專利名稱：藍萼甲素衍生物、制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藍萼甲素(GLA)衍生物，特別涉及含有多肽的藍萼甲素(GLA)衍生物。本發(fā)明還涉及所述含有多肽的藍萼甲素(GLA)衍生物的制備方法及其在治療癌 癥中的應用。
背景技術(shù)：
香茶菜為唇形科香茶菜屬植物，廣泛分布于河南、湖北、四川、貴州、陜西、山西、河 北等省。全草具有抗菌、消炎等作用，民間用于治療急性黃疽型肝炎、急性膽囊炎、跌打損 傷、毒蛇咬傷、膿疙疹等。其藥理作用未見報道。對鄂西香茶菜粗制劑進行了藥理作用的研 究，結(jié)果表明其對體內(nèi)和體外的艾氏腹水癌腫瘤細胞有明顯的抑制作用。唇形科香茶菜屬植物。在亞洲東部和非洲西部廣為分布，全世界約有150種，我國 約有90種25個變種。其中約有30種民間作為藥用，作為清熱解毒、抗癌消炎、健脾、活血、 杭菌藥來使用。人們對該屬植物的-菇類成分作了研究，已從中提取了百余種藥類成分。經(jīng) 藥理篩選發(fā)現(xiàn)許多二萜化合物具有細胞毒、抗腫瘤、杭炎活性作用。在研究中還發(fā)現(xiàn)該屬植 物除含二萜成分外，還富含三萜，脂肪酸以及少量的黃酮、倍半萜、鏈烴等。藍萼香茶菜是唇形科香茶菜屬植物，分布在我國的東北、華北，朝鮮.日本，原蘇 聯(lián)遠東地區(qū)，吉林省資源尤其豐富。藍萼香茶菜具有健胃、清熱解毒、活血、抗菌消炎和抗癌 活性，用于胃炎、肝炎初起、感冒發(fā)熱、乳腺炎、關(guān)節(jié)痛等疾病。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)全草對心血管 有一定的作用，而其中的有效成分對血小板聚集及癌癥有一定的影響。從上世紀80年代至 今各國學者對其藥理及化學等各方面進行了研究，以我國學者研究的較多。1981年許云龍等人從藍萼香茶菜中提取出藍萼甲素(glaucocalyxinA)和藍萼乙 素(glaucocalyxinB)，從光譜中推斷藍萼甲素具有香茶菜屬二萜典型的巧一氧_16 —貝殼 杉烯(ent-15-OXO-I6-kaurene)骨架，而藍萼乙素是藍萼甲素的14 一乙?；?，把兩者分 別乙酰化，得到相同的乙?；?，從而證實了兩者的相互關(guān)系。隨后趙全成也從吉林產(chǎn)藍萼 香茶菜中分得這兩種二萜。1988年劉晨江等從北京地區(qū)產(chǎn)藍萼香茶菜中分得甲素和乙素外，還分得藍萼丙素 (glaucocalyxinC)，結(jié)構(gòu)為對映 _7p，14a, 15a-三羥基-16-貝殼杉 酮。Dongsa kimls, 除了從中分出藍萼甲素、藍萼乙素和藍萼丙素，還分出了兩種新二萜glaucocalyxinD和 glaucocalyxinE并列出了這五種化合物的結(jié)構(gòu)紅外紫外吸收值、最主要的1H—核磁共振、 13C 一核磁共振化學位移值及質(zhì)譜數(shù)據(jù)值。金永日等從藍萼香茶菜根中分得了藍萼甲素，另外王先榮等從安徽產(chǎn)王棗子〔 Isodonamethystoides(Benth)CyffuetHsuan)中也分得藍萼甲素。王慧芬等人用反相高效 液相色譜法外標法對不同部位及不同采集期的藍萼香茶菜中藍萼甲素的含量進行了測定， 結(jié)果表明葉中藍萼甲素遠高于根、莖。不同采集期以7-8月份含量高，9月末含量下降。張 元桐等也采用反相HPLC測定藍萼甲素含量，測得藍萼甲素含量為1.03%，平均回收率為 99.2%。趙全成從藍萼香茶菜中分得p—谷留醇和熊果酸。藍萼香茶菜用乙醇提取后經(jīng)硅膠柱層析和HPLC制備柱層析分離得到4個化合物齊墩果酸，阿江欖仁酸，毛花獼猴酸B和 熊果酸。代桂明玉等人從藍萼香茶菜中還分得蘆丁和和胡蘿卜甙。楊學儉等用日本島津AA-670型原子吸收分光光度計，以中科院環(huán)化所提供的桃 葉為標準參照物，對藍萼香茶菜的根、莖、葉分別進行測定發(fā)現(xiàn)藍尊香茶菜的莖、葉中Fe， Cu, Mn, Se的含量都是較高的，現(xiàn)代醫(yī)學研究已經(jīng)證明，這些元素的存在對防治癌癥及其它 一些疾病是有作用的，提示藍萼香茶菜在此方面有一定作用。后有人用ICP-AES儀測定了 河北藍萼香茶菜不同部位多種元素的含量，發(fā)現(xiàn)其葉中5種宏量元素K，Na, P，Ca, Mg的含 量高于根和莖，8種微量元素Zn，F(xiàn)e, S，Ba, Li，Al，V，Ti的含量也是葉中偏高，首次發(fā)現(xiàn)香 茶菜葉中含有稀土元素Ce，Y，Yb，數(shù)據(jù)提示多年生草本植物藍萼香茶菜的最佳藥用部分可 能是葉。劉蘭娣等研究了藍萼香茶菜對大鼠全心缺血一再灌注時心肌C-F0S基因表達的 影響。采用dortl離體全心缺血一再灌注損傷模型，免疫組化法，用相應C-fos抗體檢測心 肌細胞中C-fos基因表達情況，用計算機圖像分析系統(tǒng)分析C-fos基因表達情況，藍萼香茶 菜生藥用乙醇回流3次提取，提取液回收乙醇，濃縮后加到0. 5%淀粉糊中，揮去乙醇，濃度 為lKg/L，分為高中低三種不同濃度的香茶菜對缺血一再灌注全心進行預灌注，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其 能明顯減少凋亡相關(guān)基因C-fos基因的表達，表明心肌缺血一再灌注損傷輕，心肌受到一 定的保護，同時發(fā)現(xiàn)高濃度藍萼香茶菜具有一定的心肌細胞毒性作用。其具有與劑量相關(guān) 的心肌保護作用，但并非濃度越大越有效。綜上所述，藍萼香茶菜在我國資源豐富?；瘜W研究表明其含有二萜和三萜成分，但 其中以二萜成分藍萼甲素為其主要的活性成分，具有抗血小板聚集的作用。因其母核為對 映貝殼杉烯型的，相似于冬凌草甲素(oridonin)，故可能具有一定的抗癌作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供能治療癌癥、特別是治療肺癌、肝癌、鼻咽癌、淋巴瘤、 黑色素瘤和骨髓性白血病的藍萼甲素(GLA)衍生物，該藍萼甲素(GLA)衍生物特別對肺癌 具有靶向作用，從而提供一種即可以治療多種癌癥就可以針對性的治療肺癌的藥物。本發(fā)明的目的之二在于提供一種制備藍萼甲素(GLA)衍生物的制備方法，從而避 免單純的采用有機合成所帶來的毒副作用較大的缺陷，并且避免單純的采用原料提純多帶 來的藥效較低、無法針對性治療某一特定癌癥的缺陷。本發(fā)明所公開的藍萼甲素(GLA)衍生物是一種二萜類物質(zhì)，具有貝殼杉烷型結(jié) 構(gòu)、羰基、多肽cNGQGEQc和/或羥基，其分子結(jié)構(gòu)的通式如下 其中，隊為-cNGQGEQc或 _0H，R2 為-cNGQGEQc 或-OH。其中，以下三種結(jié)構(gòu)對治療癌癥、特別是治療肺癌、肝癌、鼻咽癌、淋巴瘤、黑色素 瘤和骨髓性白血病具有良好的效果。其中通過乙?；磻攵嚯腸NGQGEQc，來對主體二 萜進行結(jié)構(gòu)修飾，從而使得修飾后的藍萼甲素(GLA)，即藍萼甲素(GLA)衍生物對肺癌具有 靶向作用。

所述藍萼甲素(GLA) (C20H2804)的分子結(jié)構(gòu)如下 本發(fā)明采用香茶菜藥材(地上部分)作為原料，進行粉碎、提取、溶液處理、過柱、 重結(jié)晶等得到藍萼甲素(GLA)，再和多肽cNGQGEQc進行進一步的乙?；磻?，得到所述藍 萼甲素(GLA)衍生物。所述的藍萼甲素(GLA)衍生物的制備方法，具體包含以下步驟步驟1 粉碎取香茶菜藥材(地上部分)粉碎至20目 50目。步驟2 提取步驟2. 1 將步驟1所得的粉碎物與95%乙醇(A. R.)按照體積比1 6至1 10 混合，加熱，在80°C 90°C溫度條件下回流1 2小時，提取、過濾，得到提取液和剩余物。步驟2. 2 將步驟2. 1所得的剩余物與95 %乙醇(A. R.)按照體積比1 6至1 10混合，加熱，在80°C 90°C溫度條件下回流1 2小時，提取、過濾，得到提取液和剩 余物，重復該步驟1 3次。步驟2. 3 合并步驟2. 1和2. 2所得的提取液。步驟3 溶劑處理步驟3. 1 將步驟2所得的提取液加熱，在55°C 65°C溫度條件下減壓濃縮，回收 乙醇并得到粘稠的初級濃縮物。步驟3.2 將步驟3. 1所得的初級濃縮物與水按照體積比1 8 1 10混合， 在室溫條件下以60 120轉(zhuǎn)/分的速度攪拌10分鐘，隨后靜置6 12小時，棄去上清液 得到下層固體。步驟3. 3 將步驟3. 2所得的固體與乙酸乙酯(A. R.)按照體積比1 4 1 6 混合，在25°C 35°C溫度條件下以60 120轉(zhuǎn)/分的速度攪拌溶解，靜置1 3小時，過 濾得到濾液和不溶物。步驟3. 4 將步驟3. 3所得的不溶物與乙酸乙酯(A. R.)按照體積比1 4 1 6 混合，在25°C 35°C溫度條件下以60 120轉(zhuǎn)/分的速度攪拌溶解，靜置1 3小時，過 濾得到濾液和不溶物，重復該步驟1 3次。步驟3. 5 合并步驟3. 3和3. 4所得的濾液。步驟3. 6 將步驟3. 5所得的濾液加熱，在35°C 45°C溫度條件下減壓濃縮，回收 乙酸乙酯(A. R.)，得到固體濃縮物。步驟4:過柱步驟4. 1 將步驟3所得的固體濃縮物與95 %乙醇(A. R.)按照體積比1 4 1 6混合溶解，得到溶液。步驟4. 2 將步驟4. 1所得的溶液緩慢加到樹脂柱中，觀察樹脂的顏色，在樹脂柱 有2/3變色時，停止加樣，并采用200ml 400ml的95%乙醇(A. R.)沖洗該樹脂柱，收集所 有流出液，所述樹脂柱的填充物為強堿性陰離子樹脂并用氫氧化鈉飽和至PH值中性。步驟4. 3 將步驟4. 2所得流出液加熱，并在55°C 65°C溫度條件下減壓回流，直 至溶劑干，得到固體殘留物。步驟5:重結(jié)晶步驟5. 1 將上述殘留物與30°C的 40°C的極性溶劑按照體積比1 4 1 6 混合，得到初級溶液，加熱，在30°C的 40°C溫度條件下減壓濃縮，在-5°C _8°C溫度條件 下靜置析晶，過濾得到黃色針狀結(jié)晶。所述極性溶劑為按照體積比1 1 1 2混合的氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的
混合溶液。步驟5. 2:將步驟5.1所得的結(jié)晶與極性溶劑按照體積比1 4 1 6混合， 在-5°C _8°C溫度條件下反復重結(jié)晶2 4次，得到濃縮物。所述極性溶劑為按照體積比1 1 1 4混合的氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的 混合溶液。步驟6:分離提純步驟6. 1 將步驟5所得的濃縮物加入20ml乙酸乙酯(A. R.)溶解，加入200-300 目硅膠，混合均勻，室溫揮發(fā)干燥，除去溶劑乙酸乙酯(A. R.)。
所述硅膠的加入量為所述濃縮物重量的3倍。步驟6. 2 濕法填裝一根層析硅膠柱，所述硅膠用量為步驟5所得的濃縮物重量的 20倍，柱子徑高比為1 12，并采用2BV氯仿(A.R.)反復沖洗硅膠柱。步驟6. 3 將步驟6. 1所得的混有硅膠的濃縮物加入到步驟6. 2所得的硅膠柱中， 采用2BV氯仿(A. R.)沖洗且流速為1. 5BV/小時。步驟6. 4 采用3BV氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的混合溶液沖洗所述硅膠柱，并采 用TLC薄層分析方法檢驗目標餾分藍萼甲素(GLA)，在檢驗到相應餾分的時候，采用6BV氯 仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液沖洗，收集含有藍萼甲素(GLA)主成分的餾分。所述的3BV的氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液中，氯仿(A. R.)和丙酮 (A.R.)的體積比為20 1。所述的6BV的氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的混合溶液中，氯仿(A. R.)和丙酮 (A.R.)的體積比為10 1。步驟6. 5 將步驟6. 4所得的餾分合并，在30°C 40°C溫度條件下減壓濃縮，回收 溶劑，將所得的濃縮物用氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的混合溶液重結(jié)晶，得到白色針狀晶體 藍萼甲素(GLA)。所述氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液的用量與所述餾分的體積比為 8 1 12 1。所述的氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的混合溶液中，氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的 體積比為1 1 1 4。步驟7 合成步驟7. 1 將步驟6所得的藍萼甲素(GLA)和多肽(cNGQGEQc)按照每8 17g藍 萼甲素(GLA)、0. 7 2. 3g多肽(cNGQGEQc)和80 150ml無水極性溶劑的比例混合得到 混合液，所述無水極性溶劑為甲醇(A. R.)、乙醇(A. R.)、二氯甲烷(A. R.)中的一種。步驟7. 2 將步驟7. 1所得的混合溶液加熱，在60°C 80°C溫度條件下攪拌冷凝 回流6 10小時，趁熱抽濾，室溫下靜置，析出晶體，過濾，分離出晶體，得到藍萼甲素(GLA) 衍生物。經(jīng)高效液相色譜、LC_MS、NMR分析確認所得晶體為含有多肽cNGQGEQc的藍萼甲素 (GLA)衍生物。本發(fā)明同時公開了所述含有多肽cNGQGEQc的藍萼甲素(GLA)衍生物在治療癌癥 中的應用，特別是在治療肺癌、肝癌、鼻咽癌、淋巴瘤、黑色素瘤和骨髓性白血病中的應用。 由于該藍萼甲素(GLA)衍生物是以藍萼甲素(GLA)為基礎(chǔ)并采用多肽cNGQGEQc通過乙酰 化反應對藍萼甲素(GLA)進行結(jié)構(gòu)修飾所得到，其對于肺癌具有良好的靶向作用。本發(fā)明所公開的前述任一結(jié)構(gòu)的藍萼甲素(GLA)衍生物可以采用藥劑學上的常 規(guī)藥物載體制成任何一種劑型，包括但不限于片劑、膠囊劑、軟膠劑、噴霧劑、凝膠劑、凝膠 吸入劑、口服齊IJ、混懸齊IJ、沖齊IJ、貼齊IJ、軟膏、丸齊IJ、散劑、注射齊IJ、輸液齊IJ、凍干注射齊IJ、脂質(zhì)體 注射劑、靶向給藥注射劑、栓劑、緩釋制劑或控釋制劑。優(yōu)選為凍干注射劑。


圖1是本發(fā)明的藍萼甲素(GLA)的分子結(jié)構(gòu)式。
圖2是本發(fā)明的藍萼甲素(GLA)衍生物的分子結(jié)構(gòu)通式。圖3a 3c是本發(fā)明的三種藍萼甲素(GLA)衍生物的分子結(jié)構(gòu)式。
具體實施例方式根據(jù)本發(fā)明的權(quán)利要求和發(fā)明內(nèi)容所公開的內(nèi)容，本發(fā)明的技術(shù)方案具體如下所 述。實施例一藍萼甲素(GLA)衍生物的制備以下所制備過程中所采用的各化學試劑如無特別標注，則為分析純。采用香茶菜藥材(地上部分)作為原料，提純藍萼甲素(GLA)，并采用多肽 cNGQGEQc修飾其結(jié)構(gòu)，制備藍萼甲素(GLA)衍生物的制備方法，具體包含以下步驟步驟1 粉碎取香茶菜藥材(地上部分)粉碎至20目 50目。步驟2:提取步驟2. 1 將步驟1所得的粉碎物與95%乙醇(A. R.)按照體積比1 6至1 10 混合，加熱，在80°C 90°C溫度條件下回流1 2小時，提取、過濾，得到提取液和剩余物。步驟2. 2 將步驟2. 1所得的剩余物與95 %乙醇(A. R.)按照體積比1 6至 1 10混合，加熱，在80°C 90°C溫度條件下回流1 2小時，提取、過濾，得到提取液和剩 余物，重復該步驟1 3次。步驟2. 3 合并步驟2. 1和2. 2所得的提取液。步驟3 溶劑處理步驟3. 1 將步驟2所得的提取液加熱，在55°C 65°C溫度條件下減壓濃縮，回收 乙醇并得到粘稠的初級濃縮物。步驟3.2 將步驟3. 1所得的初級濃縮物與水按照體積比1 8 1 10混合， 在室溫條件下以60 120轉(zhuǎn)/分的速度攪拌10分鐘，隨后靜置6 12小時，棄去上清液 得到下層固體。步驟3. 3 將步驟3. 2所得的固體與乙酸乙酯(A. R.)按照體積比1 4 1 6 混合，在25°C 35°C溫度條件下以60 120轉(zhuǎn)/分的速度攪拌溶解，靜置1 3小時，過 濾得到濾液和不溶物。步驟3. 4 將步驟3. 3所得的不溶物與乙酸乙酯(A. R.)按照體積比1 4 1 6 混合，在25°C 35°C溫度條件下以60 120轉(zhuǎn)/分的速度攪拌溶解，靜置1 3小時，過 濾得到濾液和不溶物，重復該步驟1 3次。步驟3. 5 合并步驟3. 3和3. 4所得的濾液。步驟3. 6 將步驟3. 5所得的濾液加熱，在35°C 45°C溫度條件下減壓濃縮，回收 乙酸乙酯(A. R.)，得到固體濃縮物。步驟4:過柱步驟4. 1 將步驟3所得的固體濃縮物與95 %乙醇(A. R.)按照體積比1 4 1 6混合溶解，得到溶液。步驟4. 2 將步驟4. 1所得的溶液緩慢加到樹脂柱中，觀察樹脂的顏色，在樹脂柱 有2/3變色時，停止加樣，并采用200ml 400ml的95%乙醇(A. R.)沖洗該樹脂柱，收集所有流出液，所述樹脂柱的填充物為強堿性陰離子樹脂并用氫氧化鈉飽和至pH值中性。所述樹脂柱采用7號樹脂柱，柱徑比1 12。步驟4. 3 將步驟4. 2所得流出液加熱，并在55°C 65°C溫度條件下減壓回流，直 至溶劑干，得到固體殘留物。步驟5:重結(jié)晶步驟5. 1 將上述殘留物與30°C的 40°C的極性溶劑按照體積比1 4 1 6 混合，得到初級溶液，加熱，在30°C的 40°C溫度條件下減壓濃縮，在-5°C _8°C溫度條件 下靜置析晶，過濾得到黃色針狀結(jié)晶。所述極性溶劑為按照體積比1 1 1 2混合的氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的
混合溶液。步驟5. 2:將步驟5.1所得的結(jié)晶與極性溶劑按照體積比1 4 1 6混合， 在-5°C _8°C溫度條件下反復重結(jié)晶2 4次，得到藍萼甲素(GLA)。所述極性溶劑為按照體積比1 1 1 4混合的氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的 混合溶液。步驟6:分離提純步驟6. 1 將步驟5所得的濃縮物加入20ml乙酸乙酯(A. R.)溶解，加入200-300 目硅膠，混合均勻，室溫揮發(fā)干燥，除去溶劑乙酸乙酯(A. R.)。所述硅膠的加入量為所述濃縮物重量的3倍。步驟6. 2 濕法填裝一根層析硅膠柱，所述硅膠用量為步驟5所得的濃縮物重量的 20倍，柱子徑高比為1 12，并采用2BV氯仿(A.R.)反復沖洗硅膠柱。步驟6. 3 將步驟6. 1所得的混有硅膠的濃縮物加入到步驟6. 2所得的硅膠柱中， 采用2BV氯仿(A. R.)沖洗且流速為1. 5BV/小時。步驟6. 4 采用3BV氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的混合溶液沖洗所述硅膠柱，并采 用TLC薄層分析方法檢驗目標餾分藍萼甲素(GLA)，在檢驗到相應餾分的時候，采用6BV氯 仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液沖洗，收集含有藍萼甲素(GLA)主成分的餾分。所述的3BV的氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的混合溶液中，氯仿(A. R.)和丙酮 (A.R.)的體積比為20 1。所述的6BV的氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的混合溶液中，氯仿(A. R.)和丙酮 (A.R.)的體積比為10 1。步驟6. 5 將步驟6. 4所得的餾分合并，在30°C 40°C溫度條件下減壓濃縮，回收 溶劑，將所得的濃縮物用氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的混合溶液重結(jié)晶，得到白色針狀晶體 藍萼甲素(GLA)。所述氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液的用量與所述餾分的體積比為 8 1 12 1。所述的氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的混合溶液中，氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的 體積比為1 1 1 4。步驟7:合成步驟7. 1 將步驟6所得的藍萼甲素(GLA)和多肽(cNGQGEQc)按照每8 17g藍 萼甲素(GLA)、0. 7 2. 3g多肽(cNGQGEQc)和80 150ml無水極性溶劑的比例混合得到混合液，所述無水極性溶劑為甲醇(A. R.)、乙醇(A. R. )、二氯甲烷(A. R.)中的一種。步驟7. 2 將步驟7. 1所得的混合溶液加熱，在60°C 80°C溫度條件下攪拌冷凝 回流6 10小時，趁熱抽濾，室溫下靜置，析出晶體，過濾，分離出晶體，得到藍萼甲素(GLA) 衍生物。經(jīng)高效液相色譜、LC-MS、NMR分析確認所得晶體為含有多肽cNGQGEQc的藍萼甲素 (GLA)衍生物。實施例二藍萼甲素(GLA)衍生物的制備采用以下技術(shù)參數(shù)改進實施例一的制備方法所述步驟2. 1中，是將所述粉碎物與95 %乙醇(A. R.)按照體積比1 6.5混合， 加熱，在82°C溫度條件下回流1. 8小時，再提取過濾。所述步驟2. 2中，是將所述剩余物與95 %乙醇(A. R.)按照體積比1 9.5混合， 加熱，在88°C溫度條件下回流1. 2小時，再提取過濾，重復該步驟1次。所述步驟3. 1中，是將所述提取液加熱，在57°C溫度條件下減壓濃縮。所述步驟3. 2中，是將所述初級濃縮物與水按照體積比1 8. 5混合，在室溫條件 下攪拌并隨后靜置11小時才分離上清液和固體。所述步驟3. 3中，是將所述固體與乙酸乙酯(A. R.)按照體積比1 5. 5混合，在 27°C溫度條件下攪拌溶解，靜置1. 5小時再過濾。所述步驟3. 4中，是將所述不溶物與乙酸乙酯(A. R.)按照體積比1 4. 5混合， 在33°C溫度條件下攪拌溶解，靜置2. 5小時再過濾，重復該步驟3次。所述步驟3. 6中，是將所述濾液加熱，在37°C溫度條件下減壓濃縮。所述步驟4. 1中，是將所述固體濃縮物與95%乙醇(A. R.)按照體積比1 4. 5混
合溶解。所述步驟4. 2中，采用的樹脂柱為填充物為強堿性陰離子樹脂、并用氫氧化鈉飽 和至pH值中性的樹脂柱。所述步驟4. 2中，當所述樹脂柱有2/3變色時，停止加樣，并采用240ml的95%乙 醇(A. R.)沖洗所述樹脂柱。所述步驟4. 3中，是將所述流出液加熱，并在57°C溫度條件下減壓回流。所述步驟5.1和5. 2中，所述極性溶劑混合為按照體積比1 1.2混合的氯仿 (A. R.)和丙酮(A. R.)的混合溶液。所述步驟5.1中，是將所述殘留物與31°C的極性溶劑按照體積比1 5. 5混合。所述步驟5. 1中，是將所述初級溶液加熱，在31°C溫度條件下減壓濃縮，在_7°C溫 度條件下靜置析晶。所述步驟5. 2中，是將所述結(jié)晶與極性溶劑按照體積比1 4.5混合，在_61溫度 條件下反復重結(jié)晶4次。所述步驟6. 5中，是在32°C溫度條件下減壓濃縮，減壓濃縮過程中所述氯仿 (A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液的用量與所述餾分的體積比為11.5 1。所述步驟6. 5中，所述的氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的混合溶液中，氯仿(A. R.) 和丙酮(A.R.)的體積比為1 2。所述步驟7. 1中，是按照每10g藍萼甲素(GLA)、0. 9g多肽(cNGQGEQc)和90ml無水極性溶劑的比例混合。所述步驟7. 1中，所述無水極性溶劑為甲醇(A. R.)。所述步驟7. 2中，是將所述混合溶液加熱，在64°C溫度條件下攪拌冷凝回流9. 5小 時，趁熱抽濾，室溫下靜置析晶。經(jīng)高效液相色譜、LC_MS、NMR分析確認所得晶體為含有多肽cNGQGEQc的藍萼甲素 (GLA)衍生物。實施例三藍萼甲素(GLA)衍生物的制備采用以下技術(shù)參數(shù)改進實施例一的制備方法所述步驟2. 1中，是將所述粉碎物與95 %乙醇(A. R.)按照體積比1 7.5混合， 加熱，在84°C溫度條件下回流1. 6小時，再提取過濾。所述步驟2. 2中，是將所述剩余物與95 %乙醇(A. R.)按照體積比1 8.5混合， 加熱，在86°C溫度條件下回流1. 4小時，再提取過濾，重復該步驟1次。所述步驟3. 1中，是將所述提取液加熱，在59°C溫度條件下減壓濃縮。所述步驟3. 2中，是將所述初級濃縮物與水按照體積比1 8. 5混合，在室溫條件 下攪拌并隨后靜置10小時才分離上清液和固體。所述步驟3. 3中，是將所述固體與乙酸乙酯(A. R.)按照體積比1 5. 5混合，在 29°C溫度條件下攪拌溶解，靜置1. 5小時再過濾。所述步驟3. 4中，是將所述不溶物與乙酸乙酯(A. R.)按照體積比1 4. 5混合， 在31°C溫度條件下攪拌溶解，靜置2. 5小時再過濾，重復該步驟3次。所述步驟3. 6中，是將所述濾液加熱，在39°C溫度條件下減壓濃縮。所述步驟4. 1中，是將所述固體濃縮物與95%乙醇(A. R.)按照體積比1 4. 5混
合溶解。所述步驟4. 2中，采用的樹脂柱為填充物為強堿性陰離子樹脂、并用氫氧化鈉飽 和至pH值中性的樹脂柱。所述步驟4. 2中，當所述樹脂柱有2/3變色時，停止加樣，并采用280ml的95%乙 醇(A. R.)沖洗所述樹脂柱。所述步驟4. 3中，是將所述流出液加熱，并在59°C溫度條件下減壓回流。所述步驟5.1和5. 2中，所述極性溶劑混合為按照體積比1 1.4混合的氯仿 (A. R.)和丙酮(A. R.)的混合溶液。所述步驟5. 1中，是將所述殘留物與33°C的極性溶劑按照體積比1 5. 5混合。所述步驟5. 1中，是將所述初級溶液加熱，在33°C溫度條件下減壓濃縮，在_7°C溫 度條件下靜置析晶。所述步驟5. 2中，是將所述結(jié)晶與極性溶劑按照體積比1 4.5混合，在_71溫度 條件下反復重結(jié)晶4次。所述步驟6. 5中，是在34°C溫度條件下減壓濃縮，減壓濃縮過程中所述氯仿 (A. R.)和丙酮(A. R.)的混合溶液的用量與所述餾分的體積比為10. 5 1。所述步驟6. 5中，所述的氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的混合溶液中，氯仿(A. R.) 和丙酮(A.R.)的體積比為1 2。所述步驟7. 1中，是按照每12g藍萼甲素(GLA)、1. 3g多肽(cNGQGEQc)和105ml無水極性溶劑的比例混合。所述步驟7. 1中，所述無水極性溶劑為乙醇(A. R.)。所述步驟7. 2中，是將所述混合溶液加熱，在68°C溫度條件下攪拌冷凝回流8. 5小 時，趁熱抽濾，室溫下靜置析晶。經(jīng)高效液相色譜、LC-MS、NMR分析確認所得晶體為含有多肽cNGQGEQc的藍萼甲素 (GLA)衍生物。實施例四藍萼甲素(GLA)衍生物的制備采用以下技術(shù)參數(shù)改進實施例一的制備方法所述步驟2. 1中，是將所述粉碎物與95 %乙醇(A. R.)按照體積比1 8.5混合， 加熱，在86°C溫度條件下回流1. 4小時，再提取過濾。所述步驟2. 2中，是將所述剩余物與95 %乙醇(A. R.)按照體積比1 7.5混合， 加熱，在84°C溫度條件下回流1. 6小時，再提取過濾，重復該步驟3次。所述步驟3.1中，是將所述提取液加熱，在ere溫度條件下減壓濃縮。所述步驟3. 2中，是將所述初級濃縮物與水按照體積比1 9. 5混合，在室溫條件 下攪拌并隨后靜置8小時才分離上清液和固體。所述步驟3. 3中，是將所述固體與乙酸乙酯(A. R.)按照體積比1 4. 5混合，在 31°C溫度條件下攪拌溶解，靜置2. 5小時再過濾。所述步驟3. 4中，是將所述不溶物與乙酸乙酯(A. R.)按照體積比1 5. 5混合， 在29°C溫度條件下攪拌溶解，靜置1. 5小時再過濾，重復該步驟1次。所述步驟3. 6中，是將所述濾液加熱，在41°C溫度條件下減壓濃縮。所述步驟4. 1中，是將所述固體濃縮物與95%乙醇(A. R.)按照體積比1 5. 5混
合溶解。所述步驟4. 2中，采用的樹脂柱為填充物為強堿性陰離子樹脂、并用氫氧化鈉飽 和至pH值中性的樹脂柱。所述步驟4. 2中，當所述樹脂柱有2/3變色時，停止加樣，并采用320ml的95%乙 醇(A. R.)沖洗所述樹脂柱。所述步驟4.3中，是將所述流出液加熱，并在61°C溫度條件下減壓回流。所述步驟5. 1和5. 2中，所述極性溶劑混合為按照體積比1 1. 6混合的氯仿 (A. R.)和丙酮(A. R.)的混合溶液。所述步驟5. 1中，是將所述殘留物與37°C的極性溶劑按照體積比1 4. 5混合。所述步驟5. 1中，是將所述初級溶液加熱，在37°C溫度條件下減壓濃縮，在-6°C溫 度條件下靜置析晶。所述步驟5. 2中，是將所述結(jié)晶與極性溶劑按照體積比1 5.5混合，在_61溫度 條件下反復重結(jié)晶2次。所述步驟6. 5中，是在36 °C溫度條件下減壓濃縮，減壓濃縮過程中所述氯仿 (A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液的用量與所述餾分的體積比為9. 5 1。所述步驟6. 5中，所述的氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液中，氯仿(A. R.) 和丙酮(A.R.)的體積比為1 3。所述步驟7. 1中，是按照每14g藍萼甲素(GLA)、1. 7g多肽(cNGQGEQc)和125ml無水極性溶劑的比例混合。所述步驟7. 1中，所述無水極性溶劑為乙醇(A. R.)。所述步驟7. 2中，是將所述混合溶液加熱，在72°C溫度條件下攪拌冷凝回流7. 5小 時，趁熱抽濾，室溫下靜置析晶。經(jīng)高效液相色譜、LC-MS、NMR分析確認所得晶體為含有多肽cNGQGEQc的藍萼甲素 (GLA)衍生物。實施例五藍萼甲素(GLA)衍生物的制備采用以下技術(shù)參數(shù)改進實施例一的制備方法所述步驟2. 1中，是將所述粉碎物與95 %乙醇(A. R.)按照體積比1 9.5混合， 加熱，在88°C溫度條件下回流1. 2小時，再提取過濾。所述步驟2. 2中，是將所述剩余物與95 %乙醇(A. R.)按照體積比1 6.5混合， 加熱，在82°C溫度條件下回流1. 8小時，再提取過濾，重復該步驟3次。所述步驟3. 1中，是將所述提取液加熱，在63°C溫度條件下減壓濃縮。所述步驟3. 2中，是將所述初級濃縮物與水按照體積比1 9. 5混合，在室溫條件 下攪拌并隨后靜置7小時才分離上清液和固體。所述步驟3. 3中，是將所述固體與乙酸乙酯(A. R.)按照體積比1 4. 5混合，在 33°C溫度條件下攪拌溶解，靜置2. 5小時再過濾。所述步驟3. 4中，是將所述不溶物與乙酸乙酯(A. R.)按照體積比1 5. 5混合， 在27°C溫度條件下攪拌溶解，靜置1. 5小時再過濾，重復該步驟1次。所述步驟3. 6中，是將所述濾液加熱，在43°C溫度條件下減壓濃縮。所述步驟4. 1中，是將所述固體濃縮物與95%乙醇(A. R.)按照體積比1 5. 5混
合溶解。所述步驟4. 2中，采用的樹脂柱為填充物為強堿性陰離子樹脂、并用氫氧化鈉飽 和至pH值中性的樹脂柱。所述步驟4. 2中，當所述樹脂柱有2/3變色時，停止加樣，并采用360ml的95%乙 醇(A. R.)沖洗所述樹脂柱。所述步驟4.3中，是將所述流出液加熱，并在63°C溫度條件下減壓回流。所述步驟5. 1和5. 2中，所述極性溶劑混合為按照體積比1 1. 8混合的氯仿 (A. R.)和丙酮(A. R.)的混合溶液。所述步驟5. 1中，是將所述殘留物與39°C的極性溶劑按照體積比1 4. 5混合。所述步驟5. 1中，是將所述初級溶液加熱，在39°C溫度條件下減壓濃縮，在-6°C溫 度條件下靜置析晶。所述步驟5. 2中，是將所述結(jié)晶與極性溶劑按照體積比1 5.5混合，在_71溫度 條件下反復重結(jié)晶2次。所述步驟6. 5中，是在38°C溫度條件下減壓濃縮，減壓濃縮過程中所述氯仿 (A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液的用量與所述餾分的體積比為8. 5 1。所述步驟6. 5中，所述的氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的混合溶液中，氯仿(A. R.) 和丙酮(A.R.)的體積比為1 3。所述步驟7. 1中，是按照每16g藍萼甲素(GLA)、2. lg多肽(cNGQGEQc)和140ml無水極性溶劑的比例混合。所述步驟7. 1中，所述無水極性溶劑為甲醇(A. R.)。所述步驟7. 2中，是將所述混合溶液加熱，在76°C溫度條件下攪拌冷凝回流6. 5小 時，趁熱抽濾，室溫下靜置析晶。經(jīng)高效液相色譜、LC_MS、NMR分析確認所得晶體為含有多肽cNGQGEQc的藍萼甲素 (GLA)衍生物。實施例六藍萼甲素(GLA)衍生物的制備(優(yōu)選實施例)采用以下技術(shù)參數(shù)改進實施例一的制備方法 所述步驟2. 1中，是將所述粉碎物與95 %乙醇(A. R.)按照體積比1 8混合，加 熱，在85°C溫度條件下回流1. 5小時，再提取過濾。所述步驟2. 2中，是將所述剩余物與95 %乙醇(A. R.)按照體積比1 8混合，加 熱，在85°C溫度條件下回流1. 5小時，再提取過濾，重復該步驟2次。所述步驟3. 1中，是將所述提取液加熱，在60°C溫度條件下減壓濃縮。所述步驟3. 2中，是將所述初級濃縮物與水按照體積比1 9混合，在室溫條件下 攪拌并隨后靜置9小時才分離上清液和固體。所述步驟3. 3中，是將所述固體與乙酸乙酯(A. R.)按照體積比1 5混合，在30°C 溫度條件下攪拌溶解，靜置2小時再過濾。所述步驟3. 4中，是將所述不溶物與乙酸乙酯(A. R.)按照體積比1 5混合，在 30°C溫度條件下攪拌溶解，靜置2小時再過濾，重復該步驟2次。所述步驟3. 6中，是將所述濾液加熱，在40°C溫度條件下減壓濃縮。所述步驟4. 1中，是將所述固體濃縮物與95%乙醇(A. R.)按照體積比1 5混合溶解。所述步驟4. 2中，采用的樹脂柱為填充物為強堿性陰離子樹脂、并用氫氧化鈉飽 和至pH值中性的樹脂柱。所述步驟4. 2中，當所述樹脂柱有2/3變色時，停止加樣，并采用300ml的95%乙 醇(A. R.)沖洗所述樹脂柱。所述步驟4.3中，是將所述流出液加熱，并在60°C溫度條件下減壓回流。所述步驟5.1和5. 2中，所述極性溶劑混合為按照體積比1 1.5混合的氯仿 (A. R.)和丙酮(A. R.)的混合溶液。所述步驟5.1中，是將所述殘留物與35°C的極性溶劑按照體積比1 5混合。所述步驟5. 1中，是將所述初級溶液加熱，在35°C溫度條件下減壓濃縮，在-6. 5°C 溫度條件下靜置析晶。所述步驟5. 2中，是將所述結(jié)晶與極性溶劑按照體積比1 5混合，在_6.5°C溫度 條件下反復重結(jié)晶3次。所述步驟6. 5中，是在35°C溫度條件下減壓濃縮，減壓濃縮過程中所述氯仿 (A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液的用量與所述餾分的體積比為10 1。所述步驟6. 5中，所述的氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的混合溶液中，氯仿(A. R.) 和丙酮(A.R.)的體積比為1 2.5。所述步驟7. 1中，是按照每13g藍萼甲素(GLA)、1.5g多肽(cNGQGEQc)和115ml無水極性溶劑的比例混合。所述步驟7. 1中，所述無水極性溶劑為二氯甲烷(A. R.)。所述步驟7. 2中，是將所述混合溶液加熱，在70°C溫度條件下攪拌冷凝回流8小 時，趁熱抽濾，室溫下靜置析晶。經(jīng)高效液相色譜、LC_MS、NMR分析確認所得晶體為含有多肽cNGQGEQc的藍萼甲素 (GLA)衍生物。實施例七采用優(yōu)選實施例六的制備方法制備的藍萼甲素(GLA)衍生物，其分子結(jié)構(gòu)通式如 下 其中，R1為-cNGQGEQc 或 _0H，R2 為-cNGQGEQc 或-0H。其中，所述的-cNGQGEQc是通過原藍萼甲素(GLA)上的羥基與多肽cNGQGEQc的乙 酰化反應從而引入的。其中，以下三種結(jié)構(gòu)對治療癌癥、特別是治療肺癌、肝癌、鼻咽癌、淋巴瘤、黑色素 瘤和骨髓性白血病具有良好的效果。其中通過乙?；磻攵嚯腸NGQGEQc，來對主體二 萜進行結(jié)構(gòu)修飾，從而使得修飾后的藍萼甲素(GLA)，即藍萼甲素(GLA)衍生物對肺癌具有 靶向作用。
采用藥劑學上的常規(guī)藥物載體，并采用藥劑學上的常規(guī)制備方法，將采用優(yōu)選實施例六的制備方法制備的、具有實施例七的分子結(jié)構(gòu)的藍萼甲素(GLA)衍生物中的一種或 多種，制備成藥劑學上的常規(guī)劑型，包括但不限于片劑、膠囊劑、軟膠劑、噴霧劑、凝膠劑、凝 膠吸入劑、口服劑、混懸劑、沖劑、貼劑、軟膏、丸劑、散劑、注射劑、輸液劑、凍干注射劑、脂質(zhì) 體注射劑、靶向給藥注射劑、栓劑、緩釋制劑或控釋制劑。其中優(yōu)選制備劑型為凍干注射劑。
實施例九藍萼甲素(GLA)衍生物的應用根據(jù)實施例一至六中任意制備方法制備所得的藍萼甲素(GLA)衍生物，用于癌癥 的治療，特別是用于治療肺癌、肝癌、鼻咽癌、淋巴瘤、黑色素瘤和骨髓性白血病。其中由于 所得的藍萼甲素(GLA)衍生物，是通過乙?；磻攵嚯腸NGQGEQc，來對主體二萜進行 結(jié)構(gòu)修飾的，從而使得修飾后的藍萼甲素(GLA)，即藍萼甲素(GLA)衍生物對肺癌具有靶向 作用，尤其適用是肺癌的治療。實施例十藍萼甲素(GLA)衍生物治療肺癌的藥效學實驗采用根據(jù)優(yōu)選實施例六的制備方法制備的、具有實施例七的分子結(jié)構(gòu)的藍萼甲素 (GLA)衍生物的混合物(以下簡稱GH-02)進行藥效學實驗，考察GH-02對肺癌A549細胞的影響。1.實驗材料1. 1藥品與試劑四氮唑蘭(MTT)1. 2儀器二氧化碳孵化箱，顯微鏡，酶標儀1. 3 動物無1. 4瘤株肺癌A549細胞由復旦大學腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所羅建民老師惠贈2.實驗方法2. 1A549 細胞培養(yǎng)A549細胞用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37°C、5% C02孵化箱中進行培養(yǎng)。2. 2細胞傳代取出已長滿細胞的25cm2培養(yǎng)瓶，倒去培養(yǎng)液，先注入胰蛋白酶消化液1ml，輕輕搖 晃后棄去。再加入胰蛋白酶消化液2ml，將其浸潤細胞后，放入C02孵化箱中消化2-3min。 注入5ml培養(yǎng)液，用滴管吸取培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液反復吹打培養(yǎng)瓶基面。取2只無菌的培養(yǎng) 瓶，將含有細胞的培養(yǎng)液均勻份入培養(yǎng)瓶中，分別加入10ml新鮮培養(yǎng)液后培養(yǎng)。2. 3細胞凍存先制成含細胞50萬/ml的細胞懸液，后加10 % DMS0,裝入凍存管中火封，放置 于-20°C冰箱內(nèi)3h后取出，置于-60°C冰箱內(nèi)過夜，取出后裝入固定架后投入液氮中保存。2. 4細胞復蘇取出凍存管后，迅速投入37°C的溫水化凍，吸出細胞液，離心1000rpm，10min，棄 上清液，除去DMS0，換入含20%胎牛血清的培養(yǎng)液，稀釋細胞數(shù)為20-50萬/ml分種于培養(yǎng) 瓶中，置于C02孵化箱中培養(yǎng)。3.實驗結(jié)果表1GH-02 對 A549 細胞的影響(X士S，n = 4)
18 注表示與空白對照組比較，P < 0. 05?！ū硎九c空白對照組比較，P < 0. 01。 A表示與陽性對照(阿霉素)比較，P<0.01?！硎九cPV助溶劑比較，P< 0.05?！?表示與PVP助溶劑比較，P < 0. 01。4.結(jié)論GH-02小劑量有一定的抑瘤作用，而高劑量組則有明顯的抗腫瘤作用，與模型組相 比差異有顯著性，而與陽性對照組相比則差異無顯著性。GH-02抗腫瘤作用雖然稍遜于陽性 對照阿霉素，但仍顯示出較強的抗腫瘤作用。實施例十一藍萼甲素(GLA)衍生物對小鼠Lewis肺癌影響的動物模型試驗采用根據(jù)優(yōu)選實施例六的制備方法制備的、具有實施例七的分子結(jié)構(gòu)的藍萼甲素 (GLA)衍生物的混合物(以下簡稱GH-02)進行動物模型試驗，考察GH-02對小鼠Lewis肺
癌的影響。1.實驗材料，1. 1藥品與試劑GH_02(質(zhì)量分數(shù)99. 8% )，試驗時用生理鹽水稀釋。1. 2儀器顯微鏡，酶標儀1. 3動物C57純系小鼠64只，體重為(20 士 2)9，雌雄兼用，由上海中醫(yī)藥大學實 驗動物中心提供。實驗室溫度為22 — 25°C，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，飲水量不限。1. 4瘤株LewiS肺癌實體型由復旦大學腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所羅建民老師惠贈2.實驗方法模型組(生理鹽水10mL/kg)，陽性對照組(環(huán)磷酰胺25mg/ml)，GH-02 (25mg/ml) 分為腹腔注射組、靜脈注射組，每組8只動物。實驗按常規(guī)方法接種，接種后次日按擬定劑 量ip給藥，每天1次，連續(xù)10d。腹水性腫瘤以生命延長率為療效指標，停藥后繼續(xù)觀察 60d，死亡動物以實際存活時間計算。實體型腫瘤以瘤質(zhì)量抑制率作為療效指標，于停藥次 日將腫瘤剖出精確稱質(zhì)量。實驗結(jié)果用抑瘤率x士s表示，組間比較用t檢驗。3.實驗結(jié)果實驗結(jié)果詳見表2GH-02對小鼠Lewis肺癌的影響。4.結(jié)論GH-02有明顯的抑瘤作用和抗腫瘤作用，與模型組相比差異有顯著性，而與陽性對 照組相比則差異無顯著性。GH-02抗腫瘤作用強于陽性對照，顯示出較強的抗腫瘤作用。腹 腔注射和靜脈注射都有明顯的抑瘤作用和抗腫瘤作用。上述內(nèi)容為本發(fā)明的具體實施例的例舉，對于其中未詳盡描述的試劑、設(shè)備、操作 方法等，應當理解為采取本領(lǐng)域已有的普通及常規(guī)試劑、設(shè)備、操作方法等來予以實施。同時本發(fā)明上述實施例僅為說明本發(fā)明技術(shù)方案之用，僅為本發(fā)明技術(shù)方案的列
權(quán)利要求
一種藍萼甲素(GLA)衍生物，其特征在于，是一種二萜類物質(zhì)，具有貝殼杉烷型結(jié)構(gòu)、羰基、多肽cNGQGEQc和/或羥基，其分子結(jié)構(gòu)的通式如下其中，R1為-cNGQGEQc或-OH，R2為-cNGQGEQc或-OH。F2009100485548C0000011.tif
2.如權(quán)利要求1所述的藍萼甲素(GLA)衍生物，其特征在于，分子結(jié)構(gòu)如下0其中，R1 為-OH 且 ，或者 R1 為-cNGQGEQc 且 R2 為-0H，或者 R1 為-cNGQGEQc 且 R2 為-cNGQGEQc。
3.—種如權(quán)利要求1 2所述的藍萼甲素(GLA)衍生物的制備方法，其特征在于，包含 以下步驟步驟1 粉碎取香茶菜藥材(地上部分)粉碎至20目 50目；步驟2 提取步驟2. 1 將步驟1所得的粉碎物與95%乙醇混合，加熱回流，提取過濾，得到提取液和 剩余物；步驟2. 2 將步驟2. 1所得的剩余物與95%乙醇混合，加熱回流，提取過濾，得到提取液 和剩余物，重復該步驟1 3次；步驟2. 3 合并步驟2. 1和2. 2所得的提取液；步驟3 溶劑處理步驟3. 1 將步驟2所得的提取液加熱減壓濃縮，回收乙醇并得到粘稠的初級濃縮物；步驟3. 2 將步驟3. 1所得的初級濃縮物與水混合，攪拌隨后靜置，棄去上清液得到下 層固體；步驟3. 3 將步驟3. 2所得的固體與乙酸乙酯混合，攪拌溶解并靜置，過濾得到濾液和 不溶物；步驟3. 4 將步驟3. 3所得的不溶物與乙酸乙酯混合，攪拌溶解并靜置，過濾得到濾液 和不溶物，重復該步驟1 3次；步驟3. 5 合并步驟3. 3和3. 4所得的濾液；步驟3. 6 將步驟3. 5所得的濾液加熱，減壓濃縮，回收乙酸乙酯，得到固體濃縮物； 步驟4:過柱步驟4. 1 將步驟3所得的固體濃縮物與95%乙醇混合溶解，得到溶液； 步驟4. 2 將步驟4. 1所得的溶液緩慢加到樹脂柱中，觀察樹脂的顏色，采用95%乙醇 沖洗該樹脂柱，收集所有流出液，步驟4. 3 將步驟4. 2所得流出液減壓加熱回流，直至溶劑干，得到固體殘留物；步驟 5 重結(jié)晶步驟5. 1 將上述殘留物與極性溶劑混合，得到初級溶液，加熱并減壓濃縮，靜置析晶， 過濾得到黃色針狀結(jié)晶；步驟5. 2 將步驟5. 1所得的結(jié)晶與極性溶劑混合，反復重結(jié)晶2 4次，得到濃縮物； 步驟6:分離提純步驟6. 1 將步驟5所得的濃縮物加入乙酸乙酯溶解，加入200-300目硅膠，混合均勻， 室溫揮發(fā)干燥，除去溶劑乙酸乙酯；步驟6. 2 濕法填裝一根層析硅膠柱，并采用氯仿反復沖洗硅膠柱； 步驟6. 3 將步驟6. 1所得的混有硅膠的濃縮物加入到步驟6. 2所得的硅膠柱中，采用 氯仿沖洗；步驟6. 4 采用氯仿和丙酮的混合溶液沖洗所述硅膠柱，并采用TLC薄層分析方法檢驗 目標餾分藍萼甲素(GLA)，在檢驗到相應餾分的時候，采用氯仿和丙酮的混合溶液沖洗，收 集含有藍萼甲素(GLA)主成分的餾分；步驟6. 5 將步驟6. 4所得的餾分合并，減壓濃縮，回收溶劑，將所得的濃縮物用氯仿和 丙酮的混合溶液重結(jié)晶，得到白色針狀晶體藍萼甲素(GLA)； 步驟7 合成步驟7. 1 將步驟6所得的藍萼甲素(GLA)和多肽(cNGQGEQc)和無水極性溶劑混合得 到混合液；步驟7. 2 將步驟7. 1所得的混合溶液加熱，攪拌冷凝回流，趁熱抽濾，靜置，析出晶體， 過濾，分離出晶體，得到藍萼甲素(GLA)衍生物。
4.如權(quán)利要求3所述的藍萼甲素(GLA)衍生物的制備方法，其特征在于，所述步驟2.1 中，是將所述粉碎物與95%乙醇按照體積比1 6至1 10混合，加熱，在80°C 90°C溫 度條件下回流1 2小時，再提取過濾；所述步驟2. 2中，是將所述剩余物與95%乙醇按照體積比1 6至1 10混合，加熱， 在80°C 90°C溫度條件下回流1 2小時，再提取過濾。
5.如權(quán)利要求4所述的藍萼甲素(GLA)衍生物的制備方法，其特征在于，所述步驟3.1 中，是將所述提取液加熱，在55°C 65°C溫度條件下減壓濃縮；所述步驟3. 2中，是將所述初級濃縮物與水按照體積比1 8 1 10混合，在室溫 條件下攪拌并隨后靜置6 12小時才分離上清液和固體；所述步驟3. 3中，是將所述固體與乙酸乙酯按照體積比1 4 1 6混合，在25°C 35°C溫度條件下攪拌溶解，靜置1 3小時再過濾；所述步驟3.4中，是將所述不溶物與乙酸乙酯按照體積比1 4 1 6混合，在25°C 35 °C溫度條件下攪拌溶解，靜置1 3小時再過濾；所述步驟3. 6中，是將所述濾液加熱，在35°C 45°C溫度條件下減壓濃縮。
6.如權(quán)利要求5所述的藍萼甲素(GLA)衍生物的制備方法，其特征在于，所述步驟4.1 中，是將所述固體濃縮物與95%乙醇按照體積比1 4 1 6混合溶解；所述步驟4. 2中，采用的樹脂柱為填充物為強堿性陰離子樹脂、并用氫氧化鈉飽和至 PH值中性的樹脂柱；所述步驟4. 2中，當所述樹脂柱有2/3變色時，停止加樣，并采用200ml 400ml的95% 乙醇沖洗所述樹脂柱；所述步驟4. 3中，是將所述流出液加熱，并在55°C 65°C溫度條件下減壓回流。
7.如權(quán)利要求6所述的藍萼甲素(GLA)衍生物的制備方法，其特征在于，所述步驟5.1 和5. 2中，所述極性溶劑混合為按照體積比1 1 1 2混合的氯仿和丙酮的混合溶液； 所述步驟5. 1中，是將所述殘留物與30°C 40°C的極性溶劑按照體積比1 4 1 6混 合；所述步驟5. 1中，是將所述初級溶液加熱，在30°C 40°C溫度條件下減壓濃縮， 在-5°C _8°C溫度條件下靜置析晶；所述步驟5.2中，是將所述結(jié)晶與極性溶劑按照體積比1 4 1 6混合， 在-5°C _8°C溫度條件下反復重結(jié)晶2 4次。
8.如權(quán)利要求7所述的藍萼甲素(GLA)衍生物的制備方法，其特征在于，所述的步驟 6. 1中，是將所述的濃縮物加入20ml乙酸乙酯溶解，而所述硅膠的加入量為所述濃縮物重 量的3倍；所述步驟6. 2中，所述硅膠用量為步驟5所得的濃縮物重量的20倍，柱子徑高比為 1 12，所述氯仿的用量為2BV(2倍柱體積)；所述步驟6. 3中，所述氯仿的用量為2BV且流速為1. 5BV/小時； 所述步驟6. 4中，是采用3BV的氯仿和丙酮的混合溶液沖洗所述硅膠柱，再進行TLC薄 層分析，在檢驗到相應餾分的時候，是采用6BV的氯仿和丙酮的混合溶液沖洗，收集餾分； 所述的3BV的氯仿和丙酮的混合溶液中，氯仿和丙酮的體積比為20 1 ； 所述的6BV的氯仿和丙酮的混合溶液中，氯仿和丙酮的體積比為10 1 ； 所述步驟6. 5中，所得餾分是在30°C 40°C溫度條件下減壓濃縮，濃縮過程中氯仿和 丙酮的混合溶液的用量與所述餾分的體積比為8 1 12 1;所述氯仿和丙酮的混合溶液中，氯仿和丙酮的體積比為1 1 1 4。
9.如權(quán)利要求8所述的藍萼甲素(GLA)衍生物的制備方法，其特征在于，所述步驟7.1 中，是按照每8 17g藍萼甲素(GLA)、0. 7 2. 3g多肽(cNGQGEQc)和80 150ml無水極 性溶劑的比例混合；所述步驟7. 1中，所述無水極性溶劑為甲醇、乙醇、二氯甲烷中的一種； 所述步驟7. 2中，是將所述混合溶液加熱，在60°C 80°C溫度條件下攪拌冷凝回流 6 10小時，趁熱抽濾，室溫下靜置析晶。
10.如權(quán)利要求1 3所述的藍萼甲素(GLA)衍生物在治療癌癥中的應用，特別是在治 療肺癌、肝癌、鼻咽癌、淋巴瘤、黑色素瘤和骨髓性白血病中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了藍萼甲素(GLA)衍生物、制備方法及其用途。所述藍萼甲素(GLA)衍生物以藍萼甲素(GLA)為主體，是二萜類物質(zhì)，具有貝殼杉烷型結(jié)構(gòu)、羰基、多肽cNGQGEQc和/或羥基。本發(fā)明采用香茶菜藥材(地上部分)作為原料，進行粉碎、提取、溶液處理、過柱、重結(jié)晶等得到藍萼甲素(GLA)，再和多肽cNGQGEQc進行進一步的乙?；磻?，得到所述藍萼甲素(GLA)衍生物。所述藍萼甲素(GLA)衍生物具有較高的抗癌活性，對于肺癌、肝癌、鼻咽癌、淋巴瘤、黑色素瘤和骨髓性白血病多種腫瘤細胞均有顯著的抑制，尤其對于肺癌具有靶向作用，可以針對性地治療肺癌。
文檔編號C07K7/06GK101851273SQ20091004855
公開日2010年10月6日 申請日期2009年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月31日
發(fā)明者李云森, 檀愛民, 程萍, 陳子珺, 雷啟福 申請人:蘇州金昊藥業(yè)開發(fā)有限公司