專利名稱：一種提取藍萼香茶菜總二萜或藍萼甲素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥提取領(lǐng)域，涉及一種以藥材藍萼香茶菜為原材料制備藍萼香茶菜總二萜或藍萼甲素的方法。
背景技術(shù)：
藍萼香茶菜(Isodon japonica var glaucocalyx (Maxim) Hara)為唇形禾斗香茶菜屬植物，廣泛分布在我國的東北，華北，華東等地區(qū)；具有健胃、清熱解毒、活血、抗菌消炎等活性，用于治療胃炎，脘腹脹痛，肝炎初期，感冒發(fā)熱，乳腺炎、關(guān)節(jié)痛等。藍萼香茶菜主要含有藍萼甲素、藍萼乙素、藍萼丙素、藍萼丁素、藍萼戊素、glaucocalyxin F、 glaucocalyxin X，等對映-貝殼杉燒型二萜(參見Zhao Bao Xiang, et al. Two new diterpenoids from Rabdosia japonica var. glaucocalyx. Chinese Chemical Letters. 2008, 19: 852，曹露曄等，藍萼香茶菜研究進展，云南中醫(yī)中藥雜志，2004，25 (3) :42.)。 藍萼香茶菜中的二萜類成分是其主要活性物質(zhì)，藍萼甲素可抑制卡西霉素刺激的兔血小板生成血小板活化因子，能抑制花生四烯酸誘導(dǎo)的兔血小板血栓素A2生成，并同時升高前列腺素E2，能顯著抑制ADP，AA，PAF等誘導(dǎo)的兔血小板聚集，顯著升高血小板內(nèi)cAMP水平(參見Zhang B, Long K. Effects of glaucocalyxin A on aggtegation and cAMP levels of rabbit platelets in vitro. Acta Pharmacologica Sinica 1993, 14 (4): 347.) 藍萼甲素對艾氏腹水癌有一定抑制作用，體內(nèi)對S180實體瘤抑制率達30. 4% (10mg/kg, 7天)，(參見張淑香等，藍萼甲素在體外對DNA，RNA和蛋白質(zhì)生物合成的影響，藥學(xué)情報通訊，1990，8 (3) 238.)。藍萼甲素、藍萼乙素、藍萼丁素、藍萼戊素、藍萼己素對A549 (人肺癌細胞)、L0V0 (人腸癌細胞)、6T-CEM (人T細胞白血病細胞)、HL-60 (人白血病細胞) 具有較強的細胞毒活性，可用于制備抗癌藥物(參見陳海生等，藍萼香茶菜中二萜類化合物在制備抗癌藥物中的應(yīng)用，專利號為200910044882. O的中國發(fā)明專利)；藍萼乙素、藍萼丙素、藍萼丁素、藍萼戊素和藍萼己素進行了抗乙肝表面抗原和乙肝核心抗原試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它們具有顯著的抗乙肝病毒活性，可用于制備抗乙肝病毒的藥物(參見陳海生等，藍萼香茶菜中二萜類化合物在制備抗肝炎病毒藥物中的應(yīng)用，專利號為200910044883. 5的中國發(fā)明專利)。現(xiàn)有技術(shù)中，從藥材藍萼香茶菜中提取藍萼甲素的方法不僅步驟繁瑣，得率偏低， 普遍低于10%，而且由于采用對生物體具有毒性的溶劑，殘留的有毒溶劑不符合藥典要求， 具體包括以下步驟
( 采集藥材藍萼香茶菜地上部分并粉碎，在常壓下，用體積百分數(shù)859Γ95%乙醇水溶液回流提取2 3次，每次回流提取2小時，合并提取液，減壓回收溶劑，至每毫升溶劑含原藥材3 IOg ；
G)用等體積的石油醚萃取三次，石油醚層棄去，水層再用等體積氯仿萃取三次，合并氯仿層并濃縮，得到氯仿萃取液；(3J向步驟 所得氯仿萃取液中加入硅膠攪拌均勻，減壓干燥，進行硅膠柱層析；以氯仿甲醇200:1或氯仿甲醇100:1洗脫，以薄層層析對照，收集含有藍萼甲素的洗脫液，將洗脫液回收溶劑；
(4)以無水乙醇或甲醇反復(fù)結(jié)晶，得藍萼甲素，測試純度，計算得率。采用上述技術(shù)方案所得藍萼甲素的純度一般在90%以上，但得率一般為79Γ9%，而且過程中使用了有毒的溶劑，氯仿、甲醇，并且殘留的有毒溶劑會影響藍萼甲素作為藥物的使用，不符合藥典要求。公開號為CN 101914002的中國發(fā)明專利申請公開了一種藍萼甲素的提取方法， 提取、硅膠柱層析洗脫色素和雜質(zhì)、純化步驟，具體包括以下步驟
⑴采集原藥材藍萼香茶菜地上部分并粉碎，在常壓下，用體積百分數(shù)75、0%乙醇水溶液回流提取2 3次，每次回流提取2 3小時，合并提取液，減壓除去部分溶劑，得濃縮提取液；
⑵向步驟⑴所得濃縮提取液中加入硅膠并攪拌均勻，減壓干燥，進行硅膠柱層析以硅膠柱體積為1體積份，首先以2 3份體積份的洗脫液A洗脫脂溶性色素，再以4飛份體積份的洗脫液B洗脫雜質(zhì)，最后以1(Γ15份體積份的洗脫液C洗脫；收集洗脫液，濃縮后放置， 析出晶體；
其中，所述洗脫液A為石油醚和乙酸乙酯的混合物，并且按體積比，石油醚乙酸乙酯=8 1 ；所述洗脫液B為石油醚和乙酸乙酯的混合物，并且按體積比，石油醚乙酸乙酯=4 1 ；所述洗脫液C為石油醚和乙酸乙酯的混合物，并且按體積比，石油醚乙酸乙酯 =2:1;
)無水乙醇重結(jié)晶，得藍萼甲素晶體。經(jīng)上述方法得到的藍萼甲素的純度在95 100%，純度高，適于制備各種劑型，得率在10%以上，得率高，方法的重現(xiàn)性強，按照2010版藥典附錄中有機溶劑殘留測定方法測定，無有機溶劑殘留，并且適用的有機溶劑無毒性，符合2010版藥典要求。大孔吸附樹脂是一類不帶離子交換基團的多孔性交聯(lián)聚合物，具有大孔結(jié)構(gòu)的高分子吸附劑。物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，比表面積大，吸附容量大，選擇性好，吸附速度快，解吸條件溫和，對有機物選擇性好，不受無機鹽類及其他強離子、低分子存在的影響，有利于吸附， 品種多，不同品種可吸附多種有機化合物，流體阻力較小，脫色能力高，再生處理方便、使用周期長、宜于構(gòu)成閉路循環(huán)、節(jié)省費用；同時還可減少產(chǎn)品的吸潮性，有效去除重金屬，解決中藥重金屬超標的難題。目前主要用于中草藥的分離純化，如對藥材樣品的預(yù)處理、對單味中藥提取物的分離純化及對中藥復(fù)方提取物的分離純化，有的已實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，具有廣闊的發(fā)展前景。(參見劉帥英等，赤芍中芍藥苷的大孔吸附樹脂純化研究，中草藥，2010， 41 (9) :1480.)
硅膠為不可重復(fù)使用的柱填料，化學(xué)分離純化藍萼甲素，硅膠用量大，成本較高，而大孔樹脂為可重復(fù)使用的柱層析填料，并且可以工業(yè)化生產(chǎn)，會大大降低成本。藍萼香茶菜中藍萼甲素及二萜具有顯著的藥理活性，但未見有文獻報道藍萼甲素及總二萜的大孔樹脂制備方法，有必要進行制備工藝考察。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的是提供一種提取藍萼香茶菜總二萜的方法。為達到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種提取藍萼香茶菜總二萜的方法，包括提取、洗脫、脫色步驟，其中，
所述提取步驟為將藥材藍萼香茶菜地上部分粉碎，用乙醇水溶液回流提取，得到提取液，減壓回收溶劑，得濃縮提取液，所述每毫升濃縮提取液中含原藥材0. 5-lg ；
所述洗脫步驟為將所得濃縮提取液過大孔吸附樹脂，以50倍柱體積水洗脫色素，25 倍柱體積30%乙醇水溶液洗脫雜質(zhì)，30倍柱體積60%乙醇水溶液洗脫，收集此洗脫部分，回收溶劑，得到藍萼香茶菜二萜提取物。所述脫色步驟為將藍萼香茶菜二萜提取物溶于乙醇中，然后加入活性炭脫色，回收溶劑，干燥，得到藍萼香茶菜總二萜。上述技術(shù)方案中，脫色步驟是為了去除葉綠素等色素，提高得率。上述技術(shù)方案中，用乙醇水溶液回流提取的方法為在常壓下，用體積百分數(shù) 55-70%乙醇水溶液回流提取廣3次，每次回流提取廣3小時，合并提取液。上述技術(shù)方案中，所述大孔吸附樹脂為非極性或弱極性的大孔吸附樹脂，包括 AB-8 型、DlOl 型、HPD-100、HPD-200A、HPD-200B、HPD-300、HPD-700、HPD-722 型，在使用前按現(xiàn)有技術(shù)進行處理。上述技術(shù)方案中，洗脫步驟中，大孔樹脂質(zhì)量藥材質(zhì)量為1 1. 0-2. 7。上述技術(shù)方案中，洗脫步驟中，大孔樹脂柱直徑柱高為1 4-9。上述技術(shù)方案中，洗脫步驟中，大孔樹脂質(zhì)量柱體積為Img lmL。上述技術(shù)方案中，脫色步驟中，藍萼香茶菜二萜提取物的質(zhì)量和乙醇的體積比為 1 250-300。上述技術(shù)方案中，脫色步驟中，活性炭的質(zhì)量為藍萼香茶菜二萜提取物質(zhì)量的
1 5%。進一步的技術(shù)方案中，取上述藍萼香茶菜總二萜，乙醇結(jié)晶，制備得到藍萼甲素， 純度90%以上，得率7%以上。因此，本發(fā)明同時又要求保護一種提取藍萼甲素的方法。采用本發(fā)明所述制備方法制備得到的藍萼甲素及總二萜可以用于制成片劑、膠囊劑、丸劑等劑型，應(yīng)用于復(fù)方或單方制劑。由于上述技術(shù)方案運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點
采用本發(fā)明所述制備方法得到的藍萼香茶菜總二萜含量高，藍萼甲素純度90%以上， 得率7%以上，此工藝操作簡單，無污染，可工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1是實施例一中藍萼甲素的純度分析色譜圖； 圖2是實施例二中藍萼甲素的純度分析色譜圖3是實施例三中藍萼甲素的純度分析色譜圖； 圖4是實施例五中藍萼甲素的氫譜分析圖； 圖5是實施例五中藍萼甲素的碳譜分析圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步描述 實施例一
取藍萼香茶菜地上部分100克，經(jīng)粉碎，在常壓回流提取裝置中，用體積分數(shù)55%乙醇水溶液回流提取2次，每次回流提取2小時，合并提取液，減壓回收溶劑，至200毫升；經(jīng)過 80克HPD-100型大孔吸附樹脂(柱體積80毫升，大孔樹脂柱直徑2. 8厘米，大孔樹脂柱高13 厘米)，以50倍水洗脫色素，25倍體積分數(shù)30%乙醇水溶液洗脫雜質(zhì)，30倍60%體積分數(shù)乙醇水溶液洗脫，收集此洗脫部分，回收溶劑，得到藍萼香茶菜二萜提取物1. 65克。將藍萼香茶菜二萜提取物溶于430毫升乙醇中，向此溶液加入0. 08克活性炭脫色素，干燥，得到藍萼香茶菜總二萜1. 08克，含量41. 3%，2毫升乙醇結(jié)晶，得藍萼甲素0. 02克，其純度為95. 6%， 得率8%。上述技術(shù)方案中，藍萼甲素純度檢測方法為藍萼甲素2毫克，甲醇溶解定容到10 毫升，色譜柱為瑞典Kromasil C18 (4.6 mmX250 mm, 5 μ m)；流動相甲醇0. 1%磷酸 (70:30)；流速1 mL/min ；檢測波長231 nm ；進樣量20 μ L ；柱溫30°C，檢測所得圖如液相色譜圖1所示，數(shù)據(jù)見下表
峰(Peak)保留時間面積尚度面積％拖尾因子12. 72611437274622. 0981. 16523. 61310559746151. 9370. 95935. 127520931342349295.5731. 04848. 2472134913230. 3920. 735總和5450631436892100.000實施例二
取藍萼香茶菜地上部分1000克，經(jīng)粉碎，在常壓回流提取裝置中，用60%乙醇回流提取 2次，每次回流提取3小時，合并提取液，減壓回收溶劑，至1500毫升，經(jīng)過600克DlOl型大孔吸附樹脂(柱體積600毫升，大孔樹脂柱直徑5. 5厘米，大孔樹脂柱高沈厘米，)，以50倍水洗脫色素，25倍30%乙醇洗脫雜質(zhì)，30倍60%乙醇洗脫，收集此洗脫部分，回收溶劑，得到藍萼香茶菜二萜提取物16. 72克。將藍萼香茶菜二萜提取物溶于4190毫升乙醇中，向此溶液加入0. 60克活性炭脫色素，干燥，得到藍萼香茶菜總二萜10. 16克，含量42. 0%, 35毫升乙醇結(jié)晶，得藍萼甲素0. 25克，其純度為95. 0%，得率9%。上述技術(shù)方案中，藍萼甲素純度檢測方法為藍萼甲素2毫克，甲醇溶解定容到10 毫升，色譜柱為瑞典Kromasil C18 (4.6 mmX250 mm, 5 μ m)；流動相甲醇0. 1%磷酸 (70:30)；流速1 mL/min ；檢測波長231 nm ；進樣量20 μ L ；柱溫30°C，檢測所得圖如液相色譜圖2所示，數(shù)據(jù)見下表
峰(Peak)保留時間面積尚度面積％拖尾因子12. 68813760592023. 0261. 42523. 5267671141571. 6871. 02834. 988432050338974495. 0181. 12846. 6161221913120. 2691. 062總和4547037404415100.000 實施例三
取藍萼香茶菜地上部分10000克，經(jīng)粉碎，在常壓回流提取裝置中，用70%乙醇回流提
6取2次，每次回流提取2小時，合并提取液，減壓回收溶劑，至16000毫升，經(jīng)過6000克AB-8 型大孔吸附樹脂(柱體積6000毫升，大孔樹脂柱直徑10厘米，大孔樹脂柱高77厘米，)，以 50倍水洗脫色素，25倍30%乙醇洗脫雜質(zhì)，30倍60%乙醇洗脫，收集此洗脫部分，回收溶劑， 得到藍萼香茶菜二萜提取物170. 20克。將藍萼香茶菜二萜提取物溶于4190毫升乙醇中， 向此溶液加入5. 98克活性炭脫色素，干燥，得到藍萼香茶菜總二萜121. 83克，含量43. 2%， 50毫升乙醇結(jié)晶，得藍萼甲素2. 48克，其純度為96. 0%，得率8%。 上述技術(shù)方案中，藍萼甲素純度檢測方法為藍萼甲素2毫克，甲醇溶解定容到10 毫升，色譜柱為瑞典Kromasil C18 (4.6 mmX250 mm, 5 μ m)；流動相甲醇0. 1%磷酸 (70:30)；流速1 mL/min ；檢測波長231 nm ；進樣量20 μ L ；柱溫30°C，檢測所得圖如液相色譜圖3所示，數(shù)據(jù)見下表
權(quán)利要求
1.一種提取藍萼香茶菜總二萜的方法，包括提取、洗脫、脫色步驟，其特征在于所述提取步驟為將藥材藍萼香茶菜地上部分粉碎，用乙醇水溶液回流提取，得到提取液，減壓回收溶劑，得濃縮提取液，每毫升濃縮提取液中含原藥材0. 5-lg；所述洗脫步驟為將所得濃縮提取液過大孔吸附樹脂，以50倍柱體積水洗脫色素，25 倍柱體積的濃度為體積百分數(shù)30%乙醇水溶液洗脫雜質(zhì)，30倍柱體積的濃度為體積百分數(shù) 60%乙醇水溶液洗脫，收集此洗脫部分，回收溶劑，得到藍萼香茶菜二萜提取物；所述脫色步驟為將藍萼香茶菜二萜提取物溶于乙醇中，然后加入活性炭脫色，回收溶劑，干燥，得到藍萼香茶菜總二萜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述提取藍萼香茶菜總二萜的方法，其特征在于，用乙醇水溶液回流提取的方法為在常壓下，用體積百分數(shù)55-70%乙醇水溶液回流提取廣3次，每次回流提取廣3小時，合并提取液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述提取藍萼香茶菜總二萜的方法，其特征在于，所述大孔吸附樹脂為非極性或弱極性的大孔吸附樹脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述提取藍萼香茶菜總二萜的方法，其特征在于，所述大孔吸附樹脂包括 AB-8 型、DlOl 型、HPD-100、HPD-200A、HPD-200B、HPD-300、HPD-700、HPD-722 型。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述提取藍萼香茶菜總二萜的方法，其特征在于，洗脫步驟中，大孔樹脂質(zhì)量藥材質(zhì)量為1 1. 0-2. 7。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述提取藍萼香茶菜總二萜的方法，其特征在于，洗脫步驟中，大孔樹脂柱直徑柱高為1:4-9。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述提取藍萼香茶菜總二萜的方法，其特征在于，洗脫步驟中，大孔樹脂質(zhì)量柱體積為Img lmL。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述提取藍萼香茶菜總二萜的方法，其特征在于，脫色步驟中，藍萼香茶菜二萜提取物的質(zhì)量和乙醇的體積比為1 250-300。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述提取藍萼香茶菜總二萜的方法，其特征在于，脫色步驟中，活性炭的質(zhì)量為藍萼香茶菜二萜提取物質(zhì)量的1 5%。
10.一種提取藍萼甲素的方法，其特征在于，采用權(quán)利要求1所述提取藍萼香茶菜總二萜的方法制備得到藍萼香茶菜總二萜，乙醇結(jié)晶，制備得到藍萼甲素。
全文摘要
本發(fā)明屬于中藥提取領(lǐng)域，公開了一種制備藍萼香茶菜總二萜或藍萼甲素的方法包括提取、洗脫、脫色步驟，將藥材藍萼香茶菜地上部分粉碎，在常壓下，用乙醇水溶液回流提取1~3次，合并提取液，減壓回收溶劑，得濃縮提取液；將所得濃縮提取液過已經(jīng)處理好的大孔吸附樹脂，50倍柱體積水洗脫色素，25倍柱體積30%乙醇洗脫雜質(zhì)，30倍柱體積60%乙醇洗脫，收集此洗脫部分，回收溶劑，得到藍萼香茶菜二萜提取物；將藍萼香茶菜二萜提取物溶于乙醇，加入活性炭脫色，回收溶劑，干燥，得到藍萼香茶菜總二萜，乙醇結(jié)晶，制備得到藍萼甲素。采用本發(fā)明所述制備方法得到的藍萼香茶菜總二萜含量高，藍萼甲素純度90%以上，得率7%以上。
文檔編號C07C49/743GK102389456SQ201110387128
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月29日
發(fā)明者吳雙慶, 姚士, 張健, 徐乃玉, 沈曉丹, 褚純雋 申請人:蘇州大學(xué)