專利名稱：一種藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素、藍(lán)萼丙素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然植物有效成分提取技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素、藍(lán)萼丙素的制備方法。
背景技術(shù)：
藍(lán)粵香茶菜 Rabdosia japonica (Burm. f. )Hara var. glau-cocalyxi (Maxin) Hara為唇形科香茶菜屬植物，又名山蘇子，廣布于我國(guó)北方，長(zhǎng)期以來，我國(guó)民間作為毛葉香茶菜用，具有健胃、清熱解毒、活血、抗菌消炎和抗癌活性。藍(lán)萼香茶菜還具有與劑量相關(guān)的心肌保護(hù)作用。其化學(xué)成分主要為二萜和三萜類化合物。沈曉丹等從藍(lán)萼香茶菜中分離得到藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素、藍(lán)萼丙素等貝殼杉烷型二萜類化合物，張濱等通過藥理研究藍(lán)萼甲素具有顯著抑制ADP，AA，PAF等誘導(dǎo)的兔血小板聚集。中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?00910044882. 0 采用MTT法，用A549、L0V0、6T-CEM、HL-60細(xì)胞株對(duì)藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素、藍(lán)萼丙素、藍(lán)萼丁素、藍(lán)萼戊素、藍(lán)萼己素進(jìn)行了細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)它們均具有顯著的細(xì)胞毒活性，可用于制備抗癌藥物。中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?00910044883. 6采用乙肝表面抗原(HBsAg)診斷試劑盒和乙肝核心抗原(HBeAg)診斷試劑盒對(duì)上述藍(lán)萼香茶菜二萜類化合物進(jìn)行了抗乙肝表面抗原和乙肝核心抗原試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)它們均具有顯著的抗乙肝病毒活性，可用于制備乙肝病毒的藥物?，F(xiàn)有技術(shù)多采用硅膠柱反復(fù)層析進(jìn)行分離，中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0101(^64658. 5采用常壓乙醇回流提取，提取液濃縮、硅膠柱層析，無水乙醇重結(jié)晶的方法提取得到藍(lán)萼甲素，該方法采用傳統(tǒng)硅膠柱層析法，樣品損失較大，得率低，且僅分離得到一種單體，原料利用率低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種從藍(lán)萼香茶菜中制備藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素、藍(lán)萼丙素的方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
一種藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素、藍(lán)萼丙素的制備方法，其特征在于包括以下步驟
(1)將藍(lán)萼香茶菜葉粉碎，用乙醇加熱回流提取，合并提取液，濃縮得浸膏；
(2)將浸膏用乙酸乙酯和水的混合溶液溶解，過濾，乙酸乙酯和水的體積比為10:1，濾液靜置分層12-Mh，分液，取上相減壓濃縮得乙酸乙酯萃取物；將乙酸乙酯萃取物用石油醚-甲醇的混合溶液溶解，過濾，石油醚和甲醇的體積比為1 1，靜置分層8-12h，分液，取下相，減壓濃縮蒸干得甲醇萃取物；
(3)將甲醇萃取物通過高速逆流色譜儀進(jìn)一步分離，所用的溶劑體系為正庚烷-乙酸乙酯-乙腈-水，其體積比為(3-5): (1-2): (3-5): (2-4)，置于分液漏斗中搖勻，靜置分層， 取上相為固定相，下相為流動(dòng)相，將上相充滿整個(gè)色譜柱中，調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速，泵入流動(dòng)相，待平衡后注入流動(dòng)相溶解的甲醇萃取物，紫外檢測(cè)器檢測(cè)，分別收集藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素、藍(lán)萼丙素流分，減壓濃縮得各單體成分粗晶；
(4)將藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素、藍(lán)萼丙素粗晶分別用二氯甲烷-乙酸乙酯結(jié)晶，冷凍干燥得到純度95%以上的藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素、藍(lán)萼丙素結(jié)晶產(chǎn)品。本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于通過兩次不同的兩相溶劑體系分配，提高了藍(lán)萼香茶菜二萜化合物的保留率，同時(shí)減輕了后續(xù)工序的工作量；采用高速逆流色譜進(jìn)行分離純化，以正庚烷-乙酸乙酯-乙腈-水為溶劑體系，分離效果好，溶劑消耗少，可一次性制備大量藍(lán)萼香茶菜二萜單體成分產(chǎn)品，原料利用率高，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
取Ikg藍(lán)萼香茶菜葉粉碎過20目篩，用70%乙醇加熱回流提取2次，每次池，合并提取液，減壓濃縮得浸膏。將浸膏用乙酸乙酯和水的混合溶液(乙酸乙酯和水的體積比為10:1) 攪拌溶解，過濾，濾液靜置分層15h，分液，取上相，減壓濃縮蒸干得到乙酸乙酯萃取物。將乙酸乙酯萃取物用石油醚和甲醇的混合溶液(石油醚和甲醇的體積比為1:1)攪拌溶解，過濾， 濾液靜置分層10h，分液，取下相，減壓濃縮蒸干得到甲醇萃取物。將甲醇萃取物通過高速逆流色譜分離純化，以正庚烷-乙酸乙酯-乙腈-水為溶劑系統(tǒng)，按體積比為3 1 4 3置于分液漏斗中搖勻，靜置分層，取上相為固定相，下相為流動(dòng)相，將上相充滿整個(gè)色譜柱中，調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速，泵入流動(dòng)相，待平衡后注入流動(dòng)相溶解的甲醇萃取物，紫外檢測(cè)器檢測(cè)，分別收集藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素、藍(lán)萼丙素流分，將藍(lán)萼甲素流分減壓回收試劑，用二氯甲烷-乙酸乙酯結(jié)晶，得到975mg藍(lán)萼甲素；將藍(lán)萼乙素流分減壓回收試劑，用二氯甲烷-乙酸乙酯結(jié)晶，得到489mg藍(lán)萼乙素；將藍(lán)萼丙素流分減壓回收試劑，用二氯甲烷-乙酸乙酯結(jié)晶，得到 101. 7mg藍(lán)萼丙素。實(shí)施例2
取Ikg藍(lán)萼香茶菜葉粉碎過20目篩，用60%乙醇加熱回流提取3次，每次1. 5h,合并提取液，減壓濃縮得浸膏。將浸膏用乙酸乙酯和水的混合溶液(乙酸乙酯和水的體積比為 10:1)攪拌溶解，過濾，濾液靜置分層12h，分液，取上相，減壓濃縮蒸干得到乙酸乙酯萃取物。將乙酸乙酯萃取物用石油醚和甲醇的混合溶液(石油醚和甲醇的體積比為1:1)攪拌溶解，過濾，濾液靜置分層12h，分液，取下相，減壓濃縮蒸干得到甲醇萃取物。將甲醇萃取物通過高速逆流色譜分離純化，以正庚烷-乙酸乙酯-乙腈-水為溶劑系統(tǒng)，按體積比為 4:2:3:4置于分液漏斗中搖勻，靜置分層，取上相為固定相，下相為流動(dòng)相，將上相充滿整個(gè)色譜柱中，調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速，泵入流動(dòng)相，待平衡后注入流動(dòng)相溶解的甲醇萃取物，紫外檢測(cè)器檢測(cè)，分別收集藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素、藍(lán)萼丙素流分，將藍(lán)萼甲素流分減壓回收試劑，用二氯甲烷-乙酸乙酯結(jié)晶，得到1013mg藍(lán)萼甲素；將藍(lán)萼乙素流分減壓回收試劑，用二氯甲烷-乙酸乙酯結(jié)晶，得到496mg藍(lán)萼乙素；將藍(lán)萼丙素流分減壓回收試劑，用二氯甲烷-乙酸乙酯結(jié)晶，得到107. 3mg藍(lán)萼丙素。實(shí)施例3
取Ikg藍(lán)萼香茶菜葉粉碎過20目篩，用90%乙醇加熱回流提取2次，每次池，合并提取液，減壓濃縮得浸膏。將浸膏用乙酸乙酯和水的混合溶液(乙酸乙酯和水的體積比為10:1) 攪拌溶解，過濾，濾液靜置分層Mh，分液，取上相，減壓濃縮蒸干得到乙酸乙酯萃取物。將乙酸乙酯萃取物用石油醚和甲醇的混合溶液(石油醚和甲醇的體積比為1:1)攪拌溶解，過濾， 濾液靜置分層8h，分液，取下相，減壓濃縮蒸干得到甲醇萃取物。將甲醇萃取物通過高速逆流色譜分離純化，以正庚烷-乙酸乙酯-乙腈-水為溶劑系統(tǒng)，按體積比為5 1 5 2置于分液漏斗中搖勻，靜置分層，取上相為固定相，下相為流動(dòng)相，將上相充滿整個(gè)色譜柱中，調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速，泵入流動(dòng)相，待平衡后注入流動(dòng)相溶解的甲醇萃取物，紫外檢測(cè)器檢測(cè)，分別收集藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素、藍(lán)萼丙素流分，將藍(lán)萼甲素流分減壓回收試劑，用二氯甲烷-乙酸乙酯結(jié)晶，得到873mg藍(lán)萼甲素；將藍(lán)萼乙素流分減壓回收試劑，用二氯甲烷-乙酸乙酯結(jié)晶，得到422mg藍(lán)萼乙素；將藍(lán)萼丙素流分減壓回收試劑，用二氯甲烷-乙酸乙酯結(jié)晶，得到 103. Img藍(lán)萼丙素。
權(quán)利要求
1. 一種藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素、藍(lán)萼丙素的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)將藍(lán)萼香茶菜葉粉碎，用乙醇加熱回流提取，合并提取液，濃縮得浸膏；(2)將浸膏用乙酸乙酯和水的混合溶液溶解，過濾，乙酸乙酯和水的體積比為10:1，濾液靜置分層12-Mh，分液，取上相減壓濃縮得乙酸乙酯萃取物；將乙酸乙酯萃取物用石油醚-甲醇的混合溶液溶解，過濾，石油醚和甲醇的體積比為1 1，靜置分層8-12h，分液，取下相，減壓濃縮蒸干得甲醇萃取物；(3)將甲醇萃取物通過高速逆流色譜儀進(jìn)一步分離，所用的溶劑體系為正庚烷-乙酸乙酯-乙腈-水，其體積比為(3-5): (1-2): (3-5): (2-4)，置于分液漏斗中搖勻，靜置分層， 取上相為固定相，下相為流動(dòng)相，將上相充滿整個(gè)色譜柱中，調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速，泵入流動(dòng)相，待平衡后注入流動(dòng)相溶解的甲醇萃取物，紫外檢測(cè)器檢測(cè)，分別收集藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素、藍(lán)萼丙素流分，減壓濃縮得各單體成分粗晶；(4)將藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素、藍(lán)萼丙素粗晶分別用二氯甲烷-乙酸乙酯結(jié)晶，冷凍干燥得到純度95%以上的藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素、藍(lán)萼丙素結(jié)晶產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素、藍(lán)萼丙素的制備方法，采用醇提——兩相溶劑體系分配——高速逆流色譜分離純化——結(jié)晶組合工藝，提取制備藍(lán)萼香茶菜中的藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素和藍(lán)萼丙素。兩相溶劑體系分配先采用乙酸乙酯-水體系分配，上相濃縮后再用石油醚-甲醇體系分配，下相濃縮蒸干得甲醇萃取物。該制備方法通過兩次不同溶劑體系分配，除去了部分雜質(zhì)，高速逆流色譜法分離過程無產(chǎn)品損失，制備周期短，克服了傳統(tǒng)硅膠柱分離過程中樣品死吸附、工藝繁瑣、重現(xiàn)性差的技術(shù)缺陷。
文檔編號(hào)C07C67/56GK102311327SQ20111026394
公開日2012年1月11日 申請(qǐng)日期2011年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月8日
發(fā)明者劉東鋒, 郭琴 申請(qǐng)人:南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司