專利名稱：一種犬α干擾素突變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程重組蛋白領(lǐng)域，其中該基因工程蛋白是一種犬α干擾素突 變體。通過對(duì)天然蛋白的分子設(shè)計(jì)與基因工程改造，得到了具有更高活性的犬α干擾素突 變體。
二.
背景技術(shù)：
犬在人類的生活中占據(jù)著重要的的地位，但是犬類各種病毒性疾病也很嚴(yán)重，如 犬細(xì)小病毒病，犬瘟病毒病等，并且有些成為人畜共患病的病原，引起嚴(yán)重的問題。但在獸 醫(yī)領(lǐng)域，目前還沒有一種治療病毒性疾病的特效藥物，目前看來，僅有犬α干擾素還可以 一定程度地滿足這種需要，它具有廣譜的抗病毒活性。因此，市場(chǎng)需要開發(fā)一種安全、有效、 副作用少、穩(wěn)定性高的干擾素來綜合控制犬病毒性疾病。1957年，英國(guó)科學(xué)家Alick Isaacs和lean Lindenmann首次發(fā)現(xiàn)一種能夠干擾病 毒繁殖的物質(zhì)，稱之為干擾素(interferon，IFN)。目前，重組人干擾素早已上市，作為醫(yī)用 藥品廣泛應(yīng)用于治療乙肝、丙肝等病毒性感染，且取得了不錯(cuò)的療效。1987年，Himmler等首先開始了犬α干擾素(CalNF. α)的研究工作，報(bào)道了其基 因序列(GenBank Μ28624. 1 GI :16397 。將該基因重組到大腸桿菌中使其表達(dá)犬α干擾 素，在犬細(xì)胞上測(cè)得生物活性為3Χ 105U/mg。我國(guó)的科學(xué)工作者于上世紀(jì)90年代也相續(xù)開 始了犬α干擾素的研究工作，并在其基因重組、克隆、表達(dá)等方面取得了一系列的研究結(jié) 果，得到的犬α干擾素生物活性也僅為5X KfU/mg左右。目前，文獻(xiàn)報(bào)道中的天然犬α干擾素氨基酸序列完全相同，均為164個(gè)氨基酸組 成的蛋白。為了提高其生物活性，更好地應(yīng)用于病毒病治療領(lǐng)域，本發(fā)明一方面通過計(jì)算機(jī) 模擬分子設(shè)計(jì)，發(fā)現(xiàn)原序列第1 位Tyr突變成Phe所形成的空間結(jié)構(gòu)，更有利于該分子與 受體結(jié)合。另一方面本發(fā)明采用基因工程定點(diǎn)突變的方法，得到了一系列的單點(diǎn)和多點(diǎn)突 變體，從中篩選出一種活性很高的突變體，其原序列也是第1 位Tyr替換為Wre。然后將 該突變體基因與GST基因進(jìn)行融合，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，通過破菌和純化，獲得了純度 大于95%的犬α干擾素突變體。在犬腎細(xì)胞上進(jìn)行生物活性測(cè)定，生物活性達(dá)到了 3 8X108U/mg，遠(yuǎn)高于目前文獻(xiàn)報(bào)道的比活性水平。這使犬α干擾素的臨床用量大大降低， 降低了其毒副作用，使本品的商品化成為可能，也為獸醫(yī)領(lǐng)域提供價(jià)廉質(zhì)高的抗病毒藥品 成為可能。
三.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)方面，涉及一種犬α干擾素突變體，其為SEQ ID NO 1所示的氨基 酸序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知曉，所述犬α干擾素突變體可以通過基因重組表達(dá)的方法 制備。在本發(fā)明中，所述犬α干擾素突變體是通過基因工程重組表達(dá)的方法獲得的。在本 發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過如下方法獲得犬α干擾素突變體，包括如下步驟1)表達(dá)載體的構(gòu)建
依據(jù)已知犬α干擾素突變體氨基酸序列(SEQ ID NO 1)，選用大腸桿菌偏好密碼 子全基因合成犬α干擾素突變體DNA序列，同時(shí)在相應(yīng)于所編碼的氨基酸序列之5’端和 3’端加上限制性酶切位點(diǎn)，加入EK酶酶切位點(diǎn)，得到編碼犬α干擾素突變體的核酸序列。 再分別將如上述制備的犬α干擾素突變體以及篩選質(zhì)粒PBSK用限制性內(nèi)切酶處理好，經(jīng) 計(jì)算各樣品濃度后按一定摩爾比加入T4連接體系。用限制性酶切下目的蛋白基因，再將該 基因與用限制性酶處理好的Wiarmacia公司質(zhì)粒pGEX連接，經(jīng)篩選得到正確的重組子。2)重組犬α干擾素突變體的表達(dá)及分離純化將如上述所得重組子轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌，經(jīng)表達(dá)篩選出高表達(dá)基因工程菌，然后 經(jīng)發(fā)酵，離心收集目的蛋白高表達(dá)的菌體。高壓均質(zhì)機(jī)破碎菌體并離心得到含目的前體蛋 白上清液，將上清液上樣到GST親和柱上，洗脫目的前體蛋白并用EK酶酶切后，再將樣品通 過陰離子柱進(jìn)一步純化，使得最終目的蛋白純度大于98%。3)重組犬α干擾素突變體的體外生物活性測(cè)定使用Wish細(xì)胞株法測(cè)定重組犬α干擾素突變體的生物學(xué)活性。4)體內(nèi)藥效學(xué)試驗(yàn)按照30萬單位/kg的劑量對(duì)犬瘟熱病進(jìn)行治療。 四.
具體實(shí)施例方式1.重組犬α干擾素突變體前體蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與工程菌的獲得表達(dá)載體的構(gòu)建依據(jù)已知重組犬α干擾素突變體序列(SEQ ID NO 1)，選用大腸桿菌偏好密碼子 全基因合成重組犬α干擾素突變體的DNA序列，同時(shí)在相應(yīng)于所編碼的氨基酸序列之5’ 端和3’端加上限制性酶切位點(diǎn)，加入EK酶酶切位點(diǎn)，得到編碼重組犬α干擾素突變體的 核酸序列。GGA TCC ^AT GAC GAT GAC AAG UGC CAC CUG CCC GAC ACC CAC GGC CUG CGCBanHIEK酶切位點(diǎn)
AACUACCGCGUGCUGACCCUCUUGGGCGAGAUGCGCAGGCUG
AGCGCCGGCAGCUGCGACCACUACACCAACGACUUCGCUUUC
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GAGCGCAUCUCCCUGUUUCUUGAGGACAGAAACCAUACCCCC
UGCGCCUGGCAGAUGGUGAGGGCACAGAUCGGCAGGAGCUUC
UUUUCCAGUACUAUUCUGGAACAACGCAUACGUCGCAGGAAG
TAATGAGAATTCEcoRI目的片段經(jīng)BamH I.EcoR I雙酶切后分別回收小片段，質(zhì)粒PGEX經(jīng)BamH I.EcoRI雙酶切后回收大片段，14°C在T4連接酶體系中兩段目的基因片段進(jìn)行連接，經(jīng)篩選得到 的重組質(zhì)粒命名為PGEX-IFN。然后用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，涂布在含有100ug/ml 氨芐青霉素的LB平板，挑選陽(yáng)性菌落在LA中培養(yǎng)至0D600為0. 6-0. 8時(shí)加入IPTG 0. ImM 誘導(dǎo)3-4小時(shí)離心收集菌體，8M尿素破菌后15% SDS-PAGE電泳時(shí)出現(xiàn)一條44KD左右的蛋 白帶，表達(dá)量為菌體可溶性蛋白的35%。所獲得的高效表達(dá)前體蛋白的工程菌分別命名為 PGEX-IFN/BL21。2.重組犬α干擾素突變體的發(fā)酵1).搖瓶表達(dá)含重組犬α干擾素突變體前體蛋白基因的PGEX-IFN/BL21，在含 100ug/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中搖瓶過夜(37°C，200rpm)，再按1 30接種含有IOOug/ ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)3小時(shí)后，加入0. ImMIPTG誘導(dǎo)4小時(shí)。收集菌體 經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，發(fā)現(xiàn)含重組犬α干擾素突變體的前體蛋白(44KD)以可溶性表達(dá)為 主，表達(dá)量占菌體可溶性蛋白的30 %。2)發(fā)酵工藝a.培養(yǎng)基a)種子液培養(yǎng)基(LA)胰蛋白胨10克/升、酵母粉5克/升、氯化鈉10克/升、氨芐青霉素100微克
/毫升。b)培養(yǎng)基(15 升)磷酸氫二鈉375克、 磷酸二氫鉀80克、 氯化鈉10.克、氯化銨45克、胰蛋白胨50克。以上成分一起在罐中滅菌；下面的成分單獨(dú)滅菌后加入發(fā)酵罐。硫酸鎂15克、 葡萄糖150克、補(bǔ)料(500克/升)葡萄糖b.發(fā)酵過程(a)種子培養(yǎng)從已鑒定的平皿上劃取菌種，接種到50毫升O50毫升的三角瓶)LA中，37度、200 轉(zhuǎn)/分、8小時(shí)后將這50毫升種子液轉(zhuǎn)接到700毫升LA中，36度、200轉(zhuǎn)/分，過夜。(b)發(fā)酵過程將培養(yǎng)好的種子液(0D600 = 3-4)加入罐中，調(diào)好各參數(shù)，37度、150轉(zhuǎn)、溶氧 100%，開始發(fā)酵；5小時(shí)后開始以2. 5速流加2小時(shí)，加入終濃度0. 3mM的IPTG誘導(dǎo)(五 小時(shí))。3.重組犬α干擾素突變體的純化(1)親和層析采用GST Fast Flow層析介質(zhì)(GE公司)，平衡液采用25mM Tris-HCl, pH8，菌體 經(jīng)過破碎并離心取上清，上樣平衡后，裂菌的離心上清上Glutathione Sepharose層析柱， 平衡后用含IOmM還原型谷胱甘肽(GSH)的洗脫液洗下融合蛋白。(2)酶解上一步的洗脫液加入EK酶(5NIHU/mL) 37°C酶切20小時(shí)。(3)陰離子交換層析
5
采用SOurce30Q層析介質(zhì)，平衡液為20mM PB, pH7，上一步得到的樣品用水稀釋1 倍進(jìn)行上樣，平衡后采用20mM PB, ρΗ7，0-1Μ NaCl，20個(gè)柱體積的梯度洗脫，收集目的蛋白 洗脫峰。4.檢測(cè)得到的重組犬α干擾素突變體通過SDS-PAGE純度檢測(cè)和反相HPLC檢測(cè)，純度均 大于95%。5.體外活性檢測(cè)干擾素能刺激某些指示細(xì)胞(如人羊膜上皮細(xì)胞Wish株、人喉癌細(xì)胞株Hep-2 以及人胚肌皮或肺單層細(xì)胞)產(chǎn)生抗病毒蛋白，從而使細(xì)胞免受水皰性口炎病毒(VSV)的 攻擊，根據(jù)待測(cè)樣品不同稀釋度的保護(hù)能力，計(jì)算出干擾素生物學(xué)活性單位。以保護(hù)半數(shù) (50% )細(xì)胞免受病毒損害的最高干擾素稀釋度為1個(gè)干擾素活性單位。也可從標(biāo)準(zhǔn)曲線 中求得待測(cè)樣品的IFN活性單位。結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種犬α干擾素突變體(SEQ ID NO 1)，其特征在于將天然犬α干擾素氨基酸序 列的第1 位的Tyr替換成為Wie。v1 chlpdthglr nwrvltllgq mrrlsagscd hytndfafpk elfdgqrlqe aqalsvvhvm 61 tqkvfhlfcp dtssapwnmt lleelcsgls eqlddleacp lqeaglaetp lmhedstlrt 121 yfqrislfIq drnhspcawe mvraeigrsf fsstilqeri rrrk
2.一種多核苷酸序列(SEQ ID NO :2)，其編碼權(quán)利要求1所述的犬α干擾素突變體。
3.權(quán)利要求1中的犬α干擾素突變體，使用大腸桿菌為宿主細(xì)胞，應(yīng)用基因工程的方 法進(jìn)行表達(dá)。
4.一種治療犬病毒病的方法，包括向所述受試對(duì)象施用治療有效量的權(quán)利要求1中所 述的犬α干擾素突變體。
全文摘要
利用基因工程手段對(duì)天然犬α干擾素進(jìn)行改造，制備出一種犬α干擾素突變體，其比天然犬α干擾素在體內(nèi)外具有更高的活性，試驗(yàn)結(jié)果顯示，該蛋白可開發(fā)成為獸藥，用來治療犬病毒病。
文檔編號(hào)C07K14/56GK102079784SQ20091025018
公開日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2009年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月30日
發(fā)明者李為民 申請(qǐng)人:李為民