
需耍說(shuō)明的是，本發(fā)明提供的附圖是在顯微鏡或熒光顯微鏡下采集的細(xì)胞圖片，為醫(yī)學(xué)研究 最清晰的圖片，也不能應(yīng)用計(jì)算機(jī)修改為黑白對(duì)比圖片，因?yàn)橹挥懈鶕?jù)不同的顯色，才能判斷實(shí) 驗(yàn)的結(jié)果。
以上實(shí)施例中未作詳細(xì)敘述部分屬于本行業(yè)或相關(guān)行業(yè)的公知技術(shù),采用的設(shè)備是行業(yè)慣例設(shè)備。序列表
1. dsCARE(PKR) cDNA序列
atgtacgcccgtgccgccgcccgtcaggcccgtgccagtggtctcgagatggctggtgat
ctttcagcaggtttcttcatggaggaacttaatacataccgtcagaagcagggagtagta
cttaaatatcaagaactgcctaattcaggacctccacatgataggaggtttacatttcaag
ttataatagatggaagagaatttccagaaggtgaaggtagatcaaagaaggaagcaaaa
aatgccgcagccaaattagctgttgagatacttaataaggaaaagaaggcagttagtcct
ttattattgacaacaacgaattcttcagaaggattatccatggggaattacatAggccttat
caatagaattgcccagaagaaaagactaactgtaaattatgaacagtgtgcatcgggggt
gcatgggccagaaggatttcattataaatgcaaaatgggacagaaagaatatagtattggt
acaggttctactaaacaggaagcaaaacaattggccgctaaacttgcatatcttcagatat
tatcagaagaaacctcagtgaaatctgactacctgtcctctggttccggtaccatggatgc
aaaagctcgaaattgtttgcttcaacatagapaagctctggaaaaggacatcaagacat
cctacatcatggatcacatgattagtgatggatttttaacaatatcagaagaggaaaaagt
aagaaatgagcccactcaacagcaaagagcagctatgctgattaaaatgatacttaaaaa
agataatgattcctacgtatcattctacaatgctctactacatgaaggatataaagatcttg
ctgcccttctccatgatggcattcctgttgtctaa
蛋b序列
myaraaarqarasglemagdlsagffmeelntyrqkqgvvlkyqelpnsgpphdrrftfqvhd
grefpegegrskkeaknaaaklaveilnkekkavspllltttnsseglsmgnyiglinriaqkkrl
tvnyeqcasgvhgpegfhykckmgqkeysigtgstkqeakqlaaklaylqilseetsvksdyls
sgsgtmdakarncllqhrealekdktsyimd畫sdgfltiseeekvrneptqqqraamlikmi
lkkdndsyvsfynallhegykdlaallhdgipw
2. dsCARE(ADARl) cDNA序列
atgtacgcccgtgccgccgcccgtcaggcccgtgccagtggtctcgagaagaaccccatcag
cgggctgttagaatatgcccagttcgctagtcaaacctgtgagttcaacatgatagagcagag
tggaccaccccatgaacctcgatttaaattccaggttgtcatcaatggccgagagtttccccc
agctgaagctggaagcaagaaagtggccaagcaggatgcagctatgaaagccatgacaattc
tgctagaggaagccaaagccaaggacagtggaaaatcagaagaatcatcccactattccaca
gagaaagaatcagagaagactgcagagtcccagacccccaccccttcagccacatccttctt
ttctgggaagagccccgtcaccacactgcttgagtgtatgcacaaattggggaactcctgcg
aattccgtctcctgtccaaagaaggccctgcccatgaacccaagttccaatactgtgttgcag
tgggagcccaaactttccccagtgtgagtgctcccagcaagaaagtggcaaagcagatggcc
gcagaggaagccatgaaggccctgcatggggaggcgaccaactccatggcttctoataacca
gcctgaaggtatgatctcagagtcacttgataacttggaatccatgAtocccaacaaggtcag
gaagattggcgaggtcgtgagatacctgaacaccaaccctgtgggtggccttttggagtacg
cccgctcccatggctttgctgctgaattcaagttggtcgaccagtccggacctcctcacgagc
ccaagttcgtttaccaagcaaaagttgggggtcgctggttcccagccgtctgcgcacapvgc
aagaagcaaggcaagcaggaagcagcagatgcg(jctctccgtgtcttgattggggagaacg
19GTACCATGGATGCAAAAGCTCGAAATTGTTTGCTTCAACATAGAGAAGCTCTGGAAAAGGACA
TCAAGACATCCTACATCATGGATCACATGATTAGTGATGGATTTTTAACAATATCAGAAGAGGA
AAAAGTAAGAAATGAGCCCACTCAACAGCAAAGAGCAGCTATGCTGATTAAAATGATACTTAA
AAAAGATAATGATTCCTACGTATCATTCTACAATGCTCTACTACATGAAGGATATAAAGATCTTG
CTGCCCTTCTCCATGATGGCATTCCTGTTGTCTAA
蛋白序列
MYARAAARQARASGLEKNPISGLLEYAQFASQTCEFNMIEQSGPPHEPRFKFQVVINGREFPPAEA
GSKKVAKQDAAMKAMTILLEEAKAKDSGKSEESSHYSTEKESEKTAESQTPTPSATSFFSGKSPVT
TLLECMHKLGNSCEFRLLSKEGPAHEPKFQYCVAVGAQTFPSVSAPSKKVAKQMAAEEAMKALH
GEATNSMASDNQPEGM腿SLDNLESMMPNKVRKIGELVRYLNTNPVGGLLEYARSHGFAAEFKL
VDQSGPPHEPKFVYQAKVGGRWFPAVCAHSKKQGKQEAADAALRVLIGENGTMDAKARNCLLQ
HREALEKDIKTSYIMDHMISDGFLTISEEEKVRNEPTQQQRAAMLIKMILKKDNDSYVSFYNALL
HEGYKDLAALLHDGIPW
3. dsCARE(PACT) CDNA序列
ATGTACGCCCGTGCCGCCGCCCGTCAGGCCCGTGCCAGTGGTCTCGAGAGCGATTACGACATC
CCCACTACTGAGAATCTTTATTTTCAGGGATCCTCCCAGAGCAGGCACCGCGCCGAGGCCCCG
CCGCTGGAGCGCGAGGACAGTGGGACCTTCAGTTTGGGGAAGATGATAACAGCTAAGCCAGG
GAAAACACCGATTCAGGTATTACACGAATACGGCATGAAGACCAAGAACATCCCAGTTTATGA
ATGTGAAAGATCTGATGTGCAAATACACGTGCCCACTTTCACCTTCAGAGTAACCGTTGGTGA
CATAACCTGCACAGGTGAAGGTACAAGTAAGAAGCTGGCGAAACATAGAGCTGCAGAGGCTG
CCATAAACATTTTGAAAGCCAATGCAAGTATTTGCTTTGCAGTTCCTGACCCCTTAATGCCTGA
CCCTTCCAAGCAACCAAAGAACCAGCTTAATCCTATTGGTTCATTACAGGAATTGGCTATTCAT
CATGGCTGGAGACTTCCTGAATATACCCTTTCCCAGGAGGGAGGACCTGCTCATAAGAGAGAA
TATACTACAATTTGCAGGCTAGAGTCATTTATGGAAACTGGAAAGGGGGCATCAAAAAAGCAA
GCCAAAAGGAATGCTGCTGAGAAATTTCTTGCCAAATTTAGTAATATTTCTCCAGAGAACCAC
ATTTCTTTAACAAATGTAGTAGGACATTCTTTAGGATGTACTTGGCATTCCTTGAGGAATTCTCC
TGGTGAAAAGATCAACTTACTGAAAAGAAGCCTCCTCAGTATTCCAAATACAGATTACATCCA
GCTGCTTAGTGAAATTGCCAAGGAACAAGGTTTTAATATAACATATTTGGATATAGATGAACTG
AGCGCCAATGGACAATATCAATGTCTTGCTGAACTGTCCACCAGCCCCATCACAGTCTGTCAT
GGCTCCGGTATCTCCTGTGGCAATGCACAAAGTGATGCAGCTCACAATGCTTTGCAGTATTTAA
AGATAATAGCAGAAAGAAAGGGTACCATGGATGCAAAAGCTCGAAATTGTTTGCTTCAACATA
GAGAAGCTCTGGAAAAGGACATCAAGACATCCTACATCATGGATCACATGATTAGTGATGGAT
TTTTAACAATATCAGAAGAGGAAAAAGTAAGAAATGAGCCCACTCAACAGCAAAGAGCAGCT
ATGCTGATTAAAATGATACTTAAAAAAGATAATGATTCCTACGTATCATTCTACAATGCTCTACT
ACATGAAGGATATAAAGATCTTGCTGCCCTTCTCCATGATGGCATTCCTGTTGTCTAA
蛋白序列
MYARAAARQARASGLESDYD1PTTENLYFQGSSQSRHRAEAPPLEREDSGTFSLGKMITAKPGKT PIQVLHEYGMKTKNIPVYECERSDVQIHVPTFTFRVTVGDITCTGEGTSKKLAKHRAAEAAINILK ANASICFAVPDPLMPDPSKQPKNQLNPIGSLQELAIHHGWRLPEYTLSQEGGPAHKREYTTICRLES FMETGKGASKKQAKRNAAEKFLAKFSNISPENHISLTNVVGHSLGCTWHSLRNSPGEKINLLKRSLLSIPNTDYIQLLSEIAKEQGFNITYLDIDELSANGQYQCLAELSTSPITVCHGSGISCGNAQSDAAH
NALQYLKIIAERKGTMDAKARNCLLQHREALEKDIKTSYIMDHMISDGFLTISEEEKVRNEPTQQ
QRAAMLIKM1LKKDNDSYVSFYNALLHEGYKDLAALLHDGIPVV
4. dsCARE(NF90) CDNA序列
ATGTACGCCCGTGCCGCCGCCCGTCAGGCCCGTGCCAGTGGTCTCGAGATGAATGCCCTGATG
CGGTTGAACCAGCTGAAGCCAGGGCTGCAGTACAAGCTGGTGTCCCAGACTGGGCCCGTCCA
TGCCCCCATCTTTACCATGTCTGTGGAGGTTGATGGCAATTCATTCGAGGCCTCTGGGCCCTCC
AAAAAGACGGCCAAGCTGCACGTGGCCGTTAAGGTGTTACAGGACATGGGCTTGCCGACGGG
TGCTGAAGGCAGGGACTCGAGCAAGGGGGAGGACTCGGCTGAGGAGACCGAGGCGAAGCC
AGCAGTGGTGGCCCCTGCCCCAGTGGTAGAAGCTGTCTCCACCCCTAGTGCGGCCTTTCCCTC
AGATGCCACTGCCGAGAACGTAAAACAGCAGGGGCCGATCCTGACAAAGCACGGCAAGAAC
CCAGTCATGGAGCTGAACGAGAAGAGGCGTGGGCTCAAGTACGAGCTCATCTCCGAGACCGG
GGGCAGCCACGACAAGCGCTTCGTCATGGAGGTCGAAGTGGATGGACAGAAGTTCCAAGGT
GCTGGTTCCAACAAAAAGGTGGGTACCATGGATGCAAAAGCTCGAAATTGTTTGCTTCAACAT
AGAGAAGCTCTGGAAAAGGACATCAAGACATCCTACATCATGGATCACATGATTAGTGATGGA
TTTTTAACAATATCAGAAGAGGAAAAAGTAAGAAATGAGCCCACTCAACAGCAAAGAGCAGC
TATGCTGATTAAAATGATACTTAAAAAAGATAATGATTCCTACGTATCATTCTACAATGCTpTACT
ACATGAAGGATATAAAGATCTTGCTGCCCTTCTCCATGATGGCATTCCTGTTGTCTAA
蛋白序列
MYARAAARQARASGLEMNALMRLNQLKPGLQYKLVSQTGPVHAPIFTMSVEVDGNSFEASGPS
KKTAKLHVAVKVLQDMGLPTGAEGRDSSKGEDSAEETEAKPAWAPAPWEAVSTPSAAFPSDAT
AENVKQQGPILTKHGKNPVMELNEKRRGLKYELISETGGSHDKRFVMEVEVDGQKFQGAGSNK
KVGTMDAKARNCLLQHREALEKDIKTSYIMDHMISDGFLTISEEEKVRNEPTQQQRAAMLIKMIL
KKDNDSYVSFYNALLHEGYKDLAALLHDGIPVV
權(quán)利要求
1、特異性雙鏈RNA結(jié)合蛋白嵌合體，其特征在于將蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，雙鏈RNA感受器和細(xì)胞凋亡信號(hào)通過(guò)DNA重組的方法按以上順序連接起來(lái)，組成特異性雙鏈RNA結(jié)合蛋白嵌合體，并分別在原核和真核細(xì)胞中表達(dá)。
2、 按照權(quán)利要求1所述的特異性雙鏈RNA結(jié)合蛋白嵌合體，其特征在于涉及四種不同雙鏈 RNA感受器的特異性雙鏈RNA結(jié)合蛋白嵌合體，其中雙鏈RNA感受器可以分別是NF90, PACT, ADAR1或PKR中的任一種，可以是其部分或全部雙鏈RNA結(jié)合區(qū)域。
3、 按照權(quán)利要求1所述的特異性雙鏈RNA結(jié)合蛋白嵌合體，其特征在于所述包含蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo) 信號(hào)、細(xì)胞凋亡信號(hào)和不同雙鏈RNA感受器序列，特異性雙鏈RNA結(jié)合蛋白所組成的嵌合體，其cDNA和貧基酸序列如下No.l dsCARE (PKR) CDNA序列ATGTACGCCCGTGCCGCCGCCCGTCAGGCCCGTGCCAGTGGTCTCGAGATGGCTGGTGATCTTTCAGCAGGTTTCTTCATGGAGGAACTTAATACATACCGTCAGAAGCAGGGAGTAGTACTTAAATATCAAGAACTGCCTAATTCAGGACCTCCACATGATAGGAGGTnACATTTCAAGTTATAATAGATGGAAGAGAATTTCCAGAAGGTGAAGGTAGATCAAAGAAGGAAGCAAAAAATGCCGCAGCCAAATTAGCTGTTGAGATACTTAATAAGGAAAAGAAGGCAGTTAGTCCTTTATTATTGACAACAACGAATTCTTCAGAAGGATTATCCATGGGGAATTACATAGGCCTTATCAATAGAATTGCCCAGAAGAAAAGACTAACTGTAAATTATGAACAGTGTGCATCGGGGGTGCATGGGCCAGAAGGATTTCATTATAAATGCAAAATGGGACAGAAAGAATATAGTATTGGTACAGGTTCTACTAAACAGGAAGCAAAACAATTGGCCGCTAAACTTGCATATCTTCAGATATTATCAGAAGAAACCTCAGTGAAATCTGACTACCTGTCCTCTGGTTCCGGTACCATGGATGCAAAAGCTCGAAATTGTTTGCTTCAACATAGAGAAGCTCTGGAAAAGGACATCAAGACATCCTACATCATGGATCACATGATTAGTGATGGATTTTTAACAATATCAGAAGAGGAAAAAGTAAGAAATGAGCCCACTCAACAGCAAAGAGCAGCTATGCTGATTAAAATGATACTTAAAAAAGATAATGATTCCTACGTATCATTCTACAATGGTCTACTACATGAAGGATATAAAGATCTTGCTGCCCTTCTCCATGATGGCATTCCTGTTGTCTAA蛋白序列MYARAAARQARASGLEMAGDLSAGFFMEELNTYRQKQGWLKYQELPNSGPPHDRRFTFQVIIDGREFPEGEGRSKKEAKNAAAKLAVEILNKEKKAVSPLLLTTTNSSEGLSMGNYIGLINRIAQKKRLTVNYEQCASGVHGPEGFHYKCKMGQKEYSIGTGSTKQEAKQLAAKLAYLQILSEETSVKSDYLSSGSGTMDAKARNCLLQHREALEKDIKTSYIMDHMISDGFLTISEEEKVRNEPTQQQRAAMLIKMILKKDNDSYVSFYNALLHEGYKDLAALLHDGIPVVNo2. dsCARE (ADAR1) cDNA序列ATGTACGCCCGTGCCGCCGCCCGTCAGGCCCGTGCCAGTGGTCTCGAGAAGAACCCCATCAG CGGGCTGTTAGAATATGCCCAGTTCGCTAGTCAAACCTGTGAGTTCAACATGATAGAGCAGAGTGGACCACCCCATGAACCTCGATTTAAATTCCAGGTTGTCATCAATGGCCGAGAGTTTCCCCCAGCTGAAGCTGGAAGCAAGAAAGTGGCCAAGCAGGATGCAGCTATGAAAGCCATGACAATTCTGCTAGAGGAAGCCAAAGCCAAGGACAGTGGAAAATCAGAAGAATCATCCCACTATTCCACAGAGAAAGAATCAGAGAAGACTGCAGAGTCCCAGACCCCCACCCCTTCAGCCACATCCTTCTTTTCTGGGAAGAGCCCCGTCACCACACTGCTTGAGTGTATGCACAAATTGGGGAACTCCTGCGAATTCCGTCTCCTGTCCAAAGAAGGCCCTGCCCATGAACCCAAGTTCCAATACTGTGTTGCAGTGGGAGCCCAAACTTTCCCCAGTGTGAGTGCTCCCAGCAAGAAAGTGGCAAAGCAGATGGCCGCAGAGGAAGCCATGAAGGCCCTGCATGGGGAGGCGACCAACTCCATGGCTTCTGATAACCAGCCTGAAGGTATGATCTCAGAGTCACTTGATAACTTGGAATCCATGATGCCCAACAAGGTCAGGAAGATTGGCGAGCTCGTGAGATACCTGAACACCAACCCTGTGGGTGGCCTTTTGGAGTACGCCCGCTCCCATGGCTTTGCTGCTGAATTCAAGTTGGTCGACCAGTCCGGACCTCCTCACGAGCCCAAGTTCGTTTACCAAGCAAAAGTTGGGGGTCGCTGGTTCCCAGCCGTCTGCGCACACAGCAAGAAGCAAGGCAAGCAGGAAGCAGCAGATGCGGCTCTCCGTGTCTTGATTGGGGAGAACGGTACCATGGATGCAAAAGCTCGAAATTGTTTGCTTCAACATAGAGAAGCTCTGGAAAAGGACATCAAGACATCCTACATCATGGATCACATGATTAGTGATGGATTTTTAACAATATCAGAAGAGGAAAAAGTAAGAAATGAGCCCACTCAACAGCAAAGAGCAGCTATGCTGATTAAAATGATACTTAAAAAAGATAATGATTCCTACGTATCATTCTACAATGCTCTACTACATGAAGGATATAAAGATCTTGCTGCCCTTCTCCATGATGGCATTCCTGTTGTCTAA蛋白序列MYARAAARQARASGLEKNPISGLLEYAQFASQTCEFNMIEQSGPPHEPRFKFQVVINGREFPPAEAGSKKVAKQDAAMKAMTILLEEAKAKDSGKSEESSHYSTEKESEKTAESQTPTPSATSFFSGKSPVTTLLECMHKLGNSCEFRLLSKEGPAHEPKFQYCVAVGAQTFPSVSAPSKKVAKQMAAgEAMKALHGEATNSMASDNQPEGMISESLDNLESMMPNKVRKIGELVRYLNTNPVGGLLEYARSHGFAAEFKLVDQSGPPHEPKFVYQAKVGGRWFPAVCAHSKKQGKQEAADAALRVLIGENGTMDAKARNCLLQHREALEKDIKTSYIMDHMISDGFLTISEEEKVRNEPTQQQRAAMLIKMILKKDNDSYVSFYNALLHEGYKDLAALLHDGIPVVNo3. dsCARE(PACT) cDNA序列ATGTACGCCCGTGCCGCCGCCCGTCAGGCCCGTGCCAGTGGTCTCGAGAGCGATTACGACATCCCCACTACTGAGAATCTTTATTTTCAGGGATCCTCCCAGAGCAGGCACCGCGCCGAGGCCCCGCCGCTGGAGCGCGAGGACAGTbGGACCTTCAGTTTGGGGAAGATGATAACAGCTAAGCCAGGGAAAACACCGATTCAGGTATTACACGAATACGGCATGAAGACCAAGAACATCCCAGTTTATGAATGTGAAAGATCTGATGTGCAAATACACGTGCCCACTTTCACCTTCAGAGTAACCGTTGGTGACATAACCTGCACAGGTGAAGGTACAAGTAAGAAGCTGGCGAAACATAGAGCTGCAGAGGCTGCCATAAACATTTTGAAAGCCAATGCAAGTATTTGCTTTGCAGTTCCTGACCCCTTAATGCCTGACCCTTCCAAGCAACCAAAGAACCAGCTTAATCCTAtTGGTTCATTACAGGAATTGGCTATTCATCATGGCTGGAGACTTCCTGAATATACCCTTTCCCAGGAGGGAGGACCTGCTCATAAGAGAGAATATACTACAATTTGCAGGCTAGAGTCATTTATGGAAACTGGAAAGGGGGCATCAAAAAAGCAAGCCAAAAGGAATGCTGCTOAGAAATTTCTTGCCAAATTTAGTAATATTTCTCCAGAGAACCACATTTCTTTAACAAATGTAGTAGGACATTCTTTAGGATGTACTTGGCATTCCTTGAGGAATTCTCCTGGTGAAAAGATCAACTTACTGAAAAGAAGCCTCCTCAGTATTCCAAATACAGATTACATCCAGCTGCTTAGTGAAATTGCCAAGGAACAAGGTTTTAATATAACATATTTGGATATAGATGAACTGAGCGCCAATGGACAATATCAATGTCTTGCTGAACTGTCCACCAGCCCCATCA|CAGTCTGTCATGGCTCCGGTATCTCCTGTGGCAATGCACAAAGTGATGCAGCTCACAATGCTTTGCAGTATTTAAAGATAATAGCAGAAAGAAAGGGTACCATGGATGCAAAAGCTCGAAATTGTTTGCTTCAACATAGAGAAGCTCTGGAAAAGGACATCAAGACATCCTACATCATGGATCACATGATTAGTGATGGATTTTTAACAATATCAGAAGAGGAAAAAGTAAGAAATGAGCCCACTCAACAGCAAAGAGCAGCTATGCTGATTAAAATGATACTTAAAAAAGATAATGATTCCTACGTATCATTCTACAATGCTCTACTACATGAAGGATATAAAGATCTTGCTGCCCTTCTCCATGATGGCATTCCTGTTGTCTAAMYARAAARQARASGLESDYDIPTTENLYFQGSSQSRHRAEAPPLEREDSGTFSLGKMITAKPGKTPIQVLHEYGMKTKNIPVYECERSDVQIHVPTFTFRVTVGDITCTGEGTSKKLAKHRAAEAAINILKANASICFAVPDPLMPDPSKQPKNQLNPIGSLQELAfflHGWRLPEYTLSQEGGPAHKREYTTICRLESFMETGKGASKKQAKRNAAEKFLAKFSNISPENHISLTNWGHSLGCTWHSLRNSPGEKINLLKRSLLSIPNTDYIQLLSEIAKEQGFNITYLDIDELSANGQYQCLAELSTSPITVCHGSGISCGNAQSDAAHNALQYLKIIAERKGTMDAKARNCLLQHREALEKDIKTSYIMDHMISDGFLTISEEEKVRNEPTQQQRAAMLIKM[LKKDNDSYVSFYNALLHEGYKDLAALLHDGIPWNo4. dsCARE(NF90) cDNA序列ATGTACGCCCGTGCCGCCGCCCGTCAGGCCCGTGCCAGTGGTCTCGAGATGAATGCCCTGATGCGGTTGAACCAGCTGAAGCCAGGGCTGCAGTACAAGCTGGTGTCCCAGACTGGGCCCGTCCATGCCCCCATCTTTACCATGTCTGTGGAGGTTGATGGCAATTCATTCGAGGCCTCTGGGCCCTCCAAAAAGACGGCCAAGCTGCACGTGGCCGTTAAGGTGTTACAGGACATGGGCTTGCCGACGGGTGCTGAAGGCAGGGACTCGAGCAAGGGGGAGGACTCGGCTGAGGAGACCGAGGCGAAGCCAGCAGTGGTGGCCCCTGCCCCAGTGGTAGAAGCTGTCTCCACCCCTAGTGCGGCCnTCCCTCAGATGCCACTGCCGAGAACGTAAAACAGCAGGGGCCGATCCTGACAAAGCACGGCAAGAACCCAGTCATGGAGCTGAACGAGAAGAGGCGTGGGCTCAAGTACGAGCTCATCTCCGAGACCGGGGGCAGCCACGACAAGCGCTTCGTCATGGAGGTCGAAGTGGATGGACAGAAGTTCCAAGGTGCTGGTTCCAACAAAAAGGTGGGTACCATGGATGCAAAAGCTCGAAATTGTTTGCTTCAACATAGAGAAGCTCTGGAAAAGGACATCAAGACATCCTACATCATGGATCACATGATTAGTGATGGATTTTTAACAATATCAGAAGAGGAAAAAGTAAGAAATGAGCCCACTCAACAGCAAAGAGCAGCT入T9CTGATTAAAATGATACTTAAAAAAGATAATGATTCCTACGTATCATTCTACAATGCTCTACTACATGAAGGATATAAAGATCTTGCTGCCCTTCTCCATGATGGCATTCCTGTTGTCTAA蛋白序列MYARAAARQARASGLEMNALMRLNQLKPGLQYKLVSQTGPVHAPIFTMSVEVDGNSFEASGPSKKTAKLHVAVKVLQDMGLPTGAEGRDSSKGEDSAEETEAKPAWAPAPWEAVSTPSAAFPSDATAENVKQQGPILTKHGKNPVMELNEKRRGLKYELISETGGSHDKRFVMEVEVDGQKFQGAGSNKKVGTMDAKARNCLLQHREALEKDKTSYIMDHMISDGFLTISEEEKVRNEPTQQQRAAMLIKMILKKDNDSYVSFYNAIXHEGYKDLAALLHDGIPVV
4、 按照權(quán)利要求1所述的特異性雙鏈RNA結(jié)合蛋白嵌合體，其特征在于所述雙鏈RNA結(jié)合 蛋白嵌合體，NF90， PACT, ADAR1和PKR的序列可以得自任何哺乳動(dòng)物和脊椎動(dòng)物。
5、 按照權(quán)利要求4所述的特異性雙鏈RNA結(jié)合蛋白嵌合體，其特征在于所述將特異性雙鏈 RNA結(jié)合蛋白嵌合體的重組DNA轉(zhuǎn)化各種原核和真核細(xì)胞表達(dá)體系進(jìn)行表達(dá),并將所表達(dá)蛋白制 備成針劑、片劑、口服劑、膠囊或噴劑等的抗病毒的藥物。
6、按照權(quán)利耍求4所述的特異性雙鏈RNA結(jié)合蛋白嵌合體,其特征在于所述特異性雙鏈RNA 蛋白嵌合體用于在病毒感染性疾病中的治療和預(yù)防，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞水平上作為蛋白藥物治療工 具。
全文摘要
本發(fā)明涉及雙鏈RNA結(jié)合蛋白嵌合體在治療或預(yù)防病毒感染性疾病中的應(yīng)用，特別是涉及四種由雙鏈RNA感受器序列NF90、PACT、ADAR1利PKR組成的蛋白嵌合體在治療和預(yù)防病毒感染性疾病中的一種或多種應(yīng)用，特異性雙鏈RNA結(jié)合蛋白嵌合體，其特征在于將蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，雙鏈RNA感受器和細(xì)胞凋亡信號(hào)通過(guò)DNA重組的方法按以上順序連接起來(lái)，組成特異性雙鏈RNA結(jié)合蛋白嵌合體，并分別在原核和真核細(xì)胞中表達(dá)。特異性雙鏈RNA蛋白嵌合體可用于在病毒感染性疾病中的治療和預(yù)防，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞水平上作為蛋白藥物治療工具。
文檔編號(hào)C07K19/00GK101525388SQ20091002122
公開日2009年9月9日 申請(qǐng)日期2009年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月20日
發(fā)明者晁曉東, 楊靜華, 樊代明, 汪愛勤, 光 程, 舟 費(fèi) 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)