鏈間交換由支架dna達(dá)成的核酸結(jié)構(gòu)及其合成方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及DNA納米技術(shù)領(lǐng)域的核酸結(jié)構(gòu)及其合成方法。更具體地講，涉及利用支 架DNA達(dá)成的鏈交換合成納米級(jí)別可控大小、形狀、復(fù)雜度的二維和三維核酸結(jié)構(gòu)的方法和 核酸結(jié)構(gòu)本身。基于所得結(jié)構(gòu)中每條短鏈DNA的可尋址性，可以獲得具有特定孔穴和修飾的 核酸結(jié)構(gòu)。
【背景技術(shù)】
[0002] 上世紀(jì)八十年代，Seeman首次提出利用DNA堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則可將DNA組裝成復(fù) 雜的空間結(jié)構(gòu)，開創(chuàng)了利用DNA作為納米級(jí)構(gòu)筑材料而非遺傳信息載體的新領(lǐng)域，并將其命 名為DNA納米技術(shù)。隨后，研究人員通過構(gòu)造不同基元模塊，如DX(double-crossover)、TX (triple-crossover)模塊、、十字模塊和對(duì)稱模塊，并用模塊組裝得到各式各樣的圖形結(jié)構(gòu) (二維陣列，方形網(wǎng)格等），但模塊法組裝是借助于小結(jié)構(gòu)單元的堿基互補(bǔ)配對(duì)連接成較大 的圖形結(jié)構(gòu)，其尺寸和形狀難以精確控制。
[0003] 2006年，Rothemund提出了一個(gè)全新的名詞："DNA折紙術(shù)"（DNA origami)。他將一 條基因組DNA長鏈(M13mpl8)與數(shù)百條短鏈DNA混合，通過在特定位置的堿基互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)行 折疊連接，得到了三角形、五角星、笑臉等宛如折紙作品一般令人驚嘆的復(fù)雜二維結(jié)構(gòu)，比 通過模塊DNA自組裝方法得到的結(jié)構(gòu)更為精密，堪稱DNA納米技術(shù)一次里程碑式的突破。
[0004] 其后，基于DNA折紙術(shù)的成果層出不窮。2007年，William shih等人將M13mpl8支架 折疊成六旋轉(zhuǎn)納米管，首次用DNA構(gòu)造出三維結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)了由二維圖形到三維結(jié)構(gòu)的突破。 2009年，他們?cè)诩{米管的基礎(chǔ)上提出蜂窩褶狀模型，依次構(gòu)建了橋式、瓶頸等多個(gè)單體和組 合結(jié)構(gòu)。在隨后研究中，他們又通過在每個(gè)單元內(nèi)增刪堿基，實(shí)現(xiàn)了圖形整體扭曲或彎折角 度的精確控制，將三維DNA折紙術(shù)推向了一個(gè)新的高度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的，就是為了提供一種鏈間交換由支架DNA達(dá)成的核酸結(jié)構(gòu)及其制備 方法和用途。
[0006] 本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):一種鏈間交換由支架DNA達(dá)成的核 酸結(jié)構(gòu)，是通過支架DNA達(dá)成鏈間交換形成的具有可控大小和形狀的二維或三維核酸結(jié)構(gòu)， 該核酸結(jié)構(gòu)包括一組平行的雙螺旋和一段單鏈DNA，所述雙螺旋由支架DNA通過折疊、鏈間 交換與多條短鏈DNA進(jìn)行特異性匹配，經(jīng)由退火反應(yīng)形成，單鏈DNA為支架DNA中未形成雙螺 旋的部分。
[0007] 所述支架DNA包括M13mpl8或其他指定序列的單鏈DNA;M13mpl8為ml3噬菌體基因 組DNA中一個(gè)環(huán)狀單鏈DNA分子，共含有7249個(gè)核苷酸，其序列如SEQ ID N01所示。
[0008] 所述的鏈間交換指的是支架DNA在相鄰雙螺旋相同位置的一對(duì)鏈交換位點(diǎn)處進(jìn)行 連接的行為。即在核酸結(jié)構(gòu)每行雙螺旋間隔一定距離處設(shè)置多個(gè)鏈交換位點(diǎn)對(duì)，支架DNA的 折疊路徑經(jīng)由每一行雙螺旋的鏈交換位點(diǎn)處進(jìn)入相鄰雙螺旋相同位置的鏈交換位點(diǎn)，每行 雙螺旋的鏈交換位點(diǎn)為2至500對(duì)，對(duì)同一行雙螺旋，每個(gè)鏈交換位點(diǎn)對(duì)間的距離(鏈交換周 期)為4至416個(gè)核苷酸。通過鏈間交換將結(jié)構(gòu)中相鄰位置的雙螺旋彼此連接起來，所有的鏈 間交換均通過支架DNA達(dá)成。
[0009] 所述核酸結(jié)構(gòu)為二維核酸結(jié)構(gòu)，該二維核酸結(jié)構(gòu)包含2至200行雙螺旋，一段長單 鏈DNA和20至1000條至少部分與支架DNA匹配的短鏈DNA;每行雙螺旋包含60至6000個(gè)核苷 酸，鏈交換周期為4至416;短鏈DNA在核酸結(jié)構(gòu)中與支架DNA的匹配遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則， 每條短鏈DNA的長度對(duì)同一結(jié)構(gòu)可以相等且均小于400個(gè)核苷酸。對(duì)于單個(gè)核酸結(jié)構(gòu)，其包 含的每條短鏈DNA是獨(dú)特的，僅在結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)一次；對(duì)于不同的核酸結(jié)構(gòu)，短鏈DNA可以相 同。
[0010] 所述二維核酸結(jié)構(gòu)為方形、多邊形或其他在支架DNA的長度限制內(nèi)形成的規(guī)則或 不規(guī)則的二維圖形;二維核酸結(jié)構(gòu)的不同形狀通過改變支架DNA的折疊路徑和短鏈DNA的匹 配位置達(dá)成。
[0011]所述核酸結(jié)構(gòu)為多層核酸組成的三維立體結(jié)構(gòu)，包含一段長單鏈DNA和20至1000 條至少部分與支架DNA匹配的短鏈DNA，2至100層雙螺旋，每層螺旋包含的螺旋數(shù)為2至100 行，每行螺旋包含60至3000個(gè)核苷酸，鏈交換周期為4至416,短鏈DNA在核酸結(jié)構(gòu)中與支架 DNA的匹配遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，每條短鏈DNA的長度對(duì)同一結(jié)構(gòu)可以相等且均小于200 個(gè)核苷酸;對(duì)于單個(gè)核酸結(jié)構(gòu)，其包含的每條短鏈DNA是獨(dú)特的，僅在結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)一次;對(duì)于 不同的核酸結(jié)構(gòu)，短鏈DNA可以相同。
[0012] 所述三維核酸結(jié)構(gòu)為立方體、多面體或其他在支架DNA的長度限制內(nèi)形成的規(guī)則 或不規(guī)則的三維結(jié)構(gòu);三維核酸結(jié)構(gòu)的不同形狀通過改變支架DNA的折疊路徑和短鏈DNA的 匹配位置達(dá)成。
[0013] 所述核酸結(jié)構(gòu)包含具有孔穴的核酸結(jié)構(gòu)，該孔穴通過排除核酸結(jié)構(gòu)中的一條或多 條短鏈DNA，使支架DNA在此位置不參與結(jié)構(gòu)形成而達(dá)成，所述孔穴包括方形、多邊形、十字 形和其他規(guī)則或不規(guī)則的樣式。
[0014] 所述的具有孔穴的核酸結(jié)構(gòu)包含具有代表八卦中的"乾"卦和"坤"卦孔穴的核酸 結(jié)構(gòu)，"乾"卦和"坤"卦孔穴通過刪去完整核酸結(jié)構(gòu)中特定位置的60和48條短鏈核苷酸形 成，被刪去的短鏈核苷酸不參與到退火過程中。
[0015] 所述核酸結(jié)構(gòu)包含在單個(gè)到多個(gè)結(jié)構(gòu)范圍內(nèi)的特定位點(diǎn)具有化學(xué)修飾的核酸結(jié) 構(gòu)，具有化學(xué)修飾的核酸直接作為短鏈DNA或者間接地通過與短鏈DNA的不與支架配對(duì)的單 鏈部分互補(bǔ)配對(duì)定位于核酸結(jié)構(gòu)的特定位點(diǎn)。特定的化學(xué)修飾將特異性的結(jié)合納米顆粒、 多肽或者蛋白質(zhì)。所述納米顆粒包括但不限于鏈酶親和素，金顆粒、熒光基團(tuán)等易于表征和 呈現(xiàn)的粒子。修飾的呈現(xiàn)形式包括熒光信號(hào)和圖案等，所述圖案為字母、數(shù)字和其他規(guī)則或 不規(guī)則的樣式。
[0016] 所述核酸結(jié)構(gòu)包含具有鏈酶親和素修飾的核酸結(jié)構(gòu)，將其中一條或數(shù)條短鏈DNA 在3'端延長兩個(gè)"T"作為間隔序列和一段含有15個(gè)核苷酸的序列作為輔助序列，再將一條 3'端修飾有生物素的長為15個(gè)核苷酸的短鏈DNA與該輔助序列相匹配，從而將生物素引入 到結(jié)構(gòu)中，生物素隨后可以結(jié)合鏈酶親和素。
[0017] 所述具有鏈酶親和素修飾的核酸結(jié)構(gòu)包含修飾有字母"X"圖案的核酸結(jié)構(gòu)，通過 26條指定位置的短鏈核苷酸將生物素引入到核酸結(jié)構(gòu)中，從而在AFM成像時(shí)以26個(gè)像素點(diǎn) 的方式呈現(xiàn)字母"X"的樣式。
[0018] 所述輔助序列為GG AAGGGATGGAGGA，所述長為15個(gè)核苷酸的短鏈DNA的序列為 TCCTCCATCCCTTCC-b iot in。
[0019] -種鏈間交換由支架DNA達(dá)成的核酸結(jié)構(gòu)的合成方法，是指在單個(gè)容器中使支架 DNA與多個(gè)短鏈DNA混合，在緩沖溶液中進(jìn)行退火反應(yīng)形成核酸結(jié)構(gòu)，其中短鏈DNA的摩爾濃 度大于等于支架DNA摩爾濃度的2倍。
[0020] 上述的鏈間交換由支架DNA達(dá)成的核酸結(jié)構(gòu)的合成方法，包括以下步驟：
[0021] -、樣品制備
[0022] 等體積吸取形成單個(gè)核酸結(jié)構(gòu)所需的全部短鏈DNA，補(bǔ)充去離子水使得最終的混 合溶液中每條短鏈DNA的濃度為50至4000nM;
[0023] 將支架M13mpl8用純水配制成起始濃度為50至500nM;
[0024] 二、退火反應(yīng)
[0025] 將5至50nM支架DNA與10至500nM的短鏈DNA混合在緩沖溶液中，對(duì)反應(yīng)容器施以退 火程序。
[0026] 三、分離純化
[0027] 退火結(jié)束后，將反應(yīng)混合物通過非變性瓊脂凝膠電泳分離反應(yīng)混合物，以使目標(biāo) 結(jié)構(gòu)與其他結(jié)構(gòu)在物理上分開。
[0028] 所述分離純化的具體步驟是，將退火后的反應(yīng)混合物應(yīng)用于置于冰水浴中的瓊脂 凝膠電泳，隨后切割下目標(biāo)凝膠帶，使用細(xì)研磨棒將凝膠帶擠壓成小塊，在一定轉(zhuǎn)速下（例 如1000g)下離心數(shù)分鐘，回收已被純化的目標(biāo)產(chǎn)物。
[0029] 所述退火程序的過程為1)或2)。
[0030] 1)所述退火程序的溫度以2-120分鐘/度的速度從90至60度的任一溫度降低至60 至4度的任一溫度。退火程序可以在100至70度的高溫停留10至100分鐘后再進(jìn)行降溫。處在 不同溫度區(qū)間時(shí)，降溫速度可以不同
[0031] 2)所述退火程序的溫度為恒定溫度，所述恒定溫度為80至20度間的任一溫度
[0032] 本發(fā)明提供了多種核酸結(jié)構(gòu)及其合成方法，是一種基于DNA折紙術(shù)的變體技術(shù)，旨 在實(shí)現(xiàn)利用支架DNA達(dá)成鏈間交換形成具有可控大小、形狀、復(fù)雜度和修飾的核酸結(jié)構(gòu)。核 酸結(jié)構(gòu)通過支架DNA和短鏈DNA的自組裝過程完成，產(chǎn)率較高，設(shè)計(jì)簡便，并且可以同時(shí)合成 預(yù)知的二維結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)。
【附圖說明】：
[0033] 圖1為本發(fā)明中的一種二維核酸結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)示意圖；
[0034]圖2為與圖1對(duì)應(yīng)的二維核酸結(jié)構(gòu)的AFM圖像；
[0035]圖3為本發(fā)明中的一種三維核酸結(jié)構(gòu)的簡圖；
[0036]圖4為與圖3對(duì)應(yīng)的三維核酸結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)示意圖；
[0037]圖5為與圖3對(duì)應(yīng)的三維核酸結(jié)構(gòu)中支架DNA的折疊周期路徑圖；
[0038]圖6為與圖3對(duì)應(yīng)的三維核酸結(jié)構(gòu)的TEM圖像；
[0039]圖7、圖8為本發(fā)明中的兩種具有孔穴的二維核酸結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)示意圖，其中圖7代表 的是象征"乾"圖案的鏈交換周期26的25螺旋核酸結(jié)構(gòu)，圖8代表的是象征"坤"圖案的鏈交 換周期26的25螺旋核酸結(jié)構(gòu)。
[0040]圖9為與圖7對(duì)應(yīng)的具有孔穴的二維核酸結(jié)構(gòu)的AFM圖像；
[0041 ]圖10為與圖8對(duì)應(yīng)的具有孔穴的二維核酸結(jié)構(gòu)的AFM圖像；
[0042] 圖11為本發(fā)明中的一種具有鏈酶親和素修飾的核酸結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)示意圖；
[0043] 圖12為與圖11對(duì)應(yīng)的具有鏈酶親和素修飾的核酸結(jié)構(gòu)的AFM圖像；
[0044]圖13為支架DNA與數(shù)條短鏈DNA經(jīng)過退火過程形成特定核酸結(jié)構(gòu)的流程圖，以及該 結(jié)構(gòu)的AFM圖像，在退火前，支架DNA以長單鏈環(huán)狀DNA的形式存在。
【具體實(shí)施方式】
[0045]本發(fā)明是基于對(duì)DNA折紙術(shù)的一種改進(jìn)和補(bǔ)充，通過支架DNA而非短鏈DNA的鏈交 換可同時(shí)構(gòu)筑二維或三維的核酸結(jié)構(gòu)，在其最廣義含義中涉及制備納米級(jí)別可控大小、形 狀、復(fù)雜度和修飾的核酸結(jié)構(gòu)。
[0046]本發(fā)明提供了制備多個(gè)可控大小、形狀、圖案和復(fù)雜度的二維、三維核酸結(jié)構(gòu)的方 法，通過支架DNA和短鏈DNA的自組裝過程進(jìn)行制備，該自組裝過程包含在高溫下混合支架 DNA、短鏈DNA和緩沖溶液并按一定程序逐步降低溫度，以促進(jìn)序列特異性結(jié)合。術(shù)語"自組 裝"指的是短鏈DNA和支架DNA以無需外部控制（例如順次加入短鏈DNA)的方式彼此退火的 過程。
[0047]本發(fā)明提供的核酸結(jié)構(gòu)包含以預(yù)定和已知方式與支架DNA進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)的短 鏈DNA，因此，了解所得結(jié)構(gòu)中每條短鏈DNA的位置為該核酸結(jié)構(gòu)提供了可尋址性。相應(yīng)地， 可以對(duì)指定位置的短鏈DNA進(jìn)行刪減或修飾獲得具有特定孔穴和圖案的核酸結(jié)構(gòu)。
[0048] 1、二維核酸結(jié)構(gòu)：
[0049]二維核酸結(jié)構(gòu)由支架DNA和短鏈DNA以彼此特異性結(jié)合的方式組成，在形成核酸結(jié) 構(gòu)的退火過程之前，支架DNA以環(huán)狀長鏈DNA的形式存在，每條短鏈DNA則以含有小于400個(gè) 核苷酸的單鏈形式存在。
[0050] 核酸結(jié)構(gòu)內(nèi)的支架DNA和短鏈DNA通過彼此堿基互補(bǔ)配對(duì)形成雙螺旋的方式存在， 這些雙螺旋在文中也可等價(jià)地被稱為螺旋。
[0051] 圖1提供了鏈交換周期為26個(gè)核苷酸的25螺旋矩形核酸結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)示意圖。我們 定義，自上而下，每行螺旋的位置為1，2,3……26,在每行螺旋中，從左至右，每個(gè)核苷酸的 位置為1，2,3……直至末尾。一般地，支架DNA的第0螺旋將不與短鏈DNA進(jìn)行匹配，而以長單 鏈形式存在，從第1螺旋的第26、27個(gè)核苷酸開始，每隔52個(gè)核苷酸設(shè)置一個(gè)支架DNA鏈交換 位點(diǎn)對(duì)(crossover )，即左數(shù)第26、27，78、79，……，直至螺旋結(jié)束。第2螺旋至倒數(shù)第2行螺 旋的第26、27個(gè)核苷酸開始，每隔26個(gè)堿基設(shè)置一個(gè)鏈交換位點(diǎn)對(duì)，即26、27,52、53……，直 至螺旋結(jié)束。最后一行螺旋的第52、53個(gè)核苷酸開始，每隔52個(gè)核苷酸設(shè)置一 /個(gè)鏈交換位 點(diǎn)對(duì)。在每個(gè)鏈交換位點(diǎn)對(duì)處。每個(gè)核苷酸均與相鄰一行螺旋(上一行或下一行，依次交替） 相同位置的核苷酸連接。每一行螺旋相互平行排列且包含的核苷酸數(shù)可以相同。螺旋數(shù)和 每行螺旋包含的核苷酸數(shù)取決于設(shè)計(jì)者的需求，設(shè)計(jì)的核酸結(jié)構(gòu)包含的總核苷酸數(shù)應(yīng)小于 支架DNA的核苷酸數(shù)。圖2為該核酸結(jié)構(gòu)的AFM圖像，其形狀和大小與設(shè)計(jì)相符。
[0052] 事實(shí)上，為避免支架DNA在折疊過程中可能產(chǎn)生的扭轉(zhuǎn)應(yīng)力（twist)積累，對(duì)每一 行螺旋，從第一個(gè)核苷酸開始，每隔104個(gè)核苷酸使鏈交換位點(diǎn)的周期增加一個(gè)核苷酸，以 恰好滿足DNA螺旋周期的倍數(shù)(每個(gè)螺旋周期為10.5個(gè)核苷酸），消除可能的影響。因此，以 第3螺旋為例，實(shí)際的鏈交換位點(diǎn)對(duì)的位置應(yīng)為26-27,52-53、78-79,105-106,以此類推，直 至螺旋結(jié)束。
[0053] 對(duì)于該二維核酸結(jié)構(gòu)中的短鏈DNA，其排列位置參照如下規(guī)則:對(duì)于第0行螺旋，不 加入短鏈DNA進(jìn)行匹配。對(duì)于第1行至末行螺旋，自第14個(gè)核苷酸開始，依次放置緊挨（中間 無空隙）的長度為26個(gè)核苷酸的短鏈DNA進(jìn)行匹配形成雙螺旋，直至倒數(shù)第14個(gè)核苷酸的位 置。所有短鏈DNA在螺旋結(jié)構(gòu)中均以平行方式存在。因此對(duì)于除第0行外的每一行螺旋，首尾 將各有13個(gè)核苷酸未形成雙螺旋，此舉的目的是避免核酸結(jié)構(gòu)在彼此邊界產(chǎn)生不必要的聚 集。
[0054] 二維核酸結(jié)構(gòu)還可設(shè)計(jì)成鏈交換周期為26的11螺旋核酸結(jié)構(gòu)，鏈交換周期為16的 23螺旋核酸結(jié)構(gòu)等。對(duì)于本發(fā)明涉及的其它形狀、大小的二維核酸結(jié)構(gòu)，均可以參照上述方 法進(jìn)行設(shè)計(jì)，核酸結(jié)構(gòu)包含的總螺旋數(shù)可以是2至200行，每行螺旋包含的核苷酸可以是60 至6000個(gè)。每條短鏈DNA的長度小于400個(gè)核苷酸。鏈交換周期可以在4到416之間。
[0055] 2、三維核酸結(jié)構(gòu)
[0056]三維核酸結(jié)構(gòu)同樣是基于支架DNA的鏈間交換，通過支架DNA與短鏈DNA進(jìn)行堿基 互補(bǔ)配對(duì)的方式組成。
[0057] 圖3提供了鏈交換周期為26個(gè)核苷酸的35螺旋三維核酸結(jié)構(gòu)的簡圖，每行螺旋的 編號(hào)如圖所示，共有5層雙螺旋，每層雙螺旋在第1層螺旋所處平面的投影完全重合。每層螺 旋由7行雙螺旋組成，每行雙螺旋均以平行方式排列并含有相同個(gè)數(shù)的核苷酸。因此，該三 維核酸結(jié)構(gòu)在空間呈現(xiàn)立方體的形狀。
[0058] 對(duì)應(yīng)的三維核酸結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)示意圖如圖4所示。我們定義支架DNA的折疊起點(diǎn)5'位 于第一行螺旋的第一個(gè)核苷酸處，對(duì)第1行螺旋，從第26、27個(gè)核苷酸處，每隔52個(gè)核苷酸設(shè) 置一個(gè)鏈交換位點(diǎn)對(duì)，即第26、27，78、79……個(gè)螺旋處，直至螺旋結(jié)束。對(duì)最后一行螺旋(第 35行螺旋），從第52、53個(gè)核苷酸開始，每隔52個(gè)核苷酸設(shè)置一個(gè)鏈交換位點(diǎn)對(duì)，直至螺旋結(jié) 束。對(duì)其余的每行雙螺旋，從第26、27個(gè)核苷酸處，每隔26個(gè)核苷酸設(shè)置一個(gè)鏈交換位點(diǎn)對(duì)， 即第26、27，52、53，78、79個(gè)螺旋處，直至螺旋結(jié)束。每一行螺旋通過鏈交換位點(diǎn)與相鄰行螺 旋進(jìn)行連接，該相鄰指的是在示意圖顯示位置的相鄰，例如第2行螺旋與第1行，第3行，第13 行螺旋相鄰。
[0059] 支架DNA的折疊路徑：
[0060]支架DNA在該三維核酸結(jié)構(gòu)中完成了 4個(gè)相同的折疊周期，每個(gè)周期由兩種不同的 折疊路徑組成。以第一個(gè)折疊周期為例，如圖5所示。自5'端開始，支架DNA在達(dá)到第1行螺旋 的第1處鏈交換位點(diǎn)對(duì)后，進(jìn)入第2行螺旋，隨后返回至第2行螺旋第1個(gè)核苷酸處，形成一 個(gè)" U"形回路，隨后進(jìn)入第3行螺旋，并在第3行螺旋的第一個(gè)鏈交換位點(diǎn)處進(jìn)入第4行螺旋。 以此方式，支架DNA按照自然數(shù)的序列，依次走完第1、2、3……35行螺旋。
[0061] 支架DNA達(dá)到第35行螺旋后，在第1個(gè)鏈交換位點(diǎn)對(duì)處進(jìn)入第22行螺旋，并返回至 第22行螺旋的第一個(gè)鏈交換位點(diǎn)對(duì)，隨后進(jìn)入第21行螺旋。在第21行螺旋的第一個(gè)鏈交換 位點(diǎn)對(duì)處進(jìn)入第8行螺旋，在第8行螺旋的第2個(gè)鏈交換位點(diǎn)對(duì)處進(jìn)入第7行螺旋。以此方式， 支架DNA按照示意圖中垂直方向螺旋的排列，依次走完第35、22、21、8、7、6、9……然后回到 第1行螺旋。
[0062]其余的折疊周期均按此方法進(jìn)行，需要注意的是，支架DNA所經(jīng)過的鏈交換位點(diǎn)對(duì) 根據(jù)折疊的周期數(shù)相應(yīng)改變。例如，第2個(gè)折疊周期中，支架DNA經(jīng)過的鏈交換位點(diǎn)對(duì)為每行 的第2個(gè)和第3個(gè)，支架DNA在完成所有折疊周期后，返回第1行螺旋的最后一個(gè)核苷酸處，第 1行螺旋首末核苷酸之間通過長單鏈DNA相連，以滿足支架DNA為環(huán)狀DNA的條件。
[0063]對(duì)于鏈交換周期為26的三維核酸結(jié)構(gòu)中的短鏈DNA，其排列位置參照如下規(guī)則:對(duì) 于第1至末行螺旋，自第14個(gè)核苷酸開始，依次放置緊挨（中間無空隙）的長度為26個(gè)核苷酸 的短鏈DNA進(jìn)行匹配形成雙螺旋，直至倒數(shù)第14個(gè)核苷酸的位置。所有短鏈DNA在螺旋結(jié)構(gòu) 中均以平行方式存在。對(duì)每一行螺旋，首尾將各有13個(gè)核苷酸未形成雙螺旋，以避免可能在 邊界產(chǎn)生的積聚現(xiàn)象。
[0064]上述三維核酸結(jié)構(gòu)的TEM圖像如圖6所示，其結(jié)構(gòu)尺寸與設(shè)計(jì)相符。
[0065]對(duì)于本發(fā)明涉及的其它形狀、大小的三維核酸結(jié)構(gòu)，均可以參照上述方法進(jìn)行設(shè) 計(jì)，三維核酸結(jié)構(gòu)可以包含2至100層雙螺旋，每層螺旋包含的螺旋數(shù)可以是2至100行，每行 螺旋可以包含60至3000個(gè)核苷酸。每條短鏈DNA的長度小于400個(gè)核苷酸。鏈交換周期可以 在4至416之間這樣。最終形成的三維核酸結(jié)構(gòu)在空間呈現(xiàn)為長方體的形狀。
[0066]以上設(shè)計(jì)過程和最終的支架DNA序列輸入、短鏈DNA序列輸出可在Cadnano軟件中 完成。毫無疑問，最終，我們可以設(shè)計(jì)具有特定長度和寬度的核酸結(jié)構(gòu)，并精確了解結(jié)構(gòu)中 每條短鏈DNA的位置和序列。借此，可以通過選擇性刪減短鏈DNA或?qū)μ囟ㄎ恢玫亩替淒NA進(jìn) 行修飾，獲得可控形狀、大小并具有孔穴或圖案的二維和三維圖形。
[0067] 3、具有孔穴的核酸結(jié)構(gòu)
[0068] 基于對(duì)核酸結(jié)構(gòu)中每條短鏈核苷酸的位置、長度的精確了解，可以通過排除指定 核酸結(jié)構(gòu)中一條或多條短鏈核苷酸，使得支架DNA在該位置不參與結(jié)構(gòu)形成以顯示出孔穴。 然后采用相同的退火過程，最終得到具有可控形狀、尺寸的孔穴的核酸結(jié)構(gòu)。
[0069] 考慮到可以直接排除核酸結(jié)構(gòu)中任意位置的短鏈核苷酸，所形成的孔穴包括方 形，多邊形，十字形以及其他規(guī)則或者不規(guī)則的形狀。由于AFM探針的精度有限，設(shè)計(jì)孔穴的 長寬應(yīng)在l〇nm以上以方便AFM的測(cè)量。因此，被刪去的短鏈DNA也具有一定的數(shù)量。在一些實(shí) 例中，可以通過刪除特定的20條短鏈核苷酸以形成十字形的孔穴，通過分別刪除特定位置 的60條和48條核苷酸形成代表"乾"和"坤"含義的孔穴。圖7和圖8分別顯示了帶有八卦中的 "乾"卦圖案和"坤"卦圖案的孔穴的鏈交換周期26的25螺旋核酸結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)示意圖。在設(shè)計(jì) 圖中，指定位置的短鏈DNA被直接刪去而不參與到退火過程中。通過短鏈DNA被刪去后形成 的孔穴來體現(xiàn)設(shè)計(jì)的圖案。圖9和圖10分別對(duì)應(yīng)"乾"和"坤"孔穴的核酸結(jié)構(gòu)的AFM圖像，其 孔穴出現(xiàn)位置和大小、形狀與設(shè)計(jì)相符，證明通過該方法可以獲得具有特定孔穴的核酸結(jié) 構(gòu)。
[0070] 本發(fā)明中的核酸結(jié)構(gòu)還考慮了通過修改支架DNA的折疊路徑形成孔穴的方法。支 架DNA在8個(gè)距離相鄰的鏈交換位點(diǎn)13個(gè)核苷酸的位置進(jìn)行鏈間交換(替代原有的距離為26 個(gè)核苷酸的鏈交換位點(diǎn)），因此形成一個(gè)長度為26個(gè)核苷酸，寬度為4個(gè)螺旋的孔穴區(qū)域?？?慮到核苷酸缺失可能引起的扭轉(zhuǎn)應(yīng)力，在該8個(gè)鏈交換位點(diǎn)的對(duì)應(yīng)位點(diǎn)之間，增加四個(gè)核苷 酸作為間隔序列，以消除影響。通過該方法可以形成特定大小、形狀的具有孔穴的核酸結(jié) 構(gòu)。并且由于支架DNA不再在孔穴區(qū)域存在，在AFM下觀察到的孔穴將更加接近理論尺寸。
[0071] 本發(fā)明中的二維核酸結(jié)構(gòu)還可以通過直接增加間隔序列來形成孔穴。支架DNA的 四個(gè)相同位置的鏈交換位點(diǎn)被刪除，而在相鄰的鏈交換位點(diǎn)處共增加4個(gè)長度為4個(gè)核苷酸 的間隔序列，形成一個(gè)長度為52個(gè)核苷酸，寬度為4個(gè)螺旋的孔穴區(qū)域。該方法同樣可以形 成具有特定大小、形狀的具有孔穴的核酸結(jié)構(gòu)。
[0072] 4、具有修飾的核酸結(jié)構(gòu)
[0073] 本發(fā)明中的核酸結(jié)構(gòu)可以在單個(gè)到多個(gè)結(jié)構(gòu)范圍內(nèi)的特定位點(diǎn)進(jìn)行化學(xué)修飾，具 有化學(xué)修飾的核酸可以作為短鏈DNA直接定位于特定位點(diǎn)，或者通過與短鏈DNA的不與支架 DNA配對(duì)的單鏈部分互補(bǔ)配對(duì)間接地定位于核酸結(jié)構(gòu)的特定位點(diǎn)。特定的化學(xué)修飾將特異 性的結(jié)合納米顆粒、多肽或者蛋白質(zhì)。所述納米顆粒包括但不限于鏈酶親和素，金顆粒、熒 光基團(tuán)等易于表征和呈現(xiàn)的粒子。修飾的呈現(xiàn)形式包括熒光信號(hào)和圖案等，所述圖案為字 母、數(shù)字和其他規(guī)則或不規(guī)則的樣式。
[0074] 鏈酶親和素與生物素的結(jié)合是目前已知的強(qiáng)度最高的非共價(jià)作用，而修飾有生物 素的短鏈DNA已得到商業(yè)化生產(chǎn)。對(duì)核酸結(jié)構(gòu)中每條短鏈核苷酸位置的精確了解提供了可 尋址性。因此，可以將結(jié)構(gòu)中特定位置的短鏈核苷酸延長一組序列，再將生物素修飾在與該 延長序列相匹配的短鏈核苷酸上，然后通過鏈酶親和素與生物素的特異性結(jié)合，在AFM下觀 測(cè)到修飾有預(yù)設(shè)圖案的核酸結(jié)構(gòu)?？紤]到可以對(duì)任意位置已知序列、長度的短鏈DNA進(jìn)行修 飾，該方法可以實(shí)現(xiàn)獲得修飾有任意預(yù)訂形狀的核酸結(jié)構(gòu)。
[0075] 在一些實(shí)例中，對(duì)于核酸結(jié)構(gòu)中所有需要生物素修飾的位點(diǎn)，其所處位置的短鏈 核苷酸在3 '端將延長兩個(gè)"T"作為間隔序列和一段含有15個(gè)核苷酸的序列 (GGAAGGGATGGAGGA)作為輔助序列，而3 '端生物素修飾的短鏈核苷酸則含有15個(gè)核苷酸，其 序列為TCCTCCATCCCTTCC-biotin，與該輔助序列相匹配。在退火過程前，將支架DNA、短鏈 DNA、含有生物素修飾的短鏈DNA混合在一起。在進(jìn)行AFM掃描前，將luM的鏈酶親和素加入到 待測(cè)樣品中，靜置10分鐘等待鏈酶親和素和生物素充分結(jié)合，即可觀測(cè)到修飾有特定圖案 的核酸結(jié)構(gòu)。
[0076]圖11顯示了基于該方法，修飾有字母"X"鏈交換周期為26個(gè)核苷酸的25螺旋核酸 結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)圖。如圖所示，字母"X"含有26個(gè)修飾位點(diǎn)，對(duì)修飾位點(diǎn)處的短鏈DNA增加兩個(gè) "T"作為間隔序列和15個(gè)核苷酸作為輔助序列，一段長為15個(gè)核苷酸3'端修飾有生物素的 短鏈DNA與該輔助序列相匹配并參與到退火過程中，最終附著于制備的核酸結(jié)構(gòu)中，使得鏈 酶親和素能在固定位置與生物素結(jié)合。圖12為與字母"X"對(duì)應(yīng)的核酸結(jié)構(gòu)的AFM圖像。其鏈 酶親和素結(jié)合位點(diǎn)和最終顯示圖案與設(shè)計(jì)相符，證明通過該方法可以實(shí)現(xiàn)獲得具有特定修 飾的核酸結(jié)構(gòu)。
[0077] 對(duì)于退火過程前的修飾，其前提應(yīng)保證此額外加入的短鏈DNA不會(huì)影響結(jié)構(gòu)的形 成。本發(fā)明還考慮了在退火過程后進(jìn)行修飾作為備選方案。例如，在退火完成后再將修飾有 生物素的短鏈DNA加入到樣品中，然后在37°下培育10分鐘。同樣地，在AFM掃描前加入鏈酶 親和素然后進(jìn)行觀測(cè)。
[0078] 5、支架 DNA
[0079] 本發(fā)明中采用的支架DNA為M13mpl8，M13mpl8為ml3噬菌體基因組DNA中一個(gè)環(huán)狀 單鏈DNA分子，共含有7249個(gè)核苷酸，已經(jīng)獲得商業(yè)化生產(chǎn)。
[0080] 6、短鏈 DNA
[0081] 本發(fā)明中核酸結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)和制備過程涉及數(shù)百條不同的短鏈DNA，短鏈DNA可以通 過其長度、序列進(jìn)行表征，并由其在結(jié)構(gòu)中的位置和支架DNA的序列決定，遵循堿基互補(bǔ)配 對(duì)原則。對(duì)于單個(gè)核酸結(jié)構(gòu)，其包含的每條短鏈DNA是獨(dú)特的，僅在結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)一次;對(duì)于不 同的核酸的結(jié)構(gòu)，短鏈DNA可以相同。
[0082]短鏈DNA可以在體外合成，自動(dòng)化合成短鏈DNA的方法在本領(lǐng)域是已知的并且已經(jīng) 商業(yè)化運(yùn)營。
[0083]本發(fā)明提供了多個(gè)核酸結(jié)構(gòu)，此多個(gè)結(jié)構(gòu)可以具有不同程度的同質(zhì)性，預(yù)期多個(gè) 核酸結(jié)構(gòu)中有一定百分比的結(jié)構(gòu)就大小、形狀、復(fù)雜性而言彼此相同，也可以是具有某一特 征的結(jié)構(gòu)中至少50%、60%、70%是同質(zhì)的。在一些情況下，多個(gè)核酸結(jié)構(gòu)其成員可以是基 本上單分散的，基本上單分散指的是至少50%、60%、70%具有大約相同的大小、形狀、復(fù)雜 度。
[0084]核酸結(jié)構(gòu)的大小可以通過其二維或三維維度表示，此維度可以是納米甚至亞微米 級(jí)別的尺寸。在一些實(shí)例中，二維核酸結(jié)構(gòu)為約200nm乘40nm;三維核酸結(jié)構(gòu)為約62nm乘 26nm乘19nm。核酸結(jié)構(gòu)的大小還可以呈現(xiàn)為其包含的雙螺旋數(shù)和每一行螺旋含有的核苷酸 數(shù)。例如本發(fā)明中的某一二維結(jié)構(gòu)含有11行雙螺旋，每行雙螺旋包含1154個(gè)核苷酸。
[0085]本發(fā)明通過在單個(gè)退火反應(yīng)中混合支架DNA與短鏈DNA，以獲得所需大小、形狀、復(fù) 雜度和修飾的核酸結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，可以對(duì)反應(yīng)容器實(shí)施高溫，隨后緩慢冷卻進(jìn)行 退火，高溫可以是約90度，85度，80度的溫度，冷卻過程可以將溶液冷卻至室溫，10°C，4°C甚 至更低。冷卻期可以是10小時(shí)，15小時(shí)，25小時(shí)甚至更久。在另一些實(shí)例中，可以對(duì)反應(yīng)容器 實(shí)施恒溫處理，恒溫可以是約65°C，60°C，55°C，恒溫期可以是10小時(shí)，15小時(shí)，25小時(shí)甚至 更久。
[0086]多個(gè)核酸結(jié)構(gòu)的同質(zhì)性程度可以使用許多技術(shù)進(jìn)行測(cè)定，包括但不限于AFM，TEM 和凝膠電泳。如實(shí)例中所述，這些技術(shù)已用于對(duì)所得核酸結(jié)構(gòu)的同質(zhì)性測(cè)定。
[0087]在圖1、圖4、圖7、圖8、圖11中，短鏈DNA分別用a、d、e開頭、后面加數(shù)字編號(hào)的方式 標(biāo)示，如al. 1。相應(yīng)短鏈DNA的序列列于序列表中。例如al. 1的序列如SEQ ID N03所示。 [0088] 7、合成方法
[0089]本發(fā)明提供了通過退火過程合成核酸結(jié)構(gòu)的方法，將支架DNA和短鏈DNA混合后， 可以在單個(gè)容器但不限于管、孔、小瓶中進(jìn)行混合。溶液一般是緩沖的，但退火反應(yīng)也可以 在沒有緩沖溶液的情況下進(jìn)行。緩沖溶液可以包含二價(jià)陽離子但不限于Mg 2+。陽離子濃度通 常為5至20mM，但也可以改變。溶液通常包含EDTA或其它酶抑制劑，以阻止核苷酸的降解。在 退火的混合溶液中，短鏈DNA的濃度取決于支架DNA的濃度，通常為支架DNA摩爾濃度的5至 20倍，支架DNA可以使用10nM的摩爾濃度。整個(gè)退火混合液的體積可以是20ul，30ul或者更 尚。
[0090] 退火反應(yīng)通過使溶液加熱并緩慢冷卻來執(zhí)行。加熱溫度應(yīng)足夠高，確保短鏈DNA不 會(huì)與非互補(bǔ)序列進(jìn)行結(jié)合，并使任何不希望有的二級(jí)結(jié)構(gòu)例如發(fā)夾結(jié)構(gòu)解鏈?？梢酝ㄟ^將 反應(yīng)容器置于熱水浴、PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)器)或其他溫控裝置中進(jìn)行加熱。容器可以在高 溫下培育數(shù)秒或數(shù)分鐘。一般來說，1至20分鐘的培育是足夠的。
[0091] 在高溫下的培育完成后，溫度可以以許多方式下降，可以使用自動(dòng)化控制的方法， 即在某一溫度維持一段時(shí)間，隨后下降一度或多度，繼續(xù)維持一段時(shí)間，以此方式一直進(jìn)行 直至控制程序設(shè)定的最低溫度。
[0092] 可以對(duì)反應(yīng)容器實(shí)施高溫，隨后緩慢冷卻進(jìn)行退火，高溫可以是約90度左右，冷卻 過程可以將溶液冷卻至室溫甚至更低。冷卻期可以是10小時(shí)，15小時(shí)，25小時(shí)甚至更久。 [0093] 退火反應(yīng)也可以通過對(duì)溶液進(jìn)行恒溫處理來執(zhí)行，恒溫溫度通常在65°C至55°C之 間，恒溫時(shí)間通常在10小時(shí)以上。
[0094] 實(shí)施例描述了一個(gè)具體的退火過程。將10nM的支架DNA與200nM的多條短鏈DNA混 合在Tris-EDTA/lOmM Mg2+緩沖溶液中，將溶液加熱至90°C，隨后經(jīng)過約26小時(shí)的退火緩慢 冷卻至4°C。
[0095] 可用于退火過程的另外一組條件還包括Te/Mg2+緩沖液（10mM Tris、PH 8.0、2mM EDTA、15mM Mg2+)以及在60 °C下恒溫24小時(shí)。
[0096] 退火過程無需嚴(yán)格控制短鏈DNA和支架DNA的濃度，也無需嚴(yán)格遵守化學(xué)計(jì)量學(xué)。
[0097] 退火結(jié)束后，反應(yīng)混合物可以直接進(jìn)行分析或者進(jìn)一步分離。可以通過1-2%非變 性瓊脂凝膠電泳分離反應(yīng)混合物，以使目標(biāo)結(jié)構(gòu)與其他結(jié)構(gòu)在物理上分開。通常我們會(huì)觀 察到單個(gè)顯著條帶，條帶可以由凝膠中提取并經(jīng)由離心去除短鏈DNA和其它雜質(zhì)進(jìn)一步純 化，純化后的產(chǎn)物可以通過AFM或TEM成像，此類成像能反應(yīng)目標(biāo)產(chǎn)物的尺寸和形狀，揭示預(yù) 知結(jié)構(gòu)的形成。純化產(chǎn)物也可以再次執(zhí)行凝膠電泳并觀察到預(yù)期的單個(gè)條帶。
[0098] 退火過程的效率可以通過AFM視野中所有"充分形成"的結(jié)構(gòu)的百分比進(jìn)行測(cè)定。 如果核酸結(jié)構(gòu)沒有直徑大于l〇nm的缺陷，則它被視為"充分形成的"。依據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)，本發(fā)明 中所有的核酸結(jié)構(gòu)均有80 %以上的"充分形成"的AFM "產(chǎn)率考慮到樣品在沉積在云母表 面或AFM探針對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行掃描時(shí)可能經(jīng)受的損害，這可能是低于實(shí)際情況的一個(gè)數(shù)字。 [0099] 8、Cadnano軟件操作流程：
[0100]通過Cadnano繪制本發(fā)明中的核酸結(jié)構(gòu)的流程如下：
[0101] 8.1圖形設(shè)計(jì)
[0102] 在軟件的上半部分，根據(jù)需要選擇螺旋數(shù)。在下半部分，每一行雙排網(wǎng)格對(duì)應(yīng)一行 螺旋，以此方式來表示二維或三維結(jié)構(gòu)，即上半部分為整體結(jié)構(gòu)的側(cè)視圖。下半部分為俯視 圖。在確定好螺旋數(shù)后，可以直接在俯視圖上進(jìn)行繪制。根據(jù)設(shè)計(jì)要求，依據(jù)5'至3'的折疊 方向，繪制好支架DNA的折疊路徑后，再依次補(bǔ)上與特定位置進(jìn)行匹配的短鏈DNA，多余的核 苷酸放置在第一行螺旋的回路(loop)中，完成結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)。
[0103] 8.2序列輸入與輸出
[0104]選擇支架DNA中某一處核苷酸作為5'方向的起點(diǎn)，輸入已知的支架DNA的序列，即 可得到每一條短鏈DNA的特定序列。軟件可生成含有所有短鏈DNA序列的EXCEL格式文件。 [0105] 9、具體實(shí)施方法
[0106] 實(shí)施例1:
[0107]如圖13所示，本發(fā)明涉及的制備過程包含以下步驟：
[0108] 1、樣品制備：
[0109]短鏈DNA由Bioneer公司合成，等體積吸取形成單個(gè)核酸結(jié)構(gòu)所需的全部短鏈DNA， 補(bǔ)充DEPC水使得最終的混合溶液中每條短鏈DNA的濃度為500nM。稀釋倍數(shù)取決于制造商規(guī) 格單中的起始濃度而不執(zhí)行額外的內(nèi)部校正，因此短鏈DNA的化學(xué)計(jì)量學(xué)無需精確控制。 [0110]支架DNA中的M13mpl8采購自NEB公司，其加入適量純水使起始的支架DNA濃度為 ΙΟΟηΜο
[0111] 2、退火反應(yīng)
[0112] 將ΙΟηΜ支架DNA與200nM的短鏈DNA混合在緩沖溶液（10mM Tris、pH 8.0、2mM EDTA、10mM Mg2+)中，施以退火程序使反應(yīng)容器從90°C緩慢冷卻至4°C。溫度變化過程為:90 °C停留10分鐘，在90 °C至60 °C之間以5min/ °C下降，在60 °C至4 °C之間以25min/ °C下降。將退 火后的樣品應(yīng)用于置于冰水浴中的2%瓊脂凝膠電泳(使用Gel red染色，緩沖液為0.5 X TBE/10mM MgCi2)。隨后切割下目標(biāo)凝膠帶，使用細(xì)研磨棒將凝膠帶擠壓成小塊，在lOOOg下 離心3分鐘，回收已被純化的目標(biāo)產(chǎn)物。
[0113] 3、AFM 成像
[0114] 退火后的混合溶液可以直接進(jìn)行AFM成像，也可使用凝膠電泳純化后再進(jìn)行測(cè)量。 本發(fā)明采用的AFM成像儀器為Bruke公司的mu 11imode 8。將退火或凝膠電泳純化后的樣品 稀釋5倍，取2ul滴加在剛撕平的云母表面，隨后加50ul ΙΧΤΕ/lOmM Mg2+，以促進(jìn)核酸結(jié)構(gòu) 的沉降，也可根據(jù)實(shí)際情況改變樣品的稀釋比例或滴加體積以滿足核酸結(jié)構(gòu)在視野中有合 適的排布比例(視野中多數(shù)核酸結(jié)構(gòu)可以清楚辨識(shí)，無堆積現(xiàn)象）。使用帶有SNL-10氮化硅 懸臂的AFM在液相智能掃描模式(ScanAsyst in Fluid)下進(jìn)行掃